CN1051914A

CN1051914A - 肽类

Info

Publication number: CN1051914A
Application number: CN90109352A
Authority: CN
Inventors: 爱德华兹·朱森·文森特; 凡歌·布拉弗德·奥托
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Sanofi Aventis UK Holdings Ltd; Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-11-22
Filing date: 1990-11-22
Publication date: 1991-06-05
Also published as: NO905038D0; DE69024626T2; JP2927936B2; FI905741A0; AU6679390A; NZ236114A; IL96402A0; IE904211A1; HU907234D0; FI905741A; HUT55798A; ES2084635T3; EP0434979A1; NO905038L; ATE132501T1; JPH03261800A; AU638775B2; PT95953A; CA2030212A1; DE69024626D1

Abstract

控制肿瘤组织特别是小细胞肺肿瘤和前列腺瘤生长、胃酸分泌、消化性(食管、胃和十二指肠)溃疡之病因和症状的方法。治疗包括给患者使用有效量的韩蛙皮素/GRP型抑制剂。

描述了韩蛙皮素/GRP的拮抗剂，其为天然存在之韩蛙皮素/GRP的衍生物，在其羧基末端上连接两个氨基酸的硫代亚甲基或亚甲基亚矾键受到了修饰。使用常规竞争性结合和生化分析法以及常规生理学试验，进一步证实了该拮抗作用，也述及这些衍生物可用于处理有韩蛙皮素/GRP参予的各种病理状况。

Description

本发明涉及新的抗有丝分裂和抗分泌肽，其为相关肽韩蛙皮素（Bombesin）和胃泌素（Gastrin）释放肽的拮抗剂，可用于控制（1）小细胞肺癌和前列腺癌的生长、（2）胃酸分泌、溃疡病（食管、胃及十二指肠溃疡）的病原和症状。

韩蛙皮素是一种14氨基酸肽，最初是从铃蟾属铃蟾（Bombina bombina）的皮肤中分离的。已知韩蛙皮素有多种效应，包括诱导胃和胰腺分泌、刺激神经系统、诱导小肠肌细胞的肌电和收缩活性、降低肾血流、促进垂体激素的分泌及生长。

胃泌素释放肽（GRP）是一种27氨基酸肽，是后来在哺乳动物体内分离的，并发现它与韩蛙皮素有相同的羧基末端及相类似的特性。另外，已证明胃泌素释放肽和结构上相关的韩蛙皮素可竞争结合小细胞性肺癌细胞（SCLC）及前列腺上皮细胞上的高亲和性受体。与这些生长因子的结合可显示[³H]胸苷摄入增加及集落生长。

许多研究涉及细胞生长因子通过激活生长因子受体而产生肿瘤细胞生长作用。在这方面，韩蛙皮素/GRP及受体激活作用均与其他已知的生长因子及致癌基因有关。因为发现这些肽，韩蛙皮素和GRP可用作人小细胞性肺癌（还可能包括前列腺癌）系统中的潜在自泌（autocrine）生长因子故对设计和开发竞争性韩蛙皮素受体拮抗剂以作为可能的抗有丝分裂剂产生了很大兴趣。利用抗韩蛙皮素单克隆抗体所作的实验显示其可阻止这些受体的结合并引发有丝分裂反应，从而进一步支持上述研究结果。使用单克隆抗肽抗体所作实验证明了在体外对SCLC细胞，在体内对裸鼠之异种移植物的克隆生长抑制作用。有丝分裂反应随着配基-受体复合物之细胞内信号的产生而开始。对于GRP/韩蛙皮素，其包括激活G蛋白，后者本身又进一步活化磷酸脂酶C（PLC）。PLC则可将磷脂酰肌醇磷酸酯（PI）转化成肌醇1，4，5-三磷酸酯（IP₃）和二酰基甘油（DAG）。据信IP₃和DAG是GRP/韩蛙皮素受体途径活化的细胞内信号。

在证实了SCLC细胞上的韩蛙皮素/GRP细胞受体之后，还发现这些受体也存在于人前列腺细胞上。继后在体外利用韩蛙皮素/GRP抗体所作的研究进一步证实了韩蛙皮素/GRP对前列腺上皮细胞的生长促进作用。此外，对PC₃（一种人前列腺癌细胞系）和PMU23（一种得自Ⅲ期前列腺癌之初级培养物的上皮细胞系）所作的细胞增殖研究，证明于剂量依赖性韩蛙皮素/GRP生长曲线。这些资料提示，可能在前列腺内有肿瘤细胞生长的自泌或旁泌（paracrine）增强。因此，干扰GRP/韩蛙皮素的作用可以改善前列腺癌的预后，其中这些因子则是作为自泌或旁泌有丝分裂剂。

韩蛙皮素和GRP也能够诱导胃和胰分泌，且在胰腺（B细胞）和小肠（C细胞）来源的细胞上有可证实的饱和受体，因此可利用这些受体的拮抗剂治疗消化性溃疡及肠和胰脏疾病，并可能用于治疗这些组织的腺癌。

根据使用抗韩蛙皮素/GRP抗体所作研究推测，有可能使用设计的肽受体拮抗剂来干扰韩蛙皮素/GRP的自泌生长周期。因此，后来相继报导了几种类型的韩蛙皮素拮抗剂。这些拮抗剂都是按照天然序列取代的类型和位置来限定的。早期的受体拮抗剂效力差、缺乏特异性，存在着一系列毒性问题，故阻制了其在科研和治疗上的应用。

最近的研究工作已集中在修饰这些肽的羧基末端（C末端）区域，以利用各种不同类型的C末端修饰的同系物来干扰受体相互作用上。这些工作包括掺入D-氨基酸、非肽键如（ψ[CH₂NH]）、酰胺、以及酯修饰。由这些改变可产生某些改善了特性的肽。

申请人已制备了天然韩蛙皮素的线性肽类似物，该类似物在氨基酸13和14之间含有一个包括硫代亚甲基基团（ψ[CH₂S）的非肽键，用以提高键的构象挠曲性，并进而提高肽的整个构象挠曲性。申请人还对硫代亚甲基作适当氧化，制备了含有相应亚甲基亚砜（ψ[CHS₂（O）]）的肽。硫代亚甲基氧化成亚甲基亚砜可产生两种异构体。申请人从物理上分离了亚甲基亚砜的肽异构体，定名为（ψ[CH₂S（O）]^Ⅰ）和（ψ[CH₂S（O）]^Ⅱ），并已用适当的分析法检验了这些化合物。申请人证明韩蛙皮素的硫代亚甲基和亚甲基亚砜类似物是天然分子的体外拮抗剂，其作用是（1）受体结合的竞争性抑制剂;（2）对抗胃泌素释放肽的生物学作用。本发明的肽拮抗剂具有显著的抗有丝分裂和/或抗分泌活性，故在科研及肿瘤和溃疡治疗上有重要价值。此外，因存在硫代亚甲基或亚甲基亚砜功能性，故可提高效力并延长作用时间。

权利要求的是有下列结构通式的肽衍生物：

X是选自氢、一个或两个有1至10个碳原子的烷基基团、一个或两个有2至10个碳原子的酰基基团、苄氧羰基或叔丁氧羰基的氨基末端残基，除非氨基末端氨基酸是环状衍生物并因而删去X，

N是韩蛙皮素、GRP的序列，或这些序列之一的天然变异体或其部分、键、或含有1至11个任何氨基酸残基的肽;除非氨基末端氨基酸是环状衍生物并因而删去N，

A₁是Glp，或适当的酸性亲水残基;

A₂是Gln，适当的中性或疏水残基，Nle、α氨基丁酸、pSubPhe、BNap，或键;

A₃是Arg、适当的碱性亲水残基，或键;

A₄是Leu、或与A₂相同;

A₅是Gly、与A₂相同者、D-Phe、或D-Ala;

A₆是Asn、与A₂相同者、D-Ala、pGlu、Lys、Lys（Z）、SubPhe，或D-Phe;

A₇是Gln、His、适当的中性、疏水、或碱性亲水残基，αNap、D-His、Me His、His（τ-Me）、His（π-Me）、D-Glu（OMe）、D-Glp、D-Leu、Me Leu、D-Phe，或Glu;

A₈是Trp、适当的中性残基或Met、Me Trp、SubPhe、Lys、Cha、或Lys（Z（2Cl）;

A₉是Ala、与A₂相同者、Me Ala、Aib、D-Phe、L-Nal、Arg、或Glu;

A₁₀是Val、与A₂相同者、Me Val、Thr（CH₂Ph）、或DL-Flg;

A₁₁是Gly、适当的中性残基、Phe、D-Phe、Sar、D-Ala、D-Ser、D-Ser（CH₂Ph）、SubPhe、D-Pro、D-Lys、Asp、D-Arg、D-Lys（Z（2Cl）、Ac3c、Ac5c、或Ac6c;

A₁₂是His、适当的中性或碱性亲水残基、Tyr、D-Phe、pSubPhe、His、Me His、His（τ-Me）、His（π-MeOH）、D-pcF、Aib、Ahx、Ape、Gln、Lys、Lys（Z）、Ser、Ser（CH₂Ph）、Thr、Glu、Asp、Asp（OtBu）、或N-Nal;

A₁₃是Leu、Phe、适当的疏水或中性残基、Ahx、Me Ahx、Ape、Me Ape、D-Leu、Me Leu、Me Ile、Me Val，或Glu;

ψ是A₁₃aaψA₁₄aa的二肽决定基，其中ψ代表[CH₂S]、[CH₂S（O）]、ψ[CH₂S（O）]^Ⅰ和ψ[CH₂S（O）]^Ⅱ，且A₁₃aa和A₁₄aa代表取代基氨基酸;

A₁₄是Leu、Met、Nle、适当的疏水或中性残基、Ahx、Me Ahx、Ape、Me Ape、D-Leu、Me Leu、Me Ile、Me Val、或Glu;

C是韩蛙皮素、GRP的序列，或其天然变异体或部分、键、或者是含有1至11个任何氨基酸残基的肽;且

Y是选自OH、（C₁-C₈）烷氧基酯、羧酰胺、一或二（C₁-C₄）烷基酰胺、（C₁-C₄）烷基胺、（C₁-C₄）硫代烷基醚的羧基末端残基，

或其医药上可接受的盐。

本说明书中所用的下列通用缩写字分别是（1）氨基酸和它们的三字母代码，（2）经修饰的或不常见的氨基酸，以及（3）末端氨基或羧基取代基：

（1）氨基酸和它们的三字母代号

L-氨基酸 D-氨基酸

Ala-丙氨酸 D-Ala-D-丙氨酸

Arg-精氨酸 D-Arg-D-精氨酸

Asn-天冬酰胺 D-Asn-D-天冬酰胺

Cys-半胱氨酸 D-Cys-D-半胱氨酸

Gly-甘氨酸 D-Glu-D-谷氨酸

Glu-谷氨酸 D-Val-D-缬氨酸

Val-缬氨酸 D-Gln-D-谷氨酰胺

Gln-谷氨酰胺 D-His-D-组氨酸

His-组氨酸 D-Ile-D-异亮氨酸

Ile-异亮氨酸 D-Leu-D-亮氨酸

Leu-亮氨酸 D-Lys-D-赖氨酸

Lys-赖氨酸 D-Phe-D-苯丙氨酸

Phe-苯丙氨酸 D-Met-D-蛋氨酸

Met-蛋氨酸 D-Pro-D-脯氨酸

Pro-脯氨酸 D-Ser-D-丝氨酸

Ser-丝氨酸 D-Thr-D-苏氨酸

Thr-苏氨酸 D-Trp-D-色氨酸

Trp-色氨酸 D-Tyr-D-酪氨酸

Tyr-酪氨酸

（2）经修饰的和不常见的氨基酸

Ac3c-1-氨基-1-环丙烷甲酸

Ac5c-1-氨基-1-环戊烷甲酸

Ac6c-1-氨基-1-环己烷甲酸

Asp（Ot Bu）-邻-叔丁基天冬氨酸

Aba -α-氨基-正丁酸

Ahx -（2S）-2-氨基己酸（正亮氨酸）

Ape -（2S）-2-氨基戊酸（正缬氨酸）

Cha -环己基丙氨酸

Chg -环己基甘氨酸

Cin -肉桂酰

Deh -（2，3-二乙基胍基）高精氨酸

Dh Cin -3，4-二氢肉桂酰

Hse -高丝氨酸内酯

Mis（π-Me）-N^π-甲基组氨酸

Mis（τ-Me）-N^τ-甲基组氨酸

Hyp -羟脯氨酸

pGlu -焦谷氨酸

Glu（OMe）-γ-甲基-D-谷氨酸

I-Tyr -3-碘酪氨酸、5-碘酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸

Lys（Z） -苄氧羰基赖氨酸

Lys（ZCl） -对氯苄氧基赖氨酸

Me Lys -N-甲基赖氨酸

Me Leu -N-甲基亮氨酸

Me His -N-甲基组氨酸

Me Trp -N-甲基色氨酸

Me Ala -N-甲基丙氨酸

Me Val -N-甲基缬氨酸

Me Ahx -N-甲基（2S）-2-氨基己酸

Me Ape -N-甲基（2S）-2-氨基戊酸

Me Ile -N-甲基异亮氨酸

Me Phe -N-甲基苯丙氨酸

Me Pgl -N-甲基苯甘氨酸

Npa -β-（萘基）丙氨酸

Dh Pro -3，4-二氢脯氨酸

Nle -正亮氨酸

Orn -鸟氨酸

Pip -哌可酸酯

Pha -对氨基苯基丁酸

pSubPhe -对取代的苯丙氨酸;pCl Phe-对氯苯丙

氨酸，pBr Phe-对溴苯丙氨酸，

pFl Phe-对氟苯丙氨酸、

pNO₂Phe-对硝基苯丙氨酸、

pOHPhe-对羟基苯丙氨酸

Pgl -苯甘氨酸

Ser（CH₂Ph）-苄基丝氨酸

Sar -肌氨酸（N-甲基甘氨酸）

SubPhe -邻位、间位、或对位，一或二取代的苯丙氨酸

Tha -β-（2-噻吩基）-丙氨酸

Thr（CH₂Ph）-苄基苏氨酸

Trp（CH₂Ph）-苄基色氨酸

Tiq -四氢异喹啉3-羧基酯

（3）氨基和羧基末端取代基

Ac -乙酰

Azt -氮杂环丁烷-2-羧酸酯

Cin -肉桂酰

Dh Cin-3，4-二氢肉桂酰

Glt -戊二酰

Mal -马来酰

Oac -8-氨基辛酸

Oct -正辛烷

Suc -琥珀酰

Tfa -三氟乙酰

Glt -戊二酰

＃ -C末端酰胺

下列标明的是已知GRP和韩蛙皮素之天然存在的氨基酸序列变异：

序列鉴定

GRP和韩蛙皮素的氨基酸序列变异

GRP:

1 5 10 15

Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr

Ala Val Ser Val Gln ser Pro Ala Ala Ile Thr

Gln Pro

Gly

20 25

Pro Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met-NH₂(人）

Ser

韩蛙皮素

1 5 10

pGlu Gln Arg Leu Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Leu Met-NH₂

(人）

利托灵

1 5 10

pGlu Gln Trp Ala Val Gly His Phe Met-NH₂

氨基酸及修饰

按照习惯，本文所示肽的结构，其氨基末端写在链的左边，羧基末端写在链的右边。

除甘氨酸外，天然存在的氨基酸均含有手性碳原子。除特别指出者外，本文所说的光学活性氨基酸均为L构型。例如，A₁或A₁₄基团的任何氨基酸可以是D或L构型的。另外，应明确的是，在硫代亚甲基氧化成亚甲基亚砜后，存在两种亚甲基亚砜的肽异构体，分别称为（ψ[CH₂S（O）]^Ⅰ）和（ψ[CH₂S（O）]^Ⅱ）。还应明确的是可以分离出这些异构体并确定其绝对构型。本文所用的术语ψ[CH₂S（O）]是用以指明共同或分别存在两种异构体。

烷基基团和烷氧基基团的烷基部分包括直链、支链或环形烷基基团，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、环戊基、己基、异己基、环己基和环戊基甲基、庚基、辛基（Oct）、8-氨基辛酸（Oac）。2至10个碳原子的酰基基团包括直链、支链、环形、饱和和未饱和的、各有1或2个羰基部分的酰基基团，如乙酰（Ac）、氮杂环丁烷-2-羧酸酯（Azt）、苄氧基琥珀酰、肉桂酰（Cin）、3，4-二氢肉桂酰（Dh Cin）、马来酰（Mal）和戊二酰（Glt）。烷基和酰基取代基两者均包括具有卤素取代基的基团，所说的卤素是氟、氯、溴或碘，如三氟乙酰（Tfa）。N末端氨基酸残基的环形衍生物包括焦谷氨酸（pGlu）和高丝氨酸内酯（Hse）。

本文所用的术语“任何氨基酸”并不意味着包括任何有氨基取代基的羧酸，而最好使用多肽衍生物技术领域中常用氨基酸，且包括天然存在的氨基酸;当涉及制备天然存在的肽的合成同系物时，还包括肽化学领域里常用的“非蛋白质”α-氨基酸。天然存在的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。还可包括天然存在之氨基酸的D-异构体;即D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-丝氨酸、D-蛋氨酸、D-苏氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸、D-半胱氨酸、D-脯氨酸、D-组氨酸、D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸。还包括“非蛋白质”α-氨基酸，如1-氨基-1-环丙烷甲酸（Ac3c）、1-氨基-1-环戊烷甲酸（Ac5c）、1-氨基-1-环己烷甲酸（Ac6c）、邻-叔丁基天冬氨酸（Asp（Ot Bu））、α-氨基-正丁酸（Aba）、（2S）-2-氨基己酸（正亮氨酸）（Ahx或Nle）、（2S）-2-氨基戊酸（正缬氨酸）（Ape）、N-甲基组氨酸（Mis（π-Me））、N-甲基组氨酸（Mis（τ-Me））、N-甲基赖氨酸（Me Lys）、N-甲基亮氨酸（Me Leu）、N-甲基组氨酸（Me His）、N-甲基色氨酸（Me Trp）、N-甲基丙氨酸（Me Ala）、N-甲基缬氨酸（Me Val）、N-甲基（2S）-2-氨基己酸（Me Ahx）、N-甲基（2S）-2-氨基戊酸（Me Ape）、N-甲基异亮氨酸（Me Ile）、N-甲基苯丙氨酸（Me Phe）、N-甲基苯甘氨酸（Me Pgl）、β-（2-噻吩基）-丙氨酸（Tha）、苄基苏氨酸（Thr（CH₂Ph））、苄基色氨酸（Trp（CH₂Ph））、正亮氨酸、正缬氨酸、别异亮氨酸、高精氨酸、硫代脯氨酸、二氢脯氨酸、羟脯氨酸（Hyp）、高丝氨酸、环己基甘氨酸（Chg）、α-氨基-正丁酸（Aba）、环己基丙氨酸（Cha）、氨基苯丁酸（Pba）、在邻位、间位或对位上单或二取代的苯丙氨酸，如对位取代的苯丙氨酸（pSubPhe）和对氯苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸及对硝基苯丙氨酸（pNPhe），或在苯基部分的位置被下列一个或两个基团取代，即被（C₁-C₄）烷基、（C₁-C₄）烷氧基、卤素或硝基基团取代，或被亚甲二氧基基团取代、β-2-和3-噻吩基丙氨酸、β-2-和3-呋喃基丙氨酸、β-2-、3-和4-吡啶基丙氨酸、β-（苯并噻吩-2-和3-基）丙氨酸、β-（1-或2-萘基）丙氨酸（Npa）、邻位烷基化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸衍生物、谷氨酸和天冬氨酸的甲基酯、S-烷基化的半胱氨酸、酪氨酸的O-硫酸酯、以及卤化的酪氨酸，如3-碘酪氨酸、5-碘酪氨酸和3，5-二碘酪氨酸。

借助“韩蛙皮素或GRP或其天然变异体”这一表达方式，申请人意欲说明可由自然界提供的韩蛙皮素或GRP的氨基酸序列。

当涉及GRP和韩蛙皮素及其变异体时，所用的术语“其部分”是指包括GRP、韩蛙皮素或其变异体序列中的1至11个氨基酸（或更多个）的连续区域。

可根据某些电荷特征来限定α-氨基酸的类别。侧链可表现有两大类特征：非极性和极性。非极性残基由疏水性残基构成，其包括有脂族烃侧链的氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Nle、Pro，有芳香基团的氨基酸Phe和Trp、以及假烃氨基酸Met。极性氨基酸由三组构成：（1）酸性疏水残基，（2）中性残基，以及（3）碱性疏水残基。中性残基含有带烃基的残基，如Ser和Thr;带酰胺者，如Asn和Gln;带芳环者，如Tyr和Trp;带硫氢基的，如Cys，以及小的结构适应性氨基酸，如Ala和Gly。极性类中，带“酸性疏水”残基者包括天冬氨酸、谷氨酸及酪氨酸;带“碱基亲水”残基者包括His、Lys和Arg。

文中所说的“含有1至11个任何氨基酸残基的肽”是指向“核心氨基酸（A₂-A₁₄）”的氨基或羧基末端加入氨基酸，包括具有其内在活性的核心结构。

Y代表可用以取代或修饰末端氨基酸的化学基团。因此，Y可以是羧酰胺、烷氧基酯、烷基酰胺、烷基胺或硫代烷基醚。

式Ⅰ的多肽可与任何无毒性的有机或无机酸形成医药上可接受的盐。用于形成适当的盐的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸及酸性金属盐如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。用于形成适当盐的有机酸包括一、二和三元羧酸。这些酸的实例有乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和磺酸，如甲磺酸和2-羟基乙磺酸。羧基末端氨基酸部分的盐包括与任何适用的无机或有机碱形成的无毒性羧酸盐。举例来说，这些盐包括与碱金属如钠和钾、碱土金属如钙和镁、包括铝在内之ⅢA族的轻金属、有机伯、仲和叔胺如包括三乙基胺在内的三烷基胺、普鲁卡因、二苄基胺、1-乙烯胺、N，N′-二苄基1，2-乙二胺、二氢化松香胺、N-（低级）烷基哌啶及其他适用的胺所形成的盐。

利用肽化学家们常规使用的命名法，其中A₁₃-ψ-A₁₄是这样一些化合物，即其中使A₁₃残基连接到A₁₄残基上的部分包括两个由还原的硫代亚甲基键连接的Leu残基，并可定名为Pheψ[CH S]Leu。这一命名表明倒数第二个Phe的羰基基团被还原成了硫代亚甲基基团。可按照Spatola和Darlak[Tetrahedron Letters，44（3），821-33（1988）]的方法制备那些其中ψ为-CH₂S-基团的式Ⅰ的肽衍生物，即ψ[CH₂S]化合物。用以描述本发明肽衍生物的其他命名是涉及亚甲基亚砜类ψ[CH₂S（O）]的[Edward and Spatola，Journal of Liquid Chromatography，915，903-919（1986）]。另外，在硫代亚甲基氧化成亚甲基亚砜后，可存在亚甲基亚砜的两种肽异构体，分别定名为（ψ[CH₂S（O）]^Ⅰ）和（ψ[CH₂S（O）]^Ⅱ）。也已知道可分离这些异构体并确定其绝对构型。使用术语ψ[CH₂S（O）^Ⅰ]是表明混杂或分开存在两种异构体。（ψ[CH₂S（O）]）和（ψ[CH₂S（O）]^Ⅱ）的特征是它们在C₁₈（Vydac分析柱，4.6mmIDX25cm，5微米C18）柱上的滞留时间分别为5.40分钟和6.28分钟，其中柱上泵驱动的流动相流速为2ml/分钟，用25%至75%乙腈（溶于含0.1%三氟乙酸的水中）的线性梯度洗脱25分钟以上。

本发明肽衍生物作为韩蛙皮素/GRP拮抗剂的能力，是使用BucK等人（Science，226，987-989.1984）的方法观察这些肽与放射性碘标记的韩蛙皮素/GRP竞争哺乳动物韩蛙皮素/GRP受体的能力，并使用Bristow等人（British J.Pharmacol.90，211-21，1987）的方法研究这些化合物刺激或抑制韩蛙皮素/GRP诱导磷脂酰肌醇更新的能力得以证实的。

就化合物的通式来说，其中某些基团是优选的。申请人优选下述式Ⅰ的肽衍生物：

优选的式Ⅰ肽衍生物是

A₁是pGlu，或适当的酸性亲水残基;

A₂是Gln，适当的中性或疏水残基，Nle、α-氨基丁酸、pSubPhe、BNap，或键;

A₃是Arg、适当的碱性亲水残基，或键;

A₄是Leu、或与A₂相同;

A₅是Gly、与A₂相同、D-Phe、或D-Ala;

A₆是Asn、与A₂相同、D-Ala、或pGlu、

A₇是Gln、His、适当的中性、疏水、或碱性亲水残基，αNap;

A₈是Trp、适当的中性残基或Met;

A₉是Ala、与A₂相同;

A₁₀是Val、与A₂相同;

A₁₁是Gly、适当的中性残基、Phe、D-Phe;

A₁₂是His、适当的中性或碱性亲水残基、Tyr、D-Phe、pSubPhe;

A₁₃是Leu、Phe或适当的疏水或中性残基;

ψ是A₁₃aaψA₁₄aa的二肽决定基，其中ψ是[CH₂S]、[CH₂S（O）]、ψ[CH₂S（O）]^Ⅰ和ψ[CH₂S（O）]^Ⅱ，A₁₃aa和A₁₄aa指定为取代基氨基酸;

A₁₄是Leu、Met、Nle或者是适当的疏水或中性残基;

C是韩蛙皮素、GRP的序列，或其天然变异体或部分、键、或者是含有1至11个任何氨基酸的肽;且

或其医药上可接受的盐。

特别优选的是有下列结构通式的肽衍生物：

其中

N是韩蛙皮素、GRP的序列，或这些序列的天然变异体或其部分、键、或含有1至11个任何氨基酸残基的肽;除非氨基末端氨基酸是环状衍生物并因而删去N，

A₁是pGlu或键，

A₂是Gln或键，

A₃是Arg或键，

A₄是Leu或键，

A₅是Gly或键，

A₆是Asn、pGlu、Gly或D-Phe，

A₇是Gln或His，

A₈是Trp，

A₉是Ala，

A₁₀是Val，

A₁₁是Gly，

A₁₂是His，

A₁₃是Phe，

ψ是A₁₃aaψA₁₄aa的二肽决定基，其中ψ是[CH₂S]、[CH₂S（O）]、ψ[CH₂S（O）]^Ⅰ和ψ[CH₂S（O）]^Ⅱ，且A₁₃aa和A₁₄aa指定为取代基氨基酸;

A₁₄是Leu或Nle，

C是韩蛙皮素、GRP的序列，或其天然变异体或部分、一个键、或含有1至11个任何氨基酸残基的肽，

Y是选自OH、（C₁-C₈）烷氧基、氨基、一或二（C₁-C₄）烷基取代的氨基酸的羧基末端，或者是醇末端残基;且

X是氢、乙酰或琥珀酰。

肽合成

可使用本领域已知的多种方法合成本发明的肽。这些方法包括固相顺序和分段合成法、基团克隆和这些技术相结合。可使用已确立的自动合成手段、如使用自动肽合成仪进行固相顺序合成。该方法中，肽的合成是由被保护的、含氨基酸内硫代亚甲基亚甲基亚砜桥键的二肽开始的，其中C末端氨基酸连接到甲基二苯甲胺树脂上。使用厂商推荐的及本领域技术人员已知的标准方法学进行肽序列的延长。

完成序列的偶联后，可留下或除去Boc保护基团，并使N末端氨基基团酰化。使用氟化氢法由树脂上置换被保护的片段。

用于将各氨基酸引入多肽序列之α-氨基保护基团可以是本领域已知的任何一种这类保护基团。可使用的各类α-氨基保护基团是（1）酰基型保护基团，如甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲苯磺酰基、苯磺酰基、硝基苯亚磺酰基、三苯甲基亚磺酰基、邻硝基苯氧乙酰基和α-氯丁酰基;（2）芳族尿烷型保护基团，如苄氧羰基和取代的苄氧羰基，如对氯苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、对溴苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、1-（对位联苯基）-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基和二苯甲氧羰基;（3）脂族尿烷型保护基团，如叔丁氧羰基（Boc）、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基和烯丙氧羰基;（4）环烷基尿烷型保护基团，如环戊氧羰基、金刚烷氧羰基和环己氧羰羰;（5）硫尿烷型保护基团，如苯基硫代羰基;（6）烷基型保护基团如三苯甲基和苄基;以及（7）三烷基硅烷基团如三甲基硅烷。其中优选的α-氨基保护基团是叔丁氧羰基（Boc）。

如固相肽合成技术领域中已知的，许多氨基酸在链制备过程均携带保护作用所需的官能团。本技术领域内的技术人员可根据被保护的氨基酸和肽上是否存在其它被保护的氨基酸残基来适当地使用和选择保护基团。对侧链保护基团的选择是很严格的，它必须是在裂解α-氨基部分的保护基团时不致于被裂解掉。例如，赖氨酸的适用侧链保护基团是苄氧羰基和取代的苄氧羰基，所说的取代基选自于卤素（如氯、溴、氟）和硝基（如2-氯苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、3，4-二氯苄氧羰基）、甲苯磺酰基、叔戊氧羰基、叔丁氧羰基和二异丙基甲氧羰基。可用乙酰基、苄氧基、叔丁基、三苯甲基、苄基、2，6-二氯苄基或苄氧羰基基团保护苏氨酸和丝氨酸的醇式羟基基团。其中优选的保护基是苄基。

选择适当的偶联剂是本领域技术人员已知的。将氨基酸加到Gln、Asn或Arg上的特别适用的偶联剂是N，N′-二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑。使用这些试剂来阻止腈和内酰胺生成。其它偶联剂是（1）碳化二亚胺（如N，N′-二环己基碳化二亚胺和N-乙基-N′-（Y-二甲氨基丙基碳化二亚胺）;（2）氨腈（如N，N′-二苄基氨腈）;（3）烯酮亚胺;（4）异噁唑盐（如N-乙基-5-苯基-异噁唑-3′-磺酸盐;（5）在环上含有一至四个氮的芳族特性的单环含氮杂环酰胺，如咪唑酰胺、吡唑酰胺和1，2，4-三唑酰胺。具体适用的杂环酰胺包括N，N′-羰基二咪唑和N，N′-羰基-二-1，2，4-三唑;（6）烷氧基化乙炔（如乙氧基乙炔）;（7）与氨基酸之羧酸部分形成混合酐的试剂（如乙基氯代甲酸酯和异丁基氯代甲酸酯）或被偶联之氨基酸的对称酐（如Boc-Ala-O-Ala-Boc）;（8）一个环氮上有羟基的含氮杂环化合物（如N-羟基苯邻二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺及1-羟基苯并三唑），以及（9）二苯基磷酰基叠氮化物。Kapoor（J.Pharm.Sci.，59，1-27，1970）介绍了其它一些活化剂及它们在肽偶联中的应用。申请人优选对称酐作为除Arg、Asn和Gln以外之所有氨基酸的偶联剂。

以大约超过四倍的量，将被保护的氨基酸或氨基酸序列引入固相反应器中，并在含二甲基甲酰胺：二氯甲烷（1∶1）的介质中，或只在二甲基甲酰胺中，更好只在二氯甲烷介质中进行偶联。在发生不完全偶联的情况下，可于除去α-氨基保护基团之前，即在固相反应器中偶联下一个氨基酸之前重复进行该偶联过程。可按E.Kaiser等人（Analyt.Biochem.，34，595，1970）所述方法，以茚三酮反应监测合成各阶段上的偶联反应是否成功。

将α-氨基被保护的氨基酸偶联到树脂载体上之后，可使用任何适当方法，如使用在二氯甲烷中的三氟乙酸、单纯三氟乙酸或在二噁烷中的HCl去掉保护基团。可于0℃至室温的温度下完成去保护反应。也可使用其它去除特定α-氨基保护基团的常规裂解剂和反应条件。去掉α-氨基保护基团后，可依次逐步偶联其它氨基被保护的氨基酸。另外，可在用树脂支持的氨基酸序列进行偶联之前，以溶液方法偶联多个氨基酸基团。

得到所需的氨基酸序列之后，由树脂上除去所合成的肽。此可用水解方法完成、如可用氨基酸醇或溶于二氯甲烷（DCM）的乙酸处理结合在树脂上的多肽。可用已知方法除去保护基团。一般可在肽链合成完成之后去掉保护基，但也可在任何其它适当的时间除去保护基。一般可通过制备性反相高效液相层析法及其他已知技术纯化所合成的肽。

此外，可以使用多种不同的氧化试剂氧化硫代亚甲基，以制得亚甲基亚砜。完成上述氧化的一个方法是用含过氧化氢水溶液处理硫代亚甲基肽，使之转化为肽的亚甲基亚砜。可用已知的高压液相层析法（HPLC）分离异构体。例如可选用C18反相HPLC分离亚甲基亚砜肽异构体。

治疗应用

消化性溃疡病的自然病史可表现为反复加重或缓解。结果，使之成为一种慢性病理过程。消化性（食管、胃和十二指肠）溃疡多发生在接触胃酸和胃蛋白酶的胃肠道部位。本发明的化合物可用于治疗胃肠道和/或胰脏溃疡病，并可有效地抑制胰脏和/或胃的过度分泌作用，特别是盐酸和胃蛋白酶。本发明的化合物可作为适当的调节剂用于治疗消化性溃疡。

当用于治疗消化性溃疡时，根据患者状态、溃疡病的严重程度以及所选用的肽衍生物的不同来确定用量，一般适当剂量每天每公斤体重0.2mg至250mg。对于特殊患者亦可很容易地确定使用剂量。最好每天用药1至4次，每次给予5-100mg活性化合物。本领域技术人员可以很容易地确定用本发明的化合物抑制胃酸分泌时所需要的量。

韩蛙皮素/GRP类似物在肿瘤治疗中的应用指征是用于治疗SCLC和前列腺癌，以及预防各种其它肿瘤状态。有关肿瘤治疗所需的条件是本领域内有经验的技术人员很容易了解的。本文所说的“患者”是指哺乳动物，如灵长类，包括人、羊、马、猫、猪、狗、牛、大鼠和小鼠。

本文中所说的“肿瘤组织”是指良性和恶性肿瘤或赘生物，其包括黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和肉瘤。肿瘤组织的例子有皮肤肿瘤，如恶性黑色素瘤和微菌样真菌病;血液系统肿瘤如白血病，包括急性淋巴母细胞性、急性骨髓细胞性或慢性骨髓细胞性白血病;淋巴瘤如何杰金氏病或恶性淋巴瘤;妇科肿瘤如卵巢和子宫肿瘤;泌尿系肿瘤如前列腺、膀胱或睾丸肿瘤;软组织肉瘤、骨肉瘤、非骨组织肉瘤、乳腺瘤;脑垂体、甲状腺及肾上腺皮质肿瘤;胃肠道肿瘤如食道、胃、小肠和结肠肿瘤;胰脏和肝脏肿瘤;喉乳头状瘤及肺肿瘤。

术语“控制生长”和治疗肿瘤的概念是指减慢、干扰、阻止或终止温血动物体内迅速增殖性肿瘤的生长和转移;但应明确的是，治疗温血动物肿瘤并不一定是总体上“治愈”肿瘤，后者的意义是一定使肿瘤组织破坏或全部清除掉。

当用于治疗或控制癌或肿瘤组织生长时，包括治疗或控制小细胞性肺癌或前列腺瘤，本发明之肽衍生物的适宜剂量约为每天每公斤体重0.2mg至250mg，当然实际用量还要取决于患者状态，所患小细胞肺癌的严重程度以及所选用的肽衍生物。很容易确定特殊患者的适当剂量。一般每天给药1至4次，每次给予5至100mg活性化合物。本领域技术人员可很容易地确定用于抑制SCLC生长时所需本发明之肽的量。

一般都知道，用于治疗肿瘤的治疗剂可以与其它治疗肿瘤的治疗剂或治疗方法结合使用。本发明的肽也可用于联合治疗。例如，结构1-5的肽可以与肿瘤的外科手术或放射疗法一起使用。治疗肿瘤的一个优选方式是将结构1-5的肽与已知用于治疗肿瘤的化学毒性剂一起给药。化学毒性剂的实例是环磷酰胺、氨基甲基叶酸、泼尼松，6-巯基嘌呤、甲基苄肼、danorubicin、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、6-硫代鸟嘌呤、硫代TEPA、5-氟尿嘧啶、5-氟-2-脱氧尿苷、5-氮杂胞苷、氮芥、1，3-双（2-氯乙基）-1-亚硝基脲（BCNU）、1-（2-氯乙基）-3-环己基-1-亚硝基脲（CCNU）、白消安、亚德里亚霉素、博来霉素、Vindesine、cycloeucine或丙酮醛-双（脒基腙）（MGBG）。当使用这种联合治疗法时，细胞毒性剂可发挥更好的疗效。由细胞毒性剂产生的肿瘤消退作用可得以提高，并可减缓或阻止肿瘤重新生长。因此，使用这种联合治疗法可以减少细胞毒性剂的用药剂量。术语“联合治疗”是指在开始用细胞毒性剂治疗之前直接给予结构1-5的肽，或同时给药，或终止这种治疗后立即给药。当进行这种联合治疗时，所用细胞毒性剂的剂量应是已知治疗肿瘤有效的剂量。但结构1-5的肽可与细胞毒性剂产生抗特殊肿瘤的加和或协同作用。因此当进行联合治疗时，所用细胞毒性剂的剂量可以小于单独使用时的用药剂量。与结构1-5的肽衍生物合用，细胞毒性剂的给药量和给药次数均小于单独使用细胞毒性剂时剂量和次数。同样，在进行联合治疗时，所用结构1-5之肽的剂量和给药次数也比没有细胞毒性剂时少。

虽然某些肽衍生物在口服给药后可以通过消化道吸收，但申请人优选非口服途径给药，如经过皮下，静脉内、肌肉内或腹腔内注射给药;或通过植入制剂，或经粘膜如鼻、咽喉和支气管粘膜给药，如可将本发明的肽衍生物组成气雾剂或干粉末形式的制剂。

为了经胃肠道外使用这些化合物，可将化合物加在医药上可接受稀释剂及药物载体（其为水或油等无菌液体）中，加或不加表面活性剂及其他药用佐剂，组成可注射剂量的溶液或悬浮液。用作载体的油可以是石油、动物、植物或合成来源的油制品，如花生油、大豆油和矿物油。其中用作可注射溶液的优选液体载体有水、盐水、葡萄糖和相关糖的水溶液、乙醇和甘油如丙二醇或聚乙二醇。

下列非限定性实施例在于进一步阐述本发明。

实施例1

二肽决定基A₁₃aaψ[CH₂S]A₁₄aa的制备

2-巯基-4-甲基戊酸（巯基-亮氨酸，化合物1）

D-亮氨酸（5g）和溴化钾（114g）在400ml 2.5N H₂SO₄中的溶液，于冰盐浴中冷却到-5℃。搅拌下逐滴加入NaNO₂的冷溶液（30g/70ml水，0-50C）。反应于室温下约进行14小时。然后各用75ml醚提取3次。通过无水硫酸钠干燥醚提取物。过滤溶液并蒸发除去醚。将所得澄清的油状物，2-溴-4-甲基-戊酸（Martin and Greco，（1968）J.Org.Chem.，33，1275-1276（18g）于0℃搅拌下配制成250ml 33%三硫代碳酸钠的溶液。将反应混合物搅拌48小时，然后于0℃下小心加入10NH₂SO₄使之酸化。再各用75ml醚将酸化的溶液提取三次。通过无水硫酸钠干燥醚提取物，真空除去醚，并真空蒸馏所得淡黄色油状物（17g）。（S）-2-巯基-4-甲基戊酸的最后得率为15.3g;b.p.92-93（0.75mmHg）;[α]25_D＝-23.2（Cl，Me OH）。

（S）-（叔丁氧羰基）-2-氨基-3-苯丙基-对甲苯磺酸酯

（化合物2）

题目化合物的起始试剂是由（S）-（叔丁氧羰基）-2-氨基-3-苯基丙醇（4.5g，0.0179mole;由L-苯丙氨醇（Sigma）和二叔丁碳酸氢盐制得）合成的。于无水条件下将该起始试剂加到20ml吡啶中，并在干冰/丙酮浴中冷却到-40℃。然后向混合物中加入甲苯磺酰氯（6.9g，3.6mmol）。于4℃下进行反应。没有想办法除去积聚的氯化吡啶鎓。终止反应后，真空下除去吡啶，并将所得固体物溶于乙醚中。通过无水硫酸钠干燥醚提取物、过滤并真空除去醚;产生10.5g油状物。在乙酸乙酯和己烷中沉淀油状物，得到产物的结晶;得到9.0g白色固体物;m.p.：109-110℃。

（S）-（S）-叔丁氧羰基-Pheψ[CH₂S]Leu-OH

（化合物3）

用新分割的钠和无水乙醇制备乙醇钠的0.43M溶液（溶液A）。制备（S）-2-巯基-4-甲基戊酸，即化合物1的乙醇溶液（溶液B）（在25ml中含0.72g化合物1）。于氮气环境下，向15ml溶液B中缓慢加入13.5ml溶液A。将该溶液搅拌5分钟，真空除去乙醇，并加苯反复蒸发白色固体物直至干燥。将所得的巯基亮氨酸二钠盐溶解于约1ml二甲基亚砜（DMSO）中，其中加入溶于2ml DMSO的1.58g化合物2，并搅拌过夜。反应混合物与175ml蒸馏水合并，每次用20ml乙醚提取三次，然后于0℃搅拌下用5NHCl酸化之。再用乙酸乙酯将水溶液提取3次。用饱和NaCl溶液洗提取物并通过硫酸钠干燥、过滤并真空除去乙酸乙酯即得到1.05g澄清油状物。由乙酸乙酯和己烷中将其结晶出来即得到一种白色固体物（0.83g）;m.p.110-111℃;[α]25_D＝52.5（C0.881，Me OH）。

[Pheψ[CH₂S]Leu₁₄]韩蛙皮素（化合物4）

在20ml二氯甲烷：DMF（9∶1，v/v）中合并化合物3、二环己基碳化二亚胺（0.113g）、羟基苯并三唑（0.074g）和MBHA（0.414g），将化合物3（0.20g）酰化到4-甲基二苯甲基胺（MBHA）树脂上。按照文献中所述方法于半自动式Vega固相肽合成仪上偶联化合物3。2小时后用茚三酮监测反应。用DMF和乙醇洗所得的Boc-Pheψ[CH₂S]Leu MBHA树脂酰胺并干燥之，得到相当于取代水平为0.53mmol/g树脂的0.498g产物。使用厂商推荐的或本领域技术人员已知的标准方法，在Applied Biosystems肽合成仪上进行固相肽合成以延长氨基酸序列。

在茴香醚（乙二硫醇，1ml∶5mg树脂）存在下，使用氟化氢（10ml/g树脂）由树脂上裂解同树脂结合的肽（得率0.712g），裂解1小时。然后除去氟化氢（HF），搅拌树脂，用乙醚提取（2×30ml），再用30%乙酸提取。冻干后得到250mg粗制品。用C18 Dynamax层析柱，以制备性反相高效液相层析法纯化部分产物（400mg），并使用流动相梯度洗脱（15分钟，20-30%乙腈梯度[40ml/分钟][根据乙腈存量确定]和0.1%TFA[在水中]）。监测该化合物在A₂₁₄处的吸光率，四管主峰部分。

经FAB-MS检测表明用该方法得到的肽产生预期的分子离子峰，且氨基酸分析结果也与所需肽相符。以这种方法制得具有所述特性的下列肽。

1）pGlu Gln Arg Leu Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Pheψ[CH₂S]Leu-NH₂

MW 1637，FAB-MS（MH）⁺1638tR

肽含量55%

2）Ac-D-Phe Gln Trp Ala Val D-Ala His Pheψ[CH₂S]Leu-NH₂

MW 1160，FAB-MS（MH）⁺1161tR

肽含量89%

3）Asn Gln Trp Ala Val Gly His

Pheψ[CH₂S]Leu-NH₂

MW 1089，FAB-MS（MH）⁺1090tR

肽含量52%

4）Asn Gln Trp Ala Val Gly His

Pheψ[CH₂S（O）]Leu-NH₂

MW 1072，FAB-MS（MH）⁺1073tR

肽含量50%

5）pGlu Gln Trp Ala Val Gly His

Pheψ[CH₂S（O）]Leu-NH₂

MW 1069，FAB-MS（MH）⁺1070tR

肽含量80%

6）pGlu Gln Trp Ala Val Gly His

Phe[CH₂S]Nle-NH₂

MW 1069，FAB-MS（MH）⁺1070tR

实施例2

亚甲基亚砜异构体：[Phe13ψ[CH S（O）]Leu]利托灵和[Phe13ψ[CH₂S（O）]Leu14]利托灵

在HPLC洗脱溶剂（0.1%TFA：乙腈，75∶25，v/v）中制备3ml[Phe8[CH₂S]Leu9]利托灵（20mg）溶液。向该样品溶液内加入0.25ml过氧化氢的5%溶液。样品于0℃下放置2小时，之后注射到制备性反相层析系统上（C18 Dynamax 300A°柱）。根据高压液相层析（HPLC）出现两个滞留时间明显早于含CH₂S肽的接近洗脱峰，来监测该肽氧化成了它们非对映亚甲基亚砜。然后用反相HPLC法分离并纯化亚甲基亚砜。Pheψ[CH₂S（O）]^ⅠLeu利托灵和Pheψ[CH₂S（O）]^Ⅱ利托灵是基于它们的反相HPLC滞留时间而定名的。

经FAB-MS分析，用该方法得到的肽有预期的分子离子峰，且经氨基酸分析证明与所需肽相符。以这种方法制得有所述性质的下列肽。

7）pGlu Gln Trp Ala Val Gly His Pheψ[CH₂S（O）]^ⅠLeu-NH₂

MW 1085，FAB-MS（MH）⁺1086tR

肽含量55%

滞留时间5.40分钟＊

8）pGlu Gln Trp Ala Val Gly His Pheψ[CH₂S（O）]^ⅡLeu-NH₂

MW 1085，FAB-MS（MH）⁺1086tR

肽含量63%

滞留时间6.28分钟＊

＊基于在Vydac分析柱上的滞留计出滞留时间，

柱：4.6mm ID×25cm，5微米C18;流速2ml/分;洗脱25分钟以上，使用在含有0.1%三氟乙酸的水中的25-75%乙腈线性梯度。

实施例3

根据受体竞争碘化的GRP而证明的韩蛙皮素受体

（Phe13ψ[CH₂S]Leu₁₄）韩蛙皮素拮抗作用

收集一个或多个小鼠的胰组织，破碎后在含有120mM NaCl和5mM KCl的50mM HEPES（pH7.4）中4℃下制成匀浆，并以37，500g离心15分钟。将离心沉淀物重新悬浮于含10mM EDTA和300mM KCl的50mM HEPES（pH7.4）中，并于4℃下保温30分钟。按上述条件离心悬浮液，并在含有蛋白酶抑制剂（10μM苯基甲基磺酰氟、1μM四氢噻吩、40μg/ml杆菌肽、10mM碘乙酰亚胺和4μg/ml亮肽素）的50mMHEPES（pH7.4）中将沉淀物洗两次，然后再次离心。将该组织重新悬浮于保温缓冲液（每4mg胰组织1ml）中并于室温下保温15分钟，然后向各检测管内加入250μl以进行检测。检测管内含有由50mM HEPES（pH7.4）、0.5%BSA、蛋白酶抑制剂、2mM Mn Cl₂、1μM生长激素抑制素组成的保温缓冲液、及不同浓度的¹²⁵I-GRP和肽，终体积为500μl。检测于室温下进行90分钟。之后在预浸有0.1%聚乙烯亚胺的Whatman GF/B滤纸上迅速过滤各管内容物，并将滤纸迅速用冰冷的50mM HEPES（pH7.4）洗三次。在γ计数器中定量与滤纸结合的放射性。试验化合物或标准品对碘化GRP结合的竞争用在没有肽的情况下I-GRP结合的百分比表示。用Ligand法（Biosoft，Cambridge，UK）计算亲和力及最大结合率（图1和图2）。

实施例4

根据对磷脂酰肌醇更新的效应证明的韩蛙皮素受体

（Phe13ψ[CH₂S]Leu14]韩蛙皮素拮抗作用

收集小鼠的胰组织并在组织破碎器内破碎成350μm。破碎的用Krebs-Hepes洗两次，然后在37℃Krebs-Hepes缓冲液中保温30分钟，其间于15分钟后换新鲜缓冲液。再在含有100-200μ Ci³H-肌醇的该种缓冲液内37℃下保温1小时。然后将组织洗两次，并在Krebs-Hepes（含有10mM Li⁺）中37℃继续保温30分钟，同样于保温15分钟后换新鲜缓冲液。将一部分组织团块（每检测管约10mg）放在含蛋白酶抑制剂（40μg/ml杆菌肽、4μg/ml亮肽素、4μg抑凝乳蛋白酶素、20μg/ml四氢噻吩）、0.1%BSA的Li⁺缓冲液中，然后加入0.1-1000nM肽（25μl），终体积为250μl。为了检测拮抗作用，在加入兴奋剂（GRP）之前用1μM潜在拮抗剂将存在于Li⁺缓冲液中的部分组织预处理5分钟（25℃）。室温下60分钟后，加入940μl氯仿∶甲醇（1∶2）、然后加入310μl氯仿、再加入310μl水，以终止磷脂酰肌醇更新。将各管旋转5秒种，之后以2500g离心8分钟以分离各相。将900μl上层相（水相）与2.1ml水混合，并加于0.5ml Biorad AG-Ⅸ8（甲酸）离子交换柱上。由各管抽出50μl底层相（氯仿）并置于计数管中，干燥，并作液闪计数。以下列次序洗柱上的物料：1）10ml水，2）5ml 5mM四硼酸二钠/60mM甲酸钠，3）10ml 1M甲酸铵（在0.1M甲酸中）。收集最后一次（第三次）的洗出物，取其1ml与10ml Bio-Safe闪烁液混合并计数。然后计算各样品上述计数（总磷酸肌醇酯）对相应有机相计数的比例。将存在试验化合物和/或标准品时的比例与对照管（即没有兴奋剂者）的上述比例相比较。建立剂量-反应曲线，根据图形分析或借助计算机程序确定试验化合物刺激或抑制GRP诱导之磷脂酰肌醇更新的能力，有关附图见图3和4。

图1图解显示¹²⁵I-GRP在单一类位点，即小鼠胰细胞膜上之韩蛙皮素/GRP受体的结合。重复三份样品测得有25-1600pM¹²⁵I-GRP结合，然后进行分析并作图（LIGAND）。这些数据的最好计算机处理结果是每份样品19pM受体（每毫克膜蛋白约100fmol受体），Kd值为47pM。横标（X轴）指示与受体结合之¹²⁵I-GRP的浓度;纵标（Y轴）指示与受体结合之¹²⁵I-GRP的浓度除以游离的（未结合的）¹²⁵I-GRP的浓度。直线标示单一类位点;即对其各受体来说，¹²⁵I-GRP均有同样的亲和力。使25-3200pM¹²⁵I-GRP或10pM¹²⁵I-GRP±8-500pMGRP所作的其它实验也显示相似的Kd。此表明可通过竞争¹²⁵I-GRP与小鼠胰细胞膜的结合来检测对韩蛙皮素/GRP受体的结合。

图2显示韩蛙皮素类似物结合GRP受体的能力，是根据这些肽竞争¹²⁵I-GRP对小鼠胰细胞膜的结合之能力而证明的（实施例1）。使用0.1nM¹²⁵I-GRP和图中指明的不同浓度的肽重复三份来检测结合能力。横标（X轴）以对数形式指示GRP受体兴奋剂或拮抗剂的浓度。纵标（Y轴）指示根据最大¹²⁵I-GRP结合（不存在肽）的百分比测得的对各被试肽的结合。对这一结果及其它实验结果的LIGAND分析可确定韩蛙皮素和（Phe13Leu14）韩蛙皮素的Kd均为0.1nM;（Phe13ψ[CH₂S]Leu14）韩蛙皮素的Kd则为3nM。

图中：-○-韩蛙皮素

-□-（Phe13Leu14）韩蛙皮素

-△-（Phe13ψ（CH₂S）Leu14）韩蛙皮素

图3显示GRP（但不是（Phe13ψ（CH₂S）Leu14）韩蛙皮素）以剂量依赖性方式刺激磷脂酰肌醇（PI）更新的能力。横标（X轴）以指数形式显示肽的浓度。纵标（Y轴）指示所观察到的PI更新占对照组百分比率。数值均为三次重复测定的平均值±标准差，其中没有显示出小于或等于数值点之大小的误差。当（Phe13ψ[CH₂S]Leu14）韩蛙皮素浓度比几乎可导致最大刺激作用的GRP的量大3个数量级时，对PI更新也没有作用，此表明这种肽没有兴奋剂活性。

图中-○-为GRP

-△-为（Phe13ψ[CH₂S]Leu14）韩蛙皮素

图4显示（Phe13ψ[CH₂S]Leu14）韩蛙皮素拮抗GRP诱导的小鼠胰组织中PI更新的能力。横标（X轴）以指数标示所存在的肽的浓度。纵标（Y轴）指示所观察到的PI更新占对照组的百分率。与单用GRP相比，用1000nM（Phe13ψ[CH₂S]Leu14）韩蛙皮素预保温30分钟，可降低由1-1000nM GRP引起的对PI更新的刺激作用。所给数据为三次测定的均值±标准差;其中没示出小于或等于数据点之大小的误差。（Phe13ψ[CH₂S]Leu14）韩蛙皮素抑制GRP之作用的能力，表明它确实是拮抗剂。

-○-代表只有GRP

-△-代表与（Peh13ψ[CH₂S]Leu14）韩蛙皮素预保温后再加GRP

图5显示使用C18固定相（Vydac分析柱;4.6mm ID×25cm，5微米C18），以反相HPLC分离亚甲基亚砜。泵驱动的流动相流速为2ml/分钟，洗脱用含0.1%三氟乙酸的25-75%乙腈水溶液的线性梯度，洗脱25分钟以上。Pheψ[CH₂S（O）]Leu利托灵和Pheψ[CH₂S（O）]^ⅡLeu利托灵的滞留时间分别为5.40分钟和6.28分钟。反应起始材料[Phe8[CH₂S]Leu9]利托灵在HPLC系统中的滞留时间为10.92分钟。

表1中比较了前述涉及几种韩蛙皮素类似物之受体亲和力（Kd）和PI更新实验的结果。

表1

几种肽类似物的亲和力和效能

PI更新

序列 Kd(nM) 兴奋剂拮抗剂

pQ Q R L G N Q W A V G H Fψ[CH₂S]L# 3 - +

pQ Q W A V G H Fψ[CH2S]L# 3 +

Acf Q W A V G H Fψ [CH₂S]L# 10 - +

N Q W A V G H Fψ[CH₂S]L# 50 ND ND

N Q W A V G H Fψ[CH₂S(O)]L# 100 ND ND

pQ Q W A V G H Fψ[CH₂S]Z# 4 ND ND

pQ Q W A V G H Fψ[CH₂S(O)]^IL# 2 - +

pQ Q W A V G H Fψ[CH₂S(O)]^IIL# 1 - +

Kd按实施例1所述测定，PI更新按实施例2所述测定。“+”表示有活性，“-”表示无活性，ND表示活性不确定。兴奋剂活性是刺激PI更新的能力，拮抗剂活性是阻断GRP刺激的PI更新的能力。Ac，乙酰;PQ，焦谷氨酰胺;Q，谷氨酰胺;A，丙氨酸;R，精氨酸;N，天冬氨酸;C，半胱氨酸;E，谷氨酸;G，甘氨酸;H，组氨酸;I，异亮氨酸;L，亮氨酸;K，赖氨酸;M，蛋氨酸;F，苯丙氨酸;P，脯氨酸;S，丝氨酸;T，苏氨酸;W，色氨酸;Y，酪氨酸;V，缬氨酸;上框，L-氨基酸;下框，D-氨基酸;Z，正亮氨酸;＃，酰胺键;ψ[CH₂S]有一个CH₂S氨基酸间键;[CH₂S（O）]有一个CH₂S（O）氨基酸间键，右上肩的Ⅰ和Ⅱ是指CH₂S（O）的不同异构体。

Claims

1、有下列通式的肽衍生物及其医药上可接受的盐：

X是选自氢、一个或两个有1至10个碳原子的烷基基团、一个或两个有2至10个碳原子的酰基基团、苄氧羰基或叔丁氧基羰基的氨基末端残基，除非氨基末端氨基酸是环状衍生物并因而删去X，

N是韩蛙皮素、GRP的序列，或这些序列之一的天然变异体或其部分、键、或含有1至11个任何氨基酸残基的肽；除非氨基末端氨基酸是环状衍生物并因而删去N，

A₁是Glp，或适当的酸性亲水残基；

A₂是Gln，适当的中性或疏水残基，Nle、α-氨基丁酸、pSubPhe、BNap，或键；

A₃是Arg、适当的碱性亲水残基，或键；

A₄是Leu、或与A₂相同者；

A₅是Gly、与A₂相同者、D-Phe、或D-Ala；

A₆是Asn、与A₂相同者、D-Ala、pGlu、Lys、Lys(Z)、SubPhe，或D-Phe；

A₇是Gln、His、适当的中性、疏水、或碱性亲水残基，αNap、D-His、MeHis、His(τ-Me)、His(π-Me)、D-Glu(OMe)、D-Glp、D-Leu、MeLeu、D-Phe，或Glu；

A₈是Trp、适当的中性残基、或Met、MeTrp、SubPhe、Lys、Cha、或Lys(Z(2Cl)；

A₉是Ala、与A₂相同者、MeAla、Aib、D-Phe、L-Nal、Arg、或Glu；

A₁₀是Val、与A₂相同者、MeVal、Thr(CH₂Ph)、或DL-Flg；

A₁₁是Gly、适当的中性残基、Phe、D-Phe、Sar、D-Ala、D-Ser、D-Ser(CH₂Ph)、SubPhe、D-Pro、D-Lys、Asp、D-Arg、D-Lys(Z(2Cl)、Ac3c、Ac5c、或Ac6c；

A₁₂是His、适当的中性或碱性亲水残基、Tyr、D-Phe、pSubPhe、His、MeHis、His(τ-Me)、His(π-MeOH)、D-pcF、Aib、Ahx、Ape、Gln、Lys、Lys(Z)、Ser、Ser(CH₂Ph)、Thr、Glu、Asp、Asp(OBut)、或N-Nal；

A₁₃是Leu、Phe、适当的疏水或中性残基、Ahx、MeAhx、Ape、Me Ape、D-Leu、Me Leu、Me Ile、Me Val，或Glu；

ψ是A₁₃aa ΨA14aa的二肽决定基，其中ψ代表[CH₂S]、[CH₂S(O)]、[CH₂S(O)]^Ⅰ和[CH₂S(O)]^Ⅱ，且A13aa和A14aa代表取代基氨基酸，Aaa为取代基氨基酸；

A₁₄是Leu、Met、Nle、适当的疏水或中性残基、Ahx、Me Ahx、Ape、Me Ape、D-Leu、Me Leu、Me Ile、Me Val、或Glu；

C是韩蛙皮素、GRP的序列，或其天然变异体或部分、键、或者是含有1至11个任何氨基酸的肽；且

Y是选自OH、(C₁-C₈)烷氧基酯、羧酰胺、一或二(C₁-C₄)烷基酰胺、(C₁-C₄)烷基胺、(C₁-C₄)硫代烷基醚的羧基末端残基。

2、有下列通式的肽衍生物或其医药上可接受的盐：

A₁是pGlu，或适当的酸性亲水残基;

A₃是Arg、适当的碱性亲水残基，或键;

A₄是Leu、或与A₂相同者;

A₅是Gly、与A₂相同者、D-Phe、或D-Ala;

A₆是Asn、与A₂相同者、D-Ala、NAc-D-Ala、pGlu、或D-Phe;

A₇是Gln、His、适当的中性、疏水、或碱性亲水残基，αNap、或D-Gln;

A₈是Trp、适当的中性残基、或Met;

A₉是Ala、或者是与A₂相同;

A₁₀是Val、或者是与A₂相同;

A₁₁是Gly、适当的中性残基、Phe、或D-Phe、D-Ala;

A₁₂是His、适当的中性或碱性亲水残基、Tyr、D-Phe、或pXphe·（X＝F、Cl、Br、OH或CH₃）;

A₁₃是Leu、Phe、Nle、或适当的疏水或中性残基;

ψ是A₁₃aaψA₁₄aa的二肽决定基，其中ψ是[CH₂S]、[CH₂S（O）]、[CH₂S（O）]^Ⅰ和[CH₂S（O）]^Ⅱ，且A₁₃aa和A₁₄aa代表取代基氨基酸;

A₁₄是Leu、Met、或适当的疏水或中性残基;

Y是选自OH、（C₁-C₈）烷氧基酯、羧酰胺、一或二（C₁-C₄）烷基酰胺、（C₁-C₄）烷基胺、（C₁-C₄）硫代烷基醚的羧基末端残基。

3、有下列通式的肽衍生物或其医药上可接受的盐;

A₁是pGlu，是一个键，

A₂是Gln，是一个键，

A₃是Arg、是一个键，

A₄是Leu、是一个键，

A₅是Gly、是一个键，

A₆是Asn或D-Phe，

A₇是Gln或His，

A₈是Trp，

A₉是Ala，

A₁₀是Val，

A₁₁是Gly或D-Ala，

A₁₂是His，

A₁₃是Phe，

ψ是X xx ψXx的二肽决定基，其中ψ是[CH₂S]、ψ[CH₂S（O）]^Ⅰ和ψ[CH₂S（O）]^Ⅱ，且A₁₃aa和A₁₄aa代表取代基氨基酸;

A₁₄是Leu或Nle，

Y是选自OH、（C₁-C₈）烷氧基酯、氨基、一或二（C₁-C₄）烷基酰胺、（C₁-C₄）烷基胺、（C₁-C₄）硫代烷基醚的羧基末端残基。

4、根据权利要求1-3中任一项的肽，其中该肽是pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Pheψ[CH₂S]Leu-NH₂。

5、根据权利要求1-3中任一项的肽，其中该肽是Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Pheψ[CH₂S]Leu-NH₂。

6、根据权利要求1-3中任一项的肽，其中该肽是Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Pheψ[CH₂S]Leu-NH₂。

7、根据权利要求1-3中任一项的肽，其中该肽是Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Pheψ[CH₂S（O）]Leu-NH₂。

8、根据权利要求1-3中任一项的肽，其中该肽是pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Pheψ[CH₂S（O）]Leu-NH₂。

9、根据权利要求1-3中任一项的肽，其中该肽是pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Pheψ[CH₂S]Nle-NH₂。

10、根据权利要求1-3中任一项的肽，其中该肽是pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Pheψ[CH₂S（O）]^ⅠLeu-NH₂。

11、根据权利要求1-3中任一项的肽，其中该肽是pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Pheψ[CH₂S（O）]^ⅡLeu-NH₂。

12、根据权利要求1的肽，其可以是医药上可接受的盐或利用了医药上可接受的载体的药物组合物。

13、治疗患者肿瘤，包括小细胞性肺癌和前列腺癌的方法，该方法包括给患者使用有效量的根据权利要求1-3中任一项的肽。

14、控制患者体内肿瘤组织生长的方法，该方法包括给患者使用有效量的根据权利要求1-3中任一项的肽。

15、治疗患者消化性溃疡病的方法，该方法包括给患者使用治疗有效量的根据权利要求1-3中任一项的肽。

16、拮抗患者体内韩蛙皮素/GRP的方法，该方法包括给患者使用有效量的根据权利要求1-3中任一项的肽衍生物。

17、制备根据权利要求1至11中任一项的肽衍生物或其医药上可接受的盐的方法，该方法包括步骤：

a）使用带有适当地结合了C末端被保护的二肽的树脂，所说的二肽来自A₁₃ψA₁₄，其中ψ是[CH₂S]，且A₁₃和A₁₄代表取代基氨基酸;

b）然后偶联其它α氨基被保护的氨基酸，A₁₂至X，以得到权利要求的被保护的氨基酸序列;

c）除去所说的保护基团;

d）纯化所需的肽，或根据需要生成所说的ψ[CH₂S]肽的ψ[CH₂S（O）]^Ⅰ和ψ[CH₂S（O）]^Ⅱ异构体，然后再纯化所需的异构体肽。

18、根据权利要求1至11中任一项的肽衍生物或其医药上可接受的盐或其混合物用作为医药活性物质。

19、根据权利要求1至11中任何一项的肽衍生物或其医药上可接受的盐或其混合物用于治疗肿瘤，包括小细胞性肺癌和前列腺癌。

20、根据权利要求1至11中任一项的肽衍生物或其医药上可接受的盐或其混合物用于治疗消化性溃疡。

21、根据权利要求1至11中任一项的肽衍生物或其医药上可接受的盐或其混合物作为韩蛙皮素/GRP拮抗剂用于治疗。