NO313418B1 - Bombesinantagonistpeptider, farmasöytisk sammensetning inneholdende disse, samt anvendelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot nye peptider som innvirker på veksten av cancerholdige tumorer i mennesker. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt bombesinantagonister som er Y^-^ pseudopeptider inneholdende et Tac, MTac eller DMTac residie i den C-terminale posisjonen, salter derav og farmasøytiske sammensetninger, og anvendelse vedrø-rende disse peptidene. Disse peptidene har antagonistegenskaper overfor bombesin eller bombesin-1ignende peptider.

Foreliggende oppfinnelse vedrører polypeptidforbindelser som har antagonistegenskaper mot bombesin eller bombesin-lignende peptider (så som gastrinfrigjørende peptid (GRP), Neuromedin C og lignende) nedenfor referert til som bombesinantagonist-egenskaper og som er av verdi for eksempel ved behandling av maligne sykdommer i varmblodige organismer så som mennesker. Oppfinnelsen innbefatter nye polypeptidforbindelser og fremgangsmåter for fremstilling derav; nye farmasøytiske sammensetninger inneholdende nevnte polypeptidforbindelser og fremgangsmåter for fremstilling av medikamenter inneholdende disse for anvendelse ved fremstilling av en bombesin-antagoni stef fekt i varmblodige organismer så som mennesker.

Bombesin er et tetradekapeptidamid som først ble isolert fra huden til frosken Bombina bombina (Anastasi, Erspamer og Bucci, Experentia. 1971, 27, 166). Det er kjent at bombesin er et potent mitogen for muse Swiss 3T3 fibroblastceller (Rozengurt og Sinnett-Smith, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1983, 80, 2936) og at det stimulerer amylasesekresjon fra marsvin pankreas acini (Jensen, Jones, Folkers og Gardner, Nature. 1984, 309. 61). Det er også kjent at bombesin-lignende peptider blir produsert og utskilt fra humane små-celle lungecancer (SCLC) celler (Moody, Pert, Gazdar, Carney og Minna, Science. 1981, 214. 1246), som eksogent tilsatte bombesin-lignende peptider kan stimulere veksten av humane SCLC celler in vitro (Carney, Cuttita, Moody og Minna, Cancer Research, 1987, 47» 821) og at et monoklonalt antistoff spesifikt for C-Terminus regionen av bombesin og GRP kan blokkere bindingen av GRP til dets reseptorer og forhindre veksten av humane SCLC celler både in vitro og in vivo (Cuttita, Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler og Minna, Nature. 1985, 316. 823).

GRP som har bombesin-lignende egenskaper er et meget spredt peptidamid inneholdende 27 aminosyrer isolert fra grisetarm (McDonald, Jornvall, Nilsson, Vågne, Ghatei, Bloom og Mutt, Biochem. Biophys. Res. Commun.. 1979, .90, 227 ) hvor den C-terminale aminosyresekvensen nesten er identisk med den til bombesin. Neuromedin C er et dekapeptidamid, og strukturen derav er identisk med de siste ti aminosyrene i den C-terniinale regionen til GRP isolert fra tynntarmen til kanin (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke og Shively, J. Biol.

Chem., 1983, 258, 5582). GRP stimulerer forskjellige biologiske responser, inkludert frigjøring av gastrin i systemisk sirkulasjon. Det virker også som en vekstfaktor i 3T3 musefibroblaster og små-celle lungecancer (SCLC) celle. GRP er blitt foreslått å spille en direkte patofysiologisk rolle ved utvikling av SCLC via en autokrin vekstmekanisme.

Strukturene til bombesin, Neuromedin C og karboksyl-terminal nonapeptid av GRP er vist nedenfor: Bombesin pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

Neuromedin C H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

C-terminal nona-

peptid av GRP Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

Søken etter andre amfibiske bombesin-lignende peptider førte til isolering av litorin, som er et nonapeptid (pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2) i huden fra frosk fra Papua, New Guinea, som har vist seg å være en ekstremt potent bombesin-analog (Yasukara et al., Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 492). Studier på bombesinanaloger viste at et minimalt segment på 9 aminosyreresidier fra posisjon 6 til 14 av bombesin hadde et fullstendig spektrum av bombesinaktivitet.

Flere typer bombesinantagonister er nå blitt karakterisert. Forbindelse P (Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NHg) som har en viss aminosyresekvenshomologi med bombesin inhiberer ikke bindingen av bombesin og bombesin-lignende peptider, men forbindelse P analoger modifisert ved erstatning av flere L-aminosyrer med D-aminosyrer så som (D-Arg<1>, D-Pro<2>, D-Trp<7>'<9>, Leu1<1>) forbindelse P og (D-Arg<1>, D-Phe<5>, D-Trp<7>'<9>, Leu<1>!) forbindelse P, (Moody et al., Fed. Pro-ceedings, 1987, .46, 2201 ) ble funnet å blokkere utskillelse av bombesin i bukspyttkjertel acinarceller og å antagonisere de vekst-fremmende virkningene av bombesin i Swiss 3T3 celler. To typer av bombesinantagonister avledet fra bombesin, blant andre (D-Phe^, D-Phe<12>) bombesin og [Leu<13->psi-Leu<14>l bombesin (Coy et al., J. Biol. Chem.. 1988, 263, 5056 og peptider, 1989, .10, 587) har vist seg å være potente in vitro og in vivo inhibitorer av bombesinresponsen.

En annen type av bombesinantagonist tilveiebragt av Heimbrook et al., (Bio. Chem., 1989, 264. 11258) er N-acetyl-GRP(20-26) og analoger derav, hvor det C-terminale metioninresidiet er deletert fra GRP(20-27) analogene. Coy [ J. Biol. Chem.. 264, 1989, 2_5, 14691] rapporterte at visse kortkjedete bombesinantagonister basert på litorinsekvensen så som [D-Phe^, Leu13-p_si-Phe14]bombesin-(6-14 ) og [D-Phe^ , Leu13- psi-Leu<14>]bombesin-(6-14) viste mye mere potens enn deres tilsvarende opphavspeptid fLeu13- psi-Leu14]bombesin.

Lineære (ikke-cykli ske) bombesinanaloger av GRP og amfibisk bombesin med eventuelt en CHg-NH ikke-peptid binding er beskrevet i PCT patentsøknad WO 90/03980 (og beslektede analoger i WO 91/02746). Disse analogene, som virker som inhibitorer av naturlige bombesinpeptider, har formelen hvor R-l og R2 = H; A° kan ble deletert; blant de mange mulige aminosyrene i hver posisjon kan A<1> være D-Phe, D-Trp eller D-Nal; A<2> kan være Gin; A<4> kan være Ala; A<5> kan være Val; A° kan være Gly; A<7> kan være His; og W =

hvor R4 = CH2-NH; i noen tilfeller kan Z-^ være den identifiserende sidekjeden til Leu, dvs. -CH2CH(CH3)2; Z2 kan være den identifiserende sidekjeden til Cys eller Met, dvs. -CH2-SH eller (CH2 )2-S-CH3; V = N(R6)R7, hvor R6, R7 og R8 kan være H; R^ og R2 kan være H eller COE^, hvor E^ kan være C1_20 alkyl.

Lineære peptidanaloger av bombesin er også beskrevet i EP

0 309 297. Disse peptidene kan ha C-terminalt Met residie og en [CH2-NH] pseudopeptidbinding mellom C-terminalen og ved siden av liggende residie.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye polypeptider som er potente bombesinantagonister; fremgangsmåter for fremstilling av disse polypeptidene og medisinske applikasjoner inkludert farmasøytiske sammensetninger som omfatter nevnte polypeptider og nevnte polypeptider og sammensetninger som farmasøytiske aktive midler.

A. Syntetiske peptider

Foreliggende oppfinnelse omfatter bombesinantagonist-peptider, kjennetegnet ved at den har formelen

hvor

X er hydrogen,

en enkeltbinding som kobler alfaaminogruppen A<1> til gammakarboksyldelen på 3-propionyldelen av A<2> når A<2 >er Glu, eller en gruppe med formel R^CO-, hvor R<1 >blir valgt fra gruppene bestående av

a) hydrogen, C1_ 10 alkyl, fenyl, f en<y>l-C-^g<->alkyl, p-HI-fenyl, p-HI-fenyl-Ci_io-alkyl» naftyl, naftyl-Ci_10-alkyl, indolyl, indolyl-C-^Q-alkyl, pyridyl, pyridyl-C^_^Q-alkyl, tienyl, tienyl-C^_^Q-alkyl, cykloheksyl eller cykloheksyl-C1_10-alkyl, hvor HI = F, Cl, Br, OH, CH3 eller OCH3;

hvor

R<2> er hydrogen, C±_ iq alkyl, feTiyl eller fenyl-C^_^Q" alkyl,

R<3> er hydrogen eller C^_^o alkyl;

c) R<4->0 hvor R<4> er C±- iq alkyl, fenyl eller fenyl-C^.^Q-alkyl; A<1> er et D- eller L-aminosyreresidie valgt fra

gruppen bestående av Phe, p-HI-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, usubstituert Trp eller Trp substituert i benzenringen med en eller flere medlemmer valgt fra gruppen bestående av F, Cl, Br, NH2 eller C±_ 3 alkyl;

eller en peptidbinding som kobler acyldelen av R<1>CO- til alfaaminodelen av A<2>; forutsatt at X = R^-CO;

A<2> er Gin, Glu[-], Glu(Y) eller His, hvor

[-] er en enkeltbinding, når X er en enkeltbinding og A<2> er Glu[-], hvor nevnte [ - ] kobler gammakarbok-syl-delen på 3-propionyldelen av nevnte A<2> med alfaaminogruppen av A<1>,

Y er

a) -OR<5> hvor R<5> er hydrogen, C^_3 alkyl eller fenyl eller

hvor R<k> er hydrogen eller C^_3 alkyl; og

R<7> er hydrogen, C±_ 3 alkyl eller -NHCONH2, og Leu- psi- er en redusert form av Leu hvor C = 0-delen av Leu istedenfor er CH2 slik at bindingen til denne CH2-delen med alfaaminogruppentil den ved siden av liggende A<9> residie er en pseudopeptidbinding;

A<9> er Tac, MTac eller DMTac; og

Q er NH2 eller OQ<1> hvor Q<1> er hydrogen, C^_^q alkyl, fenyl eller fenyl-C^_^Q-alkyl; og farmasøytisk akseptable syrer eller salter derav.

Når A<1> er en enkeltbinding, er pseudopeptidet ifølge Formel I et oktapeptid, men når A<1> er en aminosyre, eller en analog derav, er pseudopeptidet et nonapeptid.

Når A<9> = Tac, MTac eller DMTac, er det ved A<9> til stede en 5-leddet heterocyklisk ring. Denne ringen blir generelt dannet ved oksidering av A<9> residie sidekjeden ved et visst punkt ved fremstilling av Formel I nonapeptidet, fortrinnsvis med formaldehyd eller acetaldehyd for å cyklisere sidekjeden med alfaaminogruppen til A<9>. Identiteten til det resulterende cykliserte A<9> residiet avhenger av identiteten til det opprinnelige, uoksiderte A<9> og det oksideringsreagenset som blir anvendt.

Når CH2-SH-gruppen til Cys<9> cykliserer med Cys<9> alfaamino-gruppen ved siden av Leu- psi-pseudopeptidbindingen i en reaksjon med formaldehyd, har den resulterende ringen strukturen ifølge Formel IIA (vist her som Leu8~ psi-Tac9-NH2 fragmentet ifølge Formel I nonapeptidet):

Disse pseudopeptidene har høyere biologisk aktivitet og lengre stabilitet enn de ikke-ring utførelsesformene hvor A<9 >er Cys eller Pen. I visse foretrukne utførelsesformer ifølge Formel I peptidene hvor A<9> er ikke-cykliserte, X, A<2> og Q er som ovenfor, A<9> er Cys eller Pen, og A<1> er en ikke-naturlig forekommende aminosyre valgt fra gruppen bestående av L-eller D-Pal, L- eller D-Tpi eller Hea.

I visse foretrukne utførelsesformer er X R^CO, R<1> er hydrogen eller C^_^q alkyl (fortrinnsvis metyl); A<1> er D-Cpa, D-Nal, D-Phe, D- eller L-Tpi, eller D-Trp; A<2> er Gin; A<9> er Tac eller DMTac; og Q er NH2.

Når derimot i andre foretrukne utførelsesformer A<1> er en peptidbinding som kobler acyldelen av R^CO til alfaamino-gruppen av A<2>, er

A<2> Gin eller His;

A<9> er Tac, M-Tac eller DM-Tac, og Q er NH2. I en foretrukket form av disse peptidene er X Hea, Hna, Paa, Mpp, Hpp eller Naa; A<2> er Gin og A<9> er Tac.

Oppfinnelsen omfatter videre bombesinantagonistpeptid kjennetegnet ved at den har formelen

hvor

X er hydrogen,

en enkeltbinding som kobler alfaaminogruppen av A<1> til gammakarboksyldelen på 3-propionyldelen til A<2> når A<2> er Glu[-]; eller

en gruppe med formel med formel R<1>CO-, hvor R<1> blir valgt gruppene bestående av:

a) hydrogen, Cj^.-^O alkyl, fenyl eller fenyl-C-^^o-alkyl;

hvor

R<2> er hydrogen, C1_10 alkyl, fenyl eller fenyl-C^.^^g-alkyl,

R<3> er hydrogen eller C^_^q alkyl:

c) R<4->0 hvor R4 er <C>1_10 alkyl, fenyl eller fenyl-C-^o" alkyl; A<1> er en ikke-natur1ig forekommende aminosyre valgt fra gruppen bestående av L- eller D-Pal, eller L- eller D-Tpi; A<2> er Gin, Glu[-], Glu (Y), eller His, hvor [-] er en enkeltbinding når X er en enkeltbinding og A<2> er Glu[-] hvor nevnte [-] kobler gammakarboksyldelen på 3-propionyldelen av nevnte A<2> med alfaaminogruppen til A<1>, Y er a) -OR<5> hvor R<5> er hydrogen, C^_3 alkyl eller fenyl;

hvor R^ er hydrogen eller C^_3 alkyl; og

R<7> er hydrogen, C1_ s alkyl eller -NHCONH2; Leu-psi er en redusert form av Leu hvor C=0 delen Isteden for er CH2 slik at bindingen til denne CH2-delen med alfaaminogruppen til ved siden av liggende A<9> residiet er en pseudopeptidbinding, A<9> er Cys eller Pen; og

Q er NH2 eller OQ<1> hvor Q<1> er hydrogen, C^_^o alkyl, fenyl eller f enyl-C-L_10-alkyl; °S farmasøytisk akseptable syrer eller salter derav.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også farmasøytisk sammensetning kjennetegnet ved at den omfatter et polypeptid som nevnt over, eller en terapeutisk akseptabel addisjonssaltform eller et kompleks derav og en farmasøytisk akseptabel væske eller fast bærer derav.

Tilslutt omfatter oppfinnelsen en anvendelse av polypeptidet som nevnt over eller en terapeutisk akseptabel syre eller et salt derav for fremstilling av et medikament for behandling av cancer hos pattedyr.

B. Fremstillingsmetoder

Bombesinantagonister ifølge Formel I kan bli fremstilt ved fast fase syntese. I en første protokoll blir alle aminosyrene sekvensielt koblet til hverandre etter det C-terminale residiet er blitt koblet til harpiksbærerfasen. Når alle aminoacylresidiene er koblet til harpiksen blir pseudo-peptidets 5-leddede heterocykliske ring dannet ved reaksjon av sidekjeden til C-terminal residiet med et oksideringsreagens. Pseudopeptidet blir deretter utsatt for HF-behandling for å fjerne det fra harpiksbærerfasen. Denne reaksjonen fjerner også sidekjedebeskyttende grupper.

I et annet aspekt kan pseudopeptidene ifølge Formel I bli syntetisert som to fragmenter som blir dannet ved fast fase eller væskefase. Et tripeptid inneholdende C-terminal blir koblet med et oligopeptid for å danne hele Formel I bombesinantagonisten.

Den 5-leddede heterocykli ske ringen blir dannet ved omsetning av A<9> sidekjeden med et oksideringsreagens. Peptidet blir deretter utsatt for HF-behandling, som fjerner alle amino-acylresidiesidekjedebeskyttende grupper og spalter peptidet fra harpiksen.

C. Medisinske applikasjoner

Pseudopeptidene ifølge Formel I kan ble anvendt i farma-søytiske sammensetninger for å behandle visse former for cancer i pattedyr samt andre tilstander, ved administrering av en effektiv dose av pseudopeptidet, eller en terapeutisk akseptabel syre eller et salt derav i en farmasøytisk bærer. De kan bli administrert med en farmasøytisk akseptabel bærer ved doseringer på fra omtrent 1 til 1.000 mikrogram pr. kg kroppsvekt daglig. En slik sammensetning kan bli administrert parenteralt, intravenøst, subkutant, intramuskulært, intranasalt, ved aerosol i lungene eller i depotform. Figur 1 er en graf som angir virkningen av en MXT musebryst-cancer ved administrering av visse bombesinantagonister basert på data tatt ut fra Tabell 2, Eksempel 7. Figur 2 er en graf som angir virkningen på SCLC tumorvolumet i nakne mus ved administrering av visse bombesinantagonister, basert på data tatt fra Tabell 4, Eksempel 8. Figur 3 er en graf som angir virkningen på MIA PACA-2 bukspyttkjerteltumorvolumet i nakne mus ved administrering av visse bombesinantagonister, basert på data tatt fra Tabell 5, Eksempel 9. Figur 4 er en graf som angir virkningen på et CAPAN-2 bukspyttkjerteltumorvolum i nakne mus ved administrering av visse bombesinantagonister, basert på data tatt fra Tabell 6, Eksempel 10.

A. SYNTETISKE PEPTIDER

1. Nomenklatur

For å lette beskrivelsen av oppfinnelsen blir konvensjonelle forkortelser for aminosyrer, peptider og derivater derav anvendt som generelt akseptert innen peptidområdet og som anbefalt av IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature f European J. Biochem.. 1984, 138 9-37].

Forkortelsene for individuelle aminosyreresidier er basert på det trivielle navnet til aminosyren, f. eks. Ala er alanin, Cys er cystein, Gin er glutamin, Glu er glutaminsyre, pGlu er pyroglutaminsyre, Gly er glycin, His er histidin, Leu er leucin, Phe er fenylalanin, Trp er tryptofan og Val er valin. Glu kan ha funksjonelle grupper koblet til gammakarboksyl-sidekjeden: [-] eller Y, definert ovenfor. Dpa er 2,3-diaminopropionsyre. Hvor aminosyreresidiet har isomeriske former er det L-formen av aminosyren som er representert dersom ikke annet er angitt hvor D- eller DL- fremkommer før aminosyresymbolet.

Forkortelser av uvanlige aminosyrer anvendt i foreliggende oppfinnelse er som følger:

Cpa er para-klorfenylalanin

Dpa er 2,3-diaminopropionsyre

pGlu er pyroglutaminsyre

Nal er 3-(2-naftyl)-alanin

Pal er 3-(3-pyridyl)-alanin

Pen er penicillamin

Tpi er 2,3,4,9 tetrahydro-1 H-pyrido-[3,4-b] indol-3-karboksylsyre

Tac er tiazolidin-4-karboksylsyre

MTac er 2-metyl-tiazolidin-4-karboksylsyre

DMTac er 5,5-dimetyl-tiazolidin-4-karboksylsyre Aminosyreanaloger innbefatter: Hea er hydrocinnaminsyre eller des-amino-fenylalanin Hna er 3-hydroksy-2-naftoisk syre

Hpp er 3-(4-hydroksyfenyl)propionsyre

Mpp er 3-(4-metoksyfenyl)propionsyre

Naa er naftyleddiksyre

Paa er fenyleddiksyre

Andre forkortelser som blir anvendt er:

AC acyl

Ac acetyl

AcOH eddiksyre

BHA benzhydrylamin

Boe tert-butoksykarbonyl

(BOC)20 di-tert-butyldikarbonat

Bom benzyloksymetyl

But butyl

Bzl benzyl

BSA bovint serumalbumin

DIC 1,3-diisopropylkarbodiimid

DMEM Dulbeccos modifiserte Eagle's medium

DMF dimetylformamid

Et etyl

EDTA etylendiamintetraeddiksyre

FCBS føtalt kalvebovint serum

Fmoc 9-fluorenylmetyloksykarbonyl

For formyl

HITES RPMI 16 4D medium pluss IO-<8> M hydrokortison,

5 ul/ml bovint insulin, 10 ug/ml human trans-ferrin, 10"<8> M p-estradiol og 3 x 10"<8> M Na2Se03 HOBt 1-hydroksybenzotriazol

HPLC høy ytelse væskekromatografi

Leu- psi er en redusert form av Leu hvor C = 0 bindings-delen av Leu istedenfor er CH2 slik at bindingen til denne CH2-delen med aminodelen av A<9> er en pseudopeptidbinding.

Me metyl

MeCN acetonitril

MeOH metylalkohol

PBS fosfat-bufret saltvann

TEA trietylamin

TFA trifluoreddiksyre

Peptidsekvensene blir oppført ifølge konvensjonen idet den N-terminale aminosyren er til venstre og den C-terminale aminosyren er til høyre. Det skal imidlertid bemerkes at konvensjonen for nummerering av aminosyreresidiene i et fragmentpeptid ifølge den tilsvarende posisjonen i det fullstendige bombesinantagonisttetradekapeptidet ikke blir etterfulgt heri dersom ikke annet angis. Dersom denne konvensjonen blir fulgt, vil residiene i Formel I nonapeptidet beskrevet heri bli nummerert fra 6 t.o.m. 14, og Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu kjernen til bombesinantagonistene vil bli nummerert A8-A9-A1^-A11-A-'-2-A-'-3. For å unngå forveksling, blir bombesinantagonistene istedenfor nummerert heri som følger: Det N-terminale aminosyre (eller aminosyreanalog) residiet er A<1>; det C-terminale aminosyreresidiet (eller aminosyreanalogen) er A<9>; og de mellomliggende residiene blir nummerert sekvensielt fra A<2> (ved siden av det N-terminale residiet A<1>) i økende nummere til A<8> (ved siden av det C-terminale residiet A<9>).

2. Foretrukne utførelsesformer

De foretrukne utførelsesformene er bombesinantagonistpeptider ifølge Formel I

hvor X, A<1>, A<2>, Leu- psi. A<9> og Q er som definert ovenfor.

Disse bombesinantagonistpseudopeptidene er kjennetegnet ved aminosyresekvensen, spesielt ved residiene A<1>, A<2> og A<9>; samt ved tilstedeværelse av en pseudopeptidbinding mellom A<8> og A<9>; og eventuelt med en 5-leddet heterocyklisk ring ved A<9. >Ringstrukturen blir bestemt av identiteten til A<9> residiet og forbindelsen anvendt til å oksidere det. Når derfor formaldehyd blir anvendt og A<9> er Cys, har den resulterende ringen strukturen Tac ifølge Formel IIA vist heri som Leu8- psi-Tac9-Q fragmentet ifølge Formel I peptidet hvor Q = NHg):

Når Cys istedenfor blir oksidert med acetaldehyd, har den resulterende 5-leddede heterocykliske ringen strukturen MTac ifølge Formel HB (vist her som Leu8- psi-MTac9-Q fragmentet ifølge Formel I peptidet hvor Q = NHg):

Når A<9> istedenfor er Pen og blir oksidert med formaldehyd, har den resulterende ringen strukturen DMTac ifølge Formel IIC (vist her som Leu8-p_s_i-DMTac9-Q fragmentet ifølge Formel I nonapeptidet hvor Q = NHg ):

I disse foretrukne utførelsesformene er det ønskelig at X = H eller Ac, A<1> = D-Phe, A<2> = Gin og Q = NH2.

De mest foretrukne pseudopeptidbombesinantagonistene i foreliggende oppfinnelse fremkommer nedenfor.

Spesielt foretrukne utførelsesformer innbefatter følgende:

B. Fremstillingsmetoder

1. Oversikt

Pseudopeptidene ifølge Formel I kan bli fremstilt ifølge en hvilken som helst teknikk som er kjent for fagfolk innenfor peptidområdet. En oppsummering av teknikkene som er tilgjengelige finnes i M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.

Alle Formel I pseudopeptidene kan bli fremstilt ifølge fremgangsmåtene for fast fase syntese. En spesielt fore-trukken fremgangsmåte for fremstilling av disse peptidene og intermediære peptider er fast fase syntese. Teknikker for eksklusiv fast fase syntese er angitt i læreboken til J.M. Stewart og J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2. oppi.) og i undersøkelsen til G. Barany, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 3_0, 705-739, 1987. (Det ytterligere trinnet som omfatter oksidering av det C-terminale A<9> residiet for å cyklisere residiets karakteristiske sidekjede med dets alfaaminogruppe kan bli utført ved et av flere punkter for syntese av Formel I peptidene.

Minst to fremstillingsprotokoller kan bli fulgt for å fremstille Formel I pseudopeptidbombesinantagonister. I den første metoden blir alle aminosyrene sekvensielt koblet til hverandre etter det C-terminale residiet, og A<9> er blitt koblet til en harpiksbærerfase. I den andre metoden blir et tripeptid dannet på harpiksen. Det blir deretter koblet til et oligopeptid som bærer den gjenværende aminosyren for å danne bombesinantagonisten. I begge protokoller begynner fremstillingen ved det C-terminale A<9> residiet og tilsetter aminosyreresidier sekvensielt med vekst mot det N-terminale residiet.

1. ( a) Første protokoll ( metode).

Harpiksbærerfasen anvendt ved fast fase syntese av pseudopeptidene kan være benzhydrylamin (BHA) harpiks eller klor-metylert polystyren harpiks 1 % kryssbundet med divinyl-benzen, som begge er kommersielt tilgjengelige. Det C-terminale A<9> residiet blir koblet til denne harpiksen via dets karboksylgruppe. Reaksjonen mellom to av disse residiene blir forhindret ved kobling av en kjemisk beskyttelsesgruppe ved alfaaminogruppen til hvert A<9> residie før kobling av det til harpiksen. Beskyttelsesgruppen for alfaaminogruppen til A<9> residiet og hver sekvensielt koblet aminosyreresidie kan enten være 9-fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) eller tert-butoksykarbonyl (Boe) gruppen. Fmoc er foretrukket ved kobling av det C-terminale residiet A<9> t.o.m. A<2> på grunn av at reaksjonen som fjerner Boe også fjerner den sidekjedebeskyttende gruppen fra det C-terminale A<9> residiet. I løpet av disse koblingsreaksjonene kan de karakteristiske sidekjedefunksjonelle gruppene til visse aminosyreresidier også bli beskyttet fra uønskede kjemiske reaksjoner ved kobling av en kjemisk beskyttelsesgruppe dertil (fortrinnsvis But for A<9>) før koblingsreaksjonen.

Etter at det C-terminale Fmoc-A<9>(But) residiet er koblet til bærerfasen blir alfaaminogruppen avspaltet og Fmoc-Leu-CHO blir koblet dertil, og danner dermed pseudopeptidbindingen.

De gjenværende residiene, A<5>, A<4>, A<3> og A<2>, på egnet måte beskyttet med Fmoc, og A<1> på egnet måte beskyttet med Boe, blir tilsatt trinnvis i motsatt numerisk rekkefølge (A<7>, A<6>, osv.) for å konstruere det ønskede pseudopeptidet.

Når His eller Glu er til stede i pseudopeptidet, kan deres sidekjeder bli mottagelige for uønskede kjemiske reaksjoner i løpet av koblingsreaksjonene eller koblingsreaksjonene til andre residier. En kjemisk beskyttelsesgruppe kan dermed bli koblet til slike sidekjeder før kobling av disse aminosyrene i koblingsreaksjonen. Når alle aminosyreresidiene er koblet til BHA harpiksen, kan pseudopeptidet Boe ved N-terminalen bli fjernet. Tac, MTac eller DMTac 5-leddet heterocyklisk ring blir dannet ved omsetning av den eksponerte CH2~SH-delen av Cys (eller C(CH3)2SH av Pen) og det sekundære amino til de reduserte båndkoblende residiene A<8> og A<9> (dvs. alfaamino til A<9>) med et oksideringsreagens, så som formaldehyd eller acetaldehyd. Det intermediære pseudopeptidet, som fortsatt bærer sidekjedebeskyttende grupper, blir utsatt for HF behandling for å spalte det fra harpiksbærerfasen og også fjerne sidekjedebeskyttende grupper.

1. ( b) Andre protokoll ( metode).

I den andre protokollen etter fast fase syntese reaksjons-veiene blir tripeptidet dannet på BHA harpiksen til den beskyttede tripeptidharpiksen:

Boc-His(Bom)7-Leu8-p_si-Cys(But )9-BHA harpiks

Boe<1> gruppen og But gruppen blir fjernet og CH2~SH-delen til Cys blir cyklisert med det sekundære aminet til den reduserte bindingen som kobler residiene A<8> og A<9> for å tilveiebringe His (Bom)<7->Leu<8->psi-Tac<9->BHA-harpiksen. Etter HF-behandling blir det frie tripeptidet His<7->Leu<8->psi-Tac<9->NH2 oppnådd. Boe A<1->A<2->Trp-Ala-Val-Gly-0CH2-harpiksen blir dannet trinn for trinn på Gly-OCB^-harpiksen i henhold til standard metoder for fast fase syntese, og deretter behandlet i 95 H> metanol inneholdende 1 % KCN i 12 timer for å spalte Boc-oligo-peptidet. Etter at de to fragmentene er konstruert, blir Boc-oligopeptidet koblet til det frie His7-Leu8- psi-Tac9-NHo tripeptidet med BOP reagenset. Boc-gruppen blir deretter fjernet for å tilveiebringe det ønskede peptidet.

Før syntese av Formel I bombesinantagonister blir beskrevet i detalj, blir flere syntetiske operasjoner som er felles for en eller begge av ovennevnte protokoller beskrevet.

2. Generelle operasjoner for polypeptidsyntese

Operasjon 1: Dannelse av visse syntetiske residier eller reaktanter

a) L- og D- Tpi: 2,04 g (10 mM) L-Trp blir løst opp i 25 ml kokende vann inneholdende 2,1 g citronsyre. 0,5 ml 40 %

vandig formaldehyd blir tilsatt og de faste stoffene begynner øyeblikkelig å bli dannet. Blandingen blir avkjølt i et isbad og presipitåtene samlet og vasket med kaldt vann og luft, deretter tørket ved romtemperatur for å tilveiebringe 2,14 g eller 99 % faste stoffer smp. med (dekomp.) ca. 310°. D-isomeren blir dannet på samme måte fra D-Trp og har også smp. (dekomp.) ca. 310°C. b) L- og D- Boc- Tpi: Til en omrørt suspensjon av 10,8 g (50 mM) D-Tpi i 250 ml 0,2 N NaOH og 7,5 ml trietylamin ble det

tilsatt 10 g Di-tert-butyl dikarbonat, blandingen blir omrørt i 4 t og deretter blir ytterligere 10 g dikarbonat tilsatt og ytterligere 10 g etter ytterligere 3 t omrøring. Blandingen blir omrørt over natt og ekstrahert (2 x 100 ml) med eter, som blir fjernet. Citronsyre blir tilsatt til det vandige laget for å oppnå en pH på 3-5. De faste stoffene blir samlet, vasket med vann og lufttørket over natt.

De faste stoffene blir suspendert i 100 ml tetrahydrofuran. Nesten alle faste stoffer blir løst opp. Ikke oppløste stoffer blir fjernet ved filtrering og THF fjernet under vakuum. Resten blir triturert med eter for å tilveiebringe 9,20 g eller 58 %. Dette materialet har samme smp. som utgangsmaterialet, men har annen oppløselighet og TLC på silika ved anvendelse av 85:15:0,5 CHCI3:MeOH:H0Ac.

2,55 g L-Tpi tilveiebringer 2,22 g eller 59 % Boc-Tpi ved anvendelse av samme metode.

c) Fmoc- Leu- CHO

Fmoc-Leucin metylester (35 g, 134 mmol) i tørr toluen (250

ml) under N2 blir avkjølt med tørris/aceton, og 150 ml 25 % di-isobutyl-aluminiumhydrid i toluen blir tilsatt over 30 min. Blandingen blir omrørt i 20 min i et bad av tørris/ace-ton etter tilsetning av di-isobutylaluminiumhydrid, og deretter blir metanol (15 ml) forsiktig tilsatt. Blandingen blir helt inn i 1000 ml is-kaldt vann, ristet og filtrert. Toluen blir separert og den vandige fasen blir på ny ekstrahert med eter (3 x 300 ml). Toluen og eterekstraktene blir kombinert og tørket over NagSC^. Den resulterende oljen blir hurtig sendt igjennom en silikagelkolonne (3 x 50 cm) i 1500 ml 15 % EtOAc/petrol. Fmoc-Leu-CHO blir oppnådd som et fast stoff (27,6 g).

d) Syntetiske aminosyrer eller aminosyreanaloger som skal bli inkorporert i bombesinantagonistpseudopeptidene er

generelt tilgjengelige ut i fra kommersielle kilder. Hea er kommersielt tilgjengelig fra Aldrich Co., 1001 St. Paul Avenue, Milwaukee, WI 53233. Boe- eller Fmoc-beskyttede aminosyrer er tilgjengelige fra Advanced ChemTech, 5609 Fern Valley Road, Louisville, KY 40228; eller Bachem California, 3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505.

Operasjon 2: Fremstilling av harpiks og addisjon av Å^ residiet

BHA-harpiksen blir dannet ved behandling med 10 % TEA i CHgClg (nøytralisering) to ganger, hver i tre minutter, og vasket CHgClg seks ganger. Fmoc-A<9>(But) residiet blir bundet til harpiksen ved tilsetning med 1,35 mmol Fmoc-A<9>(But) og 1,50 mmol 1-hydroksy-benzotriazol (HOBt) i DMF og blanding i tre minutter. 20 % 1,3-diisopropyl-karbodiimid (DIC) med 1,3 mmol i CH2CI2 blir tilsatt. Blandingen blir ristet ved romtemperatur i 60 minutter. Den resulterende Fmoc-A<9>(But)-BHA-harpiksen blir vasket med CH2CI2, metanol to ganger hver, og CH2CI2 tre ganger, og deretter utsatt for en Kaiser test (Anal. Biochem. 34. 595 (1970)). I tilfelle av ufullstendig kobling blir prosedyren gjentatt.

Operasjon 3: Dannelse av pseudopeptidbinding

Avspaltning av Fmoc-gruppen fra A<9> blir utført ved tilsetning av 50 % piperidin i DMF og blanding i 30 minutter; vasking med DMF (6x1 min); deretter i) tilsetning av Fmoc-Leu-CHO (3 ekv.) i DMF inneholdende 1 # AcOH; og ii) tilsetning av NaBH3CN (3,5 ekv.) i DMF og risting i 60 min. Dette blir etterfulgt av vasking med 50 % MeOH (3x1 min); 100 % MeOH (3x1 min); og DMF (3x1 min).

Operasjon 4: Kobling av aminosyrer og dannelse av peptidbinding

Beskyttelsesgruppen for alfaaminogruppen til A<9> residiet og hvert påfølgende koblet aminosyreresidie kan være enten 9-fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) eller tert-butoksykarbonyl (Boe) gruppe. Fmoc er foretrukket ved kobling av A<9 >gjennom aminosyreresidiet rett ved siden av det N-terminale aminosyreresidiet på grunn av at reaksjonen som fjerner Boe også fjerner den sidekjedebeskyttende gruppen til A<9>.

A) Anvendelse av Fmoc- aminosyre

Følgende prosedyrer blir utført for innføring av en Fmoc-aminosyre til et Fmoc-intermediært peptid. (1) Fmoc-intermediært peptid blir avspaltet og nøytrali-sert, deretter vasket med CH^Clg (3x1 min) og DMF (3x1 min). (2) Fmoc-aminosyren blir koblet til det avspaltede intermediære peptidet ved: i) tilsetning av Fmoc-aminosyre (3 ekv.) og HOBt (3,3 ekv.) i DMF (3 min) til det intermediære peptidet; ii) tilsetning av 3 ekv. DIC (som 20 % oppløsning i CH2CI2) og risting av blandingen i 90 min. (3) Blandingen blir deretter vasket med etanol (3x1 m,in ) og DMF (3x1 min ).

For å koble ytterligere residier, blir den nettopp koblede Fmoc-aminosyren avspaltet med 50 % piperidin i DMF i 30 min, og vasket med DMF (6x1 min). Andre koblinger følger som beskrevet i trinn (2).

Hver gang blir en ny aminosyre koblet til harpiksen eller peptidet, en Kaiser-test blir utført og dersom ufullstendig kobling oppstår, blir reaksjonen gjentatt.

For kobling av Fmoc-Gly og Fmoc-Gln blir trinn (2) ifølge denne operasjonen modifisert som følger: 3 ekv. DIC (som 20 CH2CI2) blir tilsatt til en blanding av DMF-oppløsningen av Fmoc-aminosyren (3,0 ekv.) og HOBt (3,3 ekv.) ved 0°C i 15 min og ved romtemperatur 15. Reaksjonsblandingen blir tilsatt til peptidharpiksen, ristet i 1 time dersom Fmoc-Gly og i 2 timer dersom Fmoc-Gln.

B) Anvendelse av Boc- aminosyre

Følgende prosedyre blir utført for innføring av en Boc-aminosyre til et Fmoc-intermediært peptid.

(1) Boc-gruppen blir fjernet ved tilsetning av 50 % TFA

i CH2C12;

(2) tilsetning av 50 % TFA i CH2C12 inneholdende 5 % merkaptoetanol og 5 ^ anisol i 25 minutter; og (3) vasking med CH2C12 (2 ganger 1 min), MeOH (2 ganger 1 min), og DMF (3 ganger 1 min). (4) Kobling av Boc-aminosyreresidiet blir utført ved tilsetning av 3 ekv. Boc-aminosyre og 3,3 ekv. HOBt i DMF og blanding i 3 minutter. Deretter blir 3 ekv. 20 % diisopropylkarbodiimid i CH2C12 tilsatt og ristet i 90 minutter. Reaksjonsblandingen blir deretter vasket

med MeOH (3 ganger 1 minutt) og deretter CH2C12 (3

ganger 1 minutt).

(5) Boc-gruppen blir fjernet (avspaltet) ved vasking av produktet ifølge trinn (5) med 50 % TFA i CH2C12 inneholdende 5 % merkaptoetanol (5 minutter) og 5 % anisol (25 minutter). Ytterligere vaskinger i CH2C12 (2 ganger 1 minutt), MeOH (2 ganger 1 minutt) og DMF (3 ganger 1 minutt) følger deretter.

Det er å bemerke at fjerning av Boc-gruppen også fjerner den But-beskyttende gruppen koblet på egnet måte til A<9> sidekjeden. Fjerning av Boe blir vanligvis ikke utført før like før cyklisering av A<9> residiet.

Operasjon 5: Dannelse av den 5-leddede heterocykliske ringen

Ringstrukturen av Formel HA blir dannet ved risting av det intermediære peptidet som har avspaltet Cys<9> i en blanding av 5 0 % AcOH, 3,7 % HCHO og DMF (1:1:8) ved romtemperatur i 3 minutter og filtrert. Produktet blir vasket med DMF, MeOH og CH2CI2 tre ganger hver.

Ringstrukturen ifølge Formel HB blir dannet ved risting av mellomproduktet med peptidet som har avspaltet Cys<9> i en blanding av 50 % AcOH, 10 % CH3CHO og DMF (1,5:0,5:8) ved romtemperatur i 10 minutter og filtrert. Produktet blir vasket med DMF, MeOH og CH2CI2 tre ganger hver.

Ringstrukturen ifølge Formel IIC blir dannet ved risting av mellomproduktet med peptidet som har avspaltet Pen<9> i en blanding av 50 % AcOH, 3,7 % HCHO og DMF (1:1:8) ved romtemperatur i 10 minutter og filtrert. Produktet blir vasket med DMF, MeOH og CH2CI2 tre ganger hver.

Operasjon 6: Frakobling av peptid fra harpiks

Etter at alle ønskede aminosyreresidier er blitt tilsatt, blir den intermediære peptidharpiksen behandlet med flytende HF i nærvær av anisol for å spalte polypeptidet fra bærerfasen. Denne reaksjonen fjerner også sidekjedebeskyttende grupper. Når BHA harpiksen blir anvendt, har det resulterende intermediære peptidet Q = NHg.

Dersom X er forskjellig fra H, blir X-gruppen plassert N-terminalt enten ved innføring av en aminosyre som allerede bærer en X-gruppe.(f.eks. Ac-D-Phe); eller ved omsetning av den avspaltede alfaaminogruppen ved N-terminal A<1> til det intermediære pseudopeptidet med et egnet reagens. Et fullstendig peptid som er fjernet fra harpiksbærerfasen kan på egnet måte bli omsatt med KOCN for å tilveiebringe X = NH2C0-.

Operasjon 7: Rensing av peptider

Pseudopeptidene ifølge Form I blir generelt renset ved høy ytelse væskekromatografi (HPLC) på en revers fasekolonne utført på et Rainin HPLC system (Rainin Inc., Co., Woburn, MA) bestående av tre Rainin Rabbit HP HPLC pumper kontrollert av en Apple Macintosh Plus datamaskin, en Rheodyne injektor og en Knauer modell 87 variabel bølgelengde UV monitor. Råpeptldet (10-40 mg) blir applisert på en Dynamax Macro kolonne (21,2 x 250 mm) pakket med sfærisk C^g silikagel (porestørrelse: 300A; partikkelstørrelse: 12 pm) (Rainin Inc. Co.) og eluert med lineær gradient ved anvendelse av et oppløsningsmiddelsystem bestående av (A) 0,1 % TFA og (B) 0,1 % TFA i 70 % vandig acetonitril ved en strømningsrate på 2,0 ml/min. Alle fraksjonene blir vurdert med hensyn på renhet og retensjonstid ifølge en analytisk HPLC beskrevet nedenfor.

Kvaliteten og elueringskaraktertrekk til rå og renset peptid blir bestemt ved analytisk HPLC på en Hewlett-Packard modell 1090 væskekromatografi utstyrt med en diodeområdedetektor innstilt på 220 og 280 nm og revers fase 4,6 X 250 mm W-porex C-Lg kolonne (porestørrelse: 300A, partikkelstørrelse 5 pm). En strømningsrate på 1,2 ml/min av oppløsningsmiddelsystem (A) og (B) beskrevet som ovenfor blir opprettholdt og separasjonene ble utført ved romtemperatur.

I de fleste tilfellene ble pseudopeptidbombesinantagonister ytterligere renset ved rekromatografi på samme kolonne med visse modifikasjoner av gradientbetingelsene. Homogenisiteten til de rensede peptidene viste seg å være rene over 97 % ifølge analytisk HPLC.

Om ønskelig, kan aminosyreanalyse av pseudopeptidene ifølge Formel I bli utført i en Beckmann 6300 aminosyreanalysator, på prøver hydrolysert ved 110°C i 20 t i forseglede, evakuerte rør med 4 M metansulfonsyre inneholdende 0,2 % 3-(2-aminoetyl )-indol.

C. SYNTETISKE MELLOMPRODUKTER

1. Sidekjedebeskyttende grupper

I fast fase syntese er det vanlig å beskytte reaktive sidekjedefunksjonelle grupper til forskjellige aminosyredeler eller peptidfragmenter. Disse sidekjedefunksjonelle gruppene kan bli beskyttet for å forhindre at en uønsket kjemisk reaksjon oppstår ved nevnte kjeder. Det er derfor vanlig at et intermediært peptid blir produsert som innbefatter hver av aminoacylresidiene beliggende i ønsket sekvens i peptidkjeden med sidekjedebeskyttende grupper koblet til hensiktsmessige residier.

Ved valg av en bestemt sidekjedebeskyttende gruppe som skal anvendes ved syntese av peptidene følges generelt disse reglene: (a) den beskyttende gruppen beholder fortrinnsvis de beskyttende egenskapene under koblingsbetingelsene, (b) beskyttelsesgruppen bør være stabil overfor koblingsreagen-sene, er fortrinnsvis stabil under betingelsene for koblingsreaksjonen valgt for fjerning av alfaaminobeskyttende gruppe ved hvert trinn av syntesen og (c) den sidekjedebeskyttende gruppen må kunne fjernes ved endt syntese av den ønskede aminosyresekvensen under reaksjonsbetingelsene som på uønsket måte vil endre peptidkjeden.

Sidekjedebeskyttende grupper blir koblet til aminosyreresidiene ifølge trinn som er velkjente innenfor fagområdet. Egnede sidekjedebeskyttende grupper for His innbefatter Bom; og for Glu og Cys But.

2. Syntetiske intermediære forbindelser

Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse anses også intermediære peptider å være ved følgende trinn av syntesen. Illustrert her er intermediære peptider av peptid 2 ved tre trinn: Trinn A: Etter kobling av alle aminosyrene og harpiksen: Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom )-Leu-p_s_i-Cys(But )-BHA harpiks ("1/02/A");

Trinn B: Etter fjerning av den N-terminale Boc-gruppen: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys-BHA harpiks ("1/02/B" ) ;

Trinn C: Etter cyklisering av A<9>: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Bom )-Leu-p_si-Tac-BHA harpiks ( "1/02/C" ).

Det er et ytterligere trinn, trinn D, illustrert ved syntese av peptid nr. 17 i Eksempel 2 nedenfor. Trinn D intermediære forbindelse blir fjernet fra harpiksen, men har ikke enda enkeltbindingen X, som kobler A<1> til A<2>.

Bombesinantagonister er nyttige for behandling av tilstander med hypergastrinemi, for eksempel pernisiøs anemi, kronisk atrofisk gastritis, Zollinger-Ellison syndrom og vitiligo, assosiert med diffus hyperplasi av gastriske enterokromaffin-lignende celler og med øket risiko for utvikling av multi-fokale gastriske karsinoidtumorer. Enterokromaffin-lignende cellehyperplasi blir lett produsert i dyr som blir gjort hypergastrinemiske.

Slik behandling er fordelaktig i forhold til foreliggende medikamenter på grunn av at I^-antagonister som cimetidin som forårsaker hypergastrinemi og kan føre til karsinoide tumorer i mennesker. I tillegg forårsaker opphør av terapi med Hg-antagonister en øyeblikkelig tilbakevendelse av sår på grunn av eksisterende hypergastrinemi.

På grunn av at disse forbindelsene ifølge oppfinnelsen er antagonister av bombesin/GRP reseptorer, kan de bli anvendt for behandling av lungecancer, tarmcancer og magecancer.

Formel I bombesinantagonistene ifølge oppfinnelsen kan bli administrert i form av farmasøytisk akseptable utoksiske syrer eller salter, så som syreaddisjonssalter. Illustrerende for slike syreaddisjonssalter er hydroklorid, hydrobromid, sulfat, fosfat, fumarat, glukonat, tannat, maleat, acetat, citrat, benzoat, succinat, alginat, pamoat, malat, askorbat, tartrat og lignende.

Disse farmasøytiske sammensetningene vil inneholde Formel I pseudopeptider sammen med en konvensjonell farmasøytisk akseptabel bærer, f.eks. fysiologisk saltvann kan være egnet, til tross for at andre bærere kjent innenfor fagområdet også kan bli anvendt.

Behandling av individer med disse farmasøytiske sammensetningene kan bli utført på samme måte som klinisk behandling ved anvendelse av andre agonister og antagonister av LHRH, eller somatostatinanaloger. Formel I bombesinantagonister kan dermed bli administrert intravenøst, subkutant, intramuskulært, intranasalt eller ved lunge-aerosol eller i en depotform (f.eks. mikrokapsler, mikrogranuler eller sylin-driske stav-1ignende implantater) formulert fra en biodegra-derbar egnet polymer (så som DL-laktid-koglykolid). Andre ekvivalente måter for administrering hører også inn under rammen av denne oppfinnelse, dvs. kontinuerlig drypp, infusjonspumpe og tids-frigjørende metoder, så som mikrokapsler og lignende.

Effektive doseringer av Formel I peptider vil variere med administreringsformen og de bestemte artene av pattedyret som blir behandlet. Doseringen vil være fra omtrent 1 til 1000 mikrogram av peptidet pr. kilogram kroppsvekt til verten pr. dag når gitt parenteralt. Disse doseringsområdene er foretrukne og høyere doseringer kan bli valgt i hensiktsmessige anledninger. En fysiologisk saltvannsoppløsning inneholdende peptidet kan bli administrert for å tilveiebringe en dose i området på omtrent 0,01 til 0,20 mg/kg kroppsvekt pr. dag, med unntagelse av depotformer hvor mengden injisert er beregnet å vare fra omtrent 15 til omtrent 30 dager eller lengre.

I de følgende eksemplene blir en tre bokstavkode anvendt for å identifisere intermediære peptider ved visse syntese-stadier. Et peptid som blir kodet "1/01/A" er. det intermediære peptidet for peptid "01" dannet i Eksempel "1" som har fullført trinn A i syntesen. Likeledes er "2/08/B" og "4/19/C" intermediære peptider til peptidene "08" og "19" i eksemplene 2 og 4 som har fullført syntesetrinnene B og C.

Eksempel ( 1)

Disse peptidene kan bli syntetisert fra en felles intermediær forbindelse I-l, Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom1-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiks, og blir syntetisert som følger. Fmoc-Leu- psi-C,ys(But )-BHA harpiksen blir oppnådd som følger: 2,0 g BHA harpiks (0,55 mmol NH2/g) blir fremstilt ved behandling med 20 ml 10 % TEA i CH2C12 (nøytralisering) to ganger hver i 3 minutter og vasket med 20 ml CH2C12 seks ganger; og deretter blandet med 3,3 mmol Fmoc-Cys(But) og 3,6 mmol HOBt i DMF i tre minutter. 3 ekv. DIC (som 20 % oppløsning i CH2C12) blir tilsatt. Blandingen blir ristet ved romtemperatur i 90 minutter. Den resulterende Fmoc-Cys(But )-BHA harpiksen blir vasket med CH2C12, metanol to ganger hver, og CH2C12 tre ganger, og deretter utsatt for en Kaiser test.

Kobling av Fmoc-Leu-CHO for å danne pseudopeptidbindingen blir utført som følger. Avspaltning av Fmoc-gruppen fra A<9 >blir utført ved tilsetning av 15 ml 50 % piperidin i DMF og blandet i 30 min og vasket med 15 ml DMF (6x1 min). Deretter blir 3,3 mmol Fmoc-Leu-CHO (3 ekv.) i DMF inneholdende 1 % AcOH tilsatt, etterfulgt av NaBH3CN (3,5 ekv.) i DMF og risting i 1 time. Dette blir etterfulgt av vasking med 15 ml 50 % MeOH (3x1 min); 15 ml 100 % MeOH (3x1 min); og

15 ml DMF (3x1 min).

Fjerning av Fmoc-gruppen (avspaltning) fra Fmoc-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiksen blir utført ifølge Operasjon 4A.

Etter fjerning av Fmoc-gruppen fra Fmoc-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiksen og nøytralisering, blir koblingen av Fmoc-His(Bom) utført som beskrevet i Operasjon 4A.

Kobling av Fmoc-Gly blir utført som i Operasjon 4. 20 % 1,3-diisopropylkarbodiimid (3,3 mmol) i CH2C12 ble tilsatt til en DMF oppløsning av 3,3 mmol Fmoc-Gly og 3,6 mmol HOBt ved 0°C, omrørt under avkjøling i 15 min og ved romtemperatur i 15 min, presipitatet filtrert ut og tilsatt til harpiksen og ristet i 60 min. Påfølgende aminosyreresidier Fmoc-Val, Fmoc-Ala og Fmoc-Trp blir deretter sekvensielt innført ved kobling på samme måte for å tilveiebringe 3,80 g intermediær forbindelse I-l, den beskyttede peptidharpiksen med strukturen Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom )-Leu-p_s_l-Cys(But )-BHA harpiks.

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-D-pGlu til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Boc-D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom )-Leu-p_s_i-Cys(But)-BHA harpiks ("1/01/A" ).

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-D-Phe til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p_si-Cys(But )-BHA harpiks ("1/02/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Ac-D-Phe til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Bom )-Leu-p_s_i-Cys (But)-BHA harpiks ("1/04/A" ).

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-D-Cpa til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi s (Bom ) -Leu-p_s_i-Cy s (But) -BHA harpiks ("1/05/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-D-Nal til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Boc-D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p_si-Cys(But )-BHA harpiks ("1/07/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-Pal til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HistBom )-Leu-p_si-Cys(But )-BHA harpiks ("1/08/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-D-Pal til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom) -Leu-ps i-Cys(But)-BHA harpiks ("1/09/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-D-Trp til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom )-Leu-p_s_i-Cys(But )-BHA harpiks ("1/10/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Ac-D-Trp til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Boro)-Leu-psi-C<y>s(But)-BHA harpiks ("1/11/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-Tpi til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom )-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiks ("1/12/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-D-Tpi til intermediært peptid I-l tilveiebringer: Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA harpiks ("1/13/A" ).

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Hea til intermediært peptid I-l tilveibringer: Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- ps i-Cys(But)-BHA harpiks ("1/14/A").

Den N-terminale Boc-gruppen av intermediært peptid 1/01/A blir deretter fjernet ved behandling med 50 % TFA i CH2CI2 inneholdende 5 1o merkaptoetanol og 5 % anisol to ganger, først i 5 minutter og deretter i 25 minutter. Det intermediære peptidet blir deretter vasket med CH2CI2 (2 ganger 1 min), MeOH (2 ganger 1 min) og DMF (3 ganger 1 min). Dette fjerner But beskyttelsesgruppen fra Cys, produserer intermediært peptid D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys-BHA harpiks ("1/01/B"), som deretter blir vasket med CH2CI2, MeOH og DMF, tre ganger hvert i ett minutt.

Ved dette stadiet blir Cys-sidekjeden av intermediært peptid 1/01/B cyklisert ved oksidering for å danne den 5-leddede heterocykli ske ringen vist i Formel HA ifølge Operasjon 5. En 10 ml blanding av AcOH, 3,7 % HCHO og DMF (1:1:8) blir tilsatt. Reaksjonsblandingen blir ristet ved romtemperatur i 3 minutter, vasket med vann, DMF og CH2CI2 3 ganger hver for å tilveiebringe intermediærpeptidet 1/01/C, D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Tac-BHA harpiks.

Intermediærpeptidet 1/01/C blir deretter behandlet med HF og anisol ifølge Operasjon 6 for å fjerne Bom beskyttelsesgruppen fra His og samtidig spalte nonapeptidet fra harpiksbærerfasen som resulterer i en C-terminal Q-gruppe som er NH2• Peptidet blir renset med HPLC ifølge Operasjon 7. Bombesinantagonistpeptid nummer 1 blir dermed oppnådd.

De samme trinnene for fjerning av Boc-gruppen og But-gruppen og cyklisering av CHg-SH-gruppen til Cys med det sekundære aminet til den reduserte bindingen blir utført på intermediærpeptidene 1/02/A, 1/05/A, 1/07/A, 1/08/A, 1/09/A, 1/10/A og 1/12/A for å tilveiebringe intermediærpeptidene som følger:

Råpeptidene blir spaltet fra BHA harpiksen og deretter renset ifølge Operasjon 6 og 7 for å tilveiebringe rene peptider 2, 4, 5 og 7-14.

Retensjonstiden til disse peptidene er som følger.

Alternativt kan den 5-leddede heterocykli ske ringen bli dannet i en oppløsning med prosedyren som følger: 25 mg av et intermediærpeptid innbefattende strukturen Leu-psi-C.ys-NH2 oppnådd fra fast fase syntese i 0,8 ml iseddiksyre blir blandet med 100 ul 1 % formaldehyd (vekt-# oppløsning i vann) ved romtemperatur i 30 sekunder, og deretter blir 20 ul 50 % ammoniumacetatoppløsning tilsatt. Reaksjonsblandingen blir utsatt for rensing for å tilveiebringe det ønskede peptidet som inneholder strukturen Leu-psi-Tac-NH2.

Eksempel ( 2)

Peptidene i dette eksemplet kan bli syntetisert fra den felles intermediære forbindelsen 1-2, Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiksen, dannet trinn for trinn på 0,5 BHA harpiks (0,55 mmol rø^/g). Intermediært peptid 1-2 blir dannet ifølge operasjonene og prosedyrene angitt i Eksempel (1). En 150 mg del av den intermediære forbindelsen 1-2 blir deretter delt i 3 aliquoter og utsatt for to ytterligere koblinger ifølge prosedyren beskrevet i Operasjon 4 for å tilveiebringe de endelige nonapeptid-harpiksene.

Sekvensiell kobling av Fmoc-His(Bom) og Boc-D-Phe til intermediærpeptid 1-2 tilveiebringer: Boc-D-Phe-His(Bom )-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom )-Leu-p_si-Cys(But)-BHA harpiks ("2/15/A" ).

Sekvensiell kobling av Fmoc-Glu(OMe) og Boc-D-Phe til intermediærpeptid 1-2 tilveiebringer: Boc-D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiks ("2/16/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Glu(But) og Boc-D-Phe til intermediærpeptid 1-2 tilveiebringer: Boc-D-Phe-Glu(But )-Trp-Ala-Val-Glv-His(Bom)-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiks ("2/17/A").

Fjerning av Boc-gruppen fra intermediærpeptid 2/15/A blir utført ved anvendelse av 50 % TFA i CH2CI2 inneholdende 5 % merkaptoetanol og 5 % anisol pr. Operasjon 4. Denne reaksjonen fjerner også But-gruppen fra residiet A<9>, som resulterer i intermediærpeptid 2/15/B: D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys-BHA harpiks.

Cys-sidekjeden til intermediærpeptid 2/15/B blir cyklisert ved oksidering for dannelsen av den 5-leddede heterocykliske ringen vist i Formel HA ifølge Operasjon 5. En 10 ml blanding av AcOH, 3,7 % HCHO og DMF (1:1:8) blir tilsatt. Reaksjonsblandingen blir ristet ved romtemperatur i 3 minutter, vasket med vann, DMF og CH2C12 3 ganger hver for å tilveiebringe intermediærpeptid 2/15/C: D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom )-Leu- psi-Tac-BHA harpiks.

Deretter blir intermediærpeptid 2/15/C behandlet med friskt destillert HF (5 ml) og anisol (0,25 ml) ved 0°C i 1 time, for derved å fjerne den Bom-beskyttede gruppen fra His. Oppløsningsmidlet blir avdampet i vakuum og vasket med etylacetat, ekstkrahert med 70-80 % vandig eddiksyre og lyofilisert. Etter rensing blir bombesinantagonistpeptid nr.

15 oppnådd.

De samme trinnene for å fjerne N-terminal Boe, cyklisere Cys<9>, fjerne intermediærpeptid fra BHA harpiksen og rensing med HPLC blir utført på intermediærpeptidene 2/16/A og 2/17/A for å tilveiebringe peptid nr. 16 og intermediærpeptid 2/17/D: D-Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- psi-Tac-NHo.

En blanding av 15 mg 2/17/D og 15 mg HOBt i 0,8 ml DMF ved 0°C blir tilsatt til 50 mikroliter 25 % diisopropyl-karbodiimid i CH2C12 og omrørt ved 0°C i 2 timer. Enkeltbindingen til peptid 17 som kobler alfaamino av D-Phe<1> til gammakarboksyldelen på 3-propionyl-delen av Glu<2> blir dannet:

Reaksjonsblandingen blir utsatt for rensing med HPLC i henhold til Operasjon 7.

Retensjonstidene til disse peptidene er som følger. Eksempel ( 3)

Disse bombesinantagonistene kan på egnet vis bli syntetisert

fra en felles intermediær forbindelse 1-3, dvs. Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom )-Leu-p_sjL-Cys(But )-BHA harpiks. Dette blir dannet på 1,0 g BHA harpiks (0,55 mmol NH2/g) ved fortløpende kobling med fast fase syntese operasjoner som beskrevet i

Eksempel (1) begynnende med Fmoc-Cys(But) etterfulgt av Fmoc-Leu-CHO (med NaBH3CN); og Fmoc-His(Bom), osv. videre ifølge Eksempel (1). Fmoc-Gln blir koblet til N-terminalen ifølge Operasjon 4 for å danne den intermediære forbindelsen 1-3. Den endelige koblingen av Boc-D-Phe eller Boc-D-Cpa til intermediær forbindelse 1-3 blir utført ifølge fremgangsmåten i Operasjon 4 for å danne intermediærpeptidene "3/3/A" eller "3/6/A".

Fjerning av Boc-gruppen blir utført ved anvendelse av 50 # TFA i CH2C12 inneholdende 5 % merkaptoetanol og 5 % anisol pr. Operasjon 4.

Cys-sidekjeden av intermediær av intermediærpeptid 3/3/B blir nå cyklisert ved oksidering for å danne den 5-leddede heterocykliske ringen vist i Formel HB ifølge Operasjon 5. En 10 ml blanding av 50 # AcOH, 10 * CH3CHO og DMF (1,5:0,5:8) blir tilsatt. Reaksjonsblandingen blir ristet ved romtemperatur i 10 minutter, vasket med vann, DMF og CH2CI2 3 ganger hver for å tilveiebringe intermediærpeptidet 3/3/C: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- psi-MTac-BHA harpiks.

Intermediærpeptidene 3/3/C og 3/6/C blir fjernet fra harpiksen ifølge Operasjon 6 ved behandling med HF (5 ml) og anisol (0,25 ml) ved 0°C i 1 time. Denne prosessen fjerner også den Bom-beskyttende gruppen fra His, som tilveiebringer de endelige nonapeptidene 3 og 6.

Peptidene blir renset med HPLC ifølge Operasjon 7; og retensjonstidene er som følger.

Alternativt kan den 5-leddede heterocykli ske ringen bli dannet i en oppløsning ved tilsetning til 25 mg et intermediært peptid inneholdende strukturen Leu- psi-Cys-NH2. 0,8 ml iseddiksyre blir blandet med 100 mikroliter 10 % acetaldehyd ved romtemperatur. Dette blir blandet i 5 minutter; og deretter blir 100 mikroliter ammoniumacetat tilsatt. Reaksjonsblandingen blir utsatt for rensing for tilveiebringing av et ønsket peptid som inneholder strukturen Leu-psi-MTac-NHo■

Eksempel ( 4)

Disse polypeptidene kan bli syntetisert fra en felles intermediær forbindelse 1-4, Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Pen(But)-BHA harpiks. Denne intermediærforbindelsen blir dannet trinn for trinn på benzhydrylamin (BHA) harpiksen i henhold til standard metoder for fåst fase syntese som beskrevet i eksemplene (1) og (2).

1,0 g BHA harpiks (0,55 mmol NH2/g) blir fremstilt ifølge Operasjon 2, blir behandlet med 10 ml 10 # TEA i CH2C12 (nøytralisering) to ganger hver i tre minutter og vasket med 10 ml CH2C12 seks ganger; deretter blandet med 1,6 mmol Fmoc-Pen(But) og 1,8 mmol 1-hydroksybenzotriazol (HOBt) i DMF i tre minutter. 20 % 1,3-diisopropylkarbodiimid (DIC) med 1,6 mmol i CH2C12 blir tilsatt. Blandingen blir ristet ved romtemperatur i 90 minutter. Den resulterende Fmoc-Pen(But)-BHA harpiksen blir vasket med CH2C12, metanol to ganger hver, og CH2C12 tre ganger, og deretter utsatt for en Kaiser test.

Fjerning av Fmoc-gruppen (avspaltning) fra Fmoc-Pen(But)-BHA harpiks blir utført ifølge Operasjon 4A.

Kobling av Fmoc-Leu-CHO blir utført ifølge Operasjon 3. A<9>(But)-BHA harpiksen blir vasket med DMF 2 ganger. Deretter blir 1,6 mmol Fmoc-Leu-CHO i DMF inneholdende 1 % AcOH tilsatt, etterfulgt av 1,8 mmol NaB^CN i DMF. Reaksjonsblandingen blir ristet i 60 minutter, deretter vasket med 50 % metanol i H20 2 ganger, 100 % MeOH 2 ganger, og CH2C12 3 ganger, hver i 1 minutt.

Etter fjerning av Fmoc-gruppen fra Fmoc-Leu- psi-Pen(But)-BHA harpiks og nøytralisering, blir kobling av Fmoc-His(Bom) utført som beskrevet i Operasjon 4.

Kopling av Fmoc-Gly blir utført som i Operasjon 4. 20 % 1,3-diisopropylkarbodiimid (1,5 mmol) i CH2C12 ble tilsatt til en DMF oppløsning av 1,5 mmol Fmoc-Gly og 1,65 mmol HOBt ved 0°C, omrørt under avkjøling i 15 min og ved romtemperatur i 15 min, presipitatet ble filtrert ut og tilsatt til harpiksen, og ristet i 60 min. Påfølgende aminosyreresidier Fmoc-Val, Fmoc-Ala og Fmoc-Trp blir deretter sekvensielt innført ved kobling på samme måte for å tilveiebringe 1,9 g av intermediær forbindelse 1-4, den beskyttede peptidharpiksen med strukturen Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi - Pen(But)-BHA harpiks.

0,91 g av intermediærforbindelsen 1-4 blir delt inn i fem aliquoter (omtrent 200 mg hver) som blir anvendt for å syntetisere beskyttede polypeptidharpikser i henhold til prosedyrene beskrevet for Operasjon 4: Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-D-Phe til intermediærpeptid 1-4 tilveiebringer: Boe-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Pen(But)-BHA harpiks ("4/18/A" ).

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln etterfulgt av Ac-D-Phe til intermediærpeptid 1-4 tilveiebringer: Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Pen(But)-BHA harpiks ("4/19/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln og Boc-D-Cpa til intermediærpeptid 1-4 tilveiebringer: Boe-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Pen(But)-BHA harpiks ("4/20/A".

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln etterfulgt av Boc-Tpi til intermediærpeptid 1-4 tilveiebringer: Boe-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Pen(But)-BHA harpiks ("4/21/A").

Sekvensiell kobling av Fmoc-Gln etterfulgt av Boc-Tpi til intermediærpeptid 1-4 tilveiebringer: Boe-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Bom )-Leu-p_si-Pen(But)-BHA harpiks ("4/22/A").

Boc-gruppen blir deretter fjernet fra intermediærpeptid 4/18/A med 50 % TFA i CH2CI2 inneholdende 5 % merkaptoetanol og 5 io anisol, resulterende i intermediærpeptid 4/18/B: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi s( Bom )-Leu-p_s_i-Pen-BHA harpiks.

Pen-sidekjeden til intermediærpeptid 4/18/B blir deretter cyklisert ved oksidasjon for å danne den 5-leddede heterocykliske ringen vist i Form IIC ifølge Operasjon 5. En 10 ml blanding av AcOH, 3,7 # HCHO og DMF (1:1:8) blir tilsatt for å danne en reaksjonsblanding som blir ristet ved romtemperatur i 3 minutter, vasket med vann, DMF og CH2CI2 3 ganger hver for å tilveiebringe intermediærpeptidet 4/18/C: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-DMTac-BHA harpiks.

Intermediærpeptidet 4/18/C blir deretter vasket med 5 ml CH2CI2, metanol og CH2CI2 tre ganger hver og behandlet med friskt destillert HF (5 ml) og anisol (0,25 ml) ved 0°C i 1 t. Oppløsningsmidlet blir avdampet i vakuum, vasket med eter eller etylacetat og deretter ekstrahert med 70-80 % eddiksyre og lyofilisert for tilveiebringing av rå nonapeptidharpiks. Reaksjonsblandingen blir renset for tilveiebringing av bombesinantagonistpeptid nr. 18.

De samme trinnene for fjerning av beskyttelsesgruppene, cyklisering av avspaltet A<9> og erstatning av intermediærpeptidet fra BHA-harpiksen blir utført på intermediærpeptidene 4/19/A, 4/20/A, 4/21/A og 4/22/A for tilveiebringing av peptidnumrene 19, 20, 21 og 22.

Rensingen blir utført ifølge HPLC med oppløsningsmiddelsystem bestående av (A) 0,1 % TFA og (B) 1 % TFA i 70 % acetonitril i henhold til Operasjon 7. Rensede peptider blir bevist å være over 97 <f> rene ifølge analytisk HPLC. Retensjonstiden til disse peptidene følger nedenfor.

Alternativt kan A<9> residiet bli cyklisert i oppløsning ved tilsetning av 25 mg fritt peptid inneholdende strukturen Leu-psi-Pen-NH? til 25 mg HOBt i 0,8 ml iseddiksyre og blandet med 100 mikroliter 10 % formaldehyd og omrørt ved 0°C i 30 minutter for å tilveiebringe peptidet som har den 5-leddede ringstrukturen Leu- psi-DMTac-NH2•

Eksempel ( 5)

Disse peptidene kan bli syntetisert fra en felles intermediær forbindelse 1-5, Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiks.

Fmoc-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiks blir oppnådd som følger: 1,0 g BHA harpiks (0,55 mmol N^/g) blir koblet med Fmoc-Cys(But) og Fmoc-Leu-CHO suksessivt ifølge fremgangsmåten angitt i operasjonene 2 og 3.

Sekvensiell kobling av Fmoc-His(Bom), Fmoc-Gly, Fmoc-Val, Fmoc-Ala og Fmoc-Trp og Fmoc-Gln resulterer i Fmoc-Gln-Trp-

Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(Butl-BHA harpiks, intermediærpeptid 1-5.

En 150 mg aliquot av denne intermediærforbindelse 1-5 som er felles for alle peptidene ifølge dette eksemplet, blir utsatt for en ytterligere kobling ifølge prosedyrene beskrevet i Operasjon 4 for å tilveiebringe de endelige peptidharpiksene.

Sekvensiell kobling av Boc-Pal til intermediærpeptid 1-5 tilveiebringer: Boe-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p_si-Cys(But )-BHA harpiks ("5/08/A").

Sekvensiell kobling av Boc-D-Pal til intermediærpeptid 1-5 tilveiebringer: Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Bom )-Leu-p_s_i- Cys (But )-BHA harpiks ("5/09/A").

Sekvensiell kobling av Boc-Tpi til intermediærpeptid 1-5 tilveiebringer: Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiks ("5/12/A").

Sekvensiell kobling av Boc-D-Tpi til intermediærpeptid 1-5 tilveiebringer: Boe-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(But)-BHA harpiks ("5/13/A").

Sekvensiell kobling av Hea til intermediærpeptid 1-5 tilveiebringer: ,

Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His( Bom )-Leu-p_si-Cys( But )-BHA harpiks ("5/14/A").

Den N-terminale Boc-gruppen blir fjernet fra intermediærpeptid 5/01/A ved behandling med 50 % TFA i CH2C12 inneholdende 5 % merkaptoetanol og 5 ^ anisol to ganger, først i 5 minutter og deretter i 25 minutter. Denne behandlingen fjerner den beskyttende gruppen fra Cys. Peptidet blir deretter vasket med CB^Clg, MeOH og DMF, ifølge Operasjon 4, som resulterer i intermediærpeptid 5/08/B: Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cvs-BHA harpiks.

Intermediærpeptid 5/08/B blir deretter behandlet med friskt destillert HF (5 ml) og anisol (0,25 ml) ved 0°C i 1 time, men også fjerning av Bom-beskyttelsesgruppen fra His. Oppløsningsmidlet blir avdampet i vakuum og vasket med etylacetat, ekstrahert med 70-80 1o eddiksyre og lyofilisert, ved tilveiebringing av følgende peptid: Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2.

Beskyttelsesgruppen og BHA harpiksen blir fjernet fra intermediærpeptidene 5/08/A, 5/09/A, 5/11/A, 5/12/A, 5/13/A og 5/14/A for tilveiebringing av peptidene nummerert i begynnelsen av dette eksemplet. Disse blir utsatt for renhetstesten i henhold til Operasjon 7.

Alternativt kan disse peptidene på egnet måte bli dannet trinn for trinn på BHA harpiksen med Boc-beskyttede aminosyrer og anvendelse av Bz for å beskytte -SH-gruppen til Cys<9 >i henhold til standard metoder for fast fase metodene, som resulterer i intermediærpeptidene som følger: Boe-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(Bz)-BHA harpiks ("5/08/A"). Boe-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cvs(Bz)-BHA harpiks ("5/09/A"). Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(Bz)-BHA harpiks ("5/12/A"). Boe-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(Bz)-BHA harpiks ("5/13/A"). Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu- psi-Cys(Bz)-BHA harpiks ("5/14/A").

Boc-gruppen blir fjernet ved behandling med 50 % TFA i CH2CI2 inneholdende 5 % merkaptoetanol og 5 % anisol, og deretter behandlet med HF og anisol for å spalte peptidet fra harpiksen og også fjerne den beskyttende gruppen Bom fra His og Bz fra Cys for å tilveiebringe peptidene nummerert ved begynnelsen av dette eksemplet.

Eksempel ( 6) : Analyseprosedyrer

(A) Reseptorbindingsanalyse

Binding av <125>j-Tyr<4->bombesin og erstatning med bombesinantagonistpseudopeptidene blir testet i 24-brønn vevskultur-skåler (GIBCO) ved anvendelse av Swiss 3T3 cellene. Murine Swiss 3T3 fibroblaster blir opprettholdt ved ukentlig føring i DMEM inneholdende 10 % FCBS og antimykotiske midler. Kulturene blir inkubert i 5 # CO2 i luft ved 37°C. Brønnene blir sådd ut med IO<5> celler/brønn (levedyktighet >95 %), dyrket til sammenløp og ro. Bindingsprosedyren blir utført 7 dager etter utsåing. Cellene blir vasket 2 ganger med 0,5 ml bindingsbuffer (Dulbeccos modifiserte Eagle's medium inneholdende 20 nM HEPES-NaOH (pH 7,4), 0,2 % BSA og 100 mcg/ml bacitracin). Cellene blir deretter inkubert med 0,2 nM <125>j_Tyr<4->bombesin i nærvær eller fravær av forskjellige konsentrasjoner antagonister (6xlO-<11->6xlO"^M, totalvolum 0,4 ml ).

Cellene blir inkubert i 30 min ved 37°C på grunn av at binding av <125>j-GRP ved 37°C når en maksimalverdi ved 30 min og deretter reduseres, ifølge Zachary og Rozengurt (1985) og Layton et al., (1988). Etter dette blir cellene vasket 2 ganger med iskald (4°C) bindingsbuffer og 2 ganger med iskald fosfat-bufret saltvann (PBS, mM): NaCl 138, KC1 2,8, Na2HP04 8, KH2P04 1,45, CaCl2 0,91, MgCl2 0,49. Vaskede kulturer blir ekstrahert i 0,5 ml 0,5 M NaOH og overført til rør for opptelling. Brønnene blir vasket en gang med 0,5 ml destillert vann (sterilt), og vaskevannene blir tilsatt til hensiktsmessige rør. Deretter blir radioaktiviteten i prøvene opptelt i en automatisk gammateller (Micromedic System, Inc., Huntsville, Ala.).

Ligand - PC-datakurvetilpasningsprogrammet til Munson og Rodbard blir anvendt for å bestemme typer av reseptorbinding, dissosiasjonskonstant (Kd), assosiasjonskonstant (Ka) og maksimal bindingskapasitet til reseptorene (Bmax).

Bindingsdataene til polypeptidene i foreliggende oppfinnelse er oppført i Tabell I nedenfor. Varierende doser av umerket peptid blir anvendt for å bestemme evnen til å erstatte spesifikk <125>j-Tyr<4->bombesin binding. Gjennomsnittsverdien til 2-3 uavhengige tester for hvert peptid (hvert utført i triplikat) er vist.

Eksempel ( 7)

Virkning av behandling med bombesinantagonister på tumorvolumet til østrogenuavhengige MXT musebrystcancere i følgende forsøk: 40 hunn B6D2F^ mus blir oppnådd fra National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility (Frederick, Maryland) og huset ved 21 ± 1<0>C og 55 + 5 % luftfuktighet. Dyrene blir oppbevart under automatisk 12-t lys/12-t mørke og gitt laboratorie chow 50001 for til gnagere og springvann etter behov. Et østrogenuavhengig MXT (3,2)/0vex bryst-karsinom kryo-konservert vev, oppnådd fra dr. A.E. Bogden (Biomeasure Inc., Hopkinton, MA), blir innokulert i modne hunn-mus subkutant med en mm<3> MXT (3,2)/0vex tumor.

To dager etter transplantasjon av tumorene blir musene fordelt inn i fire grupper og terapi med vedvarende leve-ringssystemer (mikrokapsler) av peptidene blir påbegynt. Følgende fire grupper blir dannet: 1) Kontroll, bare injeksjonsbærer;

2) [D-Tpi<6>, Leu<13->p_si-Leu<14>] Bn(6-14),

3) [D-Phe<6>, Leu<13->psi-Tac<14>l Bn(6-14),

4) Kirurgisk bilateral ovarieektomi.

Disse forkortelsene for bombesinantagonister anvender konvensjonell nummerering for et residie av et peptid-fragment: hvert residie er nummerert ifølge posisjonen som den bærer i det fullstendige fragmentet. Bombesinantagonistene blir derimot lettere sammenlignet med andre peptider heri dersom nummereringen begynner med "en" fra N-terminalen. Dermed "fD-Tpi6-Leu13- psi-Leu141 Bn(6-14)" er D-Tpi<1->Gln<2->Trp<3->Ala<4->Val<5->Glv<6->His<7->Leu8-psi-Leu<9->NH2 (nedenfor "Bl"), mens "[D-Phe6-Leu13- psi-Tac14l Bn(6-14)" er lik peptid nr. 2 ovenfor.

De to bombesinantagonistene blir syntetisert ved en fast fase metode. Gruppe 2 av mus mottok vedvarende frigjørings-formulering ifølge "Bl", mens gruppe 3 mottok en formulering med peptid nr. 2 ovenfor. Denne formuleringen med vedvarende frigjøring opprettholdt en kontinuerlig frigjøring av Bl eller peptid nr. 2 ved 25 mikrogram/dag i 15 dager.

For vedvarende levering ble Alzet osmotiske pumper.(Alzo Co., Palo Alto, CA) anvendt. Alzet pumpemodell 2002 som frigjør 0,48 pl/t ble implantert subkutant i det lavere-laterale området i ryggen. Peptidene ble løst opp i 50 $ (v/v) propylenglykol i vann for fylling av de osmotiske mini-pumpene.

Etter at tumorene ble synlige og palperbare, ble tumorvolumene målt og beregnet som beskrevet i Szende B., et al. "Growth Inhibition of MXT Mammary Carcinoma by Enhancing Programmed Cell Depth", (apoptosis) med analoger av LH-RH og somatostatin). Breast Cancer Res. Treat. 14: 307-314 (1989).

Eksperimentene ble avsluttet ved den eksponentielle fasen av tumorveksten. Den første målingen av tumorvolumet var ved 10 dager. Forskjellene i tumorvolumene mellom kontroll og de som blir behandlet med enten bombesinantagonister samt mellom begge bombesinantagonistene er statistisk signifikant. Resultatene av tumorvolum-målingene fremkommer i Tabell 2 og er illustrert i Figur 1.

Ved avslutning av eksperimentene ble musene blodtappet under Metofane anestesi, tumorvektene ble deretter målt og utsatt for statistisk analyse ifølge Duncan's test og Student's test. Resultatene fremkommer i Tabell 3.

Eksempel ( 8)

Virkningen av en somatostatinanalog og tre bombesinantagonister på humane småcellelungekarsinomer i nakne mus blir testet som følger: Atymiske hann nakne mus som er omtrent 6 uker gamle ved ankomst blir oppnådd fra National Cancer Institute (Bethesda, MD) og blir opprettholdt under patogene begrensende betingelser.

Humane småcellelungekarsinomer (SCLC, linje H69) blir dyrket som et monolag i rpmi 1640 (Gibco, Grand Island, NY) supplementert med 10 % bovint serumalbumin, antibiotika og antimykotiske midler ved 37°C i en fuktig 5 % C02 atmosfære. Xenografter blir initiert ved s.c. injeksjon av 1 x IO<7 >celler fra eksponentielt voksende celler fra cellevevskul-turen inn i den høyre flanken til fem nakne mus. Tumorene som fremkommer etter tre uker blir dissekert aseptisk og malt mekanisk. Tre mm<3> stykker av tumorvevet blir deretter transplantert s.c. ved hjelp av trokarnål inn i 60 dyr. To uker etter transplantasjon har tumorene vokst til et volum på omtrent 10 mm<3> og dyrene ble blandet og delt tilfeldig inn i 5 eksperimentelle grupper for behandling med fem forskjellige forbindelser, begynnende på dagen to uker etter transplantasjon. Tumorene ble målt hver uke deretter i fem uker. Tumorvolumet blir beregnet som (lengde x vidde x høyde x pi)/6. Åtte dyr i hver gruppe ble ofret for måling av tumorvekten.

De første av medikamentterapiforbindelsene administrert til nakne mus er en somatostatinanalog D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2, betegnet "Sl".

Den første av de tre bombesinantagonistene er D-Tpi^-Gln<2->Trp<3->Ala<4->Val<5->Gly<6->His<7->Leu<8->psi-Leu<9->NH2, dvs. Bl. Den andre bombesinantagonisten er [Tpi<6->Leu<13->psi-Tpi<14>] Bn(6-14), dvs. D-Tpi<1->Gln<2->Trp3-Ala<4->Val<5->Gly6-His<7->Leu<8->psi-Tpi<9->NH2-- betegnet "B2" og den tredje antagonisten er peptid 2.

Mikrogranuler av pamoatsaltet til Sl i poly(DL-laktid-koglykolidet) blir fremstilt som Cytotech SA og konstruert for å frigjøre omtrent 100 mikrogram/dag i 2 uker fra en aliquot på 16 mg. Disse mikrogranulene blir injisert hver 15 dag s.c. i et sete motsatt tumoren. Hver av bombesinantagonistene blir løst opp i 0,1 % dimetylsulfoksid i saltvannsoppløsning og injisert s.c. to ganger daglig i doser på 20 mikrogram/dag.

Virkningen av denne medikamentterapien på tumorvolumet fremkommer i Tabell 4 og er illustrert i Figur 2.

Eksempel ( 9)

Virkningen på MIA PACA-2 bukspyttkjertelcancertumorer ved bombesinantagonister blir målt som følger: Nakne mus som ligner de i Eksempel 8 blir injisert s.c. med MIA PACA-2 human bukspyttkjertelcancercelle injeksjon, avledet fra cellevevskulturer dyrket som SCLC, i Eksempel 8. Tumorvolumet blir målt i begge eksperimentelle gruppene som i Eksempel 8.

De to eksperimentelle gruppene er: en gruppe mus som mottar bombesinantagonistpeptid 2 og en kontrollgruppe som bare mottar injeksjonsbæreroppløsningen. 50 pg av injisert bæreroppløsning eller peptid nr. 2 blir administrert til hver mus to ganger daglig ved s.c. injeksjon.

Resultatene til tumorvolummålingene fremkommer i Tabell 5 og er illustrert i Figur 3.

Eksempel ( 10)

Virkning av behandling med en bombesinantagonist på nakne mus som bærer CAPAN-2 human bukspyttkjertelcancer er som følger.

Nakne mus som ligner de i Eksempel 7 blir gitt xenografter av humane CAPAN-2 bukspyttkjerteltumorer avledet fra cellevevs-kultur dyrket som i Eksempel 7. Gruppen av mus blir delt inn i to, idet kontrollgruppen bare mottar injeksjonsbæreropp-løsning og den andre mottar bombesinantagonistpeptid nr. 2, 50 mg, som blir administrert to ganger daglig ved s.c. injeksjon.

Tumorvolumet blir målt som i Eksempel 8 og resultater av målingen av tumorvolumet fremkommer i Tabell 6 og er illustrert i Figur 4.

Til tross for at oppfinnelsen er blitt beskrevet med hensyn på foretrukne utførelsesformer er det å bemerke at forand-ringer og modifikasjoner som er innlysende for fagfolk innenfor dette området kan bli utført uten å fravike fra rammen ifølge oppfinnelsen, som fremgår av kravene heri. Substitusjoner kjent innenfor fagområdet som ikke signifikant fraviker fra effektivitetene kan bli anvendt i foreliggende oppf innelse.

Claims (15)

1. Bombesinantagonistpeptid, karakterisert ved at det har formelen hvor X er hydrogen, en enkeltbinding som kobler alfaaminogruppen til A<1 >til gammakarboksyldelen på 3-propionyldelen av A<2> når A<2> er Glu, eller en gruppe med formel E-^CO-, hvor R<1 >blir valgt fra gruppene bestående av a) hydrogen, C1_ 10 alkyl, fenyl, fenyl-C-L.-^-alkyl, p-HI-fenyl, p-HI-fenyl-C-L_ig-alkyl, naftyl, naftyl-cl-10_alky1« indolyl, indolyl-C-^-LQ-alkyl, pyridyl, pyridyl-C^.-LQ-alkyl, tienyl, tienyl-C^_^Q-alkyl, cykloheksyl eller cykloheksyl-C1_10<->alkyl, hvor HI = F, Cl, Br, OH, CH3 eller 0CH3; hvor R<2> er hydrogen, C^_^q alkyl, fenyl eller fenyl-C^_^Q-alkyl, R<3> er hydrogen eller C^_^q alkyl; c) R<4->0 hvor R<4> er C^_^<q> alkyl, fenyl eller fenyl-C-L_iQ-alkyl; A<1> er et D- eller L-aminosyreresidie valgt fra gruppen bestående av Phe, p-HI-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, usubstituert Trp eller Trp substituert i benzenringen med en eller flere medlemmer valgt fra gruppen bestående av F, Cl, Br, NH2 eller C-^_ 3 alkyl; eller en peptidbinding som kobler acyldelen av R^CO- til alfaaminodelen av A<2>, forutsatt at X = R<1>CO; A<2> er Gin, Glu[-], Glu(Y) eller His, hvor [-] er en enkeltbinding, når X er en enkeltbinding og A<2> er Glu[-], hvor nevnte [-] kobler gammakarboksyldelen på 3-propionyldelen av nevnte A<2> med alfaamino-gruppen til A<1>, Y era) -OR<5> hvor R<5> er hydrogen, C^_3 alkyl eller fenyl eller b) hvor R<6> er hydrogen eller C^_3 alkyl; og R<7> er hydrogen, <C>1-3 alkyl eller -NHC0NH2, Leu- psi- er en redusert form av Leu hvor C=0-delen istedenfor er CH2 slik at bindingen til CH2-delen med alfaaminogruppen til den ved siden av liggende A<9> residie er en pseudopeptidbinding; A<9> er Tac, MTac eller DMTac; og Q er NH2 eller OQ<1> hvor Q1 er hydrogen, C-l_10 alkyl, fenyl eller fenyl-C^.^Q-alkyl; og farmasøytisk akseptable syrer eller salter derav.

2 . Peptid ifølge krav 1,karakterisert ved at X er hydrogen, eller R^CO hvor R er H eller C^_^Q-alkyl; A<1> er D-Cpa, D-Nal, L- eller D-Pal, D-Phe, L- eller D-Tpi, eller Trp; A<2> er Gin eller His; og Q er NH2.

3. Peptid ifølge krav 2,karakterisert ved at A9 er Tac.

4 . Peptid ifølge krav 2,karakterisert ved at A<9> er DMTac.

5 . Peptid ifølge krav 3,karakterisert ved at X er H eller Ac, A<1> er D-Phe, L- eller D-Tpi, og A2 er Gin.

6. Peptid ifølge krav 4,karakterisert ved at X er H eller Ac, Ai er D-Phe, L- eller D-Tpi, og A2 er Gin.

7. Polypeptid ifølge krav 3, karakterisert ved at det har formelen D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi s-Leu-p_si-Tac-NH2 •

8. Polypeptid ifølge krav 3, karakterisert ved at det har formelen: D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi s-Leu- psi-Tac-NH2

9. Polypeptid ifølge krav 4,karakterisert ved at det har formelen D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi s-Leu-p_si~DMTac-NH2

10. Bombesinantagonistpeptid, karakterisert ved at det har formelen: hvor X er hydrogen, en enkeltbinding som kobler alfaaminogruppen av A<1 >til gammakarboksyldelen på 3-propionyldelen til A<2 >når A<2> er Glu[-]; eller en gruppe med formel R-^CO-, hvor R<1> blir valgt fra gruppene bestående av : a) hydrogen, C^.^q alkyl, fenyl eller fenyl-C-^.^Q- alkyl; hvor R<2> er hydrogen, C^_ iq alkyl, fenyl eller fenyl-cl-10~alkyl» R<3> er hydrogen eller C^_-^q alkyl: c) R<4->0 hvor R<4> er C±- iq alkyl, fenyl eller fenyl- Cl-10-^ky1 > A<1> er en ikke-naturlig forekommende aminosyre valgt fra gruppen bestående av L- eller D-Pal, eller L- eller D-Tpi; A<2> er Gin, Glu[-], Glu (Y), eller His, hvor [-] er en enkeltbinding når X er en enkeltbinding og A<2> er Glu[-] hvor nevnte [-] kobler gammakarboksyldelen på 3-propionyldelen av nevnte A<2> med alfaaminogruppen til A<1>, Y er a) -OR<5> hvor R<5> er hydrogen, C^_ 3 alkyl eller fenyl; hvor R<6> er hydrogen eller C^_3 alkyl; og R<7> er hydrogen, C-l_3 alkyl eller -NHC0NH2; Leu- psi er en redusert form av Leu hvor C=0 delen istedenfor er CH2 slik at tindingen til denne CH2-delen med alfaamino-gruppen til ved siden av liggende A<9> residiet er en pseudo-pept i dh ind ing , A<9> er Cys eller Pen; og Q er NH2 eller OQ<1> hvor Q<1> er hydrogen, Ci- io alkyl, fenyl eller fenyl-C^.^Q-alkyl; og farmasøytisk akseptable syrer eller salter derav.

11. Bombesinantagonistpeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at X er Rico-, A<1> er en peptidbinding som kobler acyldelen av R-^CO- til alfaaminodelen av A<2>; A<2> er Gin eller His; og Q er NH2.

12 . Peptid ifølge krav 11,karakterisert ved at X er Hea, Hna, Paa, Mpp, Hpp eller Naa, A<2> er Gin, og A<9> er Tac.

13 . Peptid ifølge krav 12, karakterisert ved at det har formelen

14 . Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et polypeptid ifølge krav 1, eller en terapeutisk akseptabel addisjonssaltform eller et kompleks derav og en farmasøytisk akseptabel væske eller fast bærer derav.

15 . Anvendelse av et polypeptid ifølge krav 1, eller en terapeutisk akseptabel syre eller et salt derav for fremstilling av et medikament for behandling av cancer hos pattedyr.