PT95953A - Processo para a preparacao de derivados peptidicos e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents
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Description
MERRELL DOW PHARMACEUTICALS, INC.
"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS PEPTÍDICOS
E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM"
ÂMBITO DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novos antimitóticos e péptidos anti-secretores que sao antagonistas dos péptidos aparentados a Bombesina e o Péptido de Libertação da Gastrina, que sao úteis para o controlo: 1) do crescimento dos carcinomas de células pequenas do pulmão e da próstata e 2) de secre çoes ácidas ou gástricas causadoras e sintomáticas de úlceras peptídicas (esofágicas, gástricas e duodenais).
ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO A bombesina é um péptido de 14 aminoácidos, original, mente isolado a partir da pele dos.sapos Bombina bombina♦ Sabe. -se que a bombesina tem uma gama de efeitos que incluem a indução da secreção gástrica e pancreática, a estimulação do sijs tema nervoso, indução da actividade mioeléctrica e contráctil dos miócitos intestinais, redução do fluxo sanguíneo renal, se creçao de hormonas pituitárias e promoção do crescimento. 0 Péptido de Libertação da Gastrina (GRP) , um pépti. do de 27 aminoácidos, isolou-se, por último nos mamíferos e des. cobriu-se que tem uma extremidade carboxi idêntica a extremi- -2- dade carboxi da bombesina, com propriedades análogas. Para além disto, o péptido de libertação de gastrina e a bombesina estr_u turalmente relacionada, demonstraram competir na ligação aos re ceptores de alta afinidade nas células dos carcinomas de células pequenas do pulmão (SCLC) e nas células endoteliais pros-táticas. A ligaçao de qualquer destes factores de crescimento origina uma absorçao mensurável de [ J-timidina e crescimejn to clonal.
Diversos estudos implicaram os factores do crescimento celular no crescimento das células tumorais por activa-çao dos receptores do factor do crescimento. Deste ponto de vista, a Bombesina/GRP e a activaçao dos receptores estão relacionadas com outros factores do crescimento e oncogenes bem conhecidos. Tem existido um grande interesse na concepção e de senvolvimento de antagonistas competitivos do receptor da bom besina, como possíveis agentes anti-mitóticos, visto que se descobriu que esses péptidos, bombesina e GRP, actuam como fac_ tores de crescimento autocráticos potentes em sistemas de car. cinomas de células pequenas do pulmão e, possivelmente, em sis temas de carcinomas prostáticos. 0 melhor suporte para esta a-bordagem deriva dos ensaios em que se utilizam anticorpos mono clonais anti-bombesina para impedir a ligaçao aos seus receptores e despoletar uma resposta mitogénica. Os ensaios em que se utilizam anticorpos monoclonais antipeptidicos revelaram a inibição do crescimento dos clones das células SCLC, in vitro e em xeno-enxertos de ratos nus iii vivo. A resposta mitogénica inicia-se com a produção de sinais intracelulares pelo coin plexo ligando-receptor. Para GRP/bombesina, isto inclui a ac- -3’
tivaçao de uma proteína G, que, por sua vez, activa a fosfoli^ pase C. (PLC). A PLC converte o fosfato de fosfatidilinositol (PI) em 1,4,5-trifosfato de inositol (IP^) e diacilgliceral (DAG). Crê-se que IP^ e DAG se jam sinais intracelulares de ac tivaçao do ciclo do receptor de GRP/bombesina.
Após ter-se confirmado a existência dos receptores celulares de Bombesina/GRP nas células SCLC, também se descobriu que os receptores se encontravam presentes nas células prostáticas dos seres humanos. Estudos subsequentes também coa firmaram os efeitos do crescimento de bombesina/GRP sobre as células epiteliais prostáticas, in vitro, utilizando anticorpos bombesina/GRP. Para além disto, os estudos de proliferação celular de PC3 (uma linha de células de carcinoma prostático de seres humanos) e de PMU23 (uma linha de células epiteliais de uma cultura primária de um carcinoma da próstata de Grau III) demonstraram uma curva de crescimento de Bombesina/GRP dependente da dose. Estes dados sugerem que pode existir um incremento autocrático ou paracrático do crescimento das células tu morais da glândula prostática. Por esse motivo, a interrupção do efeito de GRP/bombesina pode ser útil no tratamento da pr_o gressão de cancros prostáticos onde esses factores actuam como agentes mitóticos autocráticos ou paracráticos. A bombesina e GRP são também capazes de induzir as secreções gástrica e pancreãtica e têm receptores saturáveis, susceptíveis de serem demonstrados sobre células de origem pari creática (Células B) e intestinais (células C) e, por isso, ari tagonistas desses receptores podem servir no tratamento de úl_ ceras pépticas e de- distúrbios pancreáticos e intestinais e
podem extender-se aos adenocarcinomas destes tecidos.
Estudos com anticorpos anti-bombesina/GRP conduzem á hipótese de que pode ser possível efectuar a ruptura do ciclo de crescimento autocrático de bombesina/GRP utilizando antago_ nistas dos receptores peptídicos concebidos. A partir daí têm sido referidos diversos tipos de antagonistas da bombesina. Têm-se definido estes antagonistas pelo tipo e posição de subs^ tituiçoes da sequência natural. Os primeiros antagonistas dos receptores enfermavam de baixa potência, falta de especificidade e de toxicidade que constituíam problemas graves no que se refere à sua utilização científica e terapêutica. 0 trabalho mais recente concentrou-se na modificação da região carboxi terminal (C-terminal) destes péptidos para interromper a interacção do receptor utilizando uma diversida_ de de diferentes tipos de análogos C-terminais modificados. Es. tes incluíam a incorporação de aminoácidos D, de ligações nao peptídicas, como, por exemplo ("ψ [CE^NH J ), modificações de és_ teres e de amidas. Estas alterações originam determinados pépti. dos que possuem características aperfeiçoadas. A Requerente preparou análogos peptídicos de cadeia linear de bombesina natural, contendo uma ligaçao nao peptídi_ ca entre os aminoácidos 13 e 14, constituída por um grupo tio^ metileno 0p1ch2s]) para aumentar a flexibilidade conformacx£ nal da ligação, e, portanto, aumentar a flexibilidade confor-macional global do péptido. A requerente preparou, também pépti. dos que continham o sulfóxido de metileno correspondente 0Ψ[ CH^S(0) ]]) , efectuando a oxidaçao adequada do grupo tiome. tileno. A oxidaçao-do grupo tiometileno em sulfóxido de meti-
leno proporcionou dois isómeros. A Requerente separou fisicamente os isómeros do péptido do sulfóxido de metileno, designados por ('ÇrCCH2S(0) J1) e (T3/[CH2S(0)] e ensaiou esses compostos em ensaios adequados. A Requerente demonstrou que os análogos dos compostos tiometileno e sulfóxido de metileno da bombesina sao antagonistas, in vitro, da molécula natural: (1) actuando como inibidores competitivos da ligação ao rece£ tor e (2) antagonizando as acçoes biológicas do péptido que l_i bertam a gastrina. Os antagonistas peptídicos da presente invenção possuem uma actividade potencial antimitótica, signifi. cativa e/ou uma actividade potencialmente anti-secretora significativa. Podendo, por esse motivo, apresentar interesse sob o ponto de vista científico e terapêutico como adjuvantes da terapia do cancro e do tratamento de ulceras.
Para além disso, a presença de uma função sulfóxido de metileno ou tiometileno pode proporcionar um incremento na potência e prolongar a duração de acçao. RESUMO DA PRESENTE INVENÇÃO Reivindicam-se os derivados peptídicos de fórmula geral χ-ν-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-α13-'Ψ'-α14-ο-υ na qual o simbolo X representa um resíduo amino-te_r minai seleccionado entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, um ou dois grupos acilo com 2 a 10 átomos de carbono, grupos carboxibenziloxi ou _t-butiloxicarbonilo; a menos que o aminoácido rivado cíclico e então o amino-terminal seja símbolo X é omitido
um de- N representa uma sequência de Bombesina, GRP ou uma variante natural ou uma porção de uma destas sequêii cias, uma ligaçao, ou um péptido que contém 1 a 11 resíduos de qualquer aminoácido; a menos que o aminoácido terminal seja um derivado cíclico e, então, N é omitido; representa Glp ou um resíduo hidrófilo ácido ade_ quado; A2 representa Gin, um resíduo neutro ou hidrófilo adequado, Nle, acido o(-aminobutírico, pSubPhe, BNap , ou uma ligaçao; A^ representa Arg, um resíduo hidrófilo básico ade. quado, ou uma ligaçao; A^ representa Leu ou representa o mesmo que o símbolo Agj Α^ representa Gly, o mesmo que o símbolo Ag, D-Phe ou D-Ala;
Ag representa Asn, o mesmo que o símbolo Ag, D-Ala, pGlu, Lys, Lys(Z), SubPhe ou D-Phe;
Ay representa Gin, His, um resíduo neutro, hidrófo_ bo ou hidrófilo básico adequados, Q( Nap, D-His,MeHis, HisCX-Me), HisflT-Me), D-Glu(OMe), D-Glp, D-Leu, MeLeu, D-Phe ou Glu;
Ag representa Trp, um residuo neutro adequado ou Met, MeTrp, SubPhe, Lys, Cha ou Lys(Z(2Cl));
Ag representa Ala, o mesmo que o símbolo Ag, MeAla, Aib, D-Phe, L-Nal, Arg ou Glu; A^q representa Vai, o mesmo que o símbolo Ag, MeVal, Thr(CH2Ph) ou DL-Flg; A^ representa Gly, um resíduo neutro adequado, Phe, D- Phe, Sar, D-Ala, D-Ser, D-Ser(CHgPh), SubPhe, D-Pro, D-Lys, Asp, D-Arg, D-Lys(Z(2C1) ) , Ac^c, AC~*c ou AC^c; A^2 representa His, um resíduo neutro adequado ou um resíduo hidrofílico básico adequado, Tyr, D-Phe, pSubPhe, His, MeHis, His("£-Me), His (Jf -MeOH) , D-pcF, Aib, Ahx, Ape, Gin, Lys, Lys(Z), Ser, Ser(CH2Ph),
Thr, Glu, Asp, AspCOBu1") ou N-Nal; A^g representa Leu, Phe, um resíduo hidrófobo ou neju tro adequado, Ahx, MeAhx, Ape, MeApe, D-Leu, MeLeu, Melle, MeVal ou Glu; o simbolo "Ç* representa um determinante dipeptídico de A-j^g aa ~ψ A^aa em que "ψ" representa ([CHgS]],
Cch2s(0) ι.γι CH2S(0) f e r [^CHgSO]]'^, em que A^aa e A-^aa designam os aminoácidos substituintes; A^ representa Leu, Met, Nle, um resíduo hidrófobo ou neutro adequado, Ahx, MeAhx, Ape, MeApe, D-Leu, MeLeu, Melle, MeVal ou Glu;
C representa uma sequência de bombesina, GRP ou uma sua variante natural ou uma sua porção, uma ligaçao ou um péptido que contém 1 a 11 resíduos de qualquer aminoácido; e Y representa um resíduo carboxi terminal seleccio-nado entre OH, éster alcoxi C^-Cg, carboxamida, mono ou d.i alquil(C^-C^)-amida , alquil(C^-C^)-amina , éter tioalquílico C^-C^; ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
' DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO
Ao longo da presente especificação utilizam-se as se guintes abreviaturas usuais de 1) aminoácidos e as suas três letras de código, 2) aminoácidos modificados e nao usuais e 3) substituintes amino e carboxi terminais:
(D: AMINOÁCIDOS E SUAS TRÊS LETRAS DE CÓDIGO L-AMINOÃCIDOS D-AMINOÁCIDOS Ala - alanina D-Ala - D-alanina Arg - arginina D-Arg - D-arginina Asn - asparagina D-Asn - ácido D-asparagí- nico Cys - cisteína D-Cys - D-cisteína Gly - glicina Glu - ácido glutâmico D-Glu - ácido D-glutâmico Vai - valina D-Val - D-valina Gin - glutamina D-Gln - D-glutamina H·» -¾
His - histidina D-His - D- -histidina Ile - isoleucina D-Ile - D- -isoleucina Leu - leucina D-Leu - D· -leucina Lys - lisina D-Lys - D- -lisina Phe - fenilalanin a D-Phe - D- -fenilalanina Met - metionina D-Met - D- -metionina Pr o - prolina D-Pro - D· -prolina Ser - serina D-Ser - D· -serina Thr - treonina D-Thr - D- -treonina Trp - triptofano D-Trp - D· -triptofano Tyr - tirosina D-Tyr - D· -tirosina (2) : AMINOÂCIDOS MODIFICADOS NÃO USUAIS Ac3c - ácido 1-amino-l-ciclopr opai nocarboxílico Ac5c - ácido 1-amino-l—cilcope inta: nocarboxilico Ac6c - ácido 1-amino-l-cilco-b lexanocarboxxlico Asp(OtBu) - ácido 0-t_-butil-aspárti .co Aba - ácido OC-amino-n-butíric .0 Ahx - ácido (2S)-2-amino-hexanóii co (norleucina Ape - ácido (2S)-2-aminopentanóii co (norvalina) Cha · - ciclo -hexilalanina Chg - ciclo -hexilglicina Cin - cinamoílo Deh - (2,3- dietilguanidio)homoar; ginina DhCin - 3,4-d i-hidrocinamoilo Hse - homo- serina-lactona Mis(tf -Me) - N^-rae ítil-histidina MisCC -Me) - N -metil-histidina -10- li, -10- li, Hyp pGlu Glu(OMe) I-Tyr Lys(Z) Lys(ZCl) MeLys MeLeu MeHis MeTrp MeAla MeVal MeAhx MeApe Melle MePhe MePgl Npa DhPro Nle Or n Pip Pba pSubPhe hidroxiprolina - ácido piroglutâmico - ácido gama-metil-D-glutâmico - 3-iodotirosina, 5-iodotirosina, 3,5- di-iodotirosina - benziloxicarbonil-lisina - p-clorobenziloxi-lisina - N-metil-lisina - N-metil-leucina - N-metil-histidina - N-metil-triptofano - N-metil-alanina - N-metil-valina - ácido N^metil-(2S)-2-amino-hexanóico - acido N-metil(2S)-2-aminopentanoico - N-metil-isoleucina - N-metil-fenilalanina - N-raetilfenilglicina - |3-(naftil)alanina - 3,4-di-hidroprolina - norleucina - or niti na - Pi peco lato - ác ido p-amin ofenil butírico - f e nila lanina para substituí da, pCIPhe - para -cloro -fenilalanina, pBrPhe - - para -bromo -fenilalanina, pFlPhe - - para -fluor o-fenilalanina, pN02Phe - - para -nitro -fenilalanina, pOHPhe- - para -hidro xi fenilalanina -1/-
Pgl fenilglicina Ser (CH2Ph) - benzil-serina Sar - sarcosina-(N-metilglicina) SubPhe fenilalanina orto, meta ou para, mono ou dissubstituída Tha -(2-tienil)-alanina Thr(CH2Ph) - - benzil-treonina Trp(CH2Ph) - - benzil-triptofano Tiq 3-Carboxilato de Tetra-hidroisoquinolina
SUBSTITUINTES ÁCIDOS AMINO E CARBOXI TERMINAIS
Ac acetilo Azt azetidina-2-carboxilato Cin - cinamoílo DhCin 3,4-di-hidrocinamoílo Glt glutarilo
Mal - maleílo
Oac - ácido 8-amino-octanóico Oct - n-octano Suc - succinilo Glt glutarilo Tf a trifluoroacetilo amida C-terminal A seguir designam-se as variações das sequências aini noácidas naturais de GRP e de BOMBESINA: .../12 -12-
IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS VARIAÇÕES DAS SEQUÊNCIAS AMINOÂCIDAS DE GRP E DE BOMBESINA GRP: 1 5 10 15 Vai Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Vai Leu Thr Lys Met Tyr Ala Vai Ser Vai Gin Ser Pro Ala Ala Ile Thr Gin Pro Asp Gly 20 25 Pr o Arg Gly Asn His Trp Ala Vai Gly His Leu Met- -nh2 (Humano) Ser BOMBESINA: 1 5 10 pGlu Gin Arg Leu Gly Asn Gin Trp Ala Vai Gly His Leu Met-NE^ (Humana) LITORINA: 1 5 10 pGlu Gin Trp Ala Vai Gly His Phe Met-NH2
Aminoácidos e Modificações
Tal como é costume, a estrutura dos péptidos escreve-se aqui de tal modo que a extremidade amino terminal se eii contre do lado esquerdo da cadeia e a extremidade carboxi ter_ minai se encontre do lado direito da cadeia.
Os aminoácidos naturais, cora excepçao da glicina, contém um átomo de carbono quiral. Salvo indicaçao específica em contrário, os aminoácidos opticamente activos a que aqui se faz referência têm a configuração L. Por exemplo, qualquer dos aminoácidos dos grupos ou A14 pode possuir as configurações D ou L. Para além disso, deve entender-se que, após a oxidaçao do grupo tiometileno no grupo sulfóxido de metileno, existem dois isómeros peptídicos de sulfóxido de metileno, designados por (fCCH^CO)!1) e qpfCH^O) ] H) .
Para além disto, considera-se que se podem isolar es tes isómeros e determinar-se a sua configuração absoluta. 0 ter_ mo "ψΧCI^SCO) J s tal como aqui se utiliza, refere a existência de ambos os isómeros em conjunto ou separadamente.
Considera-se um grupo alquilo e a porção alquilo de um grupo alcoxi de tal modo que inclua grupos de cadeia linear, ramificada, ou cicloalquílicos, como, por exemplo, os gru_ pos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, tert-butilo. pentilo, isopentilo, sec-pentilo. ciclopentilo, hexilo, iso--hexilo, ciclo-hexilo e ciclopentilmetilo, heptilo, octilo (Oct) ácido 8-amino-ocatanóico (Oac). Considera-se que um grupo acilo com 2 a 10 átomos de carbono, inclui grupos acilo de cadeia li_ near ou ramificada, cíclicos, saturados ou insaturados tendo 1 a dois radicais carbonilo por grupo, como, por exemplo, ace tilo (Ac), azetidina-2-carboxilato (Azt), benzoíl-succinilo, cinamoílo (Cin), 3,4-di-hidrocinamoílo (DhCin) , maleílo (Mal) e glutarilo (Glt). Considera-se que tanto os grupos substituiri tes alquilo como acilo incluem os grupos com halogeno substi-tuintes, em que o grupo halogéneo representa os átomos de fl_ú
or, cloro, bromo ou iodo, como por exemplo, trifluoroacetilo (Tfa). Os derivados cíclicos dos aminoácidos N-terminais incluem ácido piroglutâmico (pGlu) e homo-serina-lactona (Hse). A expressão "qualquer aminoácido", tal como aqui se utiliza não pretende incluir qualquer ácido carboxílico que comporte um substituinte aminoácido, mas é mais utilizado, tal como o especialista vulgarmente utiliza nos derivados polipeptí. dicos e inclui os aminoácidos naturais, assim como ou p^-aniino. ácidos "nao proteicos" habitualmente utilizados pelo especialista, na química dos péptidos quando se preparam análogos siii táticos dos péptidos naturais. Os aminoácidos naturais sao a glicina, a alanina, a valina, a leucina, a isoleucina, a seri^ na, a metionina, a treonina, a fenilalanina, a;.tirosina,. o tript£ fanci,_.a cisteína,.-.a ;pro.l.ina.,:. a:, histidtnaí.,; o: ácido aspárti-co, a asparagina, o ácido glutâmico, a glutamina, a arginina, a ornitina e a lisina. Também se encontram abrangidos os isó-meros de configuração D dos aminoácidos naturais; D-alanina, D-valina, D-leucina, D-isoleucina, D-serina, D-metionina, D-treonina, D-£enilalanína, D-tirosina, D-triptofano, D-cisteí_ na, D-prolina, D-histidina, ácido aspártico, D-asparagina, ác_i do D-glutâmico, D-glutamina, D-arginina. Também estão incluídos os 0(-aminoácidos "nao proteicos", de que sao exemplos o ácido 1-amino-l-ciclopropanocarboxílico (Ac3c), ácido 1-amino--1-ciclopentanocarboxílico (Ac5c), ácido l-amino-l-ciclo-hex_a nocarboxílico (Ac6c), ácido 0-t_-butil-aspártico (Asp(OtBu)), ácido o(-amino-ii-butírico (Aba), ácido (2S)-2-amino-hexanóico
(norleucina) (Ahx ou Nle), ácido (2S)-2-aminopentanóico (nor-II valina) (Ape), N -metil-histidina (Mis(U-Me), NT-metil-histi -15-
dina (Mis(T-Me)), N-metil-lisina (MeLys), N-metil-leucina (MeLeu), N-metil-histidina (MeHis), N-metil-triptofano (Metrp), N-metil--alanina (MeAla), N-metil-valina (MeVal), ácido N-metil (2S)--2-amino-hexanóico (MeAhx), ácido N-metil (2S)-2-aminopentanéjL co (MeApe), N-metil-isoleucina (Melle), N-metil-fenilalanina (MePhe), N-metil-fenilglicina (MePgl), β -(2-tienil)-alanina (Tha), benziltreonina (Thr(Cl^Ph)), benzil-triptofano (TrpíCE^Ph)) . norleucina, norvalina, aloisoleucina, horaoarginina, tiaprolina, di-hidroprolina, hidroxiprolina (Hyp), homo-serina, ciclo-hexil glicina (Chg), ácido Oi, -amino-ja-butírico (Aba), ciclo-hexilala-nina (Cha), ácido aminofenilbutírico (Pba), fenilalaninas mono ou dissubstituídas nas posiçoes orto, meta ou para, tal como fenilalaninas para-substituídas (pSubPhe) e para-cloro-fenil-alanina, para-amino-fenilalanina e para-nitrofenilalanina (pNPhe) ou posições do grupo fenilo com um ou dois átomos de halogéneo ou grupo alquilo C^-C^, alcoxi C^-C^ ou nitro ou substituídas por grupos metileno-dioxi, β -2 e 3-tienilalanina, β-2- e 3-f_u ranilalanina,β -2-, 3- e 4-piridilalanina, Ç>-(benzotienil-2-e 3-il)-alanina,β -(1- e 2-naftil)-alanina (Npa), derivados de serina, treonina ou tirosina O-alquilados, ésteres metílicos de ácidos glutâmico e aspartico, cisteína S-alquilada, o 0-suJL fato-éster de tirosina e tirosinas halogenadas, tais como 3-iodo_ tirosina, 5-iodotirosina e 3,5-diiodotirosina.
Pela expressão "bombesina ou GRP ou as suas variantes naturais” a Requerente entende as sequências de aminoáci-dos descobertas para a bombesina ou GRP na Natureza.
Os termos "suas porçoes" quando utilizados em relação a GRP e à Bombesina e às suas variantes incluem uma regi- -16- ao consecutiva com 1 a 11 aminoácidos ou mais derivados da se quência de GRP, Bombesina ou das suas variantes.
Podem definir-se os grupos de -aminoácidos de acor_ do com determinadas características. Existem duas grandes ca-racterísticas gerais das cadeias laterais: não polares e pola_ res. Os resíduos nao polares representara os resíduos hidrófo-bos que incluem os que têm cadeias laterais de hidrocarbonetos alifáticos: Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Nle, Pro e o grupo aroma tico Phe e Trp e o pseudo-hidrocarboneto, Met. Os aminoácidos polares encontram-se divididos em três grupos: 1) os resíduos hidrófobos ácidos, 2) os resíduos neutros e 3) os resíduos hidrófobos básicos. Os resíduos neutros contêm os resíduos que contêm o grupo hidroxilo, Ser e Thr; as amidas, Asn e Gin; n_ú cleos aromáticos, Tyr e Trp; grupos sulfidrilo, Cys, e aminoácidos de acomodaçao estruturalmente pequena, Ala e Gly. Sao abrangidos pela classificaçao de "polares” os resíduos "hidró. filos ácidos" que incluem ácido aspártico, ácido glutâmico e tirosina e os resíduos "hidrófilos básicos" que incluem His, Lys e Arg. A expressão "um péptido que contenha 1 a 11 resíduos de qualquer aminoácido" significa que a adiçao de aminoáci^ dos quer ao terminal amino quer ao terminal carboxi dos amino_ ácidos do "núcleo" (A2~A^) inclui a estrutura nuclear com a sua actividade intrínseca. 0 símbolo Y designa o(s) grupo(s) químico(s) que . po_ de(m) ser utilizado(s) para substituir ou modificar oaminoácido terminal. Para além disso, o símbolo Y pode ser um grupo car-boxamida, um alcoxi-éster, uma alquilamida, uma alquilamina ou
um éter tioalquílico.
Os polipéptidos de fórmula geral 1, podem formar sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico com qualquer acido nao tóxico, orgânico ou inorgânico. Os exemplos de ácidos inorgânicos que formam sais adequados incluem o ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico e sais de metais áci. dos tais como mono-hidrogeno-ortofosfato de sódio e hidrogeno. -sulfato de potássio. Sao exemplos de ácidos orgânicos que for mam sais adequados os ácidos mono, di e tricarboxílicos. Sao exemplos desses ácidos, nomeadamente, o ácido acético, o ácido glicólico, o ácido láctico, o ácido pirúvico, o ácido ma-lónico, o ácido succínico, o ácido glutárico, o ácido fumári-co, o ácido málico, o ácido tartárico, o ácido cítrico, o áci_ do ascórbico, o ácido maleico, o ácido hidroximaleico, o ácido benzóico, o ácido hidroxibenzóico, o ácido fenilacético, o ácido cinâmico, o ácido salicílico, o ácido 2-fenoxibenzóico e os ácidos sulfónicos, tais como o ácido metano-sulfónico e o ácido 2-hidroxietano-sulfónico. Os sais do radical aminoácido carboxi terminal incluem os sais de ácidos carboxílicos nao to. xicos formados com quaisquer bases adequadas orgânicas ou inor. gânicas. Esses sais incluem, por exemplo, os de metais alcali, nos, como, por exemplo, sódio e potássio; os sais de metais al. calino-terrosos, tais como cálcio e magnésio; os de metais le. ves do Grupo IIIA, incluindo o alumínio; e aminas orgânicas primárias, secundárias e terciárias, como, por exemplo, triaJL quilaminas, incluindo trietilamina, procaína, dibenzilamina, 1-etanamina, N,N'-dibenziletilenodiamina, di-hidroabietilami-na, N-alquil(inferror)-piperidina e outras aminas adequadas. -18-
Utilizando a nomenclatura convencional empregue na química dos péptidos, em que A^- T -A^ sao os compostos em que o radical que faz a ligaçao do resíduo ao resíduo A^ está compreendido entre dois resíduos Leu ligados por uma ligaçao de tiometileno reduzido e se pode designar por Phe^P"£ CH2S JLeu. Esta designação indica que o grupo carbonilo da penúltima Phe foi reduzido para um grupo tiometileno. Spa-tola e Darlak, Tetrahedron Letters, 4_4(3J (1988) 821-33, descrevem um procedimento para a preparaçao destes derivados peptidicos de fórmula geral 1, na qual ”ψ" representa um grupo -CH^S-, isto é, os compostos TfXc^S J . Outras designações uti_ lizadas para se descrever os derivados peptidicos da presente invenção sao para os sulfóxidos de metileno Yt CH2S(0)] , Edward e Spatola, Journal of Liquid Chromatography, 915 (1986) 903-919. Para além disso, após oxidaçao do tiometileno em sul^ fóxido de metileno, formam-se dois isómeros peptidicos de sujl fóxido de metileno, designados por (-çr[CH2S(0) J1) e (f[CH2S(0) I11). Sabe-se que estes isómeros podem ser isolados e que se pode determinar a sua configuração absoluta. Utji liza-se a fórmula ~ψ QCH2S(Ó) J para se referir a existência de ambos os isómeros, quer em conjunto quer separadamente. Caraç, terizam-se ( TpXCH2S(0) J *) e (”^CCH2S(0) 3 ^) Por possuírem tempos de retenção de, respectivamente, 5,40 minutos e de 6,28 minutos, numa coluna C18; coluna analítica de Vydac; 4,6 mmDI X 25 cm, C18 de 5 microns com a fase móvel bombada a um caudal de 2 ml/minuto, com um gradiente linear desde 25% até 75% de acetonitrilo em água contendo ácido trifluoroacé-tico a 0,1%, durante 25 minutos. -19-
Pode demonstrar-se a capacidade dos derivados pept_í dicos da presente invenção para actuarem como antagonistas de Bombesina/GRP pela capacidade desses péptidos para competirem com bombesina/GRP radio-iodado, nos receptores de bombesina/ /GRP nos mamíferos, utilizando o método de Buck e outros, Science 226 (1984) 987-989. e pela capacidad e desses compostos para estimularem ou para inibirem a viragem do fosfatidilino_ sitol induzida por bombezina/GRP utilizando o método de Bristow e outros, British J. Pharmacol., £0 (1987) 211-221.
Tal como acontece com quaisquer grupos genéricos de compostos químicos, dá-se preferência a determinados grupos. A Requerente prefere os derivados peptídicos de formula geral: χ-ν-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-α13-ψ -a14-c-y na qual o simbolo X representa um resíduo amino-ter_ minai seleccionado entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, um ou dois grupos aciLo com 2 a 10 átomos de carbono, grupos carbobenziloxi ou _t-butiloxi-carbonilo; a menos que o aminoácido amino-terminal seja um derivado cíclico, caso em que X é omitido; N representa sequências de Bombesina, GRP ou uma variante ou porção naturais de uma destas sequências, uma ligaçao ou um péptido contendo 1 a 11 resíduos de qualquer aminoácido; a menos que o aminoáci_ do terminal seja um derivado cíclico, caso em que N e omitido; representa pGlu, ou um resíduo hidrófilo ácido adequado; A2 representa Gin, um resíduo neutro ou um resíduo hidrófobo adequados, Nle , acido o( -aminobutírico, pSubPhe, BNap, ou uma ligaçao; A^ representa Arg, um resíduo básico adequado ou uma ligaçao; A^ representa Leu ou é idêntico a A2; Α^ representa Gly, é idêntico a A2 ou representa D-Phe ou D-Ala;
Ag representa Asn, é idêntico a ou representa D-Ala; pGlu;
Ay representa Gin, His, um resíduo neutro, um resí_ duo hidrófobo ou um residuo hidrófilo básico ou oíNap;
Ag representa Trp, um resíduo neutro adequado ou Met; A9 representa Ala ou é idêntico a A2 5 A10 representa Vai ou é idêntico a A2; A11 representa Gly, um resíduo neutro adequado, Phe ou D-Phe; A^g representa His, um residuo neutro ou um resíduo hidrófilo básico adequados, Tyr, D-Phe ou pSubPhe; -21- & k-^2 representa Leu, Phe ou um resíduo hidrófobo ou neutro adequados; 0 símbolo ψ representa um determinante dipeptídico de A^aa Ύ A^aa em que Tp· representa £CH2S]], [CH2S(0)] .YfC^Í0)]1 ouY[CH2SO J11, em que A^aa e A-^aa designam os aminoácidos substituintes; A^4 representa Leu, Met, Nle ou representa um resíduo neutro ou hidrófobo adequados; C representa uma sequência de bombesina, GRP, ou uma sua variante natural ou uma sua porção, uma li-gaçao ou representa um péptido que contenha 1 a 11 resíduos de qualquer aminoácido; e 0 símbolo Y representa um resíduo carboxi-terminal seleccionado entre o carboxamida, mono ou alquil(C^-C^)-amina, ou os seus sais aceitáveis sob grupo OH, éster-alcoxi C^-Cg, dialquil (C^-C^)-amida, éter tioalquílico C^-C^; o ponto de vista farmacêutico.
Da-se especial preferência aos derivados peptídicos de fórmula geral
X-N-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-Ag-A10-A11-A12-A13-"5p"-A14-C-Y na qual o símbolo X representa um resíduo amino-ter_ minai, seleccionado entre um átomo de hidrogéneo, um ou dois grupos alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, um ou dois grupos acilo com 2 a 10 átomos de carbo- -22- \ no , grupos carbobenziloxi ou t_-butilóxicarbonilo ; a menos que o aminoácido amino-terminal seja um derivado cíclico, caso em que X é omitido; a menos cíclico, N representa sequências de Bombesina, GRP ou as suas variantes ou porções destas suas sequências na_ turais, uma ligaçao ou representa um péptido que coii tém 1 a 11 resíduos de qualquer aminoácido; que o aminoácido terminal seja um derivado caso em que N é omitido; A1 representa pGlu ou uma ligaçao; A2 representa Gin ou uma ligação; A3 representa Arg ou uma ligaçao; A4 representa Leu ou uma ligação; A5 representa Gly ou uma ligaçao; A6 representa Asn, pGlu, Gly ou D-Phe; A7 representa Gin ou His; A8 representa Trp; A9 representa Ala; A10 representa Vai; A11 representa Gly; A12 representa His; -23¾ A-^2 representa Phe; 0 símbolo ~ψ* representa um determinante dipeptídico de A .^aa, em que ~ψ" representa CH2S J , [CH2S(0)], Tc CH2S(0)JI ou CyfCH^O]11 ), em que A^aa e A^aa designam os aminoacidos substituintes; representa Leu ou Nle; 0 símbolo G representa uma sequência de Borabesina, GRP ou uma sua variante ou uma sua porção natural, uma ligação ou representa um péptido que contém 1 a 11 resíduos de qualquer aminoácido; 0 símbolo Y representa um resíduo carboxi terminal seleccionado entre um grupo OH, alcoxi C,-C0, ami-no, aminoacidos mono ou dialquil(C^-C^)-substitu£-dos, ou representa um resíduo álcool terminal; e o simbolo X representa um átomo de hidrogénio, ace tilo ou succinilo. Síntese de Péptidos
Podem preparar-se os péptidos da presente invenção, de acordo com uma diversidade de procedimentos que sao do conhecimento do especialista. Tais procedimentos incluem 0 procedimento sequencial de fase sólida e a síntese de bloco, clo^ nagem de genes e combinações dessas técnicas. Pode efectuar--se o procedimento sequencial de fase sólida utilizando métodos automatizados estabelecidos, tais como a utilização de um
sintetizador de péptidos automático. Neste procedimento sinte. tizam-se os péptidos sobre resina, iniciando-se com um dipép-tido protegido contendo uma ponte de sulfóxido de metileno--tiometileno inter-aminoãcidos, estando o aminoácido C-termi-nal ligado a uma resina metilbenzidrilamina. Ef ectuou-i-se a ex tensão da sequência péptidica utilizando a metodologia normalizada e as instruções do fabricante e as que sao do conhecimento do especialista.
Após ter-se completado a ligaçao da sequência, cada um dos grupos protectores Boc permaneceu no seu lugar ou foi removido e o grupo amino N-terminal foi acilado. Efectuou-se a remoção do fragmento protegido da resina utilizando o proce dimento de fluoreto de hidrogénio. 0 grupo protector de -amino utilizado com cada um dos aminoácidos introduzidos na sequência polipeptídica pode ser qualquer dos grupos protectores utilizados na especialid_a de. Entre as classes de grupos protectores de 0(-amino conside^ rados ccntam-se. os (1) grupos protectores de tipo acilo, tais como, os grupos formilo, trifluoroacetilo, ftalilo, tolueno-sul. fonilo (tosilo), benzeno-sulfonilo, nitrofenilsulfenilo, tri-tilsulfenilo , o-nitrofenoxiacetilo e o(-clorobutirilo; (2)^gru pos protectores de tipo uretana aromática, tais como os grupos benziloxicarbonilo e benziloxicarbonilo substituído, tal como jj-clor obenziloxicarbonilo, £-nitrobenziloxicarbonilo , j).-broino_ benziloxicarbonilo, £-metoxibenziloxicarbonilo, l-(j3-bifeni-lil)-l-metiletoxicarbonilo, O(,o( -dimetil-3,5-dimetoxibenzilo^ xicarbonilo e benzidriloxicarbonilo; (3) grupos protectores de tipo uretana alifática, tais como os grupos tert-butiloxicar- bonilo (Boc), diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarboni lo, etoxicarbonilo e aliloxicarbonilo; (4) grupos protectores de tipo uretana cicloalquílica, tais como os grupos ciclopen-tiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo e ciclo-hexiloxicarbo-nilo; (5) grupos protectores de tipo tiouretana, tais como os grupos feniltiocarbonilo; (6) grupos protectores de tipo alqui_ lo, tais como o grupo trifenilmetilo (tritilo) e benzilo; e (7) grupos trialquilsilânicos, tal como o grupo trimetilsila-no.Ogrupo protector de cV-amino preferidoéo grupo tert-butilo carbonilo (Boc).
Tal como é do conhecimento do especialista da sínte se de péptidos em fase sólida, muitos dos aminoácidos comportam grupos funcionais que necessitam de ser protegidos durante a preparaçao da cadeia. A utilização e selecçao dos grupos protectores adequados é da competência dos especialistas na ma teria e dependerá do aminoácido que se pretende proteger e da presença de outros resíduos aminoácidos protegidos no péptido. A escolha de um tal grupo protector da cadeia lateral é crítica devido ao facto de ter de se escolher um grupo que não se ja removido durante a cisão do grupo protector do radical &-ami no. Por exemplo, os grupos protectores da cadeia lateral adequados para a lisina sao os grupos benziloxicarbonilo e benzi^ loxicarbonilo substituído, sendo esses substituintes escolhidos entre átomos de halogéneo (como, por exemplo, cloro, bromo e flúor) e grupos nitro (como, por exemplo, 2-clorobenzilo_ xicarbonilo, _g_-nitrobenziloxicarbonilo > 3,4-diclorobenziloxi-carbonilo), tosilo, t-amiloxicarbonilo, _t-butiloxicarbonilo e diisopropilmetoxicarbonilo. Pode proteger-se o grupo hidroxi- -26 lo alcoólico da treonina e da serina, com um grupo acetilo, benzoílo, tert-butilo, tritilo, benzilo, 2,6-diclorobenzilo ou benziloxicarbonilo. 0 grupo protector preferido é o grupo ben_ zilo. A escolha de um reagente de ligação adequado é da competência do especialista na matéria. Um reagente de liga-çao especialmente adequado quando o aminoácido adicionado é Gin, Asn ou Arg é N,N'-diisopropilcarbodiimida e 1-hidroxibeii zotriazol. A utilização destes reagentes evita a formaçao de nitrilo e de lactama. Outros agentes de ligaçao sao (1) carbo_ diimidas (como, por exemplo, N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida e N-etil-N*-(Y-dimetilaminopropilcarbodiimida); (2) cianamidas (como, por exemplo, N,N-dibenzilcianamida); (3) ceteniminas; (4) sais de isoxasólio (como, por exemplo, N-etil-5-fenil--isoxasólio-3'-sulfonato; (5) azoto monocíclico contendo ami-das heterocíclicas de carácter aromático contendo 1 a 4 átomos de azoto no núcleo, tal como as imidazolidas, pirazolidas e 1,2,4-triazolidas. As amidas heterocíclicas especificas úteis, incluem N,N’-carbonildiimidazol e N,N-carbonil-di-1,2,4-tria-zol; (6) acetileno alcoxilado (como, por exemplo, etoxiaceti-leno); (7) reagentes que formam um anidrido misto com o radical carboxilo do aminoácido (como, por exemplo, cloroformato de etilo e cloroformato de isobutilo) ou o anidrido simétrico do aminoácido a ser ligado (como, por exemplo, Boc-Ala-0--Ala-Boc), (8) compostos heterocíclicos contendo azoto que possuem um grupo hidroxi num anel de azoto (como, por exemplo, N-hidroxiftalimida, N-hidroxissuccinimida e l-hidroxibenzotri_ azol) e (9) difenildifosforilazida. Kapoor em J, Pharm. Sei. 59,(1970) 1-27, descreveram outros reagentes de activaçao e a sua utilização na ligaçao de péptidos. A Requerente prefere utilizar o anidrido simétrico como um reagente de ligaçao para todos os aminoácidos, exceptuando Arg, Asn e Gin.
Introduz-se cada aminoácido protegido ou cada sequên, cia de aminoácidos protegida no reactor de fase sólida, num ex cesso de cerca de quatro vezes e efectua-se a ligaçao em uma mistura de dimetilformamida/cloreto de metileno (1:1) ou apenas em dimetilformamida ou, de preferência, apenas em cloreto de metileno. Nos casos em que se efectuam ligações incompletas, repete-se o procedimento de ligaçao antes de se remover o grupo protector de o^-amino, antes de se efectuar a ligaçao do aminoácido seguinte no reactor de fase sólida. Comprovou--se o êxito de cada reacçao de ligaçao em cada passo de sínte, se por meio da reacçao de ninidrina, tal como descrito por E. Kaiser e outros, Analyt. Biochem., J34 (1970) 595. A seguir â reacçao de ligação de aminoácido protegi^ do em o( -amino ao suporte de resina, removeu-se o grupo protec^ tor utilizando ácido trifluoroacético em cloreto de metileno, apenas ácido trifluoroacético ou HC1 em dioxano. Efectuou-se a desprotecçao a uma temperatura compreendida entre 0°C e a temperatura ambiente. Podem utilizar-se outros reagentes de cisão e outras condiçoes normalizadas para a remoção dos grii pos protectores de oi-amino específicos. Após remoção do grupo protector de õi-amino, ligam-se os outros aminoácidos protegidos em amino, passo a passo, segundo a ordem desejada. Co, mo alternativa, podem ligar-se grupos de vários aminoácidos pelo método de solução, antes de se efectuar a ligaçao à se- -28- quência de aminoácidos ligada ao suporte de resina.
Após ter-se obtido a sequência de aminoácidos desejada, remove-se o péptido da resina. Pode efectuar-se esta ope^ raçao por hidrólise, tal como o tratamento do polipéptido ligado à resina com um alcoól de aminoácido e com ácido acético em diclorometano (DCM). Podem remover-se os grupos protectores de acordo com procedimentos conhecidos na especialidade. A re, moção usual dos grupos protectores efectua-se após síntese com pleta da cadeia peptídica, embora os grupos protectores possam ser removidos em qualquer altura adequada. Efectua-seapu_ rificaçao dos péptidos, principalmente, por cromatografia líquida preparatória de fase inversa de alta resolução e de acor_ do com as técnicas conhecidas na especialidade.
Em alternativa, se se pretender preparar sulfóxido de metileno, pode efectuar-se a oxidação do tiometileno, com diversos reagentes de oxidaçao. Um dos métodos que se podem utilizar para se efectuar a oxidaçao desejada consiste em tra_ tar o péptido tiometileno com uma solução aquosa que contenha peróxido de hidrogénio, para converter o péptido no seu sulfó^ xido de metileno. Podem isolar-se os isómeros por cromatogra-fia líquida de alta pressão (HPLC), como é do conhecimento do especialista. Pode adaptar-se, por exemplo, de um modo adequa do, a HPLC de fase inversa C18, para se isolarem os isómeros do péptido sulfóxido de metileno.
Uso terapêutico: A história natural da doença designada por úlcera peptidica, consiste numa história de exacerbações recurren-
i -29-Xl tes e remissões. Como resultado, as doenças ulcerativas podem ser tratadas como um distúrbio de carácter crónico. As úlceras pepticás (esofágicas, gástricas e duodenais) surgem nas áreas do tracto gastrointestinal expostas ao ácido e à pepsi-na. Os compostos da presente invenção, que sao úteis no trata mento das úlceras gastrointestinais e/ou pancreáticas, podem ser eficazes nas hipersecreções pancreáticas e/ou gástricas, especialmente as hipersecreçoes de ácido clorídrico e de pep-sina. Portanto, os compostos da presente invenção podem constituir um tratamento adequado em casos de úlceras peptídicas. A dose adequada de um derivado peptídico da presente invenção, quando utilizado no tratamento de úlceras pépti-dicas, está compreendida entre 0,2 mg/Kg e 250 mg/Kg de peso corporal do paciente, por dia, dependendo de factores, tais como o proprio paciente, a gravidade da úlcera peptídica a ser tratada e o derivado peptídico seleccionado. Pode determi^ nar-se facilmente a dose adequada para um determinado paciente. De preferência, administrar-se-ao, habitualmente 1 a 4 do_ ses diárias, contendo 5 mg a 100 mg do composto activo, por do se. A quantidade de um péptido da presente invenção necessária para inibir a secreção ácida da gastrina, pode ser facilmente determinada pelo especialista na matéria. A utilização de análogos de bombesina/GRP na terapia cancerígena é indicada no tratamento de SCLC e carcinomas da próstata e prevenção de uma diversidade de outras situações carcinomatosas.
Os especialistas neste domínio determinarão facilmente as situações em que existe a necessidade de se recorrer -30- a uma terapia do cancro. 0 termo "paciente" aqui utilizado refere-se a mamíferos, tais como os primatas, incluindo seres humanos, caprinos, equinos, bovinos, suínos, cães, gatos, ratazanas e ratos. A expressão "tecido tumoral" refere-se tanto aos tu. mores benignos como aos malignos ou neoplasmas e inclui mela-nomas, linfomas, leucemias e sarcomas. Sao exemplos de tecidos tumorais os cutâneos, tais como os melanomas malignos e mi coses fungóides; tumores hematológicos tais como as leucemias, como, por exemplo, a leucemia linfoblástica aguda, a leucemia mielocítica aguda ou a leucemia mielocítica crónica; linfomas, tais como a doença de Hodgkin ou linfomas malignos; tumores ginecológicos, tais como os tumores do ovário e os tumores ute. rinos; tumores urológicos, tais como os da próstata, da bexiga ou dos testículos; sarcomas de tecidos moles, sarcomas ósseos ou nao ósseos, tumores da mama; tumores da pituitária, da tiróide e do córtex adrenal; tumores gastrointestinais, tais como os do esófago, estômago, intestinos e cólon; tumores hepáticos e pancreáticos; papilomestases da laringe e tumores dos pulmões. A expressão "controlo do crescimento" e o conceito de tratamento do cancro significa retardar, interromper, suster ou parar o crescimento e as metástases de um tumor que pro_ lifera rapidamente num animal de sangue quente; tendo em conta que o tratamento, num animal de sangue quente, nao proporciona uma "cura" do tumor no sentido em que o tecido tumoral e destruído ou totalmente eliminado. -31 /
A dose adequada de um derivado peptídico da presente invenção quando utilizada no tratamento de, ou no controlo do crescimento de um cancro ou tecido tumoral, incluindo ocar cinoma de células pequenas do pulmão ou cancros prostáticos, está compreendida entre 0,2 mg/Kg e 250 mg/Kg do peso corporal do paciente, por dia, dependendo de factores, tais como o próprio paciente, a gravidade do carcinoma de células pequenas do pulmão que se pretende tratar e dos derivados peptídicos se leccionados. Pode determinar-se facilmente a dose adequada pa_ ra um determinado paciente. Ministrar-se-ao, de preferência, 1 a 4 doses diárias, contendo, habitualmente, 5 mg a 100 mg do ingrediente activo, por dose. 0 especialista na matéria dete;r minará, facilmente, a quantidade de péptidos da presente inveji çao necessária para inibir o crescimento de SCLC.
Sabe-se, de um modo geral, que os agentes terapêuti_ cos utilizados no tratamento do cancro podem ser utilizados em associação com outros agentes terapêuticos ou terapias que se sabe serem úteis no tratamento do cancro. Também se podem uti_ lizar os péptidos da presente invenção numa terapia de assoei ação. Pode administrar-se, por exemplo, um pêptido de estrutu ra 1-5 em simultâneo com uma excisao cirúrgica do tumor ou com terapia por radiações, imunoterapia, ou terapia por aquecimeri to local. De acordo com um dos modos preferidos de se tratarem os cancros, administra-se o péptido de estrutura 1-5, em asso ciaçao com um agente químico citotóxico que se saiba ser útil na terapia cancerígena. São exemplos de agentes citotóxicos químicos a ciclofosfamida, o metotrexato, a prednisona, 6-mer, captopurina, procarbazina, danorubicina, clorambucil, citosi-
na-arabinósido, 6-tioguanina, tio ΤΕΡΑ, 5-fluorouracilo, 5-fluo_ ro-2-desoxiuridina, 5-azacitidina, azoto, mostarda de azoto, 1,3-bis.(2-cloroetil)-l-nitro-ureia (BCNU), l-(2-cloroetil)-3--ciclo-hexil-l-nitro-soureia (CCNU), bussulfan, adriaraicina, bleomicina, vindesina, cicloeucina ou metilglioxal, bis(guanil--hidrazona) (MGBG). Quando se utiliza uma tal terapia de ass£ ciação, o efeito do agente citotóxico pode ser potenciado. A remissão produzida pelo agente citotóxico pode ser intensificada e a proliferação do tumor pode tornar-se mais lenta ou ser evitada. Deste modo, a utilização de uma tal terapia de associaçao permite doses menores ou doses individuais menos frequentes do agente citotóxico. A expressão "terapia de asso ciaçao" contempla a administraçao de um péptido de estrutura 1-5, imediatamente antes de se iniciar a terapia com um agente citotóxico, em simultâneo com essa terapia ou durante o pe^ ríodo imediatamente a seguir à interrupção dessa terapia. Quaii do se utiliza esta terapia de associação para o tratamento de um tumor, pode administrar-se o agente citotóxico, numa forma de dosagem que se saiba, na especialidade, ser eficaz para o tratamento do tumor. No entanto, um péptido de estrutura 1-5 pode produzir um efeito aditivo ou sinérgico com um agente ci. ^totóxico contra um determinado tumor. Deste modo, quando se utiliza uma tal terapia de associaçao, a dosagem do agente ci^ totóxico administrado pode ser inferior à dosagem administrada quando se utiliza o agente citotóxico sozinho. Por isso, em associação com um derivado peptídico de estrutura 1-5, pode a_d ministrar-se o agente citotóxico em uma dosagem inferior ou a intervalos de tempo menos frequentes, por comparaçao com a utí
lizaçao do agente citotoxico sozinho. De modo semelhante, quaii do se utiliza uma terapia de associaçao, a dosagem ou frequêii cia de administraçao de um péptido de estrutura 1-5 pode ser menor do que quando se utiliza a terapia sem um agente cito-tóxico.
Apesar de alguns dos derivados peptídicos da preseii te invenção poderem resistir à passagem através dos intestinos, a seguir à administração oral, a Requerente dá preferência a uma administraçao nao oral, como, por exemplo, a administraçao por via subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal; â administraçao por injecçao de depósito; ou por preparaçao de um implante; ou por aplicaçao nas membranas mucosas, tais como as do nariz, garganta, árvore brônquica, co mo, por exemplo, através de um aerossol que pode conter um de^ rivado peptídico da presente invenção, sob a forma de uma aspersão ou de pó seco.
Para administraçao parenteral, podem administrar-se os compostos, como dosagens injectáveis de uma solução ou sus pensão do composto num diluente fisiologicamente aceitável com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, que po. de ser um líquido esterilizado, tal como a água ou óleos, com ou sem a adiçao de um agente tensioactivo e de outros adjuva_n tes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Exemplos dos óleos que podem ser utilizados sao os de petróleo, os de origem animal, vegetal ou os de origem sintética, como, por exem pio, o óleo de amendoim, o óleo de soja e o óleo mineral. De um modo geral, os veículos preferenciais, especialmente para soluções injectáveis, são a água, soluções salinas, soluções -34- aquosas de dextrose e soluçoes de açúcares relacionados, eta-nol e glicóis, tais como o propilenoglicol ou o polietileno-glicol.
EXEMPLOS A presente invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLO 1 . Preparaçao do Determinante Dipeptidico ^,aa*^P*t CH^S ^A^^aa
Acido 2-Mercapto-4-metilpentanóico (mercapto-Leucina (Composto 1)
Arrefeceu-se até à temperaturaite -5°C, num banho de sal e gelo, uma solução de D-leucina (5 g) e brometo de potás_ sio (114 g) em 400 ml de I^SO^ 2,5 N. Adicionou-se, gota a go^ ta, com agitaçao, uma solução arrefecida de NaN02 (30 g/70 ml água, 0°-50°C) . Deixou-se prosseguir a reacçao durante cerca de 14 horas à temperatura ambiente. Depois, extraiu-se a mistura reaccional com porçoes de 75 ml de éter, três vezes. Secou-se o extracto etéreo sobre sulfato de sódio anidro. Fil-trou-se a solução e evaporou-se o éter. Colocou-se o óleo lím pido resultante, ácido 2-bromo-4-metil-pentanóico ^Martin e Greco, J. Org. Chem. , 33_(1968) 1275—1276 J (18 g) numa solução de 250 ml de tritiocarbonato de sódio a 33%, cora agitaçao, a 0°C. Agitou-se a mistura reaccional durante 48 horas e, depois, acidificou-se a 0°C, com uma adiçao criteriosa de í^SO^ 10 N. Depois, extraiu-se três vezes a solução acidificada com -35- / í etereos porçoes de 75 ml de éter. Secaram-se os extractos etéreos sobre sulfato de sódio anidro e removeu-se o éter sob vazio e destilou-se sob vazio o óleo amarelado resultante (17 g). A produção final foi de 15,3 g de ácido (S)-2-mercapto-4-metil-pentanóico; p.e. 92°-93°C (0,75 mmHg); £o( ^25=-23,2 (cl, MeOH). P-tolueno-sulfonato de (S)-(tert-butiloxicarbonil)-2-amino-3--fenilpropanilo (Composto 2)
Sintetisou-se o reagente de partida para o composto em epígrafe, a partir de (S)-(tert-butiloxicarbonil)-2-amino--3-fenil-propanol (4,5 g;'0,0179 mmoles); que se preparou a partir de L-fenil-alaninol (Sigma) e de dicarbonato de di-tert— -butilo). Adicionou-se, então o reagente de partida a 20 ml de piridina sob condiçoes anidras e arrefeceu-se até à temperatii ra de -40°C num banho de neve carbónica/acetona. Adicionou-se, depois, à mistura cloreto de tosilo (6,9 g, 3,6 mmoles). Depois, efectuou-se a reacçao à temperatura de 4°C. Nao se efeç. tuaram quaisquer esforços para se removerem os depósitos por acumulaçao de cloreto de piridina. Após ter terminado a reac-çao, removeu—se a piridina sob vazio e retomou—se o solido re sultante com eter. Secou-se o extracto etereo sobre sulfato de sódio anidro, filtrou-se e removeu-se o éter sob vazio; obtiveram-se 10,5 g de um óleo. Obtiveram-se cristais do produto mediante precipitação do óleo em acetato de etilo e hexano; produziram-se 9,0 g de um sólido branco; p.f. 109°-110°C. (S)-(S)-tert-butiloxicarbonil-PheCI^S „1 Leu-OH (Composto 3)
Preparou-se uma solução 0,43 M (Solução A) de etóxi. -36-. -36-. e do de sódio, com sódio recentemente cortado e etanol anidro. Preparou-se uma solução em etanol (Solução B) de ácido (S)—2— -mercapto-4-metil-pentanóico (Composto 1) (0,72 g em 25 ml). · Adicionou-se lentaraente 13,5 ml da solução A a 15 ml da solução B, sob atmosfera de azoto. Agitou-se a solução durante ciji co minutos e removeu-se o etanol sob vazio e evaporou-se repe^ tidamente o solido branco com benzeno até ã secura. Dissolveja -se o sal de dissódio de mercaptoleucina em - 1 ml de dimetil^ sulfóxido (DMSO) ao qual se adicionou 1,58 g do Composto 2, dissolvido em 2 ml de DMSO e agitou-se durante uma noite. Com binou-se a mistura reaccional com 175 ml de água destilada e extraiu-se três vezes com porçoes de 20 ml de éter e, depois, acidificou-se com HC1 5N, com agitaçao, á temperatura de 0°C. Extraiu-se novamente a solução aquosa, três vezes, com aceta to de etilo. Lavou-se o extracto com uma solução saturada de NaCl e secou-se sobre sulfato de sodio anidro, filtrou-se e r£ moveu-se o acetato de etilo sob vazio, o que levou ã produção de 1,05 g de um óleo límpido. Cristalizou-se este óleo em ace tato de etilo e hexano, para se obter um sólido branco; (0,83 g), (p.f. 110°-111°C), ( [c<]25=52,5 (C0.88 1, MeoH)). CPhe13 ψ [ CHgSLeu^^ Bombesina (Composto 4)
Efectuou-se a acilaçao do Composto 3 (0,20 g) em re sina 4-metilbenzidrilamina (MBHA), combinando o Composto 3, diciclo-hexilcarbodiimida (0,113 g) , hidroxibenzotriazol (0,074 g) e MBHA (0,414 g) em 20 ml de cloreto de metileno/dimetilforma-mida (9:l;v:v). Efectuou-se a ligaçao do composto 3 num sinte-tizador de péptidos em fase sólida Vega colocado num módulo se -37 mi-automatizado, de. acordo com as instruções.. Depois de 2 horas de ligaçao, monitorizou-se a reacçao com ninidrina. Lavou-se a amida de resina resultante, Boc-Phe TC CE^sjLeu MBHA, com di-metilformamida e etanol e secou-se, para se obter 0,489 g, o que corresponde a um grau de substituição de 0,53 mmole/g de resina. Efectuou-se a síntese de péptidos em fase sólida para alongamento da sequência de aminoácidos num sintetizador de péptidos Applied Biosystems, utilizando a metodologia normali_ zada, conhecida pelos especialistas na matéria.
Separou-se o péptido ligado à resina, completo (prç^ duçao de 0,712 g) da resina utilizando fluoreto de hidrogénio (10 ml/g de resina) a 0°C, na presença de anisol (etanoditiol; 1 ml: 5 mg de resina) durante 1 hora. A seguir á remoção de HF, agitou-se a resina e extraiu-se com éter etílico (2x30 ml) e extraiu-se com ácido acético a 30%. A liofilização deu 250 mg do produto bruto. Purificou-se uma porção do produto (400 mg) por cromatografia líquida preparatória de fase inversa de alta resolução com uma coluna C18 Dynamax, utilizando um gradiente de eluiçao de fase móvel (15 minutos, gradiente de aceto_ nitrilo 20-30% a 40 ml/minuto; que se estabeleceu a partir de reservatórios de acetonitrilo e de TFA a 0,1% em água). Recolheram-se quatro fracçoes do pico principal, lendo-se a absor_ vência do Composto a
Os péptidos obtidos de acordo com este método propor^ cionaram o pico iónico molecular desejado, por EM-BAR e uma análise de aminoácidos em concordância com o péptido desejado. Prepararam-se, de acordo com este procedimento, os péptidos que se seguem e que possuem as propriedades referidas. -3 1) pGlu Gin Arg Leu Gly Asn Gin Trp Ala Vai Gly His Phe‘Çr[CH2S ]Leu~NH2 MW 1637 EM-BAR (MH)+ 1638 tR 55% de teor de péptidos 2) Ac-D-Phe Gin Trp Ala Vai D-Ala His Phe^ CH2S ] Leu-NH2 MW 1160 EM-BAR (MH)+ 1161 tR 89% de teor de péptidos 3) Asn Gin Trp Ala Vai Gly His Phe ψ [CH2S ]Leu-NH2 MW 1089 EM-BAR (MH)+ 1090 t 52% de teor de péptidos 4) Asn Gin Trp Ala Vai Gly His Phe ψ[ CH2S(0)]Leu-NH2 MW 1072 EM-BAR (MH)+ 1073 tR 50% de teor de péptidos 5) pGlu Gin Trp Ala Vai Gly His Phe"Çr[ CH2S(0)jLeu-NH2 MW 1069 EM-BAR (MH+) 1070 tR 80% de teor de péptidos 6) pGlu Gin Trp Ala Vai Gly His Phe ψ[ CH2S ] Nle-NH2
MW 1069 EM-BAR (MH+) 1070 tR
Exemplo 2
Isómeros de Sulféxido de Metileno: fPhe-^ 1L CH2S(0)]Leu1 4 11Li-torina e JjPhe 13~lPT]cH2S(0)]Leu14 2¾ itorina
Preparou-se uma solução de 3 ml de [.Pheg^CH2S jLeu^J Lj_ tòrina (20 mg) no dissolvente de eluição de HPLC (0,1% de -39- TFA/acetonitrilo a 75:25, v:v). A esta solução de amostra ad_i cionou-se 0,25 ml de uma solução de peróxido de hidrogénio a 5%. Deixou-se repousar a amostra durante 0°C, durante 2 horas, após o que se injectou num sistema preparatório de fase inver. sa (coluna C18 Dinamax 300a). Monitorizou-se a oxidação do péptido nos seus sulfóxidos de metileno diaestereoméricos, por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), pelo aparecimento de dois picos de eluiçao muito proximos com tempos de retenção consideravelmente menores do que o péptido que contém CE^S. Separaram-se e purificaram-se os sulfóxidos de metileno, de acordo com o anteriormente exposto, por HPLC de fa se inversa. As designações de Phe^"£CH2S(0)^ ^Leu-litorina e de PheY[CH2S(0)JI3:Leu-l itorina baseiam-se nos seus tempos de rj3 tenção por HPLC de fase inversa.
Os péptidos obtidos por este método proporcionaram os picos iónicos moleculares desejados por EM-BAR e possuíam uma análise de aminoácidos em concordância com 0 péptido desejado. Preparam-se, deste modo, os péptidos que se seguem e que possuem as propriedades referidas. 7) pGlu Gin Trp Ala Vai Gly His Phef [CH2S(0)JILeu-NH2
MW 1085 EM-BAR (MH+) 1086 tR 55% de teor de péptidos ^ 'r
Tempo de retenção de 5,40 minutos 8) pGlu Gin Trp Ala Vai Gly His Phe (0)Ji:ELeu-NH2 MW 1085 EM-BAR (MH+) 1086 t„
K 63% de teor de péptidos .../40
Tempo de retenção de 6,28 minutos /
* 0 tempo de retenção, baseou-se na retenção em uma coluna analítica Vydac; 4,4 mm Dl x 25 cm, C18 de 5 microns; caudal de 2 ml/minuto; gradiente linear de 25% a 75% de acetonitrilo em água contendo ácido trifluoroacético a 0,1%, durante 25 mjl nutos. EXEMPLO 3 ANTAGONISMO DO RECEPTOR DE BOMBESINA (Phe13~!FrCH2S]Leu14)-BOMBESINA,
CONFORME DEMONSTRADO POR COMPETIÇÃO NO RECEPTOR PARA GRP IODADO
Misturaram-se os pâncreas de um ou mais ratos, pica-ram-se e homogeneizaram-se em HEPES 50 mM (pH7,4) contendo NaCl 120 mM e KCl 5 mM, a 4°C, e centrifugaram-se a 37 500 xg durante 15 minutos. Efectuou-se uma nova suspensão do sedimeii to em HEPES 50 mM (pH 7,4) contendo EDTA 10 mM e KCl 300 mM e incubou-se durante 30 minutos a 4°C. Centrifugou-se a suspensão, tal como anteriormente se referiu e, lavou-se duas vezes o agregado em HEPES 50 mM (pH 7,4) contendo inibidores de pr£ tease (fluoreto de fenilmetilsulfonilo 10 /iM, tiorfano 1 jiM,. 40^g/ml de bacitracina, iodoacetamida 10 mM e 4 /ig./inl.de leup.e.p.tina) e r.centrif ugou-se novamente. Depois , efectuou-se uma suspensão do tecido em tampão de incubaçao (1 ml por 4 mg de pâncreas) e in cubou-se durante 15 minutos, à temperatura ambiente e, depois, adicionou-se 250 a cada um dos tubos de ensaio para se ini ciar o ensaio. Os tubos de ensaio continham tampao de incubaçao que consistia em HEPES 50 mM (pH 7,4), BSA a 0,5%, inibidores de protease, MnCl2 2 mM, somatostatina 1 jnM e concentra 125 çoes de I-GRP e de peptidos necessárias, num volume final -41( de 500 jil. Deixou-se prosseguir o ensaio até ao equilíbrio, du, rante 90 minutos, à temperatura ambiente. Após este período, filtraram-se, rapidamente os conteúdos de cada tubo sobre fil tros Whatman GF/B previamente embebidos em polietilenoimina a 0,1% e lavaram-se os filtros rapidamente, três vezes com HEPES 50 mM arrefecido em gelo (pH 7,4). Quantificou-se a ra- dioactividade ligada aos filtros num contador gama. Expressou. se a competição da ligação de GRP iodado pelos compostos ou mo. - 125 delos de ensaio como uma percentagem da ligaçao de I-GRP na ausência de péptido. Calculou-se a afinidade e a ligaçao máxi. ma com Ligando (Biosoft, Cambridge, UK) (Êiguras 1 e 2). EXEMPLO 4
ANTAGONISMO D0 RECEPTOR DE BOMBESINA (Phe13 y~LCH2 S .1LEU14)-B0MBESINA, CONFORME DEMONSTRADO PELO EFEITO SOBRE A VIRAGEM DE F0SFATIDILIN0SIT0L
Juntaram-se os pâncreas de ratos e cortaram-se em pe^ dacinhos com um bisturi. Lavou-se o tecido cortado em pequenos pedaços, duas vezes com Krebs-HEPES e, depois, incubou-se durante 30 minutos em tampao Krebs-HEPES a 30°C e com mudança de tampao recentemente preparado, após 15 minutos. Depois incu- 3 bou-se o tecido neste tampao contendo 100-200 ^Ci de H-inosi^ tol, a 37°C, durante 1 hora. Depois, lavou-se o tecido duas ve zes e incubou-se durante outros 30 minutos em Krebs-HEPES (con_ tendo Li+ 10 mM a 37°C, com mudança de tampao recentemente pre^ parado após 15 minutos. Depois, colocaram-se porçoes da massa de tecido (aproximadamente 10 mg por tubo de ensaio) em tampao Li+ com inibidores da protease (40 /ig/ml de bacitracina, 4 ug/ml de leupeptina, 4 ug/ml de quimostatina, 20 ug/ml de tiorfano), BSA a 0,1% e, depois, adicionaram-se 0,1 -1000 nM de péptido em 25 jil, num volume final de 250 ^il. Para se medir o antagonismo trataram-se previamente porçoes de tecido em tampão Li+ com 1 jaM do antagonista potencial, durante 5 minutos a 25°C, antes de se adicionar o agonista (GRP). Decorridos 60 minutos à temperatura ambiente, interrompeu-se a viragem do fosfatidilinositol, pela adição de 940 jal de clorofór-mio/metanol (1:2), seguida de 310 pl de clorofórmio, seguida de 310 jil de água. Depois, agitou-se em turbilhão cada um dos tubos, durante 5 segundos, e, depois, centrifugou-sea 2500 xg durante 8 minutos para se separarem as fases. Depois, misturou-se 900 ji 1 da fase superior (aquosa) com 2,1 ml de água e carregou-se numa coluna de permuta iónica de 0,5 ml Biorad AG-lx8 (formato). Retirou-se de cada um dos tubos 50 jal da fa_ se do fundo (clorofórmio) e colocou-se numa ampola de contagem, secou-se e contou-se em fluido de cintilações. Lavou-se o material que se encontrava nas colunas, pela ordem que se segue com: 1) 10 ml de água, 2) 5 ml de tetraborato de dissó-dio 5 mM/formato de sodio 60 mM, 3) 10 ml de formato de amónio 1M em ácido fórmico 0,1 M. Recolheu-se a lavagem (terceira) final e misturou-se 1 ml com 10 ml de cintilador Bio-Safe e, efectuou-se a contagem. Depois, calculou-se a razao destas contagens (total de fosfatos de inositol) para as contagens da fase orgânica correspondente, em cada uma das amostras. Efectuou-se, então a comparação entre as razoes na presença do com posto de ensaio e/ou de protótipos com as razoes nos tubos de controlo (isto I, sem agonista de estimulação). Construíram- -se as linhas dose-resposta e determinaram-se as capacidades dos compostos de ensaio para estimular ou inibir a viragem do f os fatidilinos itol induzida por GRP, por análise gráfica ou com o auxílio de um programa informático e estão ilustrados nas Figuras 3 e 4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 125 A Figura 1 demonstra que I-GRP se liga a uma uni ca classe de sítios — o receptor bombesina/GRP — nas membra nas pancreáticas de murino (Exemplo 1). Ensaiou-se em tripli- 125 cado a ligaçao de I-GRP 25-1600 pM e, depois, analisou-see efectuou-se o diagrama com LIGAND. 0 melhor ajustamento por computador para estes dados foi de 19 pM de receptor por amos tra (-100 fmol de receptor por mg de proteína da membrana) com um de 47 pM. A abcissa (eixo dos XX) indica a concentração de I-GRP ligado ao receptor. A ordenada (eixo dos YY) indi_ 125 ca a concentração de I-GRP ligado ao receptor dividida pe- la concentração de I-GRP que se encontrava livre (nao lig.a do). A linha recta indica uma única classe de sítios; isto é, 125 I-GRP liga-se a cada um dos seus receptores com a mesma afi nidade. Outros ensaios em que se utilizou 25-3200 pM de 125I-GRP ou 10 pM de 125I-GRP - 8-500 pM de GRP também indicaram um semelhante. Isto demonstra que se pode medir a li. gaçao ao receptor para bombesina/GRP por competição da liga-125 çao de I-GRP as membranas pancreaticas de murino. A Figura 2 ilustra a capacidade dos análogos da bom besina para se ligarem ao receptor de GRP, conforme demonstra do pela capacidade destes péptidos para competirem para a li- 125 gaçao de I-GRP às membranas pancreáticas de murino (Exemplo 1). Ensaiou-se a ligaçao em triplicado utilizando 0,1 nM de I-GRP e as concentrações de péptido indicadas. A abcis--sa (eixo dos XX) indica logaritmicamente a concentração de agonistas ou de antagonistas do receptor de GRP. A ordenada (eixo dos YY) indica a ligação observada para cada um dos péptidos ensaiados, que se mediu como uma percentagem da liga, 125 çao maxima de I-GRP (nao se encontrando presente os pepti- dos). Da análise de LIGAND deste e de outros ensaios conclui_u 13 14 -se que tanto a bombesina como a (Phe Leu )-bombesina poss_u iam um de 0,1 nM e que a (Ptie^ "^"C ] Leu^)-bombesina possuia um de 3 nM. -o-bombesina -O - (Phe''’ ^Leu^)-bombesina -Δ- (Phe ^Τρ’ζ CH 2S) Leu -bombesina A Figura 3 ilustra a capacidade de GRP, mas nao de (Phe1 J Leui^)-bombesina, para estimular a viragem de fosfatidilinositol (PI) de um modo dependente da dose (Exemplo 2). A abcissa (eixo dos XX) indica logaritmicamente a coii centraçao do péptido presente. A ordenada (eixo dos YY) indica a viragem de PI observada como uma percentagem do controlo. Os valores sao iguais a média - desvio-padrao de determinações em triplicado; quando nao se indicam, os erros sao ^ às dimeii soes dos pontos de registo. A perda de efeito na viragem de PI pela (Phe^ 3f[ CI^S }Leu^)-bombesina, em concentrações três vezes superiores à quantidade de GRP que origina a estimulação que se encontra mais próxima da estimulação máxima iri -45- dica que este péptido não possui actividade agonista.
-o-GRP "A"(Phe^ 3Leu ^)-borabe sina A Figura 4 ilustra a capacidade de (Phe^^^^CH^S jLeu^) -borabesina, para antagonizar a viragem de PI induzida por GRP no pâncreas de murino (Exemplo 2). A abcissa (eixo dos XX) iii dica de um modo logarítmico a concentração de péptido presente. A ordenada (eixo dos YY) indica a viragem de PI observada como uma percentagem de controlo. A incubação prévia durante 30 minutos com (Phe1^ CC^S ]Leu1^)-bombesina 1000 nM redu ziu a estimulação da viragem de PI por GRP 1-1000 nM, por com paraçao com apenas GRP. Os dados sao iguais a média t desvio--padrao de determinações em triplicado; quando nao se indicam, os erros foram ^ às dimensões dos pontos de dados. A capacida_ de de (Phe1 3YCcx2sJ Leu^)-bombesina, para inibir as acçoes de GRP demonstrou que é um verdadeiro antagonista. -o-GRP sozinho -^-GRP após (Phe^ ’ψ’ [ CI^S jLeu^)-bombesina
Figura 5: utilizou-se a HPLC de fase inversa para se separarem os isómeros de sulfóxido de metileno, empregando uma coluna C18 de fase estacionária (coluna analítica Vydac,4,6mm Dl x 25 cm, 5 microns, C18). Bombou-se a fase móvel com um cau dal de 2 ml/minuto com um gradiente linear de 25%-75% de ace-tonitrilo em água contendo ácido trifluoroacético a 0,1%, durante 25 minutos. Phe YiCHjSfCOjh.eu-L itorina e Phe (0 )3 ^Leu-Litor ina tiveram tempos de retenção de, -46
respectivaraente, 5,40 minutos e 6,28 minutos. 0 composto inicial da reacção, ÇphegCcHoS 3 Leu^ 1-Litorina, no sistema de HPLC teve um tempo de retenção de 10,92 minutos.
No Quadro 1 comparam-se os resultados dos ensaios aii teriores (Figuras 1-4) para afinidade do receptor (K^) e para a viragem de PI, para diversos dos análogos de bombesina. QUADRO 1
Afinidade e Eficácia de Diversos Análogos Peptídicos
Viragem de PI
Sequência_______ Kd (nM) Agonista Antag . pOQRLGNQWAVGH F^f CH„S lL*fc 3 - + pQ Q W A V G H FTpTCHoSjL# 3 + Acf Q W A V G H Fy[CH2S]L# 10 - + N Q W A V G H FlJXci^S ]L# 50 ND ND N Q ¥ A V G H Fy[CH2S(0) JláfcblOO ND ND pQ Q W A V G H FY{;CH2SJZ#· 4 ND ND pQ Q W A V G H FY|]CH2S(0)]1 L# 2 - + pQ Q W A V G H F'2r[CH2S(0)]11 Ufr 1 - +
Determinou-se Kd tal como no Exemplo 1 e a viragem de PI, tal como no Exemplo 2. 0 símbolo ,,+” indica actividade e o simbolo indica a inexistência de actividade, ND indi ca que nao se determinou a actividade. A actividade agonista é a capacidade para estimular a viragem de PI, a actividade antagonista é a capacidade para bloquear a viragem de PI esti_ mulada por GRP. 0 símbolo Ac, representa um grupo acetilo; o -47-
símbolo pQ representa piroglutamina; o símbolo Q representa glutamina; o símbolo A representa alanina; o símbolo R representa arginina; o símbolo N representa ácido aspártico; o sim. bolo C representa cisteína; o símbolo E representa ácido glu-tâmico; o simbolo G representa glicina; o símbolo H representa histidina; o símbolo I representa isoleucina; o símbolo L representa leucina; o simbolo K representa lisina; o simbolo M representa metionina; o simbolo F representa fenilalanina; o símbolo P representa prolina; o símbolo S representa serina; o símbolo T representa treonina; o símbolo W representa tript£ fano; o símbolo Y representa tirosina; o símbolo V representa valina; as letras maiusculas indicam um L-aminoácido; as letras minúsculas indicam um D-aminoácido; o símbolo Z represen. ta norleucina; o símbolo representa uma ligaçao de amida; possui uma conexão Cf^S interaminoácida; [ch2s(0)] possui uma ligaçao interaminoácida CH2S(0), os exponentes I e II referem-se aos isómeros de CH2S(0).
J
Claims (13)
- -48- sr.·,/reivindicações 1.- Processo para a preparação de ura derivado peptídico de fórmula geral X-N—A1 -A2-A3-A4-A5 -Ag-A?-Ag-Ag-A^ q-A-j -j-A^ 2“a-| 3~ ψ -A., 4~C-Y na qual X representa um resíduo de terminal araino selec-cionado entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, um ou dois grupos acilo com 2 a 10 átomos de carbono, carbobenziloxi ou t-butiloxi-carbonilo; a menos que o aminoácido de terminal amino seja um derivado cíclico e então X é omitido. N representa uma sequência de Bombesina, GRP, ou uma variante natural ou porção de uma destas sequências, uma ligação, ou representa um péptido com 1 a 11 resíduos de quaisquer aminoácidos; a menos que o aminoácido de termi· nal amino seja um derivado cíclico e então N é omitido. A1 representa um radical Glp ou um resíduo hidrofílico ácido adequado; A2 representa um radical Gin, um resíduo hidrofóbico ou neutro adequado, Nle, ácido C£-amino-butírico, pSubPhe, BNap, ou uma ligação; Ag representa um radical Arg, um resíduo hidrofílico básico adequado ou uma-ligação; A^ representa um radical Leu. ou representa o mesmo que o símbolo A2; A^ representa um radical Gly, o mesmo que' o símbolo A2, D-Phe ou D-Ala; Ag representa um radical Asn, o mesmo que o símbolo A2, D-Ala, pGlu, Lys, Lys(Z), SubPhe, ou D-Phe; Ay representa um radical Gin, His, um resíduo hidrofílico básico ou hidrofóbico, neutro adequado, CÓNap, D-His, MeHis, His (t-Me) , Hisítf-Me), D-Glu(OMe), D-Glp, D-Leu, MeLeu, D-Phe ou Glu; Ag representa um radical Trp, um resíduo neutro adequado , ou Met, MeTrp, SubPhe, Lys, Cha ou Lys [Z(2C1)]; Ag representa um radical Ala, o mesmo que o símbolo A2, MeAla, Aib, D-Phe, L-Nal, Arg ou Glu; A.jq representa um radical Vai, o mesmo que o símbolo A2, -50-MeVal, Thr(CH2Ph) ou DL-Flg;representa um radical Gly, um resíduo neutro adequado, Phe, D-Phe, Sar, D-Ala, D-Ser, D-Ser(Ch2Ph), SubPhe, D-Pro, D-Lys, Asp, D-Arg, D-Lys[Z(2C1)], Ac^c, Ac5c ou Ac6c; A^2 representa um radical His, um resíduo hidrofílico básico ou neutro adequado, Tyr, D-Phe, pSubPhe, His, MeHis, His ( f -Me), His(T^-MeOH), D-pcF, Aib, Ahx, Ape, Gin, Lys, Lys(Z), Ser, Ser(CH2Ph), Thr, Glu, Asp, AspíOBu*1) ou N-Nal; A13 representa um radical Leu, Phe, um resíduo neutro hidrofõbico adequado, Ahx, MeAhx, Ape, MeApe, D-Leu, MeLeu, Melle, MeVal ou Glu; J Ψ representa um determinante dipeptídico de A*' ^aa Ψ A^aa em que Ψ significa [CH^S], [CH2S(O)] , [CH2s(0)]1 e [CH2SO]^^, em que A^aa e A^aa representam os aminoácidos substituintes, e Aaa representa os aminoãcidos substituintes; A^4 representa o radical Leu, Met, Nle um resíduo neutro ou hidrofõbico adequado, Ahx, MeAhx, Ape, MeApe, D-Leu, MeLeu, Melle, MeVal ou Glu; C representa uma sequência de Bombesina, GRP ou uma variante natural ou sua porção, uma ligação, ou representa um péptido com 1 a 11 resíduos de qualquer amino-ácido; e -51- 7 Y representa um resíduo de terminal carboxi seleccionado entre OH, éster alcoxi C^-Cg, carboxamida, mono- ou dial-quil(C1-C4)-amida, alquil(C^-C4)-amina, éter tio-alquilí-co(C1—C4), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, caracterizado pelofacto: a) de se utilizar uma resina com um dipeptido protegido C-termi-nal ligado adequadamente a partir do grupo de fórmula geral na qual "ψ1 representa [CH2S] e A13 e A14 representam os aminoácidos substituintes; b) de se ligar sequencialmente os outros aminoácidos protegidos por alfa amino, A^ através de X, para se obter a sequência de aminoácidos protegidos desejada; c) de se removerem os grupos protectores referidos; d) de se purificar o péptido desejado, ou opcionalmente de se -formar os isõmeros "ψ" [CH23 (0) ]1 e Tp' [CHjSO]1'1' do referido J péptido ipr[CH2S] e de se purificar depois o péptido isomé-rico desejado.
- 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepas ração de um derivado peptídico de fórmula geral X—N“A-J—A2-A3—A4-A5-Ag—A7-Ag—A?—A^ q-A-j t “a-j 2~a1 3— Xp -A1 4~C-Y na qual X representa um resíduo amino terminal seleccionado entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo com 1 alO átomos de carbono, um ou dais grupos acilo -52- f trcom 2 a 10 átomos de carbono, carbobenziloxi ou t-butiloxi--carbonilo; a menos que o aminoácido de terminal amino represente um derivado cíclico e então X é omitido.N representa a sequência de Bombesina, GRP, ou uma variante natural ou porção de uma destas sequências, uma ligação, ou representa um péptido com 1 a 11 resíduos de quaisquer aminoácidos; a menos que o aminoácido de terminal amino. represente um derivado cíclico e então N é omitido. A.j representa um radical pGlu ou um resíduo hidrofílico ácido; A2 representa um radical Gin, um resíduo hidrofõbico ou neutro adequado, Nle, um ácido cC-aminobutírico, pSubPhe, BNap ou uma ligação; Ag representa o radical Arg, um resíduo hidrofílico básico adequado ou uma ligação; J A^ representa um radical Leu, ou é o mesmo que A2; Α^ representa o radical Gly, o mesmo que A2, D-Phe, ou D—Ala; Ag representa o radical Asn, o mesmo que A2, D—Ala, NAc-D-Ala, pGlu ou D-Phe; Aj representa Gin, His, um resíduo hidrofílico básico ou hidrofõbico neutro adequado, C^Nap ou D-Gln; Ag representa o radical Trp, um resíduo neutro adequado ou Met; -53- Ag representa Ala ou o mesmo que A2; A1q representa o radical Vai ou o mesmo que A2; A.j^ representa o radical Gly, um resíduo neutro adequado, Phe ou D-Phe D-Ala;A.j 2 representa o radical His, um resíduo hidrofílico básico ou neutro adequado, Tyr, D-Phe, ou pXPhe (X=P, Cl, Br, OH, ou CH3)? A.j3 representa o radical Leu, Phe, Nle, ou representa um resíduo neutro ou hidrofõbico adequado; Ψ representa um determinante dipeptídico do radical de - 13 14 formula geral A aaTJT A aa na qual TJ7 representa um radical [CH2S] , [CH2S(0)], [CHjSÍO)]1, e ψ [c^SO]11, na qual A13aa e A^4aa representam os aminoãcidos substituin-tes; A14 representa o radical Leu ou Met, ou representa um resíduo neutro ou hidrofõbico adequado; J C representa uma sequência de Bombesina, GRP, ou uma variante natural ou uma sua porção, uma ligação, ou representa um péptido com 1 a 11 resíduos de qualquer amino-ácido; e Y representa um resíduo de terminal carboxi seleccionado entre OH, éster de alcoxi C^-Cg, carboxamida, mono- ou dialqull(C^ —C4)-amida, alquil(C^-C^)-amina, éter de tio--alquil C.,-^, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, caracterizado pelo% facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
- 3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um derivado peptídico de fórmula geral: χ-ν-α1-α2-α3-α4-α5-α5-α7-α8-α9-α10~α11-α12~α13- ψ -a14-c-y na qual X representa iam resíduo de terminal amino se-leccionado.entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, um ou dois grupos acilo com 2 a 10 átomos de carbono, carbo--benziloxi ou t-butiloxi-carbonilo; a menos que o ami noácido de terminal amino represente um derivado cíclico e então X é omitido; N representa sequências de Bombesina, GRP, ou variantes naturais ou porções das suas sequências, uma liga ção, ou representa um péptido com 1 a 11 resíduos de quaisquer aminoácidos; a menos que o aminoácido de terminal amino represente um derivado cíclico e então N é omitido; A^ representa o radical pGlu ou uma ligação; A^ representa o radical Gin ou uma ligação; A^ representa o radical Arg ou uma ligação? A4 representa o radical Leu ou uma ligação? A5 representa o radical Gly ou uma ligação; Ag representa o radical Asn ou D-Phe; -55-¥ .¾ Aj representa o radical Gin ou His; Ag representa o radical Trp; Ag representa o radical Ala; A^g representa o radical Vai; A11 apresenta o radical Gly ou D-Ala; A^2 representa o radical His.; A12 representa o radical Phe; ’ψ’ representa um determinante dipeptídico de XxxTpXx, na qual tp representa [CH2S], [CH^fO)1 e II tp· [CH2SO] . , em que A-^aa e A^aa representam os ami-noácidos substituintes; A^4 representa o radical Leu ou Nle; C representa uma sequência de Bombesina, GRP, ou uma variante natural ou sua porção,· uma ligação, ou repre senta um péptido com 1 a 11 resíduos de qualquer aminoá eido; Y representa um resíduo de terminal carboxi selecciona-do entre OH, éster alcoxi C^-Cg, amino, mono- ou dial-quil(C1-C4)-amida, alquil(C1~C4)-amina, éter de tio-al-quilo C^-C^, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
- 4,- Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, pa -56-ra a preparação de pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val--Gly-His-Phe ^[CH2S]Leu-NH2, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .
- 5. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3/ para a preparação de Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His--Pheip [CH^S]Leu-NH2/ caracterizado pelo facto de se utiliza rem compostos iniciais correspondentemente substituídas.
- 6. — Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, para a preparação de Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe ‘ψ" [CH2S]Leu-NH2, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
- 7. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, para a preparação de Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe.Tjr [CH2S(0)]Leu-NH2, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
- 8. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, para a preparação de pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe ·ψ [CH2S(0)]Leu-NH2, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos. -57-
- 9.- Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, para a preparação de pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe ψ [CH^S]Nle-NH2/ caracterizado pelo facto de se utilizarem com postos iniciais correspondentemente substituídos.
- 10.- Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, para a preparação de pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe ”ψ· [CH^S(O)]^Leu—NHj, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
- 11.- Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, para a preparação de pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe ψ [CH2S(0) ]IILeu-NH2, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
- 12,- Processo para a preparação de uma composição far macêutica, caracterizado pelo facto de se incorporar, como ingrediente activo, um derivado peptídico, guando preparado pelo processo de acordo com as reivindicações anteriores, em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
- 13.- Método para o tratamento de cancros, para contro lar o desenvolvimento de tecido de tumor, para o tratamento de úlceras pépticas ou para efectuar o antagonismo de Bombesina/' /GRP em um paciente, caracterizado por se administrar entre 0,2 mg/Kg e 250 mg/Kg de peso de corpo do paciente e por dia de um derivado peptldico quando preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1. Lisboa, 21 de Novembro de 1990
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