JP3838656B2 - ポリペプチドのボンベシン拮抗物質 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｎ．Ｃ．Ｉ．（ＮＩＨ）によって認められた、政府の支持の元で作成されたものである。アメリカ合衆国政府は、本出願に特定の権利を有している。
本発明の分野
本発明は、ヒトにおける癌性の腫瘍の生育に影響を及ぼす新規なペプチドに関するものである。さらに詳しくは、本発明は、Ｃ末端の位置にＴａｃ、ＭＴａｃ、またはＤＭＴａｃ残基を有するψ8-9プソイドペプチドであるボンベシン拮抗物質、その塩、および薬剤組成物、これらのペプチドの合成方法および上記ペプチドに関する使用方法に関するものである。これらのペプチドは、ボンベシンまたはボンベシン様ペプチドに対する拮抗特性を有する。
本発明の背景
本発明は、ボンベシン若しくはボンベシン様ペプチド（ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ニューロメジンＣ等の）に対する拮抗特性（以降、ボンベシン拮抗特性と称する）を有するポリペプチド化合物に関するものであり、これらは、例えば、ヒト等の温血動物における悪性の病気の治療において有用である。本発明は、新規なポリペプチド化合物およびそれらの製造方法；上記ポリペプチド化合物を含む新規な薬剤組成物およびヒト等の温血動物においてボンベシン拮抗効果を得るのに使用するための上記化合物を含む薬剤の製造方法を含むものである。
ボンベシンは、カエル、ボンビナ ボンビナ(Bombina bombina)の皮膚から初めて単離されたテトラデカペプチドアミドである（アナスタシ(Anastasi)、エルスパマー(Erspamer)およびブッチ(Bucci)、エックスペリエンティア(Experientia)、１９７１年、２７巻、ページ１６６）。ボンベシンはマウスのスイス ３Ｔ３(mouse Swiss 3T3)繊維芽細胞の強力なミトゲンであり（ローゼンガルト(Rozengurt)およびシンネット−スミス(Sinnett-Smith)、プロシ ナショル アカデ サイ アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、１９８３年、８０巻、ページ２９３６）、モルモットの膵臓の腺房からのアミラーゼの分泌を刺激する（ジェンセン(Jensen)、ジョーンズ(Jones)、フォルカーズ(Folkers)およびガードナー(Gardner)、ネイチャー(Nature)、１９８４年、３０９巻、ページ６１）ことが知られている。また、ボンベシン様ペプチドはヒトの肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）細胞によって製造および分泌され（ムーディ(Moody)、パート(Pert)、ガズダー(Gazdar)、カーネイ(Carney)およびミンナ(Minna)、サイエンス(Science)、１９８１年、２１４巻、ページ１２４６）、外因的に加えられたボンベシン様ペプチドはイン ビトロ(in vitro)でヒトのＳＣＬＣ細胞の生育を刺激でき（カーネイ(Carney)、カッティタ(Cuttita)、ムーディ(Moody)およびミンナ(Minna)、カンサー リサーチ(Cancer Research）、１９８７年、４７巻、ページ８２１）、さらにボンベシンおよびＧＲＰのＣ末端領域に特異的なモノクローナル抗体は受容体へのＧＲＰの結合を遮断し、イン ビトロ(in vitro)およびイン ビボ(in vivo)の両方でヒトのＳＣＬＣ細胞の生育を阻害できる（カッティタ(Cuttita)、カーネイ(Carney)、マルシャイン(Mulshine)、ムーディ(Moody)、フェドルコ(Fedorko)、フィシュラー(Fischler)およびミンナ(Minna)、ネイチャー(Nature)、１９８５年、３１６巻、ページ８２３）ことも知られている。
ボンベシン様特性を有するＧＲＰは、ブタの腸から単離された２７アミノ酸を有するく市販されているペプチドアミドであり（マクドナルド(McDonald)、ジョーンヴァル(Jornvall)、ニルソン(Nilsson)、ヴァーン(Vagne)、ガテイ(Ghatei)、ブルーム(Bloom)およびマット(Mutt)、バイオケム バイオフィズ レス コミュニ(Biochem. Biophys. Res. Commun.)、１９７９年、９０巻、ページ２２７）、上記ペプチドアミドにおけるＣ末端のアミノ酸配列はボンベシンのものとほぼ一致している。ニューロメジンＣは、デカペプチドアミドであり、その構造はＧＲＰのＣ末端領域における最後の１０アミノ酸が一致しており、イヌの小腸から単離された（リーブ(Reeve)、ワルシュ(Walch)、チュー(Chew)、クラーク(Clark)、ホウク(Hawke)およびシヴェリー(Shively)、ジェー バイオル ケム(J. Biol. Chem.)、１９８３年、２５８巻、ページ５５８２）。ＧＲＰは、体循環におけるガストリンの放出等の、様々な生物学的反応を刺激する。また、ＧＲＰは、３Ｔ３マウスの繊維芽細胞および肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）細胞の生長因子としても機能する。このため、ＧＲＰは、オートクラインの生長メカニズムを経由したＳＣＬＣの発達において直接的な病態生理学的な役割を果たしていると考えられてきた。
ボンベシン、ニューロメジンＣおよびＧＲＰのＣ末端ノナペプチドの構造は以下に示す通りである：
ボンベシン pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
ニューロメジンＣ H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
ＧＲＰのＣ末端ノナペプチド Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
他の両生類のボンベシン様ペプチドに関する調査によって、リトリン(Litorin)、即ちパプア、ニューギニアのカエルの皮膚内のノナペプチド(pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)が単離され、このペプチドは非常に強力なボンベシン類似体であることが分かっている（ヤスカラ(Yasukara)ら、ケム ファーム バル(Chem. Pharm. Bull.)、１９７９年、２７巻、ページ４９２）。ボンベシン類似体に関する研究によって、ボンベシンの６から１４番目の位置の９アミノ酸残基の最小断片がボンベシン活性の全スペクトルを有することが分かった。
様々な種類のボンベシン拮抗物質が現在知られている。ボンベシンとわずかなアミノ酸配列の相同性を有する物質Ｐ（Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2）はボンベシンおよびボンベシン類ペプチドの結合を阻害しないが、(D-Arg1、D-Pro2、D-Trp7,9、Leu11)物質Ｐおよび(D-Arg1、D-Phe5、D-Trp7,9、Leu11)物質Ｐ等のいくつかのＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換することによって修飾された物質Ｐの類似体（ムーディ(Moody)ら、フェド プロシーディングス(Fed. Proceedings)、１９８７年、４６巻、ページ２２０１）は、膵臓の腺房細胞内のボンベシンの分泌を遮断し、スイス ３Ｔ３(Swiss 3T3)細胞におけるボンベシンの成長促進効果に拮抗するが分かった。例えば、(D-Phe6、D-Phe12)のボンベシン、および[Leu13-psi-Leu14]のボンベシン等の、ボンベシン由来の２タイプのボンベシン拮抗物質（コイ(Coy)ら、ジェー バイオル ケム(J. Biol. Chem.)、１９８８年、２６３巻、ページ５０５６およびペプチズ(Peptides)、１９８９年、１０巻、ページ５８７）は、イン ビトロ(in vitro)およびイン ビボ(in vivo)においてボンベシン反応の強力な阻害剤であることが知られている。
ハイムブルック(Heimbrook)ら（バイオ ケム(Bio. Chem.)、１９８９年、２６４巻、ページ１１２５８）によって明らかにされた他のタイプのボンベシン拮抗物質は、Ｃ末端のメチオニン残基がＧＲＰ（２０−２７）類似体から欠損した、Ｎ−アセチル−ＧＲＰ（２０−２６）およびその類似体である。コイ(Coy)[ジェー バイオル ケム(J. Biol. Chem.)、２６４巻、１９８９年、２５、ページ１４６９１]は、[D-Phe6、Leu13-psi-Phe14]ボンベシン−（６−１４）および[D-Phe6、Leu13-psi-Leu14]ボンベシン−（６−１４）等のリトリン(Litorin)配列を基礎とした短鎖のボンベシン拮抗物質によっては上記に相当する親ペプチド(parent peptide)[Leu13-psi-Leu14]ボンベシンよりかなり強い力を示すことを報告した。
ＧＲＰの直鎖の（環状でない）ボンベシン類似体および必要であればＣＨ2−ＮＨの非ペプチド結合を有する両生類のボンベシンは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９０／０３９８０号に（および関連した類似体ＷＯ ９１／０２７４６号）に記載されている。これらの類似体は、天然のボンベシンペプチドの阻害剤としての作用に関していえば、以下の式を有する：
ただし、Ｒ1及びＲ2はＨであり；Ａ0は欠損てもよく；各位置の多くの可能なアミノ酸のうち、Ａ1はD-Phe、D-Trp、またはD-Nalであり；Ａ2はGlnであり；Ａ4はAlaであり；Ａ5はValであり；Ａ6はGlyであり；Ａ7はHisであり；およびＷは以下の式で表わされる：
ただし、Ｒ4はＣＨ2−ＮＨであり；場合によっては、Ｚ1はLeuと同じ側鎖、つまり−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2であり；Ｚ2はCys若しくはMetと同一の側鎖、つまり−ＣＨ2−ＳＨ若しくは−（ＣＨ2）2−ＳＨ−ＣＨ3であり；ＶはＮ（Ｒ6）Ｒ7［但し、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8はＨであり；Ｒ1及びＲ2はＨ若しくはＣＯＥ1（但し、Ｅ1はＣ1-20アルキルである）である］である。
また、ボンベシンの直鎖のペプチド類似体は、ＥＰ ０ ３０９ ２９７号にも記載されている。これらのペプチドはＣ末端のＭｅｔ残基およびＣ末端とその付近の残基との間に［ＣＨ2−ＮＨ］プソイドペプチド結合を有する。
本発明の要約
本発明は、強力なボンベシン拮抗物質である新規なポリペプチド；これらのポリペプチドの合成方法；および上記ポリペプチドからなる薬剤組成物による及び上記ポリペプチドの或いは薬剤活性物質としての組成物の医療への適用を提供するものである。
Ａ．合成ペプチド
さらに詳しくは、第一の実施態様は、以下の式Ｉの強力なボンベシン拮抗物質であるプソイドペプチド(pseudopeptide)を提供するものである：
X-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q Ｉ
ただし、Ｘは、水素、
Ａ2がGluである際にはＡ2の３−プロピオニル部分上のγ−カルボキシル部分にＡ1のα−アミノ基が結合した単結合、または
式Ｒ1ＣＯ−の基であり、
但し、Ｒ1は、以下よりなる郡から選ばれたものであり；
a) 水素、Ｃ1-10アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ1-10−アルキル、ｐ−Ｈｌ−フェニル、ｐ−Ｈｌ−フェニル−Ｃ1-10−アルキル、ナフチル、ナフチル−Ｃ1-10−アルキル、インドリル、インドリル−Ｃ1-10−アルキル、ピリジル、ピリジル−Ｃ1-10−アルキル、チエニル、チエニル−Ｃ1-10−アルキル、シクロヘキシルまたはシクロヘキシル−Ｃ1-10アルキル等であり（但し、ＨｌはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、ＣＨ3若しくはＯＣＨ3である）；
b)
但し、Ｒ2は、水素、Ｃ1-10アルキル、フェニルまたはフェニル−Ｃ1-10−アルキルであり、
Ｒ3は、水素若しくはＣ1-10アルキルであり；
c) Ｒ4−Ｏ
但し、Ｒ4は、Ｃ1-10アルキル、フェニルまたはフェニル−Ｃ1-10−アルキルであり；
Ａ1は、Phe、p-Hl-Phe、pGlu、Nal、Pal、Tpi、置換されないTrp若しくはベンゼン環内でＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ2及びＣ1-3アルキルからなる群より選ばれた１つまたはそれ以上の基で置換されたTrpからなる群から選ばれたD-、L-若しくはDL-アミノ酸残基；またはＡ2のα−アミノ部分にＲ1ＣＯ−のアシル部分が結合したペプチド結合であり；
Ａ2は、Gln、Glu[-]、Glu(Y)またはHisであり、
但し、[-]は、Ｘが単結合でありＡ2がGluである際にはＡ2の３−プロピオニル部分上のγ−カルボキシル部分とＡ1のα−アミノ部分とが結合した単結合であり、
Ｙは、以下のいずれかであり、
a) −ＯＲ5（但し、Ｒ5は、水素、Ｃ1-3アルキル若しくはフェニルであり）；または、
b)
であり、
但し、Ｒ6は、水素若しくはＣ1-3アルキルであり；
Ｒ7は、水素、Ｃ1-3アルキル若しくは−ＮＨＣＯＮＨ2であり、さらに、
Ｌｅｕ−ｐｓｉ−は、Ａ9残基付近のα−アミノ部分との−ＣＨ2−部分の結合がプソイドペプチド結合であるようにＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ2−に置換されたＬｅｕの還元型であり；
Ａ9は、Ｔａｃ、ＭＴａｃ、若しくはＤＭＴａｃであり；
さらに、
Ｑは、ＮＨ2若しくは−ＯＱ1（但し、Ｑ1は、水素、Ｃ1-10アルキル、フェニル若しくはフェニル−Ｃ1-10−アルキルであり）である；
および製薬上使用できるこれらの酸または塩。
Ａ1が単結合である際には、式Ｉのプソイドペプチドはオクタペプチドであるが、Ａ1がアミノ酸若しくはこの類似体である際には、このプソイドペプチドはノナペプチドである。
Ａ9は、Tac、MTac、若しくはDMTacであるので、Ａ9には５員の複素環が存在する。この環は、通常、式Ｉのノナペプチドの合成において所定の位置のＡ9残基の側鎖を、好ましくはホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒドで酸化し、側鎖をＡ9のα−アミノ基で環化することによって形成される。このようにして得られた環化されたＡ9残基の性質は、元の酸化されていないＡ9および使用される酸化剤の性質によって変化する。
したがって、Cys9の−ＣＨ2−ＳＨ基がホルムアルデヒドとの反応におけるLeu-psi−プソイドペプチド結合付近のCys9のα−アミノ基で環化する際には、得られた環は以下の式ＩＩＡの構造を有する（式Ｉのノナペプチドの-Leu8−psi-Tac9-NH2断片として示される）；
これらのプソイドペプチドは、Ａ9がCysまたはPenである非環状の実施態様より大きな生物学的活性及びより長期間の安定性を有する。しかしながら、Ａ9が環状でない際の式Ｉのペプチドの好ましい実施態様としては、Ｘ、Ａ2、及びＱが上記と同様であり、Ａ9がCysまたはPenであり、さらにＡ1がL-若しくはD-Pal、L-若しくはD-TpiまたはHcaからなる群より選ばれた非天然に生成するアミノ酸である。
好ましい実施態態としては、ＸはＲ1ＣＯ（但し、Ｒ1は水素若しくはＣ1-10アルキルであり、好ましくはメチルである）；Ａ1はD-Cpa、D-Nal、D-Phe、D-或いはL-Tpi、またはD-Trpであり；Ａ2はClnであり；Ａ9はTac若しくはDMTacであり；およびＱはＮＨ2である。
しかしながら、他の好ましい実施形態では、Ａ1はＡ2のα−アミノ基にＲ1ＣＯ−のアシル部分が結合したペプチド結合であり；Ａ2はGlnまたはHisであり；Ａ9はTac、M-Tac若しくはDM-Tacであり；およびＱはＮＨ2である。これらのペプチドの好ましい形態としては、ＸはHca、Hna、Paa、Mpp、Hpp若しくはNaaであり；Ａ2はGlnであり、Ａ9はTacである。
Ｂ．合成方法
式Ｉのボンベシン拮抗物質は固相合成(solid phase syn thesis)によって合成される。第一のプロトコルとしては、すべてのアミノ酸を、Ｃ末端残基を樹脂の支持相に連結した後、順次それぞれ結合していく。全アミノアシル残基を樹脂に連結した直後、プソイドペプチドの５員の複素環を、Ｃ末端残基の側鎖を酸化剤と反応させることによって形成する。次に、プソイドペプチドをＨＦ処理し、樹脂の支持相からペプチド部分を外す。この反応によって、側鎖の保護基も除去される。
第二のプロトコルとしては、式Ｉのプソイドペプチドを固相および液相によって構築される２断片として合成する。Ｃ末端を含むトリペプチドをオリゴペプチドと連結し、式Ｉの全ボンベシン拮抗物質を形成する。
５員の複素環を、Ａ9の側鎖を酸化剤と反応させることによって形成する。次に、このペプチドをＨＦ処理することによって、すべてのアミノアシル残基の側鎖の保護基を除去し、樹脂からペプチドを切断する。
Ｃ．医療への使用
式Ｉのプソイドペプチドは薬剤組成物中に使用し、製薬用の担体に含まれる有効量のプソイドペプチド若しくはこの治療学的に使用できる酸或いは塩を投与することによって、ある種の哺乳動物の癌および他の症状を治療することができる。これらの化合物は、１日に１ｋｇの体重当たり約１〜１，０００μｇの投与量で治療学的に使用できる担体と共に投与される。このような組成物は、非経口的に、静脈内に、皮下に、筋肉内に、鼻腔内に、肺用のエアロゾルによって若しくは貯蔵形態(depot form)で投与することができる。
図の説明
図１は、表２、実施例７のデータに基づいた、特定のボンベシン拮抗物質を投与することによるＭＸＴマウス乳癌に関する効果を示すグラフである。
図２は、表４、実施例８のデータに基づいた、特定のボンベシン拮抗物質を投与することによるヌードマウスにおけるＳＣＬＣ腫瘍の容積に関する効果を示すグラフである。
図３は、表５、実施例９のデータに基づいた、特定のボンベシン拮抗物質を投与することによるヌードマウスにおけるＭＩＡ ＰＡＣＡ−２の膵臓の腫瘍の容積に関する効果を示すグラフである。
図４は、表６、実施例１０のデータに基づいた、特定のボンベシン拮抗物質を投与することによるヌードマウスにおけるＣＡＰＡＮ−２の膵臓の腫瘍の容積に関する効果を示すグラフである。
好ましい実施態様の説明
Ａ．合成ペプチド
１．命名法
本発明を説明する上で便宜上、アミノ酸、ペプチドおよびこれらの誘導体の従来の略称を、ペプチド分野において通常用いられているようにおよびアイユーピーエーシー−アイーユービー コミッション オン バイオケミカル ノーメンクラチャー(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)［ヨーロッピアン ジェー バイオケム(European J. Biochem.)、１９８４年、１３８巻、ページ９〜３７］によって推奨されているように用いる。
個々のアミノ酸残基の略称は、アミノ酸の普通名称をもとにしており、例えば、Alaはアラニン、Cysはシステイン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、pGluはピログルタミン酸、Glyはグリシン、Hisはヒスチジン、Leuはロイシン、Pheはフェニルアラニン、Trpはトリプトファン、及びValはバリンである。Gluはγ−カルボキシル側鎖に連結する官能基を有する：[-]またはＹは上記したのと同様である。Dpaは、２，３−ジアミノプロピオン酸(2,3-diaminopropionic acid)である。アミノ酸残基が異性体を有する際には、アミノ酸の記号の前にＤ−若しくはＤＬ−による記載のない限りＬ−体のアミノ酸を表している。
本発明において用いられる通常使用されないアミノ酸の略称は以下の通りである：
Cpaは、パラ−クロロフェニルアラニンである。
Dpaは、２，３−ジアミノプロピオン酸(2,3-diaminopropionic acid)である。
pGluは、ピログルタミン酸である。
Nalは、３−（２−ナフチル）−アラニン(3-(2-naphthyl)-alanine)である。
Palは、３−（３−ピリジル）−アラニン(3-(3-pyridyl)-alanine)である。
Penは、ペニシラミンである。
Tpiは、２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−ピリド−［３，４−ｂ］インドール−３−カルボン酸(2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido-[3,4-b]indole-3-carboxylic acid)である。
Tacは、チアゾリジン−４−カルボン酸(thiazolidine-4-carboxylic acid)である。
MTacは、２−メチル−チアゾリジン−４−カルボン酸(2-Methyl-thiazolidine-4-carboxylic acid)でである。
DMTacは、５，５−ジメチル−チアゾリジン−４−カルボン酸(5,5-Dimethyl-thiazolidine-4-carboxylic acid)である。
アミノ酸類似体としては以下のものが挙げられる：
Hcaは、ヒドロ桂皮酸(hydrocinnamic acid)またはデス−アミノ−フェニルアラニン(des-amino-phenylalanine)である。
Hnaは、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸(3-hydroxy-2-naphthoic acid)である。
Hppは、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸(3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid)である。
Mppは、３−（４−メトキシフェニル）プロピオン酸(3-(4-methoxyphenyl)propionic acid)である。
Naaは、ナフチル酢酸である。
Paaは、フェニル酢酸である。
使用する他の省略事項は、以下の通りである：
ペプチド配列は従来法に従って記載され、Ｎ末端のアミノ酸が左側でＣ末端のアミノ酸が右側にくる。しかしながら、完全なボンベシン拮抗物質のテトラデカペプチドにおける相当する位置による断片的なペプチドのアミノ酸残基の番号付けは特記されない限り従来法に基づかないことに注意する。従来法に従うと、本明細書に記載された式Ｉのノナペプチドの残基は６〜１４番目であり、ボンベシン拮抗物質のTrp-Ala-Val-Gly-His-Leuの核はＡ8−Ａ9−Ａ10−Ａ11−Ａ12−Ａ13と番号付けられる。混乱を防ぐために、ボンベシン拮抗物質は以下のように番号付けられる：Ｎ末端アミノ酸（またはアミノ酸類似体）残基はＡ1である；Ｃ末端アミノ酸（またはアミノ酸類似体）残基はＡ9である；および間の残基はＡ2（Ｎ末端残基Ａ1の付近）から順次Ａ8（Ｃ末端残基Ａ9の付近）に番号が増加するように番号が付けられる。
２．好ましい実施態様
好ましい実施態様は、以下の式Ｉのボンベシン拮抗物質ペプチドである。
X-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q Ｉ
ただし、Ｘ、Ａ1、Ａ2、Leu-psi、Ａ9及びＱは上記と同様である。
これらのボンベシン拮抗物質プソイドペプチドは、アミノ酸配列、特にＡ1、Ａ2及びＡ9の残基に特徴を有する；さらにＡ8とＡ9との間のプソイドペプチド結合の存在にも特徴を有する；さらに必要であれば、Ａ9における５員の複素環をも特徴とするものである。この環状構造は、Ａ9残基の特性およびこれを酸化するのに使用する化合物によって決定される。したがって、ホルムアルデヒドを用い、Ａ9がCysである場合には、得られる環は、以下の式ＩＩＡのＴａｃ構造［式Ｉのペプチドの-Leu8-psi-Tac9-Q断片（但し、ＱはNH2である）として示される］を有する：
Cysがアセトアルデヒドで酸化される場合には、得られた５員の複素環は、以下の式ＩＩＢのＭＴａｃ構造［式Ｉのペプチドの-Leu8-psi-MTac9-Q断片（但し、ＱはNH2である）として示される］を有する：
Ａ9がPenでありホルムアルデヒドで酸化される場合には、得られる環は、以下の式ＩＩＣ［式Ｉのペプチドの-Leu8-psi-DMTac9-Q断片（但し、ＱはMH2である）として示される］のＤＭＴａｃ構造を有する：
これらの好ましい実施態様において、ＸはＨまたはＡｃであり、Ａ1はD-Pheであり、Ａ2はGlnであり、ＱはNH2であることが望ましい。
本発明において特に最も好ましいプソイドペプチドのボンベシン拮抗物質を以下に示す。
本発明において特に好ましい実施態様としては以下が挙げられる：
Ｂ．合成方法
１．概説
式Ｉのプソイドペプチドは、ペプチド分野における当業者に公知の技術によって調製できる。よく利用される技術の要旨は、エム ボダンスキー(M.Bodanszky)、プリンシプルズ オブ ペプチド シンテシス(Principles of Peptide Synthesis)、スプリンガー−フェルラグ(Springer-Verlag)、ハイデルベルグ(Heidelberg)、１９８４年に記載されている。
すべての式Ｉのプソイドペプチドは固相合成法によって合成できる。特に好ましいこれらのペプチド及びこれらの中間ペプチドの調製方法は固相合成である。固相合成の技術は、ほとんど、ジェー エム スチュワート(J.M.Stewart)およびジェー ディー ヤング(J.D.Young)、ソリッド フェイズ ペプチド シンテシス(Solid Phase Peptide Synthesis)、ピアス ケム コーポレーション(Pierce Chem Co.)、ロックフォード、アイエル(IL)、１９８４年（２版）の本およびジー バラニー(G.Barany)ら、イント ジェー ペプチド プロテイン レス(Int.J.Peptide Protein Res.)、第３０巻、ページ７０５〜７３９，１９８７年の雑誌に掲載されている。（Ｃ末端のＡ9残基を酸化し、残基の特徴的な側鎖をそのα−アミノ基で環化するさらなる段階は式Ｉのペプチドの合成の様々な段階で行われる。）
少なくとも２つの合成プロトコルによって、式Ｉのプソイドペプチドのボンベシン拮抗物質が製造できる。第一のプロトコルでは、すべてのアミノ酸を、Ｃ末端残基、Ａ9を樹脂の支持相に連結した後、順次それぞれ結合していく。第二のプロトコルでは、トリペプチドを樹脂上に構築する。さらに、このトリペプチドを残りのアミノ酸を有するオリゴペプチドに連結することによって、ボンベシン拮抗物質を形成する。これらプロトコルは２つとも、合成がＣ末端のＡ9残基で始まり、アミノ酸残基を順次付加することによってＮ末端残基に向かって成長させる。
１．（ａ）第一のプロトコル
プソイドペプチドの固相合成で用いられる樹脂支持相は、ベンズヒドリルアミン(benzhydrylamine)（ＢＨＡ）樹脂またはジビニルベンゼンで１％架橋されたクロロメチル化ポリスチレン樹脂であり、これらは両方とも市販されている。Ｃ末端のＡ9残基をカルボキシル基を介して上記樹脂に結合させる。これら２つの残基間の反応は、樹脂に連結する前に各Ａ9残基のα−アミノ基に化学保護基(chemical protecting group)を結合させることによって阻害される。Ａ9残基、および順次連結されるアミノ酸残基のα−アミノ基に対する保護基は、９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)（Ｆｍｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル(tert-butoxycarbonyl)（Ｂｏｃ）基のいずれかである。Ｆｍｏｃは、Ｂｏｃを除去する反応によってＣ末端のＡ9の残基から側鎖の保護基をも除去するため、Ｃ末端のＡ9からＡ2の残基に連結する(coupling)際に、好ましい。これらの連結反応の間、アミノ酸残基によっては特徴的な側鎖の官能基を、連結反応の前に化学保護基（Ａ9に対しては好ましくはＢｕｔ）を結合させることによって、望ましくない化学反応が起こらないように保護してもよい。
Ｃ末端のＦｍｏｃ−Ａ9（Ｂｕｔ）残基を支持相に結合させた後、そのα−アミノ基を脱保護し、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯを連結し、プソイドペプチド結合を形成する。
残りの残基、Ａ5、Ａ4、Ａ3及びＡ2はＦｍｏｃによって保護されるのが好ましく、Ａ1はＢｏｃによって保護されるのが好ましいが、これらを逆の番号順（Ａ7、Ａ6等）で順番に付加し、目的とするプソイドペプチドを構築する。
HisまたはGluがプソイドペプチド中に存在する際には、これらの側鎖は、これらの連結反応中または他の残基の連結反応中に望ましくない化学反応を受けやすい。したがって、連結反応でこれらのアミノ酸を連結する前に、化学保護基をこのような側鎖に結合させてもよい。
すべてのアミノ酸残基をＢＨＡ樹脂に連結させた後、Ｎ末端のプソイドペプチドのＢｏｃを除去する。Ｔａｃ、ＭＴａｃ若しくはＤＭＴａｃの５員の複素環を、Ｃｙｓの暴露した−ＣＨ2−ＳＨ部分（またはＰｅｎの−Ｃ（ＣＨ3）2ＳＨ）およびＡ8及びＡ9残基（即ち、Ａ9のα−アミノ）を結合させる還元された結合の第２級アミンとホルムアルデヒドやアセトアルデヒド等の酸化剤との反応によって形成する。中間プソイドペプチドは、側鎖の保護基を有したままだが、ＨＦ処理を行うことによって、樹脂の支持相から切断し、さらに側鎖の保護基をも除去する。
２．（ｂ）第二のプロトコル
第二のプロトコルにおいては、固相合成経路を経た後、トリペプチドをＢＨＡ樹脂上に構築し、保護されたトリペプチド樹脂を形成する：
Boc-His(Bom)7-Leu8-psi-Cys(But)9-BHA樹脂
Ｂｏｃ1基及びＢｕｔ基を除去し、Ｃｙｓの−ＣＨ2−ＳＨ部分をＡ8及びＡ9残基を結合する還元された結合の第２級アミンで環化し、His(Bom)7-Leu8-psi-Tac9-BHA樹脂を得る。ＨＦ処理後、遊離したトリペプチドHis7-Leu8-psi-Tac9-NH2を得る。Boc-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-OCH2-樹脂を、固相合成の標準方法にしたがってGly-OCH2-樹脂上に順次構築し、さらに、１％ ＫＣＮを含有する９５％メタノール中で１２時間処理し、Ｂｏｃ−オリゴペプチドを切断する。２断片を構築した後、Ｂｏｃ−オリゴペプチドを、ＢＯＰ試薬を用いて遊離したHis7-Leu8-psi-Tac9-NH2のトリペプチドに連結する。次に、Ｂｏｃ基を除去し、目的とするペプチドを得る。
式Ｉのボンベシン拮抗物質の合成を詳細に記載する前に、上記プロトコルの１つ若しくは両方に共通する様々な合成操作を以下に記載する。
２．ポリペプチド合成に関する一般的な操作
操作１：特定の合成残基または反応体の形成
a)Ｌ−およびＤ−Ｔｐｉ：
２．０４ｇ（１０ｍＭ）のＬ−Ｔｐｉを２．１ｇのクエン酸を含む２５ｍｌの沸騰した水に溶解する。０．５ｍｌの４０％ホルムアルデヒド水溶液を加えると、固体が即座に形成し始める。この混合物を氷浴中で冷却し、沈殿物を収集し、冷却水及び空気で洗浄し、さらに室温で乾燥させると、２．１４ｇ若しくは９９％の固体［融点（分解）［m.p.(decomposition)］は約３１０℃］が得られる。Ｄ−体はＤ−Ｔｒｐから同様にして形成され、約３１０℃の融点（分解）を有する。
b)Ｌ−およびＤ−Ｂｏｃ−Ｔｐｉ：
１０．８ｇ（５０ｍＭ）のＤ−Ｔｐｉを懸濁した２５０ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ及び７．５ｍｌ トリエチルアミンの攪拌された懸濁液に、１０ｇのジ−ｔ−ブチルジカルボネート(Di-tert-butyl dicarbonate)を添加し、この混合物を４時間攪拌した後、１０ｇのジカルボネート(dicarbonate)をさらに加え、さらに３時間攪拌した後１０ｇをさらにまた加えた。この混合物を一晩攪拌し、エーテルで抽出（２×１００ｍｌ）し、エーテルは捨てる。クエン酸を水層にｐＨが３〜５になるまで添加した。固体を収集し、水で洗浄し、一晩風乾した。
固体を１００ｍｌのテトラヒドロフラン中に懸濁する。ほとんどすべての固体が溶解する。不溶物を濾過によって除き、ＴＨＦを真空下で除去する。残渣をエーテルで粉砕することによって９．２０ｇ若しくは５８％の物質が得られる。この物質は出発材料と同じ融点を有するが、溶解度及び８５：１５：０．５のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＨＯＡｃを用いたシリカによるＴＬＣが異なる。
２．５５ｇのＬ−Ｔｐｉを使用する以外同様の方法を用いるによって、２．２２ｇ若しくは５９％のＢｏｃ−Ｔｐｉが得られる。
c)Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ：
窒素雰囲気下で乾燥トルエン（２５０ｍｌ）中に溶解したＦｍｏｃ−ロイシン メチルエステル(Fmoc-Leucine methyl ester)（３５ｇ、１３４ミリモル）を、乾燥氷／アセトンで冷却し、１５０ｍｌの２５％ 水酸化ジイソブチルアルミニウム(di-isobutyl-aluminium hydride)のトルエン溶液を３０分かけて加える。水酸化ジイソブチルアルミニウムを添加し終わった後、この混合物を乾燥氷／アセトン浴中で２０分間攪拌し、さらに、メタノール（１５ｍｌ）を注意深く加える。この混合物を１０００ｍｌの氷冷水中に注ぎ、振盪、瀘過する。トルエンを分離し、水相をエーテルで再抽出する（３×３００ｍｌ）。トルエン及びエーテル抽出物を合わせ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥する。このようにして得られた油状物を、１５００ｍｌ １５％ＥｔＯＡｃ／ガソリン中で素早くシリカゲルカラム（３×５０ｃｍ）に通す。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯが固体として得られる（２７．６ｇ）。
d)合成アミノ酸またはアミノ酸類似体：
ボンベシン拮抗物質プソイドペプチド中に導入される合成アミノ酸またはアミノ酸類似体は、通常市販されているものである。したがって、Ｈｃａは、ダブルアイ ５３２３３，ミルウォーキー，セント ポール アヴェニュー １００１(1001 St. Paul Avenue, Milwaukee, WI 53233)のアルドリッヒ コーポレーション(Aldrich Co.)より市販されているものである。Ｂｏｃ−若しくはＦｍｏｃ−保護アミノ酸は、ケーワイ ４０２２８，ルイスヴィレ，ファーン ヴァレー ロード ５６０９(5609 Fern Valley Road, Louisville, KY 40228)のアドバンスド ケムテック(Advanced ChemTech)；またはシーエー ９０５０５，トーランス，カシワ ストリート ３１３２(3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505)のバケム カルフォルニア(Bachem California)より市販されているものである。
操作２：樹脂の調製およびＡ9残基の付加
ＢＨＡ樹脂を、１０％ ＴＥＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液で各々３分間ずつ２回処理（中和）することによって調製し、ＣＨ2Ｃｌ2で６回洗浄する。１．３５ミリモルのＦｍｏｃ−Ａ9（Ｂｕｔ）及び１．５０ミリモルの１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール(1-hydroxybenzotriazole)（ＨＯＢｔ）のＤＭＦ溶液を加え、３分間混合することによって、Ｆｍｏｃ−Ａ9（Ｂｕｔ）残基を樹脂に結合させる。２０％ １，３−ジイソプロピル−カルボジイミド(1,3-diisopropyl-carbodiimide)（ＤＩＣ）のＣＨ2Ｃｌ2溶液（１．３ミリモル）を加える。この混合物を室温で６０分間振盪する。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ａ9（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を、ＣＨ2Ｃｌ2及びメタノールでそれぞれ２回、さらにＣＨ2Ｃｌ2で３回洗浄した後、カイザーテスト(Kaiser test)（アナル バイオケム(Anal. Biochem.)、３４巻、ページ５９５（１９７０年））を行った。不完全な連結が行われた場合には、この工程を繰り返す。
操作３：プソイドペプチド結合の形成
５０％ ピペリジンのＤＭＦ溶液を添加し、３０分間混合し；ＤＭＦで洗浄（６×１分）し；次に、i)１％ ＡｃＯＨを含むＤＭＦに溶解したＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（３当量）を加え；さらに、iiＤＭＦに溶解したＮａＢＨ3ＣＮ（３．５当量）を加え６０分間振盪することによって、Ｆｍｏｃ基のＡ9からの脱保護を行う。この後、５０％ ＭｅＯＨ（３×１分）；１００％ ＭｅＯＨ（３×１分）；およびＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
操作４：アミノ酸の連結およびペプチド結合の形成
Ａ9残基のα−アミノ基、および各々順次連結されるアミノ酸残基に対する保護基は、９−フルオルエニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)（Ｆｍｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル(tert-butoxycarbonyl)（Ｂｏｃ）基のいずれかである。Ｆｍｏｃは、Ｂｏｃを除去する反応によってＡ9の側鎖の保護基をも除去するため、Ａ9からＮ末端のアミノ酸残基付近のアミノ酸残基に向かって連結する(coupling)際に、好ましい。
A)Ｆｍｏｃ−アミノ酸を用いる
Ｆｍｏｃアミノ酸をＦｍｏｃ−中間ペプチドに導入するために、以下の工程を行う。
(1)Ｆｍｏｃ−中間ペプチドを脱保護および中和した後、ＣＨ2Ｃｌ2（３×１分）およびＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
(2)Ｆｍｏｃ−アミノ酸を脱保護された中間ペプチドに以下のようにして連結する：
i)ＤＭＦに溶解したＦｍｏｃアミノ酸（３当量）及びＨＯＢｔ（３．３当量）を中間ペプチドに添加（３分）する；ii３当量のＤＩＣ（２０％のＣＨ2Ｃｌ2溶液になるように）を添加し、混合物を９０分間振盪する。
(3)次に、混合物をエタノール（３×１分）およびＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
さらに残基を連結するために、新たに連結されたＦｍｏｃ−アミノ酸を、５０％ ピペリジンのＤＭＦ溶液によって３０分間脱保護し、ＤＭＦで洗浄する（６×１分）。ステップ（２）に記載したのと同様にしてさらに連結を行う。
新たなアミノ酸を樹脂またはペプチドに連結するたびに、カイザーテストを行う；連結が不完全である場合には、反応を繰り返す。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結するために、上記操作のステップ（２）を以下のように修飾する：３当量のＤＩＣ（２０％のＣＨ2Ｃｌ2溶液になるように）を、Ｆｍｏｃアミノ酸（３．０当量）及びＨＯＢｔ（３．３当量）の混合ＤＭＦ溶液に０℃で１５分間及び室温で１５分間かけて添加する。反応混合物をペプチド樹脂に添加し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙの場合には１時間振盪し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎの場合には２時間振盪する。
B)Ｂｏｃ−アミノ酸を用いる
Ｂｏｃ−アミノ酸をＦｍｏｃ−中間ペプチドに導入するために、以下の工程を行う。
(1)Ｂｏｃ基を、５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を添加することによって除去する；
(2)５％ メルカプトエタノール及び５％ アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を２５分間かけて加える；および
(3)ＣＨ2Ｃｌ2（２回、１分）、ＭｅＯＨ（２回、１分）、およびＤＭＦ（３回、１分）で洗浄する。
(4)ＤＭＦに溶解した３当量のＢｏｃ−アミノ酸及び３．３当量のＨＯＢｔを添加し、３分間混合することによって、Ｂｏｃ−アミノ酸残基の連結を行う。次に、３当量の２０％ ジイソプロピル−カルボジイミドのＣＨ2Ｃｌ2溶液を加え、９０分間振盪する。この反応混合物を、ＭｅＯＨで洗浄（３回、１分）した後、さらにＣＨ2Ｃｌ2で洗浄する（３回、１分）。
(5)５％ メルカプトエタノール（５分）及び５％ アニソール（２５分）を含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液でステップ（５）の生成物を洗浄することによって、Ｂｏｃ基を除去（脱保護）する。さらに、ＣＨ2Ｃｌ2（２回、１分）、ＭｅＯＨ（２回、１分）、およびＤＭＦ（３回、１分）で洗浄する。
Ｂｏｃ基が除去されることによってＡ9の側鎖に連結されたＢｕｔ保護基も除去されることに留意しなければならない。したがって、Ｂｏｃ基の除去は、Ａ9残基の環化直前まで、一般的に行われない。
操作５：５員の複素環の形成
式ＩＩＡの環構造は、脱保護されたＣｙｓ9を有する中間ペプチドを５０％ ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの混合物（１：１：８）中で室温で３分間振盪することによって形成され、これを瀘過する。この生成物を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄する。
式ＩＩＢの環構造は、脱保護されたＣｙｓ9を有する中間ペプチドを５０％ ＡｃＯＨ、１０％ ＣＨ3ＣＨＯ及びＤＭＦの混合物（１．５：０．５：８）中で室温で１０分間振盪することによって形成され、これを瀘過する。この生成物を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄する。
式ＩＩＣの環構造は、脱保護されたＰｅｎ9を有する中間ペプチドを５０％ ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの混合物（１：１：８）中で室温で１０分間振盪することによって形成され、これを瀘過する。この生成物を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄する。
操作６：樹脂からのペプチドの分離
すべての目的とするアミノ酸残基を付加した後、中間ペプチド樹脂を、アニソールの存在下で液状ＨＦで処理し、ポリペプチドを支持相から切断する。この反応によって、側鎖の保護基も同様に除去される。ＢＨＡ樹脂を用いる際には、得られた中間ペプチドはＱがＮＨ2である。
ＸがＨ以外のときには、Ｘ基は、すでにＸ基を有するアミノ酸（例えば、Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ）を導入することによって；または中間プソイドペプチドのＮ末端のＡ1における脱保護されたα−アミノ基を適当な試薬と反応させることによって、Ｎ末端に位置させる。このようにして、樹脂支持相から除去された完全なペプチドは、ＫＯＣＮと反応させて、ＸをＮＨ2ＣＯ−とすることが好ましい。
操作７：ペプチドの精製
式Ｉのプソイドペプチドは、通常、アップル マッキントッシュ プラス コンピューター(Apple Macintosh Plus computer)によって制御されている３機のライニン ラッビット エッチピー ＨＰＬＣポンプ(Rainin Rabbit HP HPLC pump)、レオダイン インジェクター(Rheodyne injector)及びナウアー モデル ８７ 可変波長ＵＶモニター(Knauer Model 87 variable wavelength UV monitor)から構成されるライニン ＨＰＬＣ システム(Rainin HPLC System)（ライニン インク コーポレーション(Rainin Inc. Co.)製、ウォバーン(Woburn)、エムエー(MA)）で行われる逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。未精製のペプチド（１０〜４０ｍｇ）を、球状のＣ18シリカゲル（ポアサイズ：３００オングストローム；粒子サイズ：１２μｍ）（ライニン インク コーポレーション(Rainin Inc. Co.)製）が充填されたダイナマックス マクロ（Ｄｙｎａｍａｘ Ｍａｃｒｏ）カラム（２１．２×２５０ｍｍ）にのせ、２．０ｍｌ／分の流速で(A)０．１％ ＴＦＡおよび(B)０．１％ ＴＦＡを含む７０％ アセトニトリル水溶液からなる溶媒システムを用いて直線的な濃度勾配をつけて溶出する。すべての分画について、以下に記載の分析用ＨＰＬＣ(Analytical HPLC)によって精製度および保持時間(retention time)を調べた。
未精製および精製ペプチドの品質および溶出特性は、２２０及び２８０ｎｍにセットされたダイオード捕獲検出器(diode array detector)および逆相４．６×２５０ｍｍダブル−ポレックス(W-porex)Ｃ18カラム（ポアサイズ：３００オングストローム、粒子サイズ：５μｍ）を備えたヒューレット−パッカード(Hewlett-Packard)モデル １０９０液体クロマトグラフィーによる分析用ＨＰＬＣ(Analytical HPLC)によって行った。上記の溶媒システム（Ａ）及び（Ｂ）の流速を１．２ｍｌ／分に維持し、室温で分離を行った。
ほとんどの場合、濃度勾配の条件のわずかに変えたのみで同様のカラムによる再クロマトグラフィーによって、プソイドペプチドのボンベシン拮抗物質をさらに精製した。精製されたペプチドの等質性は、分析用ＨＰＬＣにおいて９７％以上精製されていることが分かった。
必要であれば、式Ｉのプソイドペプチドのアミノ酸分析を、０．２％ ３−（２−アミノエチル）−インドール(3-(2-aminoethyl)-indole)を含む４Ｍメタン−硫酸(methanesulfonic acid)を用いて真空密閉されたチューブ中で１１０℃、２０時間、加水分解されたサンプルについて、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）６３００アミノ酸分析器で行ってもよい。
Ｃ．合成中間体
１．側鎖の保護基
固相合成において、様々なアミノ酸部分またはペプチド断片の反応性を有する側鎖の官能基を保護することは共通する事柄である。これらの側鎖の官能基は、望ましくない化学反応が側鎖で起こることを防止するために保護される。したがって、適当な残基に連結される側鎖の保護基を有するペプチド鎖において目的とする配列中に位置するそれぞれのアミノアシル残基を含む中間ペプチドを生産することは共通する。
ペプチドの合成に使用される特定の側鎖の保護基を選択する際には、以下のような規則に通常従う：(a)保護基は連結条件下で自身の保護特性を維持することが好ましい、(b)保護基は、連結試薬に対して安定でなければならず、各合成段階におけるα−アミノ保護基を除去するために選択された連結反応条件下で安定であることが好ましい、および(c)側鎖の保護基は、ペプチド鎖が望ましくないように変化しないような反応条件下で、目的とするアミノ酸配列の合成が終了した時点で除去可能でなければならない。
側鎖の保護基は、既知の方法によってアミノ酸残基に結合する。Ｈｉｓに対する側鎖の保護基としてはＢｏｍが好ましく挙げられ；ＧｌｕおよびＣｙｓに対する側鎖の保護基としてはＢｕｔが好ましく挙げられる。
２．合成中間体
以下の合成段階における中間ペプチドも本発明の概念に含まれると解する。３段階におけるペプチド番号２のペプチド（以降、ペプチド２と称する）の中間ペプチドを以下に詳細に説明する：
段階Ａ：すべてのアミノ酸及び樹脂の連結後：
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂（“1/02/A”）；
段階Ｂ：Ｎ末端のＢｏｃ−基の除去後：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-BHA樹脂（“1/02/B”）；
段階Ｃ：Ａ9の環化後：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-BHA樹脂（“1/02/C”）。
以下の実施例２におけるペプチド番号１７の合成においてはさらに一段階、つまり段階Ｄが付加される。段階Ｄの中間体は、樹脂から除去されるが、Ａ2にＡ1を連結する単結合Ｘは持たない。
医療への使用
ボンベシン拮抗物質は、悪性貧血、慢性の萎縮性胃炎、ゾーリンガー−エリソン症候群(Zollinger-Ellison Syndrome)、及び白斑等の、胃腸のクロマフィン様細胞(gastric enterochromaffin-like cell)の広範な過形成に関連した、ハイパーガストリノーマ(hypergastrinemia)、および発達の危険性の高いものでは、多病巣性の胃のカルチノイドの症状を治療するのに有用である。さらに、腸のクロマフィン様細胞(enterochromaffin-like cell)の過形成は、ハイパーガストリノーマ(hypergastrinemia)を患う動物において容易に生じる。
このような治療は、シメチジン等のＨ2−拮抗薬はハイパーガストリノーマを引き起こし、ヒトのカルチノイドを生じさせることがあるため、現状の薬剤に比べて好ましいものである。さらに、Ｈ2−拮抗薬による治療を中止すると、ハイパーガストリノーマが存在するために、潰瘍が即座に再発する。
本発明の上記した化合物はボンベシン／ＧＲＰレセプターの拮抗物質であるため、肺癌、結腸癌及び胃癌の治療に使用できる。
本発明の式Ｉのボンベシン拮抗物質は、酸付加塩(acid addition salt)等の、製薬上使用できる毒性のない酸または塩の形態で投与される。このような酸付加塩としては、具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、タンニン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、琥珀酸塩、アルギン酸塩、パモエート、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等が挙げられる。
これらの薬剤組成物は、式Ｉのプソイドペプチドを既知の製薬上使用できる担体と組み合わせて含むが、この際、生理食塩水が例えば担体として使用できるが、他の既知の担体も使用できる。
これらの薬剤組成物による被験者の治療は、ＬＨＲＨの他の作用薬および拮抗薬、またはソマトスタチン類似体を用いた臨床治療と同様にして行われる。したがって、式Ｉのボンベシン拮抗物質は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、鼻孔内にまたは肺用のエアロゾルによって若しくは生分解性の適当なポリマー（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド(DL-lactide-coglycolide)等）から配合された貯蔵された形態(in a depot form)（例えば、マイクロカプセル、マイクロ顆粒(microgranule)若しくはシリンダー状の棒様の移植片）で投与されされる。連続点滴、注入ポンプ及びマイクロカプセル等の所定の時間で放出される形態(time-release mode)などの、他の同様な投与形態もまた本発明の概念に含まれる。
式Ｉのペプチドの有効投与量は、投与形態および処置される哺乳動物の種類によって変化する。投与量は、非経口投与の場合、１日当たり患者の１ｋｇの体重当たり約１〜１，０００μｇのペプチドである。上記投与量の範囲は単に好ましいというだけでより高い投与量も場合によっては選択される。注入量が約１５〜約３０日またはそれ以上継続するように計算された貯蔵された形態(depot form)である以外は、ペプチドを含有する生理食塩水を１日当たり約０．０１〜０．２０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の投与量になるように投与してもよい。
以下の実施例では、３種類のチャラクターコード(character code)を用いて、特定の合成段階における中間ペプチドを特定する。“１／０１／Ａ”と名付けられたペプチドは、合成の段階Ａが終了した実施例“１”で作製されたペプチド“０１”に対する中間ペプチドを表わす。同様にして、“２／０８／Ｂ”及び“４／１９／Ｃ”は、それぞれ合成段階Ｂ及びＣが終了した実施例“２”及び“４”で作製されたペプチド“０８”及び“１９”の中間ペプチドを表わす。
実施例（１）
ペプチド＃
これらのペプチドは、共通の中間体Ｉ−１、Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂から適宜合成され、以下のようにして合成される。
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂を以下のようにして得る：２．０ｇ ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ2／ｇ）を、２０ｍｌ １０％ ＴＥＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液でそれぞれ３分間２回処理（中和）し、２０ｍｌ ＣＨ2Ｃｌ2で６回洗浄し；次に、ＤＭＦに溶解された３．３ミリモルのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）及び３．６ミリモルのＨＯＢｔと３分間混合する。３当量のＤＩＣ（ＣＨ2Ｃｌ2において２０％溶液となるように）を添加する。この混合物を室温で９０分間振盪する。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を、ＣＨ2Ｃｌ2、メタノールで各２回、さらにＣＨ2Ｃｌ2で３回洗浄した後、カイザーテスト(Kaiser test)を行った。
プソイドペプチド結合を形成するためのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯの連結を以下のようにして行う。Ａ9からのＦｍｏｃ基の脱保護を、１５ｍｌ ５０％ ピペリジンのＤＭＦ溶液を加え、３０分間混合し、１５ｍｌ ＤＭＦで洗浄する（６×１分）ことによって、Ｆｍｏｃ基のＡ9からの脱保護を行う。さらに、１％ ＡｃＯＨを含む３．３ミリモルのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（３当量）のＤＭＦ溶液を添加し、ＤＭＦに溶解したＮａＢＨ3ＣＮ（３．５当量）を添加し、さらに、１時間振盪する。この後、１５ｍｌ ５０％ ＭｅＯＨ（３×１分）；１５ｍｌ １００％ ＭｅＯＨ（３×１分）；および１５ｍｌ ＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂からのＦｍｏｃ基の除去（脱保護）を操作４Ａと同様にして行う。
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂からＦｍｏｃ基を除去し中和した後、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）の連結を操作４Ａに記載したようにして行う。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙの連結を操作４と同様にして行う。２０％ １，３−ジイソプロピルカルボジイミド(1,3-diisopropylcarbodiimide)のＣＨ2Ｃｌ2溶液（３．３ミリモル）を、０℃で、３．３ミリモルのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ及び３．６ミリモルのＨＯＢｔのＤＭＦ溶液に加え、冷却しながら１５分間攪拌し、さらに室温で１５分間攪拌し、沈殿物を瀘過し、樹脂に加え、６０分間振盪した。次に、アミノ酸残基、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−ＡｌａおよびＦｍｏｃ−Ｔｒｐを順次同様にして導入し、３．８０ｇの中間Ｉ−１、Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂の構造を有する保護されたペプチド樹脂を得た。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−ｐＧｌｕを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/01/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/02/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＡｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/04/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｃｐａを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/05/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｎａｌを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/07/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/08/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/09/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/10/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＡｃ−Ｄ−Ｔｒｐを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/11/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/12/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/13/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＨｃａを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/14/A”）。
さらに、中間ペプチド１／０１／ＡのＮ末端のＢｏｃ基を、５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を用いて１回目は５分間及び２回目は２５分間の計２回処理することによって除去する。次に、中間ペプチドを、ＣＨ2Ｃｌ2（２回、１分）、ＭｅＯＨ（２回、１分）及びＤＭＦ（３回、１分）で洗浄する。これによって、ＣｙｓからＢｕｔ保護基をも除去され、これによって中間ペプチド、D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-BHA樹脂(“1/01/B”)が得られ、さらにこれをＣＨ2Ｃｌ2、ＭｅＯＨ及びＤＭＦで３回ずつ１分間洗浄する。
この時点で、中間ペプチド１／０１／ＢのＣｙｓの側鎖は、酸化によって環化し、操作５のように式ＩＩＡ中に示される５員の複素環を形成する。ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１：１：８）を添加する。この反応混合物を室温で３分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって、中間ペプチド１／０１／Ｃ、D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-BHA樹脂が得られる。
次に、中間ペプチド１／０１／Ｃを操作６と同様にしてＨＦ及びアニソールで処理し、ＨｉｓからＢｏｍ保護基を除去し、同時に樹脂支持相からノナペプチドを切断することによって、Ｃ末端にＮＨ2であるＱ基を形成する。このペプチドを操作７と同様にしてＨＰＬＣで精製する。このようにして、ボンベシン拮抗物質ペプチド番号１が得られる。
Ｂｏｃ基及びＢｕｔ基の除去および還元された結合の第２級アミンによるＣｙｓの−ＣＨ2−ＳＨ基の環化の段階を同様にして中間ペプチド１／０２／Ａ、１／０５／Ａ、１／０７／Ａ、１／０８／Ａ、１／０９／Ａ、１／１０／Ａ及び１／１２／Ａについて行い、以下の中間ペプチドを得る：
未精製のペプチドをＢＨＡ樹脂から切断した後、操作６及び７によって精製、精製ペプチド２、４、５、及び７〜１４を得る。
これらのペプチドの保持時間は以下の通りである。
または、５員の複素環を以下の方法によって溶液中に形成してもよい。
０．８ｍｌの氷酢酸中に固相合成から得られた２５ｍｇのＬｅｕ−ｐｓｉ−Ｃｙｓ−ＮＨ2の構造を有する中間ペプチドを１００μｌの１％ホルムアルデヒド（水における重量％溶液）と室温で３０秒間混合した後、２０μｌの５０％酢酸アンモニウム溶液を添加する。この反応混合物を精製し、−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｔａｃ−ＮＨ2の構造を有する目的とするペプチドを得る。
実施例（２）
ペプチド＃
本実施例におけるペプチドは、０．５ｇ ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ2／ｇ）上に構築された、共通の中間体Ｉ−２、Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂から適宜合成される。中間ペプチドＩ−２を実施例（１）に記載された操作および方法にしたがって調製される。次に、１５０ｍｇの中間ペプチドＩ−２の一部を３つのアリコートに分け、操作４に記載された方法によってさらに２連結行い、最終のノナペプチド樹脂を得る。
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−２にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“2/15/A”）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−２にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“2/16/A”）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｂｕｔ）及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−２にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-Glu(But)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“2/17/A”）
操作４と同様にして５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を用いて、中間ペプチド２／１５／ＡからＢｏｃ基を除去する。この反応によって、残基Ａ9からＢｕｔ基も除去され、これによって以下の中間ペプチド２／１５／Ｂが得られる：
D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-BHA樹脂
この時点で、中間ペプチド２／１５／ＢのＣｙｓの側鎖は、酸化によって環化され、操作５と同様にして式ＩＩＡ中に示される５員の複素環を形成する。ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１：１：８）を添加する。この反応混合物を室温で３分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって以下の中間ペプチド２／１５／Ｃが得られる：
D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-BHA樹脂
次に、中間ペプチド２／１５／Ｃを、新たに蒸留されたＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理することによって、ＨｉｓからＢｏｍ保護基をも除去する。溶媒を真空下で蒸発させ、酢酸エチルで洗浄し、７０〜８０％の酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥する。精製後、ボンベシン拮抗物質ペプチド番号１５が得られる。
Ｎ末端のＢｏｃを除去し、Ｃｙｓ9を環化し、ＢＨＡ樹脂から中間ペプチドを除去し、さらにＨＰＬＣで精製する段階を中間ペプチド２／１６／Ａ及び２／１７／Ａについて同様にして行うことによって、ペプチド番号１６及び以下の中間ペプチド２／１７／Ｄが得られる：
D-Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
１５ｍｇの２／１７／Ｄ、および０℃の１５ｍｇ ＨＯＢｔを含む０．８ｍｌのＤＭＦの混合物を、５０μｌ ２５％ ジイソプロピルカルボジイミド(1,3-diisopropylcarbodiimide)のＣＨ2Ｃｌ2溶液に添加し、０℃で２時間攪拌する。Ｄ−Ｐｈｅ1のα−アミノがＧｌｕ2の３−プロピオニル部分のγ−カルボキシル部分に連結したペプチド１７の単結合を形成させる：
反応混合物を操作７にしたがってＨＰＬＣによる精製を行う。
保持時間は以下の通りである。
実施例（３）
ペプチド＃
これらのボンベシン拮抗物質は、共通の中間体Ｉ−３、即ち、Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂から適宜合成される。この中間体は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）で始まり、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（ＮａＢＨ3ＣＮによる）；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｏｍ）等［さらには実施例（１）に従う］が続く実施例（１）に記載された固相合成操作によって順次連結することによって１．０ｇ ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモル ＮＨ2／ｇ）上に構築される。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎを操作４にしたがってＮ末端に連結し、中間体Ｉ−３を形成する。中間体Ｉ−３へのＢｏｃ−Ｄ−ＰｈｅまたはＢｏｃ−Ｄ−Ｃｐａの最終的な連結は、操作４における方法にしたがって行われ、これによって中間ペプチド“３／３／Ａ”または“３／６／Ａ”がそれぞれ形成される。
Ｂｏｃ基の除去を、操作４と同様にして５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を用いて行う。
この時点で、中間ペプチド３／３／ＢのＣｙｓの側鎖は、酸化によって環化され、操作５と同様にして式ＩＩＢ中に示される５員の複素環を形成する。５０％ ＡｃＯＨ、１０％ ＣＨ3ＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１．５：０．５：８）を添加する。この反応混合物を室温で１０分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって、以下の中間ペプチド３／３／Ｃが得られる：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-BHA樹脂
中間ペプチド３／３／Ｃ及び３／６／Ｃを、ＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理することによって、操作６と同様にして樹脂から除去する。この工程によって、ＨｉｓからＢｏｍ保護基をも除去され、これによってノナペプチド３及び６が得られる。
これらのペプチドを操作７と同様にしてＨＰＬＣを用いて精製する；保持時間は以下の通りである。
または、２５ｍｇのＬｅｕ−ｐｓｉ−Ｃｙｓ−ＮＨ2の構造を有する中間ペプチドに０．８ｍｌの氷酢酸を添加し、さらに１００μｌの１％アセトアルデヒド室温で混合することによって、５員の複素環を溶液中に形成してもよい。なお、この混合は５分間行われる；その後、１００μｌの酢酸アンモニウムを添加する。この反応混合物を精製し、Ｌｅｕ−ｐｓｉ−ＭＴａｃ−ＮＨ2の構造を有する目的とするペプチドを得る。
実施例（４）
ペプチド＃
これらのポリペプチドは、共通の中間体Ｉ−４、Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂から適宜合成される。この中間体は、実施例（１）及び（２）に記載されたのと同様にして固相合成の標準方法にしたがってベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂上に順次構築される。
したがって、１．０ｇ ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ2／ｇ）を、操作２にしたがって調製し、１０ｍｌ １０％ ＴＥＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液でそれぞれ３分間２回処理（中和）し、１０ｍｌ ＣＨ2 Ｃｌ2で６回洗浄する；次に、ＤＭＦに溶解した１．６ミリモルのＦｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）及び１．８ミリモルの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1-hydroxybenzotriazole)（ＨＯＢｔ）と３分間混合する。１．６ミリモル濃度である２０％ １，３−ジイソプロピルカルボジイミド(1,3-diisopropylcarbodiimide)（ＤＩＣ）のＣＨ2Ｃｌ2溶液を添加する。この混合物を室温で９０分間振盪する。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を、ＣＨ2Ｃｌ2、メタノールで各２回、さらにＣＨ2Ｃｌ2で３回洗浄した後、カイザーテスト(Kaiser test)を行う。
Ｆｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂からのＦｍｏｃ−基の除去（脱保護）を操作４Ａと同様にして行う。
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯの連結を操作３にしたがって行う。Ａ9（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂をＤＭＦで２回洗浄する。次に、１％ ＡｃＯＨを含む１．６ミリモルのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯのＤＭＦ溶液を加えた後、１．８ミリモルのＮａＢＨ3ＣＮのＤＭＦ溶液を添加する。この反応混合物を６０分間振盪した後、５０％メタノール水溶液で２回、１００％メタノールで２回、及びＣＨ2Ｃｌ2で３回、それぞれ１分間ずつ洗浄する。
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂からＦｍｏｃ基を除去し中和した後、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）の連結を操作４と同様にして行う。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙの連結を操作４と同様にして行う。２０％ １，３−ジイソプロピルカルボジイミド（１．５ミリモル）のＣＨ2Ｃｌ2溶液を、１．５ミリモルのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ及び１．６５ミリモルのＨＯＢｔを含むＤＭＦ溶液に０℃で添加し、冷却しながら１５分間および室温で１５分間攪拌し、沈殿物を瀘過し、樹脂に加え、６０分間振盪する。次に、アミノ酸残基Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ及びＦｍｏｃ−Ｔｒｐを同様にして順次連結することによって導入し、１．９ｇのFmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂の構造を有する保護されたペプチドである中間体Ｉ−４が得られる。
０．９１ｇの中間ペプチドＩ−４を５つのアリコート（各約２００ｍｇ）に分け、これを用いて操作４に記載された方法にしたがって保護されたポリペプチド樹脂を合成する：
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−４にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/18/A”）
中間ペプチドＩ−４にＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結した後Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅをさらに連結することによって以下が得られる：
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/19/A”）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−ｐｈｅを中間ペプチドＩ−４にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/20/A”）
中間ペプチドＩ−４にＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結した後Ｂｏｃ−Ｔｐｉをさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/21/A”）
中間ペプチドＩ−４にＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結した後Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉをさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/22/A”）
さらに、Ｂｏｃ−基を５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を用いて中間ペプチド４／１８／Ａから除去することによって、以下の中間ペプチド４／１８／Ｂが得られる：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen-BHA樹脂
この時点で、中間ペプチド４／１８／ＢのＰｅｎの側鎖は、酸化によって環化され、操作５と同様にして式ＩＩＣ中に示される５員の複素環を形成する。ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１：１：８）を添加し、反応混合物を形成し、この反応混合物を室温で３分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって以下の中間ペプチド４／１８／Ｃが得られる：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-DMTac-BHA樹脂
次に、中間ペプチド４／１８／Ｃを５ｍｌ ＣＨ2Ｃｌ2、メタノール及びＣＨ2Ｃｌ2で各３回ずつ洗浄し、新たに蒸留されたＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理する。溶媒を真空下で蒸発させ、エーテル若しくは酢酸エチルで洗浄し、７０〜８０％の酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥することによって未精製のノナペプチド樹脂が得られる。この反応混合物を精製し、ボンベシン拮抗物質ペプチド番号１８を得る。
中間ペプチド４／１９／Ａ、４／２０／Ａ、４／２１／Ａ及び４／２２／Ａについて、同様にして保護基を除去し、脱保護されたＡ9を環化し、さらに中間ペプチドをＢＨＡ樹脂から外すことによって、それぞれペプチド番号１９、２０、２１及び２２が得られる。
操作７にしたがって(A)０．１％ ＴＦＡおよび(B)１％ ＴＦＡを含む７０％ アセトニトリル水溶液からなる溶媒システムを用いてＨＰＬＣによって精製を行った。これらのペプチドの保持時間は以下の通りである。
または、２５ｍｇの−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｐｅｎ−ＮＨ2の構造を有する遊離ペプチドを１００μｌの１０％ホルムアルデヒドと混合された２５ｍｇ ＨＯＢｔを含む０．８ｍｌの氷酢酸に添加し、０℃で３０分間攪拌することによって、Ａ9残基を溶液中で環化し、５員の環構造Ｌｅｕ−ｐｓｉ−ＤＭＴａｃ−ＮＨ2を有するペプチドを得てもよい。
実施例（５）
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
これらのペプチドは、共通の中間体Ｉ−５、Fmoc-Gln-Trp-Alv-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂から合成される。
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂は以下のようにして得られる：操作２及び３に示された方法によって１．０ｇＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ2／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）及びＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯを順次連結する。
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎを順次連結することによって、中間ペプチドＩ−５、Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂が得られる。
本実施例のすべてのペプチドに共通な上記中間体Ｉ−５の１５０ｍｇのアリコートを操作４に記載された方法によってさらにもう１回連結を行うことによって、最終的なペプチド樹脂を得る。
Ｂｏｃ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/08/A”）
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/09/A”）
Ｂｏｃ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/12/A”）
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/13/A”）
Ｈｃａを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/14/A”）
Ｎ末端のＢｏｃ基を、５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液で第一回目は５分間及び次に２５分間の計２回処理することによって、中間ペプチド５／０１／Ａから除去する。この処理によって、Ｃｙｓから保護基をも除去する。さらに、このペプチドを、操作４と同様にして、ＣＨ2Ｃｌ2、ＭｅＯＨ及びＤＭＦで洗浄することによって、以下の中間ペプチド５／０８／Ｂが得られる：
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-BHA樹脂
さらに、この中間ペプチド５／０８／Ｂを、新たに蒸留されたＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理することによって、ＨｉｓからＢｏｍ保護基をも除去する。溶媒を真空下で蒸発させ、酢酸エチルで洗浄し、７０〜８０％の酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥することによって以下のペプチドが得られる：
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
保護基及びＢＨＡ樹脂を中間ペプチド５／０８／Ａ、５／０９／Ａ、５／１１／Ａ、５／１２／Ａ、５／１３／Ａ及び５／１４／Ａから除去し、本実施例の冒頭に列挙されたペプチドを得る。これらのペプチドを操作７にしたがって精製試験にかける。
または、固相法の標準的な方法にしたがって、Ｃｙｓ9の−ＳＨ基を保護するＢｚを用いてＢｏｃで保護されたアミノ酸を有するＢＨＡ樹脂上に、これらのペプチドを適宜順次構築してもよく、これによって以下の中間ペプチドが得られる：
Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/08/A”）
Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/09/A”）
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/12/A”）
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/13/A”）
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/14/A”）
５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液で処理することによってＢｏｃ基を除去し、さらにＨＦ及びアニソールで処理することによって、ペプチドを樹脂から切断し、Ｈｉｓから保護基Ｂｏｍを、Ｃｙｓから保護基Ｂｚを除去し、本実施例の冒頭に列挙されたペプチドを得る。
実施例（６）：アッセイ法
（Ａ）レセプター結合アッセイ
125Ｉ−Ｔｙｒ4−ボンベシンの結合およびボンベシン拮抗物質プソイドペプチドによる置換を、スイス ３Ｔ３(Swiss 3T3)細胞を用いて２４−穴の組織培養プレート（ギブコ(GIBCO)製）において試験した。マウスのスイス ３Ｔ３(Swiss 3T3)繊維芽細胞を、１０％ ＦＣＢＳ及び抗真菌剤を含んだＤＭＥＭで１週間毎に継代することによって維持した。培養は、３７℃で５％ ＣＯ2濃度の空気中で行った。穴に、１０5細胞／穴（生存率＞９５％）で播き、集密及び休止まで生育させた。結合段階は、播種後７日目に行った。細胞を、０．５ｍｌの結合バッファー（２０ｎＭ ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．２％ ＢＳＡ及び１００μｇ／ｍｌバシトラシンを含むダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium)）で２回洗浄した。さらに、細胞を、様々な濃度の拮抗物質の存在下で（６×１０-11〜６×１０-6Ｍ、全量０．４ｍｌ）若しくは拮抗物質を存在させないで、０．２ｎＭ 125Ｉ−Ｔｙｒ4−ボンベシンと共に培養した。
ザチャリー(Zachary)及びローゼンガルト(Rozengurt)（１９８５年）およびレイトン(Layton)ら（１９８８年）によると、３７℃での125Ｉ−ＧＲＰの結合は３０分で最高値に達し、以降は減少することから、細胞を３７℃で３０分間培養する。その後、細胞を氷冷（４℃）した結合バッファーで２回洗浄し、さらに氷冷したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｍＭ）：ＮａＣｌ １３８、ＫＣｌ ２．８、Ｎａ2ＨＰＯ4 ８、ＫＨ2ＰＯ4 １．４５、ＣａＣｌ2 ０．９１、ＭｇＣｌ2 ０．４９で２回洗浄した。洗浄された培養物を０．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で抽出し、放射能値測定用のチューブに移した。穴を、０．５ｍｌの蒸留水（滅菌済）で１回洗浄し、さらに、洗浄液を適当なチューブに入れた。次に、上記サンプルの放射能値を、自動ガンマカウンター（マイクロメディック システム インク(Misromedic System Inc.）製、ハンツヴィル(Huntsville)、アラ(Ala.))で測定した。
マンソン(Munson)およびロッドバード(Rodbard)のプログラムに適したリガンド−ＰＣ算定カーブを用いて、レセプター結合のタイプ、解離定数（Ｋｄ）、会合定数（Ｋａ）、およびレセプターの最高結合能力（Ｂｍａｘ）を測定した。
本発明におけるポリペプチドの結合データを以下の表１に示す。様々な投写量の標識されないペプチドを用いて、置換された特異的な125Ｉ−Ｔｙｒ4−ボンベシン結合能を測定した。各ペプチド（それぞれ３連で行った）について２〜３の個々の試験の平均値を示す。
実施例（７）
エストロゲン非依存性ＭＸＴマウスの乳癌の腫瘍容積に関するボンベシン拮抗物質による治療効果を以下のようにして試験する：
４０匹の雌のＢ６Ｄ２Ｆ1マウスは、ナショナル カンサー インティテュート(National Cancer Institute)、フレデリック カンサー リサーチ ファシリティ(Frederick Cancer Research Facility)（フレデリック、マリーランド(Frederick,Maryland)）より得、２１±１℃及び５５±５％湿度で飼育する。この動物を１２時間照射／１２時間暗室に自動的に切り替わる部屋に置き、齧歯動物用の実験飼料５０００１(rodent laboratory chow 5001)と水道水を無制限に与える。ドクター エーイー ボーデン(Dr. A.E. Bogden)（バイオメジャー インク(Biomeasure Inc.）、ホッキントン、エムエー(Hopkinton, MA)）より得られた、エストロゲン非依存性ＭＸＴ（３．２）／オベックス乳癌の凍結保存された組織(estrogen independent MXT(3.2)/Ovex mammary carcinoma cryo-preserved tissus)を、１ｍｍ3のＭＸＴ（３．２）／オベックス腫瘍(MXT(3.2)/Ovex tumor)の容積で成熟した雌のマウスの皮下に接種する。
腫瘍を移植してから２日後、マウスを無作為に４つのグループに分け、ペプチドが一様に放出するシステム(sustained delivery system)（マイクロカプセル）による治療を開始する。以下の４群を用いる：
１） コントロール：賦形剤のみを注入；
２） [D-Tpi6,Leu13-psi-Leu14]Bn(6-14)；
３） [D-Phe6,Leu13-psi-Tac14]Bn(6-14)；
４） 左右の卵巣を外科的にｖ摘出。
ボンベシン拮抗物質に関するこれらの略称は、以下の既知のペプチド断片の残基の番号付けを用いる：各残基を完全な断片における位置によって番号付けする。しかしながら、ボンベシン拮抗物質は、Ｎ末端を「１」として始めて番号付けをした方が本明細書においては他のペプチドと比べて容易である。したがって、「［Ｄ−Ｔｐｉ6，Ｌｅｕ13−ｐｓｉ−Ｌｅｕ14］Ｂｎ（６−１４）」は、Ｄ−Ｔｐｉ1−Ｇｌｎ2−Ｔｒｐ3−Ａｌａ4−Ｖａｌ5−Ｇｌｙ6−Ｈｉｓ7−Ｌｅｕ8−ｐｓｉ−Ｌｅｕ9−ＮＨ2（以降、「Ｂ１」と称する）であり、「［Ｄ−Ｐｈｅ6，Ｌｅｕ13−ｐｓｉ−Ｔａｃ14］Ｂｎ（６−１４）」は上記ペプチド番号２と同じである。
これら２つのボンベシン拮抗物質を固相合成によって合成する。第２群のマウスは「Ｂ１」が一様に放出するような製剤(sustained release formulation)を投与され、第３群のマウスは上記ペプチド番号２を含む一様に放出するような製剤を投与される。上記一様に放出するような製剤(sustained release formulation)は、１５日間、２５μｇ／日の量でＢ１またはペプチド番号２を連続して放出し続けた。
一様に放出(sustained delivery)させるために、アルゼット浸透ポンプ(Alzet osmotic pump)（アルゾ コーポレーション(Alzo Co.)製、パロ アルト、シーエー(Palo Alto, CA)）を用いた。０．４８μｌ／時間で放出するアルゼットポンプモデル２００２(Alzet Pump Model 2002)を背中の下側面領域に皮下移植した。ペプチドを、浸透ミニポンプに満たすために、５０％（ｖ／ｖ）のポリプロピレングリコール水溶液に溶解した。
腫瘍が目視でき触知できるようになった後、腫瘍容積を測定し、チェンデ ビー(Szende B.)ら、「グロース インヒビション オブ エムエックスティ マンマリー カルシノマ バイ エンハンシング プログラムド セルデプス(Growth Inhibition of MXT Mammary Carcinoma by Enhancing Programmed Cell Depth)」（ＬＨ−ＲＨ及びソマトスタチンの類似体によるアポプトシス）、ブレスト カンサー レス トリート(Breast Cancer Res. Treat.)、１４巻、ページ３０７〜３１４（１９８９年）に記載されたようにして計算する。
腫瘍の成長が指数的成長相になったところで実験を終了した。第一回目の腫瘍容積測定は１０日目であった。コントロールといずれかのボンベシン拮抗物質で処理したものとの腫瘍の容積の差および２つのボンベシン拮抗物質で処理したものの間の腫瘍の容積の差は統計上顕著である。腫瘍容積の測定の結果を表２に示し、図１に詳細に記載する。
実験終了後、マウスをメトフェイン(Metofane)による麻酔下で放血し、腫瘍の重量を測定し、ダンカンテスト(Duncan's test)およびスチューデントテスト(Student's test)による統計学的分析を行った。結果を表３に示す。
実施例（８）
ヌードマウスにおけるヒトの肺小細胞癌への１つのソマトスタチン類似体および３つのボンベシン拮抗物質の効果を以下のようにして試験する：到着時におおよそ６週令の無胸腺の雄のヌードマウスをナショナル カンサー インティテュート(National Cancer Institute)（ベテスダ、エムディ(Bethesda, MD)）より得、病原体が制限された条件下で維持する。
ヒトの肺小細胞癌（ＳＣＬＣ、Ｈ６９系統）を、湿度のある５％ ＣＯ2濃度の雰囲気下で３７℃で１０％ウシ血清アルブミン、抗生物質及び抗真菌剤を添加したＲＰＭＩ １６４０（ギブコ(Gibco)製、グランド アイランド、エヌワイ(Grand Island, NY)）中に単層として生育させる。細胞組織培養した指数的に成長した細胞のうち１×１０7個の細胞を５匹のヌードマウスの右側腹部中に皮下注射することによって、異種移植を開始する。３週間たった後の腫瘍を無菌的に切開し、物理的に細かく切り刻む。次に、３ｍｍ3の腫瘍組織片を６０匹の動物に套管針によって皮下移植する。移植してから２週間たった後、腫瘍を約１０ｍｍ3の容積になるまで成長させ、動物を無作為に選び、５種類の異なる化合物による処理を行うために５つの実験群に分け、移植後２週間目の日に開始する。５週間に渡り、毎週腫瘍の容積を測定する。腫瘍の容積は、（長さ×幅×高さ×π）／６として計算される。各群において８匹の動物を腫瘍の重量を測定するために剖検した。
ヌードマウスに投与された第一の治療用薬剤化合物は、ソフトスタチン類似体、D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2であり、本明細書においては「Ｓ１」と称する。
３つのボンベシン拮抗物質のうち第一の拮抗物質は、D-Tpi1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psi-Leu9-NH2、即ち、Ｂ１である。第二のボンベシン拮抗物質は、[Tpi6-Leu13-psi-Tpi14]Bn(6-14)、即ち、D-Tpi1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psi-Tpi9-NH2であり、本明細書においては「Ｂ２」と称し、さらに、第三の拮抗物質はペプチド番号２のペプチド（以下、ペプチド２と称する）である。
ポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）[poly(DL-lactide-coglycolide)]に含まれるＳ１のパモエートのマイクロ顆粒(microgranule)を、サイトテック エスエー(Cytotech SA)で調製し、１６ｍｇのアリコートから２週間にわたり約１００μｇ／日の量が放出されるように設計する。これらのマイクロ顆粒を腫瘍に対して反対側に毎日１５日間にわたり皮下注射する。各ボンベシン拮抗物質は、０．１％ジメチルスルホキシドの生理食塩水に溶解し、２０μｇ／日の投与量で毎日２回皮下注射する。
腫瘍の容積に関する上記薬剤の治療効果を表４に示し、図２に詳細に記載する。
実施例（９）
ボンベシン拮抗物質によるＭＩＡ ＰＡＣＡ−２膵臓癌腫瘍(MIA PACA-2 pancreatic cancer tumor)に対する効果を以下のようにして測定する：
実施例８と同様のヌードマウスに、実施例８におけるＳＣＬＣと同様に生育された細胞組織培養物由来の、ＭＩＡ ＰＡＣＡ−２ヒト膵臓癌細胞注射液(MIA PACA-2 human pancreatic cancer cell injection)を皮下注射する。腫瘍の容積を実施例８と同様にして両方の実験群について測定する。
以下の２実験群を使用する：ボンベシン拮抗物質ペプチド２を投与したマウスの群および注射用賦形剤溶液のみを投与したコントロール群。５０μｇの注射用賦形剤溶液またはペプチド２を、皮下注射によって毎日２回各マウスに投与する。
腫瘍の容積の測定結果を表５に示し、図３に詳細に記載する。
実施例（１０）
ＣＡＰＡＮ−２ヒト膵臓癌(CAPAN-2 human pancreatic cancer)を有するヌードマウスに対するボンベシン拮抗物質による治療効果を以下のようにして測定する。
実施例７と同様のヌードマウスに、実施例７と同様にして生育された細胞組織培養物由来のヒトＣＡＰＡＮ−２膵臓腫瘍(human CAPAN-2 pancreatic tumor)の異種移植を行う。マウスの群を、注射用賦形剤溶液のみを投与したコントロール群およびボンベシン拮抗物質ペプチド番号２を投与した群の、２つに分け、それぞれの物質を５０ｍｇ、皮下注射によって毎日２回マウスに投与する。
実施例８と同様にして腫瘍の容積を測定し、腫瘍の容積の測定結果を表６に示し、図４に詳細に記載する。
本発明は上記好ましい実施態様に関して記載してきたが、当業者に明らかな変化(changes)および修飾(modifications)が、添付した請求の範囲に記載された、本発明の概念を外れない限り可能であることは理解されるべきである。有効性を損なわない程度の既知の置換(substitutions)も本発明において使用できる。
本発明の分野
本発明は、ヒトにおける癌性の腫瘍の生育に影響を及ぼす新規なペプチドに関するものである。さらに詳しくは、本発明は、Ｃ末端の位置にＴａｃ、ＭＴａｃ、またはＤＭＴａｃ残基を有するψ8-9プソイドペプチドであるボンベシン拮抗物質、その塩、および薬剤組成物、これらのペプチドの合成方法および上記ペプチドに関する使用方法に関するものである。これらのペプチドは、ボンベシンまたはボンベシン様ペプチドに対する拮抗特性を有する。
本発明の背景
本発明は、ボンベシン若しくはボンベシン様ペプチド（ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ニューロメジンＣ等の）に対する拮抗特性（以降、ボンベシン拮抗特性と称する）を有するポリペプチド化合物に関するものであり、これらは、例えば、ヒト等の温血動物における悪性の病気の治療において有用である。本発明は、新規なポリペプチド化合物およびそれらの製造方法；上記ポリペプチド化合物を含む新規な薬剤組成物およびヒト等の温血動物においてボンベシン拮抗効果を得るのに使用するための上記化合物を含む薬剤の製造方法を含むものである。
ボンベシンは、カエル、ボンビナ ボンビナ(Bombina bombina)の皮膚から初めて単離されたテトラデカペプチドアミドである（アナスタシ(Anastasi)、エルスパマー(Erspamer)およびブッチ(Bucci)、エックスペリエンティア(Experientia)、１９７１年、２７巻、ページ１６６）。ボンベシンはマウスのスイス ３Ｔ３(mouse Swiss 3T3)繊維芽細胞の強力なミトゲンであり（ローゼンガルト(Rozengurt)およびシンネット−スミス(Sinnett-Smith)、プロシ ナショル アカデ サイ アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、１９８３年、８０巻、ページ２９３６）、モルモットの膵臓の腺房からのアミラーゼの分泌を刺激する（ジェンセン(Jensen)、ジョーンズ(Jones)、フォルカーズ(Folkers)およびガードナー(Gardner)、ネイチャー(Nature)、１９８４年、３０９巻、ページ６１）ことが知られている。また、ボンベシン様ペプチドはヒトの肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）細胞によって製造および分泌され（ムーディ(Moody)、パート(Pert)、ガズダー(Gazdar)、カーネイ(Carney)およびミンナ(Minna)、サイエンス(Science)、１９８１年、２１４巻、ページ１２４６）、外因的に加えられたボンベシン様ペプチドはイン ビトロ(in vitro)でヒトのＳＣＬＣ細胞の生育を刺激でき（カーネイ(Carney)、カッティタ(Cuttita)、ムーディ(Moody)およびミンナ(Minna)、カンサー リサーチ(Cancer Research）、１９８７年、４７巻、ページ８２１）、さらにボンベシンおよびＧＲＰのＣ末端領域に特異的なモノクローナル抗体は受容体へのＧＲＰの結合を遮断し、イン ビトロ(in vitro)およびイン ビボ(in vivo)の両方でヒトのＳＣＬＣ細胞の生育を阻害できる（カッティタ(Cuttita)、カーネイ(Carney)、マルシャイン(Mulshine)、ムーディ(Moody)、フェドルコ(Fedorko)、フィシュラー(Fischler)およびミンナ(Minna)、ネイチャー(Nature)、１９８５年、３１６巻、ページ８２３）ことも知られている。
ボンベシン様特性を有するＧＲＰは、ブタの腸から単離された２７アミノ酸を有するく市販されているペプチドアミドであり（マクドナルド(McDonald)、ジョーンヴァル(Jornvall)、ニルソン(Nilsson)、ヴァーン(Vagne)、ガテイ(Ghatei)、ブルーム(Bloom)およびマット(Mutt)、バイオケム バイオフィズ レス コミュニ(Biochem. Biophys. Res. Commun.)、１９７９年、９０巻、ページ２２７）、上記ペプチドアミドにおけるＣ末端のアミノ酸配列はボンベシンのものとほぼ一致している。ニューロメジンＣは、デカペプチドアミドであり、その構造はＧＲＰのＣ末端領域における最後の１０アミノ酸が一致しており、イヌの小腸から単離された（リーブ(Reeve)、ワルシュ(Walch)、チュー(Chew)、クラーク(Clark)、ホウク(Hawke)およびシヴェリー(Shively)、ジェー バイオル ケム(J. Biol. Chem.)、１９８３年、２５８巻、ページ５５８２）。ＧＲＰは、体循環におけるガストリンの放出等の、様々な生物学的反応を刺激する。また、ＧＲＰは、３Ｔ３マウスの繊維芽細胞および肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）細胞の生長因子としても機能する。このため、ＧＲＰは、オートクラインの生長メカニズムを経由したＳＣＬＣの発達において直接的な病態生理学的な役割を果たしていると考えられてきた。
ボンベシン、ニューロメジンＣおよびＧＲＰのＣ末端ノナペプチドの構造は以下に示す通りである：
ボンベシン pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
ニューロメジンＣ H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
ＧＲＰのＣ末端ノナペプチド Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
他の両生類のボンベシン様ペプチドに関する調査によって、リトリン(Litorin)、即ちパプア、ニューギニアのカエルの皮膚内のノナペプチド(pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)が単離され、このペプチドは非常に強力なボンベシン類似体であることが分かっている（ヤスカラ(Yasukara)ら、ケム ファーム バル(Chem. Pharm. Bull.)、１９７９年、２７巻、ページ４９２）。ボンベシン類似体に関する研究によって、ボンベシンの６から１４番目の位置の９アミノ酸残基の最小断片がボンベシン活性の全スペクトルを有することが分かった。
様々な種類のボンベシン拮抗物質が現在知られている。ボンベシンとわずかなアミノ酸配列の相同性を有する物質Ｐ（Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2）はボンベシンおよびボンベシン類ペプチドの結合を阻害しないが、(D-Arg1、D-Pro2、D-Trp7,9、Leu11)物質Ｐおよび(D-Arg1、D-Phe5、D-Trp7,9、Leu11)物質Ｐ等のいくつかのＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換することによって修飾された物質Ｐの類似体（ムーディ(Moody)ら、フェド プロシーディングス(Fed. Proceedings)、１９８７年、４６巻、ページ２２０１）は、膵臓の腺房細胞内のボンベシンの分泌を遮断し、スイス ３Ｔ３(Swiss 3T3)細胞におけるボンベシンの成長促進効果に拮抗するが分かった。例えば、(D-Phe6、D-Phe12)のボンベシン、および[Leu13-psi-Leu14]のボンベシン等の、ボンベシン由来の２タイプのボンベシン拮抗物質（コイ(Coy)ら、ジェー バイオル ケム(J. Biol. Chem.)、１９８８年、２６３巻、ページ５０５６およびペプチズ(Peptides)、１９８９年、１０巻、ページ５８７）は、イン ビトロ(in vitro)およびイン ビボ(in vivo)においてボンベシン反応の強力な阻害剤であることが知られている。
ハイムブルック(Heimbrook)ら（バイオ ケム(Bio. Chem.)、１９８９年、２６４巻、ページ１１２５８）によって明らかにされた他のタイプのボンベシン拮抗物質は、Ｃ末端のメチオニン残基がＧＲＰ（２０−２７）類似体から欠損した、Ｎ−アセチル−ＧＲＰ（２０−２６）およびその類似体である。コイ(Coy)[ジェー バイオル ケム(J. Biol. Chem.)、２６４巻、１９８９年、２５、ページ１４６９１]は、[D-Phe6、Leu13-psi-Phe14]ボンベシン−（６−１４）および[D-Phe6、Leu13-psi-Leu14]ボンベシン−（６−１４）等のリトリン(Litorin)配列を基礎とした短鎖のボンベシン拮抗物質によっては上記に相当する親ペプチド(parent peptide)[Leu13-psi-Leu14]ボンベシンよりかなり強い力を示すことを報告した。
ＧＲＰの直鎖の（環状でない）ボンベシン類似体および必要であればＣＨ2−ＮＨの非ペプチド結合を有する両生類のボンベシンは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９０／０３９８０号に（および関連した類似体ＷＯ ９１／０２７４６号）に記載されている。これらの類似体は、天然のボンベシンペプチドの阻害剤としての作用に関していえば、以下の式を有する：
また、ボンベシンの直鎖のペプチド類似体は、ＥＰ ０ ３０９ ２９７号にも記載されている。これらのペプチドはＣ末端のＭｅｔ残基およびＣ末端とその付近の残基との間に［ＣＨ2−ＮＨ］プソイドペプチド結合を有する。
本発明の要約
本発明は、強力なボンベシン拮抗物質である新規なポリペプチド；これらのポリペプチドの合成方法；および上記ポリペプチドからなる薬剤組成物による及び上記ポリペプチドの或いは薬剤活性物質としての組成物の医療への適用を提供するものである。
Ａ．合成ペプチド
さらに詳しくは、第一の実施態様は、以下の式Ｉの強力なボンベシン拮抗物質であるプソイドペプチド(pseudopeptide)を提供するものである：
X-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q Ｉ
ただし、Ｘは、水素、
Ａ2がGluである際にはＡ2の３−プロピオニル部分上のγ−カルボキシル部分にＡ1のα−アミノ基が結合した単結合、または
式Ｒ1ＣＯ−の基であり、
但し、Ｒ1は、以下よりなる郡から選ばれたものであり；
a) 水素、Ｃ1-10アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ1-10−アルキル、ｐ−Ｈｌ−フェニル、ｐ−Ｈｌ−フェニル−Ｃ1-10−アルキル、ナフチル、ナフチル−Ｃ1-10−アルキル、インドリル、インドリル−Ｃ1-10−アルキル、ピリジル、ピリジル−Ｃ1-10−アルキル、チエニル、チエニル−Ｃ1-10−アルキル、シクロヘキシルまたはシクロヘキシル−Ｃ1-10アルキル等であり（但し、ＨｌはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、ＣＨ3若しくはＯＣＨ3である）；
b)
Ｒ3は、水素若しくはＣ1-10アルキルであり；
c) Ｒ4−Ｏ
但し、Ｒ4は、Ｃ1-10アルキル、フェニルまたはフェニル−Ｃ1-10−アルキルであり；
Ａ1は、Phe、p-Hl-Phe、pGlu、Nal、Pal、Tpi、置換されないTrp若しくはベンゼン環内でＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ2及びＣ1-3アルキルからなる群より選ばれた１つまたはそれ以上の基で置換されたTrpからなる群から選ばれたD-、L-若しくはDL-アミノ酸残基；またはＡ2のα−アミノ部分にＲ1ＣＯ−のアシル部分が結合したペプチド結合であり；
Ａ2は、Gln、Glu[-]、Glu(Y)またはHisであり、
但し、[-]は、Ｘが単結合でありＡ2がGluである際にはＡ2の３−プロピオニル部分上のγ−カルボキシル部分とＡ1のα−アミノ部分とが結合した単結合であり、
Ｙは、以下のいずれかであり、
a) −ＯＲ5（但し、Ｒ5は、水素、Ｃ1-3アルキル若しくはフェニルであり）；または、
b)
但し、Ｒ6は、水素若しくはＣ1-3アルキルであり；
Ｒ7は、水素、Ｃ1-3アルキル若しくは−ＮＨＣＯＮＨ2であり、さらに、
Ｌｅｕ−ｐｓｉ−は、Ａ9残基付近のα−アミノ部分との−ＣＨ2−部分の結合がプソイドペプチド結合であるようにＬｅｕのＣ＝Ｏ部分が−ＣＨ2−に置換されたＬｅｕの還元型であり；
Ａ9は、Ｔａｃ、ＭＴａｃ、若しくはＤＭＴａｃであり；
さらに、
Ｑは、ＮＨ2若しくは−ＯＱ1（但し、Ｑ1は、水素、Ｃ1-10アルキル、フェニル若しくはフェニル−Ｃ1-10−アルキルであり）である；
および製薬上使用できるこれらの酸または塩。
Ａ1が単結合である際には、式Ｉのプソイドペプチドはオクタペプチドであるが、Ａ1がアミノ酸若しくはこの類似体である際には、このプソイドペプチドはノナペプチドである。
Ａ9は、Tac、MTac、若しくはDMTacであるので、Ａ9には５員の複素環が存在する。この環は、通常、式Ｉのノナペプチドの合成において所定の位置のＡ9残基の側鎖を、好ましくはホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒドで酸化し、側鎖をＡ9のα−アミノ基で環化することによって形成される。このようにして得られた環化されたＡ9残基の性質は、元の酸化されていないＡ9および使用される酸化剤の性質によって変化する。
したがって、Cys9の−ＣＨ2−ＳＨ基がホルムアルデヒドとの反応におけるLeu-psi−プソイドペプチド結合付近のCys9のα−アミノ基で環化する際には、得られた環は以下の式ＩＩＡの構造を有する（式Ｉのノナペプチドの-Leu8−psi-Tac9-NH2断片として示される）；
好ましい実施態態としては、ＸはＲ1ＣＯ（但し、Ｒ1は水素若しくはＣ1-10アルキルであり、好ましくはメチルである）；Ａ1はD-Cpa、D-Nal、D-Phe、D-或いはL-Tpi、またはD-Trpであり；Ａ2はClnであり；Ａ9はTac若しくはDMTacであり；およびＱはＮＨ2である。
しかしながら、他の好ましい実施形態では、Ａ1はＡ2のα−アミノ基にＲ1ＣＯ−のアシル部分が結合したペプチド結合であり；Ａ2はGlnまたはHisであり；Ａ9はTac、M-Tac若しくはDM-Tacであり；およびＱはＮＨ2である。これらのペプチドの好ましい形態としては、ＸはHca、Hna、Paa、Mpp、Hpp若しくはNaaであり；Ａ2はGlnであり、Ａ9はTacである。
Ｂ．合成方法
式Ｉのボンベシン拮抗物質は固相合成(solid phase syn thesis)によって合成される。第一のプロトコルとしては、すべてのアミノ酸を、Ｃ末端残基を樹脂の支持相に連結した後、順次それぞれ結合していく。全アミノアシル残基を樹脂に連結した直後、プソイドペプチドの５員の複素環を、Ｃ末端残基の側鎖を酸化剤と反応させることによって形成する。次に、プソイドペプチドをＨＦ処理し、樹脂の支持相からペプチド部分を外す。この反応によって、側鎖の保護基も除去される。
第二のプロトコルとしては、式Ｉのプソイドペプチドを固相および液相によって構築される２断片として合成する。Ｃ末端を含むトリペプチドをオリゴペプチドと連結し、式Ｉの全ボンベシン拮抗物質を形成する。
５員の複素環を、Ａ9の側鎖を酸化剤と反応させることによって形成する。次に、このペプチドをＨＦ処理することによって、すべてのアミノアシル残基の側鎖の保護基を除去し、樹脂からペプチドを切断する。
Ｃ．医療への使用
式Ｉのプソイドペプチドは薬剤組成物中に使用し、製薬用の担体に含まれる有効量のプソイドペプチド若しくはこの治療学的に使用できる酸或いは塩を投与することによって、ある種の哺乳動物の癌および他の症状を治療することができる。これらの化合物は、１日に１ｋｇの体重当たり約１〜１，０００μｇの投与量で治療学的に使用できる担体と共に投与される。このような組成物は、非経口的に、静脈内に、皮下に、筋肉内に、鼻腔内に、肺用のエアロゾルによって若しくは貯蔵形態(depot form)で投与することができる。
図の説明
図１は、表２、実施例７のデータに基づいた、特定のボンベシン拮抗物質を投与することによるＭＸＴマウス乳癌に関する効果を示すグラフである。
図２は、表４、実施例８のデータに基づいた、特定のボンベシン拮抗物質を投与することによるヌードマウスにおけるＳＣＬＣ腫瘍の容積に関する効果を示すグラフである。
図３は、表５、実施例９のデータに基づいた、特定のボンベシン拮抗物質を投与することによるヌードマウスにおけるＭＩＡ ＰＡＣＡ−２の膵臓の腫瘍の容積に関する効果を示すグラフである。
図４は、表６、実施例１０のデータに基づいた、特定のボンベシン拮抗物質を投与することによるヌードマウスにおけるＣＡＰＡＮ−２の膵臓の腫瘍の容積に関する効果を示すグラフである。
好ましい実施態様の説明
Ａ．合成ペプチド
１．命名法
本発明を説明する上で便宜上、アミノ酸、ペプチドおよびこれらの誘導体の従来の略称を、ペプチド分野において通常用いられているようにおよびアイユーピーエーシー−アイーユービー コミッション オン バイオケミカル ノーメンクラチャー(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)［ヨーロッピアン ジェー バイオケム(European J. Biochem.)、１９８４年、１３８巻、ページ９〜３７］によって推奨されているように用いる。
個々のアミノ酸残基の略称は、アミノ酸の普通名称をもとにしており、例えば、Alaはアラニン、Cysはシステイン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、pGluはピログルタミン酸、Glyはグリシン、Hisはヒスチジン、Leuはロイシン、Pheはフェニルアラニン、Trpはトリプトファン、及びValはバリンである。Gluはγ−カルボキシル側鎖に連結する官能基を有する：[-]またはＹは上記したのと同様である。Dpaは、２，３−ジアミノプロピオン酸(2,3-diaminopropionic acid)である。アミノ酸残基が異性体を有する際には、アミノ酸の記号の前にＤ−若しくはＤＬ−による記載のない限りＬ−体のアミノ酸を表している。
本発明において用いられる通常使用されないアミノ酸の略称は以下の通りである：
Cpaは、パラ−クロロフェニルアラニンである。
Dpaは、２，３−ジアミノプロピオン酸(2,3-diaminopropionic acid)である。
pGluは、ピログルタミン酸である。
Nalは、３−（２−ナフチル）−アラニン(3-(2-naphthyl)-alanine)である。
Palは、３−（３−ピリジル）−アラニン(3-(3-pyridyl)-alanine)である。
Penは、ペニシラミンである。
Tpiは、２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−ピリド−［３，４−ｂ］インドール−３−カルボン酸(2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido-[3,4-b]indole-3-carboxylic acid)である。
Tacは、チアゾリジン−４−カルボン酸(thiazolidine-4-carboxylic acid)である。
MTacは、２−メチル−チアゾリジン−４−カルボン酸(2-Methyl-thiazolidine-4-carboxylic acid)でである。
DMTacは、５，５−ジメチル−チアゾリジン−４−カルボン酸(5,5-Dimethyl-thiazolidine-4-carboxylic acid)である。
アミノ酸類似体としては以下のものが挙げられる：
Hcaは、ヒドロ桂皮酸(hydrocinnamic acid)またはデス−アミノ−フェニルアラニン(des-amino-phenylalanine)である。
Hnaは、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸(3-hydroxy-2-naphthoic acid)である。
Hppは、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸(3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid)である。
Mppは、３−（４−メトキシフェニル）プロピオン酸(3-(4-methoxyphenyl)propionic acid)である。
Naaは、ナフチル酢酸である。
Paaは、フェニル酢酸である。
使用する他の省略事項は、以下の通りである：
２．好ましい実施態様
好ましい実施態様は、以下の式Ｉのボンベシン拮抗物質ペプチドである。
X-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q Ｉ
ただし、Ｘ、Ａ1、Ａ2、Leu-psi、Ａ9及びＱは上記と同様である。
これらのボンベシン拮抗物質プソイドペプチドは、アミノ酸配列、特にＡ1、Ａ2及びＡ9の残基に特徴を有する；さらにＡ8とＡ9との間のプソイドペプチド結合の存在にも特徴を有する；さらに必要であれば、Ａ9における５員の複素環をも特徴とするものである。この環状構造は、Ａ9残基の特性およびこれを酸化するのに使用する化合物によって決定される。したがって、ホルムアルデヒドを用い、Ａ9がCysである場合には、得られる環は、以下の式ＩＩＡのＴａｃ構造［式Ｉのペプチドの-Leu8-psi-Tac9-Q断片（但し、ＱはNH2である）として示される］を有する：
本発明において特に最も好ましいプソイドペプチドのボンベシン拮抗物質を以下に示す。
１．概説
式Ｉのプソイドペプチドは、ペプチド分野における当業者に公知の技術によって調製できる。よく利用される技術の要旨は、エム ボダンスキー(M.Bodanszky)、プリンシプルズ オブ ペプチド シンテシス(Principles of Peptide Synthesis)、スプリンガー−フェルラグ(Springer-Verlag)、ハイデルベルグ(Heidelberg)、１９８４年に記載されている。
すべての式Ｉのプソイドペプチドは固相合成法によって合成できる。特に好ましいこれらのペプチド及びこれらの中間ペプチドの調製方法は固相合成である。固相合成の技術は、ほとんど、ジェー エム スチュワート(J.M.Stewart)およびジェー ディー ヤング(J.D.Young)、ソリッド フェイズ ペプチド シンテシス(Solid Phase Peptide Synthesis)、ピアス ケム コーポレーション(Pierce Chem Co.)、ロックフォード、アイエル(IL)、１９８４年（２版）の本およびジー バラニー(G.Barany)ら、イント ジェー ペプチド プロテイン レス(Int.J.Peptide Protein Res.)、第３０巻、ページ７０５〜７３９，１９８７年の雑誌に掲載されている。（Ｃ末端のＡ9残基を酸化し、残基の特徴的な側鎖をそのα−アミノ基で環化するさらなる段階は式Ｉのペプチドの合成の様々な段階で行われる。）
少なくとも２つの合成プロトコルによって、式Ｉのプソイドペプチドのボンベシン拮抗物質が製造できる。第一のプロトコルでは、すべてのアミノ酸を、Ｃ末端残基、Ａ9を樹脂の支持相に連結した後、順次それぞれ結合していく。第二のプロトコルでは、トリペプチドを樹脂上に構築する。さらに、このトリペプチドを残りのアミノ酸を有するオリゴペプチドに連結することによって、ボンベシン拮抗物質を形成する。これらプロトコルは２つとも、合成がＣ末端のＡ9残基で始まり、アミノ酸残基を順次付加することによってＮ末端残基に向かって成長させる。
１．（ａ）第一のプロトコル
プソイドペプチドの固相合成で用いられる樹脂支持相は、ベンズヒドリルアミン(benzhydrylamine)（ＢＨＡ）樹脂またはジビニルベンゼンで１％架橋されたクロロメチル化ポリスチレン樹脂であり、これらは両方とも市販されている。Ｃ末端のＡ9残基をカルボキシル基を介して上記樹脂に結合させる。これら２つの残基間の反応は、樹脂に連結する前に各Ａ9残基のα−アミノ基に化学保護基(chemical protecting group)を結合させることによって阻害される。Ａ9残基、および順次連結されるアミノ酸残基のα−アミノ基に対する保護基は、９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)（Ｆｍｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル(tert-butoxycarbonyl)（Ｂｏｃ）基のいずれかである。Ｆｍｏｃは、Ｂｏｃを除去する反応によってＣ末端のＡ9の残基から側鎖の保護基をも除去するため、Ｃ末端のＡ9からＡ2の残基に連結する(coupling)際に、好ましい。これらの連結反応の間、アミノ酸残基によっては特徴的な側鎖の官能基を、連結反応の前に化学保護基（Ａ9に対しては好ましくはＢｕｔ）を結合させることによって、望ましくない化学反応が起こらないように保護してもよい。
Ｃ末端のＦｍｏｃ−Ａ9（Ｂｕｔ）残基を支持相に結合させた後、そのα−アミノ基を脱保護し、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯを連結し、プソイドペプチド結合を形成する。
残りの残基、Ａ5、Ａ4、Ａ3及びＡ2はＦｍｏｃによって保護されるのが好ましく、Ａ1はＢｏｃによって保護されるのが好ましいが、これらを逆の番号順（Ａ7、Ａ6等）で順番に付加し、目的とするプソイドペプチドを構築する。
HisまたはGluがプソイドペプチド中に存在する際には、これらの側鎖は、これらの連結反応中または他の残基の連結反応中に望ましくない化学反応を受けやすい。したがって、連結反応でこれらのアミノ酸を連結する前に、化学保護基をこのような側鎖に結合させてもよい。
すべてのアミノ酸残基をＢＨＡ樹脂に連結させた後、Ｎ末端のプソイドペプチドのＢｏｃを除去する。Ｔａｃ、ＭＴａｃ若しくはＤＭＴａｃの５員の複素環を、Ｃｙｓの暴露した−ＣＨ2−ＳＨ部分（またはＰｅｎの−Ｃ（ＣＨ3）2ＳＨ）およびＡ8及びＡ9残基（即ち、Ａ9のα−アミノ）を結合させる還元された結合の第２級アミンとホルムアルデヒドやアセトアルデヒド等の酸化剤との反応によって形成する。中間プソイドペプチドは、側鎖の保護基を有したままだが、ＨＦ処理を行うことによって、樹脂の支持相から切断し、さらに側鎖の保護基をも除去する。
２．（ｂ）第二のプロトコル
第二のプロトコルにおいては、固相合成経路を経た後、トリペプチドをＢＨＡ樹脂上に構築し、保護されたトリペプチド樹脂を形成する：
Boc-His(Bom)7-Leu8-psi-Cys(But)9-BHA樹脂
Ｂｏｃ1基及びＢｕｔ基を除去し、Ｃｙｓの−ＣＨ2−ＳＨ部分をＡ8及びＡ9残基を結合する還元された結合の第２級アミンで環化し、His(Bom)7-Leu8-psi-Tac9-BHA樹脂を得る。ＨＦ処理後、遊離したトリペプチドHis7-Leu8-psi-Tac9-NH2を得る。Boc-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-OCH2-樹脂を、固相合成の標準方法にしたがってGly-OCH2-樹脂上に順次構築し、さらに、１％ ＫＣＮを含有する９５％メタノール中で１２時間処理し、Ｂｏｃ−オリゴペプチドを切断する。２断片を構築した後、Ｂｏｃ−オリゴペプチドを、ＢＯＰ試薬を用いて遊離したHis7-Leu8-psi-Tac9-NH2のトリペプチドに連結する。次に、Ｂｏｃ基を除去し、目的とするペプチドを得る。
式Ｉのボンベシン拮抗物質の合成を詳細に記載する前に、上記プロトコルの１つ若しくは両方に共通する様々な合成操作を以下に記載する。
２．ポリペプチド合成に関する一般的な操作
操作１：特定の合成残基または反応体の形成
a)Ｌ−およびＤ−Ｔｐｉ：
２．０４ｇ（１０ｍＭ）のＬ−Ｔｐｉを２．１ｇのクエン酸を含む２５ｍｌの沸騰した水に溶解する。０．５ｍｌの４０％ホルムアルデヒド水溶液を加えると、固体が即座に形成し始める。この混合物を氷浴中で冷却し、沈殿物を収集し、冷却水及び空気で洗浄し、さらに室温で乾燥させると、２．１４ｇ若しくは９９％の固体［融点（分解）［m.p.(decomposition)］は約３１０℃］が得られる。Ｄ−体はＤ−Ｔｒｐから同様にして形成され、約３１０℃の融点（分解）を有する。
b)Ｌ−およびＤ−Ｂｏｃ−Ｔｐｉ：
１０．８ｇ（５０ｍＭ）のＤ−Ｔｐｉを懸濁した２５０ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ及び７．５ｍｌ トリエチルアミンの攪拌された懸濁液に、１０ｇのジ−ｔ−ブチルジカルボネート(Di-tert-butyl dicarbonate)を添加し、この混合物を４時間攪拌した後、１０ｇのジカルボネート(dicarbonate)をさらに加え、さらに３時間攪拌した後１０ｇをさらにまた加えた。この混合物を一晩攪拌し、エーテルで抽出（２×１００ｍｌ）し、エーテルは捨てる。クエン酸を水層にｐＨが３〜５になるまで添加した。固体を収集し、水で洗浄し、一晩風乾した。
固体を１００ｍｌのテトラヒドロフラン中に懸濁する。ほとんどすべての固体が溶解する。不溶物を濾過によって除き、ＴＨＦを真空下で除去する。残渣をエーテルで粉砕することによって９．２０ｇ若しくは５８％の物質が得られる。この物質は出発材料と同じ融点を有するが、溶解度及び８５：１５：０．５のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＨＯＡｃを用いたシリカによるＴＬＣが異なる。
２．５５ｇのＬ−Ｔｐｉを使用する以外同様の方法を用いるによって、２．２２ｇ若しくは５９％のＢｏｃ−Ｔｐｉが得られる。
c)Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ：
窒素雰囲気下で乾燥トルエン（２５０ｍｌ）中に溶解したＦｍｏｃ−ロイシン メチルエステル(Fmoc-Leucine methyl ester)（３５ｇ、１３４ミリモル）を、乾燥氷／アセトンで冷却し、１５０ｍｌの２５％ 水酸化ジイソブチルアルミニウム(di-isobutyl-aluminium hydride)のトルエン溶液を３０分かけて加える。水酸化ジイソブチルアルミニウムを添加し終わった後、この混合物を乾燥氷／アセトン浴中で２０分間攪拌し、さらに、メタノール（１５ｍｌ）を注意深く加える。この混合物を１０００ｍｌの氷冷水中に注ぎ、振盪、瀘過する。トルエンを分離し、水相をエーテルで再抽出する（３×３００ｍｌ）。トルエン及びエーテル抽出物を合わせ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥する。このようにして得られた油状物を、１５００ｍｌ １５％ＥｔＯＡｃ／ガソリン中で素早くシリカゲルカラム（３×５０ｃｍ）に通す。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯが固体として得られる（２７．６ｇ）。
d)合成アミノ酸またはアミノ酸類似体：
ボンベシン拮抗物質プソイドペプチド中に導入される合成アミノ酸またはアミノ酸類似体は、通常市販されているものである。したがって、Ｈｃａは、ダブルアイ ５３２３３，ミルウォーキー，セント ポール アヴェニュー １００１(1001 St. Paul Avenue, Milwaukee, WI 53233)のアルドリッヒ コーポレーション(Aldrich Co.)より市販されているものである。Ｂｏｃ−若しくはＦｍｏｃ−保護アミノ酸は、ケーワイ ４０２２８，ルイスヴィレ，ファーン ヴァレー ロード ５６０９(5609 Fern Valley Road, Louisville, KY 40228)のアドバンスド ケムテック(Advanced ChemTech)；またはシーエー ９０５０５，トーランス，カシワ ストリート ３１３２(3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505)のバケム カルフォルニア(Bachem California)より市販されているものである。
操作２：樹脂の調製およびＡ9残基の付加
ＢＨＡ樹脂を、１０％ ＴＥＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液で各々３分間ずつ２回処理（中和）することによって調製し、ＣＨ2Ｃｌ2で６回洗浄する。１．３５ミリモルのＦｍｏｃ−Ａ9（Ｂｕｔ）及び１．５０ミリモルの１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール(1-hydroxybenzotriazole)（ＨＯＢｔ）のＤＭＦ溶液を加え、３分間混合することによって、Ｆｍｏｃ−Ａ9（Ｂｕｔ）残基を樹脂に結合させる。２０％ １，３−ジイソプロピル−カルボジイミド(1,3-diisopropyl-carbodiimide)（ＤＩＣ）のＣＨ2Ｃｌ2溶液（１．３ミリモル）を加える。この混合物を室温で６０分間振盪する。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ａ9（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を、ＣＨ2Ｃｌ2及びメタノールでそれぞれ２回、さらにＣＨ2Ｃｌ2で３回洗浄した後、カイザーテスト(Kaiser test)（アナル バイオケム(Anal. Biochem.)、３４巻、ページ５９５（１９７０年））を行った。不完全な連結が行われた場合には、この工程を繰り返す。
操作３：プソイドペプチド結合の形成
５０％ ピペリジンのＤＭＦ溶液を添加し、３０分間混合し；ＤＭＦで洗浄（６×１分）し；次に、i)１％ ＡｃＯＨを含むＤＭＦに溶解したＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（３当量）を加え；さらに、iiＤＭＦに溶解したＮａＢＨ3ＣＮ（３．５当量）を加え６０分間振盪することによって、Ｆｍｏｃ基のＡ9からの脱保護を行う。この後、５０％ ＭｅＯＨ（３×１分）；１００％ ＭｅＯＨ（３×１分）；およびＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
操作４：アミノ酸の連結およびペプチド結合の形成
Ａ9残基のα−アミノ基、および各々順次連結されるアミノ酸残基に対する保護基は、９−フルオルエニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)（Ｆｍｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル(tert-butoxycarbonyl)（Ｂｏｃ）基のいずれかである。Ｆｍｏｃは、Ｂｏｃを除去する反応によってＡ9の側鎖の保護基をも除去するため、Ａ9からＮ末端のアミノ酸残基付近のアミノ酸残基に向かって連結する(coupling)際に、好ましい。
A)Ｆｍｏｃ−アミノ酸を用いる
Ｆｍｏｃアミノ酸をＦｍｏｃ−中間ペプチドに導入するために、以下の工程を行う。
(1)Ｆｍｏｃ−中間ペプチドを脱保護および中和した後、ＣＨ2Ｃｌ2（３×１分）およびＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
(2)Ｆｍｏｃ−アミノ酸を脱保護された中間ペプチドに以下のようにして連結する：
i)ＤＭＦに溶解したＦｍｏｃアミノ酸（３当量）及びＨＯＢｔ（３．３当量）を中間ペプチドに添加（３分）する；ii３当量のＤＩＣ（２０％のＣＨ2Ｃｌ2溶液になるように）を添加し、混合物を９０分間振盪する。
(3)次に、混合物をエタノール（３×１分）およびＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
さらに残基を連結するために、新たに連結されたＦｍｏｃ−アミノ酸を、５０％ ピペリジンのＤＭＦ溶液によって３０分間脱保護し、ＤＭＦで洗浄する（６×１分）。ステップ（２）に記載したのと同様にしてさらに連結を行う。
新たなアミノ酸を樹脂またはペプチドに連結するたびに、カイザーテストを行う；連結が不完全である場合には、反応を繰り返す。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結するために、上記操作のステップ（２）を以下のように修飾する：３当量のＤＩＣ（２０％のＣＨ2Ｃｌ2溶液になるように）を、Ｆｍｏｃアミノ酸（３．０当量）及びＨＯＢｔ（３．３当量）の混合ＤＭＦ溶液に０℃で１５分間及び室温で１５分間かけて添加する。反応混合物をペプチド樹脂に添加し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙの場合には１時間振盪し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎの場合には２時間振盪する。
B)Ｂｏｃ−アミノ酸を用いる
Ｂｏｃ−アミノ酸をＦｍｏｃ−中間ペプチドに導入するために、以下の工程を行う。
(1)Ｂｏｃ基を、５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を添加することによって除去する；
(2)５％ メルカプトエタノール及び５％ アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を２５分間かけて加える；および
(3)ＣＨ2Ｃｌ2（２回、１分）、ＭｅＯＨ（２回、１分）、およびＤＭＦ（３回、１分）で洗浄する。
(4)ＤＭＦに溶解した３当量のＢｏｃ−アミノ酸及び３．３当量のＨＯＢｔを添加し、３分間混合することによって、Ｂｏｃ−アミノ酸残基の連結を行う。次に、３当量の２０％ ジイソプロピル−カルボジイミドのＣＨ2Ｃｌ2溶液を加え、９０分間振盪する。この反応混合物を、ＭｅＯＨで洗浄（３回、１分）した後、さらにＣＨ2Ｃｌ2で洗浄する（３回、１分）。
(5)５％ メルカプトエタノール（５分）及び５％ アニソール（２５分）を含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液でステップ（５）の生成物を洗浄することによって、Ｂｏｃ基を除去（脱保護）する。さらに、ＣＨ2Ｃｌ2（２回、１分）、ＭｅＯＨ（２回、１分）、およびＤＭＦ（３回、１分）で洗浄する。
Ｂｏｃ基が除去されることによってＡ9の側鎖に連結されたＢｕｔ保護基も除去されることに留意しなければならない。したがって、Ｂｏｃ基の除去は、Ａ9残基の環化直前まで、一般的に行われない。
操作５：５員の複素環の形成
式ＩＩＡの環構造は、脱保護されたＣｙｓ9を有する中間ペプチドを５０％ ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの混合物（１：１：８）中で室温で３分間振盪することによって形成され、これを瀘過する。この生成物を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄する。
式ＩＩＢの環構造は、脱保護されたＣｙｓ9を有する中間ペプチドを５０％ ＡｃＯＨ、１０％ ＣＨ3ＣＨＯ及びＤＭＦの混合物（１．５：０．５：８）中で室温で１０分間振盪することによって形成され、これを瀘過する。この生成物を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄する。
式ＩＩＣの環構造は、脱保護されたＰｅｎ9を有する中間ペプチドを５０％ ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの混合物（１：１：８）中で室温で１０分間振盪することによって形成され、これを瀘過する。この生成物を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄する。
操作６：樹脂からのペプチドの分離
すべての目的とするアミノ酸残基を付加した後、中間ペプチド樹脂を、アニソールの存在下で液状ＨＦで処理し、ポリペプチドを支持相から切断する。この反応によって、側鎖の保護基も同様に除去される。ＢＨＡ樹脂を用いる際には、得られた中間ペプチドはＱがＮＨ2である。
ＸがＨ以外のときには、Ｘ基は、すでにＸ基を有するアミノ酸（例えば、Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ）を導入することによって；または中間プソイドペプチドのＮ末端のＡ1における脱保護されたα−アミノ基を適当な試薬と反応させることによって、Ｎ末端に位置させる。このようにして、樹脂支持相から除去された完全なペプチドは、ＫＯＣＮと反応させて、ＸをＮＨ2ＣＯ−とすることが好ましい。
操作７：ペプチドの精製
式Ｉのプソイドペプチドは、通常、アップル マッキントッシュ プラス コンピューター(Apple Macintosh Plus computer)によって制御されている３機のライニン ラッビット エッチピー ＨＰＬＣポンプ(Rainin Rabbit HP HPLC pump)、レオダイン インジェクター(Rheodyne injector)及びナウアー モデル ８７ 可変波長ＵＶモニター(Knauer Model 87 variable wavelength UV monitor)から構成されるライニン ＨＰＬＣ システム(Rainin HPLC System)（ライニン インク コーポレーション(Rainin Inc. Co.)製、ウォバーン(Woburn)、エムエー(MA)）で行われる逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。未精製のペプチド（１０〜４０ｍｇ）を、球状のＣ18シリカゲル（ポアサイズ：３００オングストローム；粒子サイズ：１２μｍ）（ライニン インク コーポレーション(Rainin Inc. Co.)製）が充填されたダイナマックス マクロ（Ｄｙｎａｍａｘ Ｍａｃｒｏ）カラム（２１．２×２５０ｍｍ）にのせ、２．０ｍｌ／分の流速で(A)０．１％ ＴＦＡおよび(B)０．１％ ＴＦＡを含む７０％ アセトニトリル水溶液からなる溶媒システムを用いて直線的な濃度勾配をつけて溶出する。すべての分画について、以下に記載の分析用ＨＰＬＣ(Analytical HPLC)によって精製度および保持時間(retention time)を調べた。
未精製および精製ペプチドの品質および溶出特性は、２２０及び２８０ｎｍにセットされたダイオード捕獲検出器(diode array detector)および逆相４．６×２５０ｍｍダブル−ポレックス(W-porex)Ｃ18カラム（ポアサイズ：３００オングストローム、粒子サイズ：５μｍ）を備えたヒューレット−パッカード(Hewlett-Packard)モデル １０９０液体クロマトグラフィーによる分析用ＨＰＬＣ(Analytical HPLC)によって行った。上記の溶媒システム（Ａ）及び（Ｂ）の流速を１．２ｍｌ／分に維持し、室温で分離を行った。
ほとんどの場合、濃度勾配の条件のわずかに変えたのみで同様のカラムによる再クロマトグラフィーによって、プソイドペプチドのボンベシン拮抗物質をさらに精製した。精製されたペプチドの等質性は、分析用ＨＰＬＣにおいて９７％以上精製されていることが分かった。
必要であれば、式Ｉのプソイドペプチドのアミノ酸分析を、０．２％ ３−（２−アミノエチル）−インドール(3-(2-aminoethyl)-indole)を含む４Ｍメタン−硫酸(methanesulfonic acid)を用いて真空密閉されたチューブ中で１１０℃、２０時間、加水分解されたサンプルについて、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）６３００アミノ酸分析器で行ってもよい。
Ｃ．合成中間体
１．側鎖の保護基
固相合成において、様々なアミノ酸部分またはペプチド断片の反応性を有する側鎖の官能基を保護することは共通する事柄である。これらの側鎖の官能基は、望ましくない化学反応が側鎖で起こることを防止するために保護される。したがって、適当な残基に連結される側鎖の保護基を有するペプチド鎖において目的とする配列中に位置するそれぞれのアミノアシル残基を含む中間ペプチドを生産することは共通する。
ペプチドの合成に使用される特定の側鎖の保護基を選択する際には、以下のような規則に通常従う：(a)保護基は連結条件下で自身の保護特性を維持することが好ましい、(b)保護基は、連結試薬に対して安定でなければならず、各合成段階におけるα−アミノ保護基を除去するために選択された連結反応条件下で安定であることが好ましい、および(c)側鎖の保護基は、ペプチド鎖が望ましくないように変化しないような反応条件下で、目的とするアミノ酸配列の合成が終了した時点で除去可能でなければならない。
側鎖の保護基は、既知の方法によってアミノ酸残基に結合する。Ｈｉｓに対する側鎖の保護基としてはＢｏｍが好ましく挙げられ；ＧｌｕおよびＣｙｓに対する側鎖の保護基としてはＢｕｔが好ましく挙げられる。
２．合成中間体
以下の合成段階における中間ペプチドも本発明の概念に含まれると解する。３段階におけるペプチド番号２のペプチド（以降、ペプチド２と称する）の中間ペプチドを以下に詳細に説明する：
段階Ａ：すべてのアミノ酸及び樹脂の連結後：
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂（“1/02/A”）；
段階Ｂ：Ｎ末端のＢｏｃ−基の除去後：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-BHA樹脂（“1/02/B”）；
段階Ｃ：Ａ9の環化後：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-BHA樹脂（“1/02/C”）。
以下の実施例２におけるペプチド番号１７の合成においてはさらに一段階、つまり段階Ｄが付加される。段階Ｄの中間体は、樹脂から除去されるが、Ａ2にＡ1を連結する単結合Ｘは持たない。
医療への使用
ボンベシン拮抗物質は、悪性貧血、慢性の萎縮性胃炎、ゾーリンガー−エリソン症候群(Zollinger-Ellison Syndrome)、及び白斑等の、胃腸のクロマフィン様細胞(gastric enterochromaffin-like cell)の広範な過形成に関連した、ハイパーガストリノーマ(hypergastrinemia)、および発達の危険性の高いものでは、多病巣性の胃のカルチノイドの症状を治療するのに有用である。さらに、腸のクロマフィン様細胞(enterochromaffin-like cell)の過形成は、ハイパーガストリノーマ(hypergastrinemia)を患う動物において容易に生じる。
このような治療は、シメチジン等のＨ2−拮抗薬はハイパーガストリノーマを引き起こし、ヒトのカルチノイドを生じさせることがあるため、現状の薬剤に比べて好ましいものである。さらに、Ｈ2−拮抗薬による治療を中止すると、ハイパーガストリノーマが存在するために、潰瘍が即座に再発する。
本発明の上記した化合物はボンベシン／ＧＲＰレセプターの拮抗物質であるため、肺癌、結腸癌及び胃癌の治療に使用できる。
本発明の式Ｉのボンベシン拮抗物質は、酸付加塩(acid addition salt)等の、製薬上使用できる毒性のない酸または塩の形態で投与される。このような酸付加塩としては、具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、タンニン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、琥珀酸塩、アルギン酸塩、パモエート、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等が挙げられる。
これらの薬剤組成物は、式Ｉのプソイドペプチドを既知の製薬上使用できる担体と組み合わせて含むが、この際、生理食塩水が例えば担体として使用できるが、他の既知の担体も使用できる。
これらの薬剤組成物による被験者の治療は、ＬＨＲＨの他の作用薬および拮抗薬、またはソマトスタチン類似体を用いた臨床治療と同様にして行われる。したがって、式Ｉのボンベシン拮抗物質は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、鼻孔内にまたは肺用のエアロゾルによって若しくは生分解性の適当なポリマー（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド(DL-lactide-coglycolide)等）から配合された貯蔵された形態(in a depot form)（例えば、マイクロカプセル、マイクロ顆粒(microgranule)若しくはシリンダー状の棒様の移植片）で投与されされる。連続点滴、注入ポンプ及びマイクロカプセル等の所定の時間で放出される形態(time-release mode)などの、他の同様な投与形態もまた本発明の概念に含まれる。
式Ｉのペプチドの有効投与量は、投与形態および処置される哺乳動物の種類によって変化する。投与量は、非経口投与の場合、１日当たり患者の１ｋｇの体重当たり約１〜１，０００μｇのペプチドである。上記投与量の範囲は単に好ましいというだけでより高い投与量も場合によっては選択される。注入量が約１５〜約３０日またはそれ以上継続するように計算された貯蔵された形態(depot form)である以外は、ペプチドを含有する生理食塩水を１日当たり約０．０１〜０．２０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の投与量になるように投与してもよい。
以下の実施例では、３種類のチャラクターコード(character code)を用いて、特定の合成段階における中間ペプチドを特定する。“１／０１／Ａ”と名付けられたペプチドは、合成の段階Ａが終了した実施例“１”で作製されたペプチド“０１”に対する中間ペプチドを表わす。同様にして、“２／０８／Ｂ”及び“４／１９／Ｃ”は、それぞれ合成段階Ｂ及びＣが終了した実施例“２”及び“４”で作製されたペプチド“０８”及び“１９”の中間ペプチドを表わす。
実施例（１）
ペプチド＃
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂を以下のようにして得る：２．０ｇ ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ2／ｇ）を、２０ｍｌ １０％ ＴＥＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液でそれぞれ３分間２回処理（中和）し、２０ｍｌ ＣＨ2Ｃｌ2で６回洗浄し；次に、ＤＭＦに溶解された３．３ミリモルのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）及び３．６ミリモルのＨＯＢｔと３分間混合する。３当量のＤＩＣ（ＣＨ2Ｃｌ2において２０％溶液となるように）を添加する。この混合物を室温で９０分間振盪する。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を、ＣＨ2Ｃｌ2、メタノールで各２回、さらにＣＨ2Ｃｌ2で３回洗浄した後、カイザーテスト(Kaiser test)を行った。
プソイドペプチド結合を形成するためのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯの連結を以下のようにして行う。Ａ9からのＦｍｏｃ基の脱保護を、１５ｍｌ ５０％ ピペリジンのＤＭＦ溶液を加え、３０分間混合し、１５ｍｌ ＤＭＦで洗浄する（６×１分）ことによって、Ｆｍｏｃ基のＡ9からの脱保護を行う。さらに、１％ ＡｃＯＨを含む３．３ミリモルのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（３当量）のＤＭＦ溶液を添加し、ＤＭＦに溶解したＮａＢＨ3ＣＮ（３．５当量）を添加し、さらに、１時間振盪する。この後、１５ｍｌ ５０％ ＭｅＯＨ（３×１分）；１５ｍｌ １００％ ＭｅＯＨ（３×１分）；および１５ｍｌ ＤＭＦ（３×１分）で洗浄する。
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂からのＦｍｏｃ基の除去（脱保護）を操作４Ａと同様にして行う。
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂からＦｍｏｃ基を除去し中和した後、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）の連結を操作４Ａに記載したようにして行う。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙの連結を操作４と同様にして行う。２０％ １，３−ジイソプロピルカルボジイミド(1,3-diisopropylcarbodiimide)のＣＨ2Ｃｌ2溶液（３．３ミリモル）を、０℃で、３．３ミリモルのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ及び３．６ミリモルのＨＯＢｔのＤＭＦ溶液に加え、冷却しながら１５分間攪拌し、さらに室温で１５分間攪拌し、沈殿物を瀘過し、樹脂に加え、６０分間振盪した。次に、アミノ酸残基、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−ＡｌａおよびＦｍｏｃ−Ｔｒｐを順次同様にして導入し、３．８０ｇの中間Ｉ−１、Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂の構造を有する保護されたペプチド樹脂を得た。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−ｐＧｌｕを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/01/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/02/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＡｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/04/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｃｐａを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/05/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｎａｌを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/07/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/08/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/09/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/10/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＡｃ−Ｄ−Ｔｒｐを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/11/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/12/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/13/A”）。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＨｃａを中間ペプチドＩ−１にさらに連結することによって以下が得られる：
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“1/14/A”）。
さらに、中間ペプチド１／０１／ＡのＮ末端のＢｏｃ基を、５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を用いて１回目は５分間及び２回目は２５分間の計２回処理することによって除去する。次に、中間ペプチドを、ＣＨ2Ｃｌ2（２回、１分）、ＭｅＯＨ（２回、１分）及びＤＭＦ（３回、１分）で洗浄する。これによって、ＣｙｓからＢｕｔ保護基をも除去され、これによって中間ペプチド、D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-BHA樹脂(“1/01/B”)が得られ、さらにこれをＣＨ2Ｃｌ2、ＭｅＯＨ及びＤＭＦで３回ずつ１分間洗浄する。
この時点で、中間ペプチド１／０１／ＢのＣｙｓの側鎖は、酸化によって環化し、操作５のように式ＩＩＡ中に示される５員の複素環を形成する。ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１：１：８）を添加する。この反応混合物を室温で３分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって、中間ペプチド１／０１／Ｃ、D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-BHA樹脂が得られる。
次に、中間ペプチド１／０１／Ｃを操作６と同様にしてＨＦ及びアニソールで処理し、ＨｉｓからＢｏｍ保護基を除去し、同時に樹脂支持相からノナペプチドを切断することによって、Ｃ末端にＮＨ2であるＱ基を形成する。このペプチドを操作７と同様にしてＨＰＬＣで精製する。このようにして、ボンベシン拮抗物質ペプチド番号１が得られる。
Ｂｏｃ基及びＢｕｔ基の除去および還元された結合の第２級アミンによるＣｙｓの−ＣＨ2−ＳＨ基の環化の段階を同様にして中間ペプチド１／０２／Ａ、１／０５／Ａ、１／０７／Ａ、１／０８／Ａ、１／０９／Ａ、１／１０／Ａ及び１／１２／Ａについて行い、以下の中間ペプチドを得る：
これらのペプチドの保持時間は以下の通りである。
０．８ｍｌの氷酢酸中に固相合成から得られた２５ｍｇのＬｅｕ−ｐｓｉ−Ｃｙｓ−ＮＨ2の構造を有する中間ペプチドを１００μｌの１％ホルムアルデヒド（水における重量％溶液）と室温で３０秒間混合した後、２０μｌの５０％酢酸アンモニウム溶液を添加する。この反応混合物を精製し、−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｔａｃ−ＮＨ2の構造を有する目的とするペプチドを得る。
実施例（２）
ペプチド＃
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−２にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“2/15/A”）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−２にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“2/16/A”）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｂｕｔ）及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−２にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-Glu(But)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“2/17/A”）
操作４と同様にして５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を用いて、中間ペプチド２／１５／ＡからＢｏｃ基を除去する。この反応によって、残基Ａ9からＢｕｔ基も除去され、これによって以下の中間ペプチド２／１５／Ｂが得られる：
D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-BHA樹脂
この時点で、中間ペプチド２／１５／ＢのＣｙｓの側鎖は、酸化によって環化され、操作５と同様にして式ＩＩＡ中に示される５員の複素環を形成する。ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１：１：８）を添加する。この反応混合物を室温で３分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって以下の中間ペプチド２／１５／Ｃが得られる：
D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-BHA樹脂
次に、中間ペプチド２／１５／Ｃを、新たに蒸留されたＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理することによって、ＨｉｓからＢｏｍ保護基をも除去する。溶媒を真空下で蒸発させ、酢酸エチルで洗浄し、７０〜８０％の酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥する。精製後、ボンベシン拮抗物質ペプチド番号１５が得られる。
Ｎ末端のＢｏｃを除去し、Ｃｙｓ9を環化し、ＢＨＡ樹脂から中間ペプチドを除去し、さらにＨＰＬＣで精製する段階を中間ペプチド２／１６／Ａ及び２／１７／Ａについて同様にして行うことによって、ペプチド番号１６及び以下の中間ペプチド２／１７／Ｄが得られる：
D-Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
１５ｍｇの２／１７／Ｄ、および０℃の１５ｍｇ ＨＯＢｔを含む０．８ｍｌのＤＭＦの混合物を、５０μｌ ２５％ ジイソプロピルカルボジイミド(1,3-diisopropylcarbodiimide)のＣＨ2Ｃｌ2溶液に添加し、０℃で２時間攪拌する。Ｄ−Ｐｈｅ1のα−アミノがＧｌｕ2の３−プロピオニル部分のγ−カルボキシル部分に連結したペプチド１７の単結合を形成させる：
保持時間は以下の通りである。
ペプチド＃
Ｂｏｃ基の除去を、操作４と同様にして５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を用いて行う。
この時点で、中間ペプチド３／３／ＢのＣｙｓの側鎖は、酸化によって環化され、操作５と同様にして式ＩＩＢ中に示される５員の複素環を形成する。５０％ ＡｃＯＨ、１０％ ＣＨ3ＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１．５：０．５：８）を添加する。この反応混合物を室温で１０分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって、以下の中間ペプチド３／３／Ｃが得られる：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-BHA樹脂
中間ペプチド３／３／Ｃ及び３／６／Ｃを、ＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理することによって、操作６と同様にして樹脂から除去する。この工程によって、ＨｉｓからＢｏｍ保護基をも除去され、これによってノナペプチド３及び６が得られる。
これらのペプチドを操作７と同様にしてＨＰＬＣを用いて精製する；保持時間は以下の通りである。
実施例（４）
ペプチド＃
したがって、１．０ｇ ＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ2／ｇ）を、操作２にしたがって調製し、１０ｍｌ １０％ ＴＥＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液でそれぞれ３分間２回処理（中和）し、１０ｍｌ ＣＨ2 Ｃｌ2で６回洗浄する；次に、ＤＭＦに溶解した１．６ミリモルのＦｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）及び１．８ミリモルの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1-hydroxybenzotriazole)（ＨＯＢｔ）と３分間混合する。１．６ミリモル濃度である２０％ １，３−ジイソプロピルカルボジイミド(1,3-diisopropylcarbodiimide)（ＤＩＣ）のＣＨ2Ｃｌ2溶液を添加する。この混合物を室温で９０分間振盪する。このようにして得られたＦｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂を、ＣＨ2Ｃｌ2、メタノールで各２回、さらにＣＨ2Ｃｌ2で３回洗浄した後、カイザーテスト(Kaiser test)を行う。
Ｆｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂からのＦｍｏｃ−基の除去（脱保護）を操作４Ａと同様にして行う。
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯの連結を操作３にしたがって行う。Ａ9（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂をＤＭＦで２回洗浄する。次に、１％ ＡｃＯＨを含む１．６ミリモルのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯのＤＭＦ溶液を加えた後、１．８ミリモルのＮａＢＨ3ＣＮのＤＭＦ溶液を添加する。この反応混合物を６０分間振盪した後、５０％メタノール水溶液で２回、１００％メタノールで２回、及びＣＨ2Ｃｌ2で３回、それぞれ１分間ずつ洗浄する。
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｐｅｎ（Ｂｕｔ）−ＢＨＡ樹脂からＦｍｏｃ基を除去し中和した後、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）の連結を操作４と同様にして行う。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙの連結を操作４と同様にして行う。２０％ １，３−ジイソプロピルカルボジイミド（１．５ミリモル）のＣＨ2Ｃｌ2溶液を、１．５ミリモルのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ及び１．６５ミリモルのＨＯＢｔを含むＤＭＦ溶液に０℃で添加し、冷却しながら１５分間および室温で１５分間攪拌し、沈殿物を瀘過し、樹脂に加え、６０分間振盪する。次に、アミノ酸残基Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ及びＦｍｏｃ−Ｔｒｐを同様にして順次連結することによって導入し、１．９ｇのFmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂の構造を有する保護されたペプチドである中間体Ｉ−４が得られる。
０．９１ｇの中間ペプチドＩ−４を５つのアリコート（各約２００ｍｇ）に分け、これを用いて操作４に記載された方法にしたがって保護されたポリペプチド樹脂を合成する：
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅを中間ペプチドＩ−４にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/18/A”）
中間ペプチドＩ−４にＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結した後Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅをさらに連結することによって以下が得られる：
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/19/A”）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ｄ−ｐｈｅを中間ペプチドＩ−４にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/20/A”）
中間ペプチドＩ−４にＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結した後Ｂｏｃ−Ｔｐｉをさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/21/A”）
中間ペプチドＩ−４にＦｍｏｃ−Ｇｌｎを連結した後Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉをさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-BHA樹脂 （“4/22/A”）
さらに、Ｂｏｃ−基を５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液を用いて中間ペプチド４／１８／Ａから除去することによって、以下の中間ペプチド４／１８／Ｂが得られる：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen-BHA樹脂
この時点で、中間ペプチド４／１８／ＢのＰｅｎの側鎖は、酸化によって環化され、操作５と同様にして式ＩＩＣ中に示される５員の複素環を形成する。ＡｃＯＨ、３．７％ ＨＣＨＯ及びＤＭＦの１０ｍｌの混合物（１：１：８）を添加し、反応混合物を形成し、この反応混合物を室温で３分間振盪し、水、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2でそれぞれ３回ずつ洗浄することによって以下の中間ペプチド４／１８／Ｃが得られる：
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-DMTac-BHA樹脂
次に、中間ペプチド４／１８／Ｃを５ｍｌ ＣＨ2Ｃｌ2、メタノール及びＣＨ2Ｃｌ2で各３回ずつ洗浄し、新たに蒸留されたＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理する。溶媒を真空下で蒸発させ、エーテル若しくは酢酸エチルで洗浄し、７０〜８０％の酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥することによって未精製のノナペプチド樹脂が得られる。この反応混合物を精製し、ボンベシン拮抗物質ペプチド番号１８を得る。
中間ペプチド４／１９／Ａ、４／２０／Ａ、４／２１／Ａ及び４／２２／Ａについて、同様にして保護基を除去し、脱保護されたＡ9を環化し、さらに中間ペプチドをＢＨＡ樹脂から外すことによって、それぞれペプチド番号１９、２０、２１及び２２が得られる。
操作７にしたがって(A)０．１％ ＴＦＡおよび(B)１％ ＴＦＡを含む７０％ アセトニトリル水溶液からなる溶媒システムを用いてＨＰＬＣによって精製を行った。これらのペプチドの保持時間は以下の通りである。
実施例（５）
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
これらのペプチドは、共通の中間体Ｉ−５、Fmoc-Gln-Trp-Alv-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂から合成される。
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂は以下のようにして得られる：操作２及び３に示された方法によって１．０ｇＢＨＡ樹脂（０．５５ミリモルＮＨ2／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔ）及びＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＣＨＯを順次連結する。
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎを順次連結することによって、中間ペプチドＩ−５、Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂が得られる。
本実施例のすべてのペプチドに共通な上記中間体Ｉ−５の１５０ｍｇのアリコートを操作４に記載された方法によってさらにもう１回連結を行うことによって、最終的なペプチド樹脂を得る。
Ｂｏｃ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/08/A”）
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐａｌを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/09/A”）
Ｂｏｃ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/12/A”）
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｐｉを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/13/A”）
Ｈｃａを中間ペプチドＩ−５にさらに連結することによって以下が得られる：
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA樹脂 （“5/14/A”）
Ｎ末端のＢｏｃ基を、５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液で第一回目は５分間及び次に２５分間の計２回処理することによって、中間ペプチド５／０１／Ａから除去する。この処理によって、Ｃｙｓから保護基をも除去する。さらに、このペプチドを、操作４と同様にして、ＣＨ2Ｃｌ2、ＭｅＯＨ及びＤＭＦで洗浄することによって、以下の中間ペプチド５／０８／Ｂが得られる：
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-BHA樹脂
さらに、この中間ペプチド５／０８／Ｂを、新たに蒸留されたＨＦ（５ｍｌ）及びアニソール（０．２５ｍｌ）で０℃で１時間処理することによって、ＨｉｓからＢｏｍ保護基をも除去する。溶媒を真空下で蒸発させ、酢酸エチルで洗浄し、７０〜８０％の酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥することによって以下のペプチドが得られる：
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
保護基及びＢＨＡ樹脂を中間ペプチド５／０８／Ａ、５／０９／Ａ、５／１１／Ａ、５／１２／Ａ、５／１３／Ａ及び５／１４／Ａから除去し、本実施例の冒頭に列挙されたペプチドを得る。これらのペプチドを操作７にしたがって精製試験にかける。
Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/08/A”）
Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/09/A”）
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/12/A”）
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/13/A”）
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA樹脂 （“5/14/A”）
５％メルカプトエタノール及び５％アニソールを含む５０％ ＴＦＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液で処理することによってＢｏｃ基を除去し、さらにＨＦ及びアニソールで処理することによって、ペプチドを樹脂から切断し、Ｈｉｓから保護基Ｂｏｍを、Ｃｙｓから保護基Ｂｚを除去し、本実施例の冒頭に列挙されたペプチドを得る。
実施例（６）：アッセイ法
（Ａ）レセプター結合アッセイ
125Ｉ−Ｔｙｒ4−ボンベシンの結合およびボンベシン拮抗物質プソイドペプチドによる置換を、スイス ３Ｔ３(Swiss 3T3)細胞を用いて２４−穴の組織培養プレート（ギブコ(GIBCO)製）において試験した。マウスのスイス ３Ｔ３(Swiss 3T3)繊維芽細胞を、１０％ ＦＣＢＳ及び抗真菌剤を含んだＤＭＥＭで１週間毎に継代することによって維持した。培養は、３７℃で５％ ＣＯ2濃度の空気中で行った。穴に、１０5細胞／穴（生存率＞９５％）で播き、集密及び休止まで生育させた。結合段階は、播種後７日目に行った。細胞を、０．５ｍｌの結合バッファー（２０ｎＭ ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．２％ ＢＳＡ及び１００μｇ／ｍｌバシトラシンを含むダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium)）で２回洗浄した。さらに、細胞を、様々な濃度の拮抗物質の存在下で（６×１０-11〜６×１０-6Ｍ、全量０．４ｍｌ）若しくは拮抗物質を存在させないで、０．２ｎＭ 125Ｉ−Ｔｙｒ4−ボンベシンと共に培養した。
ザチャリー(Zachary)及びローゼンガルト(Rozengurt)（１９８５年）およびレイトン(Layton)ら（１９８８年）によると、３７℃での125Ｉ−ＧＲＰの結合は３０分で最高値に達し、以降は減少することから、細胞を３７℃で３０分間培養する。その後、細胞を氷冷（４℃）した結合バッファーで２回洗浄し、さらに氷冷したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｍＭ）：ＮａＣｌ １３８、ＫＣｌ ２．８、Ｎａ2ＨＰＯ4 ８、ＫＨ2ＰＯ4 １．４５、ＣａＣｌ2 ０．９１、ＭｇＣｌ2 ０．４９で２回洗浄した。洗浄された培養物を０．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で抽出し、放射能値測定用のチューブに移した。穴を、０．５ｍｌの蒸留水（滅菌済）で１回洗浄し、さらに、洗浄液を適当なチューブに入れた。次に、上記サンプルの放射能値を、自動ガンマカウンター（マイクロメディック システム インク(Misromedic System Inc.）製、ハンツヴィル(Huntsville)、アラ(Ala.))で測定した。
マンソン(Munson)およびロッドバード(Rodbard)のプログラムに適したリガンド−ＰＣ算定カーブを用いて、レセプター結合のタイプ、解離定数（Ｋｄ）、会合定数（Ｋａ）、およびレセプターの最高結合能力（Ｂｍａｘ）を測定した。
本発明におけるポリペプチドの結合データを以下の表１に示す。様々な投写量の標識されないペプチドを用いて、置換された特異的な125Ｉ−Ｔｙｒ4−ボンベシン結合能を測定した。各ペプチド（それぞれ３連で行った）について２〜３の個々の試験の平均値を示す。
エストロゲン非依存性ＭＸＴマウスの乳癌の腫瘍容積に関するボンベシン拮抗物質による治療効果を以下のようにして試験する：
４０匹の雌のＢ６Ｄ２Ｆ1マウスは、ナショナル カンサー インティテュート(National Cancer Institute)、フレデリック カンサー リサーチ ファシリティ(Frederick Cancer Research Facility)（フレデリック、マリーランド(Frederick,Maryland)）より得、２１±１℃及び５５±５％湿度で飼育する。この動物を１２時間照射／１２時間暗室に自動的に切り替わる部屋に置き、齧歯動物用の実験飼料５０００１(rodent laboratory chow 5001)と水道水を無制限に与える。ドクター エーイー ボーデン(Dr. A.E. Bogden)（バイオメジャー インク(Biomeasure Inc.）、ホッキントン、エムエー(Hopkinton, MA)）より得られた、エストロゲン非依存性ＭＸＴ（３．２）／オベックス乳癌の凍結保存された組織(estrogen independent MXT(3.2)/Ovex mammary carcinoma cryo-preserved tissus)を、１ｍｍ3のＭＸＴ（３．２）／オベックス腫瘍(MXT(3.2)/Ovex tumor)の容積で成熟した雌のマウスの皮下に接種する。
腫瘍を移植してから２日後、マウスを無作為に４つのグループに分け、ペプチドが一様に放出するシステム(sustained delivery system)（マイクロカプセル）による治療を開始する。以下の４群を用いる：
１） コントロール：賦形剤のみを注入；
２） [D-Tpi6,Leu13-psi-Leu14]Bn(6-14)；
３） [D-Phe6,Leu13-psi-Tac14]Bn(6-14)；
４） 左右の卵巣を外科的にｖ摘出。
ボンベシン拮抗物質に関するこれらの略称は、以下の既知のペプチド断片の残基の番号付けを用いる：各残基を完全な断片における位置によって番号付けする。しかしながら、ボンベシン拮抗物質は、Ｎ末端を「１」として始めて番号付けをした方が本明細書においては他のペプチドと比べて容易である。したがって、「［Ｄ−Ｔｐｉ6，Ｌｅｕ13−ｐｓｉ−Ｌｅｕ14］Ｂｎ（６−１４）」は、Ｄ−Ｔｐｉ1−Ｇｌｎ2−Ｔｒｐ3−Ａｌａ4−Ｖａｌ5−Ｇｌｙ6−Ｈｉｓ7−Ｌｅｕ8−ｐｓｉ−Ｌｅｕ9−ＮＨ2（以降、「Ｂ１」と称する）であり、「［Ｄ−Ｐｈｅ6，Ｌｅｕ13−ｐｓｉ−Ｔａｃ14］Ｂｎ（６−１４）」は上記ペプチド番号２と同じである。
これら２つのボンベシン拮抗物質を固相合成によって合成する。第２群のマウスは「Ｂ１」が一様に放出するような製剤(sustained release formulation)を投与され、第３群のマウスは上記ペプチド番号２を含む一様に放出するような製剤を投与される。上記一様に放出するような製剤(sustained release formulation)は、１５日間、２５μｇ／日の量でＢ１またはペプチド番号２を連続して放出し続けた。
一様に放出(sustained delivery)させるために、アルゼット浸透ポンプ(Alzet osmotic pump)（アルゾ コーポレーション(Alzo Co.)製、パロ アルト、シーエー(Palo Alto, CA)）を用いた。０．４８μｌ／時間で放出するアルゼットポンプモデル２００２(Alzet Pump Model 2002)を背中の下側面領域に皮下移植した。ペプチドを、浸透ミニポンプに満たすために、５０％（ｖ／ｖ）のポリプロピレングリコール水溶液に溶解した。
腫瘍が目視でき触知できるようになった後、腫瘍容積を測定し、チェンデ ビー(Szende B.)ら、「グロース インヒビション オブ エムエックスティ マンマリー カルシノマ バイ エンハンシング プログラムド セルデプス(Growth Inhibition of MXT Mammary Carcinoma by Enhancing Programmed Cell Depth)」（ＬＨ−ＲＨ及びソマトスタチンの類似体によるアポプトシス）、ブレスト カンサー レス トリート(Breast Cancer Res. Treat.)、１４巻、ページ３０７〜３１４（１９８９年）に記載されたようにして計算する。
腫瘍の成長が指数的成長相になったところで実験を終了した。第一回目の腫瘍容積測定は１０日目であった。コントロールといずれかのボンベシン拮抗物質で処理したものとの腫瘍の容積の差および２つのボンベシン拮抗物質で処理したものの間の腫瘍の容積の差は統計上顕著である。腫瘍容積の測定の結果を表２に示し、図１に詳細に記載する。
ヌードマウスにおけるヒトの肺小細胞癌への１つのソマトスタチン類似体および３つのボンベシン拮抗物質の効果を以下のようにして試験する：到着時におおよそ６週令の無胸腺の雄のヌードマウスをナショナル カンサー インティテュート(National Cancer Institute)（ベテスダ、エムディ(Bethesda, MD)）より得、病原体が制限された条件下で維持する。
ヒトの肺小細胞癌（ＳＣＬＣ、Ｈ６９系統）を、湿度のある５％ ＣＯ2濃度の雰囲気下で３７℃で１０％ウシ血清アルブミン、抗生物質及び抗真菌剤を添加したＲＰＭＩ １６４０（ギブコ(Gibco)製、グランド アイランド、エヌワイ(Grand Island, NY)）中に単層として生育させる。細胞組織培養した指数的に成長した細胞のうち１×１０7個の細胞を５匹のヌードマウスの右側腹部中に皮下注射することによって、異種移植を開始する。３週間たった後の腫瘍を無菌的に切開し、物理的に細かく切り刻む。次に、３ｍｍ3の腫瘍組織片を６０匹の動物に套管針によって皮下移植する。移植してから２週間たった後、腫瘍を約１０ｍｍ3の容積になるまで成長させ、動物を無作為に選び、５種類の異なる化合物による処理を行うために５つの実験群に分け、移植後２週間目の日に開始する。５週間に渡り、毎週腫瘍の容積を測定する。腫瘍の容積は、（長さ×幅×高さ×π）／６として計算される。各群において８匹の動物を腫瘍の重量を測定するために剖検した。
ヌードマウスに投与された第一の治療用薬剤化合物は、ソフトスタチン類似体、D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2であり、本明細書においては「Ｓ１」と称する。
３つのボンベシン拮抗物質のうち第一の拮抗物質は、D-Tpi1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psi-Leu9-NH2、即ち、Ｂ１である。第二のボンベシン拮抗物質は、[Tpi6-Leu13-psi-Tpi14]Bn(6-14)、即ち、D-Tpi1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psi-Tpi9-NH2であり、本明細書においては「Ｂ２」と称し、さらに、第三の拮抗物質はペプチド番号２のペプチド（以下、ペプチド２と称する）である。
ポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）[poly(DL-lactide-coglycolide)]に含まれるＳ１のパモエートのマイクロ顆粒(microgranule)を、サイトテック エスエー(Cytotech SA)で調製し、１６ｍｇのアリコートから２週間にわたり約１００μｇ／日の量が放出されるように設計する。これらのマイクロ顆粒を腫瘍に対して反対側に毎日１５日間にわたり皮下注射する。各ボンベシン拮抗物質は、０．１％ジメチルスルホキシドの生理食塩水に溶解し、２０μｇ／日の投与量で毎日２回皮下注射する。
腫瘍の容積に関する上記薬剤の治療効果を表４に示し、図２に詳細に記載する。
ボンベシン拮抗物質によるＭＩＡ ＰＡＣＡ−２膵臓癌腫瘍(MIA PACA-2 pancreatic cancer tumor)に対する効果を以下のようにして測定する：
実施例８と同様のヌードマウスに、実施例８におけるＳＣＬＣと同様に生育された細胞組織培養物由来の、ＭＩＡ ＰＡＣＡ−２ヒト膵臓癌細胞注射液(MIA PACA-2 human pancreatic cancer cell injection)を皮下注射する。腫瘍の容積を実施例８と同様にして両方の実験群について測定する。
以下の２実験群を使用する：ボンベシン拮抗物質ペプチド２を投与したマウスの群および注射用賦形剤溶液のみを投与したコントロール群。５０μｇの注射用賦形剤溶液またはペプチド２を、皮下注射によって毎日２回各マウスに投与する。
腫瘍の容積の測定結果を表５に示し、図３に詳細に記載する。
ＣＡＰＡＮ−２ヒト膵臓癌(CAPAN-2 human pancreatic cancer)を有するヌードマウスに対するボンベシン拮抗物質による治療効果を以下のようにして測定する。
実施例７と同様のヌードマウスに、実施例７と同様にして生育された細胞組織培養物由来のヒトＣＡＰＡＮ−２膵臓腫瘍(human CAPAN-2 pancreatic tumor)の異種移植を行う。マウスの群を、注射用賦形剤溶液のみを投与したコントロール群およびボンベシン拮抗物質ペプチド番号２を投与した群の、２つに分け、それぞれの物質を５０ｍｇ、皮下注射によって毎日２回マウスに投与する。
実施例８と同様にして腫瘍の容積を測定し、腫瘍の容積の測定結果を表６に示し、図４に詳細に記載する。
Claims (9)
- Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｔａｃ−ＮＨ 2 である、ボンベシン拮抗物質ペプチド。
- Ｄ−Ｃｐａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｔａｃ−ＮＨ 2 である、ボンベシン拮抗物質ペプチド。
- Ｄ−Ｎａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｔａｃ−ＮＨ2である、ボンベシン拮抗物質ペプチド。
- Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｔａｃ−ＮＨ 2 である、ボンベシン拮抗物質ペプチド。
- Ｄ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｔａｃ−ＮＨ 2 である、ボンベシン拮抗物質ペプチド。
- Ｈｃａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−Ｔａｃ−ＮＨ 2 である、ボンベシン拮抗物質ペプチド。
- Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−ＤＭＴａｃ−ＮＨ 2 である、ボンベシン拮抗物質ペプチド。
- Ｄ−Ｔｐｉ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−ＤＭＴａｃ−ＮＨ 2 である、ボンベシン拮抗物質ペプチド。
- 請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載のポリペプチド、またはこの治療学的に使用できる付加塩の形態若しくは複合体および製薬上使用できる液状若しくは固体の担体からなる、癌の治療に使用される薬剤組成物。
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