SK282267B6 - Bombezínu antagonistický peptid, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie - Google Patents

Bombezínu antagonistický peptid, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie Download PDF

Info

Publication number
SK282267B6
SK282267B6 SK1364-94A SK136494A SK282267B6 SK 282267 B6 SK282267 B6 SK 282267B6 SK 136494 A SK136494 A SK 136494A SK 282267 B6 SK282267 B6 SK 282267B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
alkyl
leu
peptide
phenyl
trp
Prior art date
Application number
SK1364-94A
Other languages
English (en)
Other versions
SK136494A3 (en
Inventor
Andrew V. Schally
Ren Zhi Cai
Original Assignee
The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Administrators Of The Tulane Educational Fund filed Critical The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Publication of SK136494A3 publication Critical patent/SK136494A3/sk
Publication of SK282267B6 publication Critical patent/SK282267B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/086—Bombesin; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

Peptidy všeobecného vzorca (I), v ktorom X je vodík jednoduchá väzba spájajúca alfa-aminoskupinu A1 s gamma-karboxylovou skupinou na 3-propionylovej skupine A2, ak je A2 Glu [-] alebo skupina vzorca R1CO-, A1 je zvyšok D-, alebo l-aminokyseliny zvolenej zo skupiny zahrňujúcej Phe, p-Hl-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, nesubstituovaný Trp alebo Trp substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viacerými substituentmi zo skupiny zahrňujúcej F, Cl, Br, NH2 alebo C1-3akryl, alebo peptidová väzba spájajúca acylová skupinu R1CO- s alfa-aminoskupinou A2, pokiaľ X = R1CO; A2 je Gln, Glu [-], Glu (Y) alebo His, kde [-] je jednoduchá väzba, ak je X jednoduchá väzba a A2 je Glu [-], ktorá spája gamma-karboxylovú skupinu 3-propionylovej skupiny tohto zvyšku A2 s alfa-aminoskupinou A1 Leu-psí je redukovaná forma Leu, kde namiesto skupiny C = O v Leu je -CH2- s alfa-aminoskupinou susedného zvyšku A9 je pseudopeptidická, A9 je Tac, Mtac alebo DMTac a Q je NH2 alebo -OQ1, kde Q1 je vodík, C1-10 alkyl, fenyl alebo fenyl- C1-10 alkyl, a ich farmaceuticky prijateľné kyseliny alebo soli, ktoré sú antagonistami bomfezínu, spôsob ich výroby, farmaceutické prostriedky s ich obsahom a ich použitie na prípravu liečiv na liečenie rakoviny.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález je zameraný na nové peptidy, ktoré ovplyvňujú rast rakovinových nádorov u človeka. Konkrétne sa vynález týka bombezínových antagonistov, ktorými sú psí8'9 pseudopeptidy, obsahujúce v C-terminálnej polohe zvyšok Tac, MTac alebo DMTac, ich soli a farmaceutické prostriedky, spôsob syntézy týchto peptidov a spôsoby použitia týchto peptidov. Tieto peptidy majú antagonistické vlastnosti voči bombezínu alebo peptidom podobným bombczínu.
Doterajší stav techniky
Vynález sa týka polypeptidických zlúčenín, ktoré majú antagonistické vlastnosti voči bombezínu alebo peptidom podobným bombezínu (ako je peptid uvoľňujúci gastrín GRP, Neuromedin C a pod.), označované tu ako vlastnosti antagonistov bombezínu a ktoré sú cenné napríklad pri liečbe malígnych ochorení u teplokrvných organizmov ako je človek. Vynález zahrňuje nové polypeptidické zlúčeniny a spôsoby ich výroby; nové farmaceutické prostriedky obsahujúce uvedené polypeptidické zlúčeniny a spôsoby výroby liekov ich obsahujúcich, na použitie vyvolania účinku antagonistov bombezínu u teplokrvných živočíchov ako je človek.
Bombezín je tetradekapeptidamid, ktorý bol prvýkrát izolovaný z kože žaby Bombina bombina (Anastasi, Erspamer a Bucci, Experientia, 1971, 27, 166). Je známe, že bombezín je účinný mitogén pre myšie fibroblastové bunky Swiss 3T3 (Rozengurt a Sinnett-Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80,2936) a že stimuluje sekréciu amylázy z morčacích pankreatických acínov (Jensen, Jones, Folkers a Gardner, Náture, 1984,309, 61). Je tiež známe, že bunky ľudskej pľúcnej rakoviny (SCLC) produkujú a vylučujú peptidy podobné bombezínu (Moody, Pert. Gazdar, Camey a Minna, Science, 1981, 214,1246), že exogénne dodané peptidy podobné bombezínu môžu stimulovať rast ľudských buniek SCLC in vitro (Camey, Cuttia, Moody a Minna, Cancer Research, 1987,47, 821) a že monoklonálna protilátka, špecifická pre C-koncovú oblasť bombezínu a GRP môže blokovať väzbu GRP k jeho receptorom a zamedzovať rast ľudských buniek SCLC in vitro aj in vivo (Cuttia, Camey, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler a Minna, Náture, 1985,316, 823).
GRP, ktorý má vlastnosti analogické bombezínu, je široko rozšírený peptidamid s 27 aminokyselinami, izolovaný z bravčového čreva (McDonald, Jomvall, Nilsson, Vágne, Ghatei, Bloom a Mutt, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979, 90, 227), kde C-terminálna sekvencia aminokyselín je takmer zhodná s bombezínom. Neuromedin C je dekapeptidamid, ktorého štruktúra je identická s poslednými desiatimi aminokyselinami C-koncovej oblasti GRP a ktorý bol izolovaný zo psieho tenkého čreva (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke a Shively, J. Biol. Chem., 1983, 258, 5582). GRP stimuluje rôzne biologické odpovede včítane uvoľňovania gastrínu do systémového obehu. Funguje tiež ako rastový faktor v myších fibroblastoch 3T3 a bunkách pľúcnej rakoviny SCLC. Bol teda vyslovený návrh, že GRP hrá priamu patofyziologickú úlohu pri vývoji SCLC prostredníctvom autokrinného rastového mechanizmu.
Bombezín, Neuromedin C a C-terminálny nonapeptid GRP majú túto štruktúru:
Bombezín:
pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-V al-Gly-H is-Leu-Met-NH2
Neuromedin C: H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHj
C-terminálny nonapeptid GRP:
Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
Výskum v oblasti peptidov typu bombezínu u obojživelníkov viedol k izolácii litorínu, nonapeptidu vzorca pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 z kože žaby z Papuy a Novej Guiney, ktorý sa ukázal byť veľmi účinný analóg bombezínu (Yasukara a i., Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 492). Štúdie analógov bombezínu ukázali, že úplné spektrum bombezínovej účinnosti má minimálny segment 9 aminokyselinových zvyškov v polohách 6 až 14 bombezínu.
Teraz bolo charakterizovaných niekoľko typov antagonistov bombezínu. Substancia P
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 ktorá má miernu homológiu aminokyselinovej sekvencie s bombezínom, neinhibuje väzbu bombezínu a bombezínu podobných peptidov, ale analógy substancie P, modifikovanej náhradou niekoľkých L-aminokyselín D-aminokyselinami ako je (D-Arg1, D-Pro2, D-Trp7’9, Leu11) substancie P a (D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11) substancie P (Moody a i., Fed. Proceedings, 1987, 46, 2201) ako sa zistilo, blokujú sekréciu bombezínu v pankreatických acinárnych bunkách a antagonizujú rast podporujúce účinky bombezínu u buniek Swiss 3T3. Dva typy antagonistov bombezínu, odvodených od bombezínu, napríklad (D-Phe6, D-Phe12) bombezín a (Leu13-psí-Leu14) bombezín (Coy a i., J. Biol. Chem., 1988, 263, 5056, a peptidy, 1989, 10, 597) preukázali účinnosť in vitro i in vivo ako inhibítory odpovede bombezínu.
Iným typom antagonistu bombezínu, popísaným Heimbrookom a i. (Bio. Chem., 1989, 264, 11258) je N-acctylGRP(20-26) a jeho analógy, kde je z analógov GRP (20-27) vypustený C-terminálny metionínový zvyšok. Coy (J. Biol. Chem. 264, 1989, 25, 14691) uvádza, že niektorí antagonisty bombezínu s krátkym reťazcom na báze litorínovej sekvencie, ako je (D-Phe6, Leu13-psíPhe14)bombezín(6-14) a (D-Phe6, Leu13-psí-LeuI4)bombezín(6-14) vykazujú oveľa vyššiu účinnosť ako zodpovedajúci pôvodný peptid (Leu13-psí-Leu14) bombezín.
Lineárne (necyklické) bombezínové analógy GRP a bombezín z obojživelníkov, obsahujúce prípadne nepeptidickú väzbu CH2-NH sú popísané v patentovej prihláške PCT v WO 90/03980 (a príbuzné analógy v WO 91/02746). Tieto analógy, o ktorých sa uvádza, že pôsobia ako inhibítory prirodzených bombezínových peptidov, majú vzorec Ri \
A°-A1-A2-Trp-A4-A-5-A6-A7-A8-W /
r2 kde Ri a R2 je vodík, A° môže byť vypustený; medzi mnohými možnými aminokyselinami v každej polohe A1 môže byť D-Phe, D-Trp alebo D-Nal, A2 môže byť Gin, A4 môže byť Ala, A5 môže byť Val, A6 môže byť Gly, A7 môže byť His a W má vzorec
Ba z2 z2 o
II II
-N - CH - R4 - CH - C - V kde R4 je CH2-NH; v určitých prípadoch Z] môže byť identifikačný bočný reťazec Leu, t. j. -CH2CH(CH3)2; Z2 môže byť identifikačný bočný reťazec Cys alebo Met, t. j. -CH2-SH alebo (CH2)2-S-CH3; vodík je N^JR,, kde R& R7 a Rg môžu byť vodík; R] a R2 môžu byť vodík alebo COEb kde Ej môže byť C|.20alkyl.
Lineárne peptidické analógy bombezínu sú tiež opísané v EP 0 309 297. Tieto peptidy môžu mať C-terminálny zvyšok Met a pseudopeptidickú väzbu (CH2-NH) medzi C-koncom a susedným zvyškom.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu sú nové polypeptidy, ktoré sú účinnými antagonistami bombezínu, spôsoby syntézy týchto polypeptidov, medicínske aplikácie včítane farmaceutických prostriedkov, obsahujúcich tieto polypeptidy, a týchto polypeptidov a farmaceutických prostriedkov ako farmaceutický účinných látok.
A. Syntetické peptidy
Konkrétne sú prvým predmetom vynálezu pseudopeptidy, antagonistické bombezínu, vzorca (I)
X-A'-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-A’-Q (I), kde
X je vodík jednoduchá väzba spájajúca α-aminoskupinu A1 s gammakarboxylovou skupinou na 3-propionylovej skupine A2, ak je A2 Glu, alebo skupina vzorca R’CO-, kde R1 je zvolené zo skupín zahrňujúcich
a) vodík, Cj.ioalkyl, fenyl, fenyl-Ci.iOalkyl, p-Hl-fenyl, p-Hl-fenyl-Cmoalkyl, naftyl, naftyl-Ci.10alkyl, indolyl, indolyl-C|.|0alkyl, pyridyl, pyridyl-C^oalkyl, tienyl, tienylCj.ioalkyl, cyklohexyl alebo cyklohexyl-CMoalkyl, kde Hl je F, Cl, Br, OH, CH3 alebo OCH3.
b)
R2 \
N/ R3 kde R2 je vodík, Cj.^alkyl, fenyl alebo fenyl-Cbloalkyl, R3 je vodík alebo Cuoalkyl,
c) R4-O, kde R4 je Ci.iOalkyl, fenyl, alebo fenyl-Ci_l0alkyl.
A1 je zvyšok D-, L-, alebo DL-aminokyseliny, zvolenej zo skupiny zahrňujúcej Phe, p-Hl-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, nesubstituovaný Trp alebo Trp substituovaný na benzínovom kruhu jedným alebo viacerými členmi skupiny zahrňujúcej F, Cl, Br, NH2 alebo C^alkyl, alebo peptidická väzba spájajúca acylovú skupinu R'CO- s a-aminoskupinou A2,
A2 je Gin, Glu [-], Glu (Y) alebo His, kde [-] je jednoduchá väzba, ak je X jednoduchá väzba a A2 je Glu, spájajúce gamma-karboxylovú skupinu 3-propionylovej skupiny A2 s α-aminoskupinou A1,
Y je
a) -OR5, kde R5 je vodík, Cj.jälkyl alebo fenyl, alebo
b)
R6 \
N/ R7 kde R6 je vodík alebo C^alkyl, R7 je vodík, C^alkyl alebo -NHCONH2, a
Leu-psí je redukovaná forma Leu, kde namiesto skupiny C=O v Leu je -CH2-, takže väzba tejto skupiny -CH2-a-aminoskupinou susedného zvyšku A9 je pseudopeptidickú
A9 je Tac, MTac alebo DMTac a
Q je NH2 alebo -OQ1, kde Q1 je vodík, C1 _i0 alkyl, fenyl alebo fenyl- C].l0 alkyl, a ich farmaceutický prijateľné kyseliny alebo soli.
Ak je A1 jednoduchú väzba, ide v prípade pseudopeptidu vzorca (I) o oktapeptid, ale ak je A1 aminokyselina alebo jej analóg, jedná sa o nonapeptid.
Ak je A9 Tac, MTac, alebo DMTac, potom je v A9 prítomný 5-členný heterocyklus, Tento kruh zvyčajne vzniká oxidáciou bočného reťazca zvyšku A9, v niektorom okamihu syntézy nonapeptidu vzorca (I), výhodne cyklizáciou bočného reťazca s α-aminokyselinou A9 pomocou formaldehydu alebo acetaldehydu. Identita vzniknutého cyklizovaného zvyšku A9 závisí od identity pôvodného neoxidovaného A9 a použitého oxidačného činidla.
Napríklad, ak skupina -CH2-SH Cys9 cyklizuje s a-aminoskupinou Cys9, susediacou so pseudopeptidickou väzbou Leu-psí, reakciou s formaldehydom, má vzniknutý kruh štruktúru vzorca (IIA) (znázornenú tu ako -Leu8-psí-Tac9-NH2-fragment nonapeptidu vzorca (I)) s
/ \
H2C CH2 I I
...NH - CH -CHj- N - CH - CO - NHj (IIA) . I
CHj - CHĺCHjij
Tieto pseudopeptidy majú väčšiu biologickú aktivitu a dlhšiu stabilitu ako nekruhové varianty, kde A9 je Cys alebo Pen. Avšak v určitých výhodných variantoch peptidov vzorca (I), kde A9 je necyklické, X, A2 a Q majú uvedený význam, A9 je Cys alebo Pen a A1 je prirodzene sa nevyskytujúca aminokyselina, vybraná zo skupiny zahrňujúcej L- alebo D-Pal,alebo D-Tpi alebo Hca.
V určitých výhodných vyhotoveniach X je R’CO, R1 je vodík alebo CM0 alkyl (výhodne metyl), A1 je D-Cpa, D-Nal, D-Phe, D- alebo L-Tpi, alebo D-Trp, A2 je Gin, A9 je Tac alebo DMTac a Q je NH2.
Ak je však v iných výhodných vyhotoveniach A* peptidická väzba spájajúca acylovú skupinu R*CO s a-aminoskupinou A2, potom A2 je Gin alebo His, A9 je Tac, Μ-Tac alebo DM-Tac a Q je NH2. Vo výhodnej forme týchto peptidov X znamená Hca, Hna, Paa, Mpp, Hpp alebo Naa, A2 je Gin a A9 je Tac.
B. Syntetické metódy
Antagonisty bombezínu vzorca I je možné syntetizovať metódou v pevnej fáze. Podľa prvého protokolu sa nadväzujú postupne všetky aminokyseliny jedna po druhej, potom čo bol C-terminálny zvyšok naviazaný na nosičovú fázu živice. Len čo sú k živici naviazané všetky aminoacylové zvyšky, vytvorí sa 5-členný heterocyklus pseudopeptidu, reakciou bočného reťazca C-terminálneho zvyšku s oxidač3 ným činidlom. Pseudopeptid sa potom podrobí pôsobeniu HF na oddelenie od nosiča. Touto reakciou sa zároveň odstránia chrániace skupiny bočných reťazcov.
Podľa druhého protokolu je možné pseudopeptidy vzorca (I) syntetizovať ako dva fragmenty, ktoré sú vybudované syntézou v pevnej alebo kvapalnej fáze. Tripeptid, obsahujúci C-koniec, sa nadviaže k oligopeptidu za vzniku celého bombezínového antagonistu vzorca (I).
5-členný heterocyklus sa vytvára reakciou bočného reťazca A9 s oxidačným činidlom. Peptid sa potom podrobí pôsobeniu HF, ktorým sa odstránia všetky chrániace skupiny bočných reťazcov aminoacylových zvyškov a peptid sa odštiepi od živice.
C. Liečebné aplikácie
Pseudopeptidy vzorca I je možné používať vo farmaceutických prostriedkoch na liečenie určitých typov rakoviny cicavcov a tiež ďalších stavov, podávaním účinnej dávky pseudopeptidu alebo jeho terapeuticky prijateľnej kyseliny alebo soli vo farmaceutickom nosiči. Môžu byť podávané s farmaceutický prijateľným nosičom v dávkach asi 1 až 1000 pg na kg telesnej hmotnosti denne. Takýto prostriedok môže byť podávaný parenterálne, intravenózne, subkutánne, intramuskuláme, intranasálne, vo forme pľúcneho aerosólu alebo v depotnej forme.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 graficky znázorňuje účinok podávania určitých antagonistov bombezínu na myšiu rakovinu mliečnej žľazy MXT na základe údajov z tabuľky 2 z príkladu 7.
Obr. 2 graficky znázorňuje účinok podávania určitých antagonistov bombezínu na objem nádoru SCLC u nahých myší na základe údajov z tabuľky 4 z príkladu 8.
Obr. 3 graficky znázorňuje účinok podávania určitých antagonistov bombezínu na objem pankreatického nádoru MIA PACA-2 u nahých myši na základe údajov z tabuľky 5 z príkladu 9.
Obr. 4 graficky znázorňuje účinok podávania určitých antagonistov bombezínu na objem pankreatického nádoru CAPAN-2 u nahých myší na základe údajov z tabuľky 6 z príkladu 10.
Popis výhodných vyhotovení
A. Syntetické peptidy
1, Názvoslovie
Na účely opisu tohto vynálezu sa používajú konvenčné skratky aminokyselín, peptidov a ich derivátov, všeobecne prijímané v oblasti peptidov a odporučené komisiou IUPAC-IUB pre biochemickú nomenklatúru (European J. Biochem., 1984,138, 9-37).
Skratky pre jednotlivé zvyšky aminokyselín sú založené na triviálnom názve aminokyseliny, napríklad Ala je alanín, Cys je cysteín, Gin je glutamín, Glu je kyselina glutamová, pGlu je kyselina pyroglutamová, Gly je glycin, His je histidín, Leu je leucín, Phe je fenylalanín, Trp je tryptofán a Val je valín. Glu môže mať na svojom gammakarboxylovom bočnom reťazci napojené vyššie definované íúnkčné skupiny [-] alebo Y. Dpa je kyselina 2,3-diaminopropiónová. Ak má zvyšok aminokyselín izomérne formy, je zastúpená L-forma, ak nie je inak pred symbolom aminokyseliny uvedené D- alebo DL-.
V opise sú použité tieto skratky nezvyčajných aminokyselín:
Cpa p-chlórfenylalanín
Dpa kyselina 2,3-diaminopropiónová
PGlu kyselina pyroglutamová
Nal 3-(2-naftyl)-alanín
Pal 3-(3-pyridyl)-alanín
Pen penicilamín
Tpi kyselina 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pyrido[3,4-b]indol-3-karboxylová
Tac kyselina tiazolidín-4-karboxylová
Mtac kyselina 2-metyltiazolidín-4-karboxylová
DMTac kyselina 5,5-dimetyltiazolidín-4-karboxylová
Skratky analógov aminokyselín:
Hca kyselina hydroškoricová, des-amino-fenyl-alanín
Hna kyselina 3-hydroxy-2-naftoová
Hpp kyselina 3-(4-hydroxyfenyl)propiónová
Mpp kyselina 3-(4-metoxyfenyl)propiónová
Naa kyselina naftyloctová
Paa kyselina fenyloctová
Ďalšie použité skratky:
AC acyl
Ac acetyl
AcOH kyselina octová
BHA benzhydrylamín
Boe terc, butoxykarbonyl (BOC)2O diterc. butyldikarbonát
Bom benzyloxymetyl
But butyl
Bzl benzyl
BS hovädzí sérový albumín
DIC 1,3-diizopropylkarbodiimid
DMEM Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium DMF dimetylformamid
Et etyl
EDTA kyselina etyléndiamintetraoctová
FCBS fetálne teľacie sérum
Fmoc 8-fluórenylmetyloxykarbonyl
For formyl
HITES médium RPMI 16 4D plus 10’8 M hydrokortizónu, 5 μί/ml hovädzieho inzulínu, 10 pg/ml ľudského transferínu, 10‘8 M B-estradiolu a 3.10‘8MNa2SeO3
HOBt 1-hydroxybenzotriazol
HPLC vysokoúčinná kvapalinová chromatografia
Leu-psí redukovaná forma Leu, kde skupina C=O Leu je nahradená skupinou -CH2-, takže väzba tejto skupiny -CHr s aminoskupinou A9 tvoria pseudopeptidickú väzbu
Me metyl
MeCN acetonitril
MeOH metylalkohol
PBS fosfátom tlmený fyziologický roztok
TEA trietylamín
TFA kyselina trifluóroctová
Peptidické sekvencie sú zapisované podľa konvencie, pričom N-terminálna aminokyselina je na ľavom konci a C-terminálna aminokyselina na pravom konci. Je však nevyhnutné upozorniť, že sa tu nedodržiava konvencia ohľadom číslovania aminokyselinových zvyškov vo fragmentárnom peptide podľa zodpovedajúcej polohy v úplnom tetradekapeptidu antagonistu bombezínu, ak nie je uvedené inak. Keby bola táto konvencia dodržiavaná, boli by zvyšky v opisovanom nonapeptide vzorca (I) Číslované od 6 do 14 a jadro bombezínového antagonistu Trp-Ala-Vla-Gly-HisLeu by bolo číslované A8-A,-A10-A11-A12-A13. Aby nedošlo k omylu, sú namiesto toho antagonisty bombezínu číslovaní takto: zvyšok N-terminálne aminokyseliny (alebo analógu aminokyseliny) je A1, zvyšok C-terminálne aminokyseliny (alebo analógu aminokyseliny) je A9 a medziľahlé zvyšky sú číslované postupne od A2 (susediaceho s Nterminálnym zvyškom A1) vzostupne do A8 (susediaceho s C-terminálnym zvyškom A9).
2. Výhodné vyhotovenia
Výhodné vyhotovenia predstavujú antagonistické peptidy bombezínu vzorca (I)
X-AJ-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-A9-Q (I) kde X, A1, A2, Leu-psí, A9 a Q majú uvedený význam.
Tieto pseudopeptidy, antagonistické bombezínu, sú charakterizované sekvenciou aminokyselín, najmä vo zvyškoch A1, A2 a A9, ďalej prítomnosťou pseudopeptidickej väzby medzi A8 a A9 a prípadne 5-členným heterocyklom v A9. Kruhová štruktúra je určovaná identitou zvyšku A9 a zlúčeniny použitej na jej oxidáciu. Napríklad ak je použitý formaldehyd a A9 je Cys, má vzniknutý kruh štruktúru Tac vzorca IIA, tu znázornenú ako fragment Leu8-psí-Tac’-Q peptidu vzorca (I), kde Q je NH2:
s / \
H2C CH3 I I
...NH - CH -CH2- N - CH - CO - NHj (IIA)
I
CHj - CHÍCHjJj
Ak je Cys namiesto toho oxidovaný acetaldehydom, má vzniknutý 5-členný heterocyklus štruktúru MTac vzorca (IIB) (tu znázornenú ako fragment Leu8-psí-MTac’-Q peptidu vzorca (I), kde Q je NH2):
s / \
CH3HC CHj
I I
...NH - CH -CHj- N - CH - CO - NHj (UBI
I
CHj - CH(CH3)j
Ak je namiesto toho A9 Pen a je oxidovaný formaldehydom, má vzniknutý kruh štruktúru DMTac vzorca (IIC) (tu znázornenú ako fragment -Leu8-psí-DMTac9-Q nonapeptidu vzorca (I), kde Q je NH2):
s / \
HC C(CH3)j
I I
...NH - CH -CHj- N - CH - CO - NHj (IIC)
I
CHj - CH(CH3)j
V týchto výhodných vyhotoveniach je žiaduce, ak je X vodík, alebo AC, A1 je D-Phe, A2 je Gin a Q je NH2.
Obzvlášť výhodné pseudopeptidy, antagonistické bombezínu, sú uvedené ďalej:
č. štruktúra
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-val-Gly-Hls-Leu-psí-Tac-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-VaJ-Gly-Kis-Leu-psí-rac-NHj
D«’Phe'*Gln-Trp-Ala-VaJ-Gly-His-Leu-psí-MTac-NH2
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NHj
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-beu-psí-Tac-NHj
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val~Gly-His-Leu-paí->crac-HH2
D-Kal-Gln-Trp»Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-HH2
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psj-Tac-HH2
D-Pal-Gln-Trp-Ala-Vai-Gly-His-Leu-psí-Tac~NH2
D-Trp-Gln’Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-WH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-p5í-Tac-NH2
D-Tpi“GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-p6Í-Tac-MH2
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-WH2
D-Fhe-GlU{0Me)-Trp-Ala-Val-Gly-HÍ8-Leu-pSÍ-Tac-NH2
D-Phe-Glu [-j-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-Nl^
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu“pfií-DMTac-NH2
Ac-D-Phe-GLn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-MHj
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Kis-Leu-psí-DMTac-NH2
Tpi-Gln*Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-DKTac-NH2
D-TpÍ-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu»psí-DHTac-NH2
Obzvlášť výhodné vyhotovenia zahrňujú:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psĹ-Tac-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu--psí-Tac-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-ONTac-NHj
B. Syntetické metódy
1. Prehľad
Pseudopeptidy vzorca 1 je možné pripravovať ktoroukoľvek z metód, známych odborníkom v odbore peptidov. Súhrn takto dostupných metód je možné nájsť v M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Špringer-Verlag, Heidelberg, 1984.
Všetky pseudopeptidy vzorca (I) je možné syntetizovať postupmi syntézy v pevnej fáze. Obzvlášť výhodnou metódou prípravy týchto peptidov a ich peptidických medziproduktov je syntéza v pevnej fáze. Metódy syntézy výlučne v pevnej fáze sú uvedené v učebnici J. M. Stewarta a J. D. Younga, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984, (2. vyd.) a v prehľade G. Baranyho a i., Int. J. Peptide proteín Res., 30, 705-739, 1987. (Dodatočný krok oxidácie C-terminálneho zvyšku A9 k cyklizácii charakteristického bočného reťazca zvyšku s jeho tu a-aminoskupinou môže byť vykonávaný v jednom alebo niekoľkých bodoch syntézy peptidov vzorca (I)).
Pri výrobe pseudopeptidov, antagonistických bombezínu, vzorca I je možné postupovať podľa aspoň dvoch protokolov. Podľa prvého protokolu sa nadväzujú postupne všetky aminokyseliny jedna k druhej potom, čo bol C-terminálny zvyšok A90 naviazaný na nosičovú fázu živice. Podľa druhého protokolu sa na živici vybuduje tripeptid. Ten sa potom naviaže k oligopeptidu, nesúcemu zvyšné aminokyseliny, za vzniku bombezínového antagonistu. Podľa oboch protokolov syntéza začína C-terminálnym zvyškom A9 a postupne sa pridávajú zvyšky aminokyselín smerom k N-terminálnemu zvyšku.
1. a) Prvý protokol. Nosičovú fázu živice, použitú pri syntéze pseudopeptidov v pevnej fáze, môže predstavovať benzhydrylamínová (BHA) živica alebo chlórmetylovaná polystyrénová živica, zosieťovaná 1 % divinylbenzénu, ktoré sú komerčne dostupné. C-terminálny zvyšok A9 sa k tejto živici pripája cez svoju karboxylovú skupinu. Vzájomnej reakcii medzi dvoma týmito zvyškami sa zamedzuje naviazaním chemickej chrániacej skupiny na a-aminoskupinu každého zvyšku A9 pred jeho naviazaním na živicu. Chrániacou skupinou pre α-aminoskupinu zvyšku A9 i každého následne naviazaného aminokyselinového zvyšku môže byť buď 9-fluórenylmetyloxykarbonylová (Fmoc) alebo terc.butoxykarbonylová (Boe) skupina. Fmoc je výhodná pri kondenzácii zvyškov od C-terminálncho A9 do A2, pretože reakciou, ktorou sa odštepuje Boe, sa odštiepi tiež skupina chrániaca bočný reťazec C-terminálneho zvyšku A9. Počas týchto väzobných reakcií môžu byť charakteristické funkčné skupiny bočných reťazcov určitých aminokyselinových zvyškov naviazaním chemickej chrániacej skupiny (pre A9 výhodne But) pred kondenzačnou reakciou tiež chránené pred nežiaducimi chemickými reakciami.
Potom, čo je C-terminálny zvyšok Fmoc-A9 (But) naviazaný na nosičovú fázu, odštiepi sa chrániaca skupina z jeho α-aminoskupiny a naviaže sa na neho Fmoc-Leu-CHO za vzniku pseudopeptidickej väzby.
Zostávajúce zvyšky A5, A4, A3 a A2, výhodne chránené Fmoc a A1, výhodne chránený Boe, sa potom pridávajú postupne v obrátenom číselnom poradí (A7, A6, atď.), a tak sa konštruuje požadovaný pseudopeptid.
Ak je v pseudopeptide prítomný His alebo Glu, môžu ich bočné reťazce byť ohrozené nežiaducimi chemickými reakciami počas ich väzobných reakcií alebo väzobných reakcií ostatných zvyškov. Preto je možné pred väzbou týchto aminokyselín, väzobnou reakciou zaviesť do týchto bočných reťazcov chemickú chrániacu skupinu.
Len čo sú k živici BHA naviazané všetky aminoacylové zvyšky, je možné zo pseudopeptidu odštiepiť Boe na N-konci. 5-členný heterocyklus Tac, MTac alebo DMTae sa vytvorí reakciou prístupnej skupiny -CH2-SH Cys (alebo -C(CH3)2SH zvyšku Pen) a sekundárnej aminoskupiny redukovanej väzby, spájajúcej zvyšky A8 a A9 (t. j. a-aminoskupinu zvyšku A9), s oxidačným činidlom, ako je formaldehyd alebo acetaldehyd. Pseudopeptidický medziprodukt, doteraz nesúci chrániace skupiny bočných reťazcov, sa potom podrobí pôsobeniu HF na oddelenie od nosičovej fázy živice a zároveň na odstránenie chrániacich skupín bočných reťazcov.
1. b) Druhý protokol. Podľa druhého protokolu metód syntézy v pevnej fáze sa na BHA živici vybuduje tripeptid za vzniku živice s naviazaným chráneným tripeptidom: Boc-His(Bom)7-Leu8-psí-Cys(But)9-BHA živica
Skupina Boe1 a skupina But sa odštiepi a skupiny -CH2-SH zvyšku Cys sa cyklizuje so sekundárnym amínom redukovanej väzby, spájajúcej zvyšky A8 a A9, za vzniku His(Bom)7-Leu8-psí-Tac9-BHA živice. Po spracovaní HF sa získa voľný tripeptid His7-Leu8-psí-Tac9-NH2.
Boc-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-OCH2-živica sa vybuduje postupne na Gly-OCH2-živici štandardnými metódami syntézy v pevnej fáze a potom sa na 12 hodín podrobí pôsobeniu 95 % metanolu, obsahujúceho 1 % KCŇ na odštiepenie Boc-oligopeptidu. Po skonštruovaní oboch fragmentov sa Boc-oligopeptid pomocou činidla BOP spojí s voľným tripeptidom His7-Leu8-psi-Tac9-NH2. Potom sa odštiepi skupina BOC za vzniku požadovaného peptidu.
Pred podrobným opisom syntézy antagonistov bombezinu vzorca (I) sa opisuje niekoľko syntetických operácií, bežných pre jeden alebo obidva opísané protokoly.
2. Všeobecné operácie pri syntéze polypeptidov
Operácia 1: Tvorba určitých syntetických zvyškov alebo činidiel
a) L- a D-Tpi: 2,04 g (10 mM) L-Trp sa rozpustí v ml vriacej vody, obsahujúcej 2,1 g kyseliny citrónovej.
Pridá sa 0,5 ml 40 % vodného formaldehydu a okamžite začnú vznikať pevné látky. Zmes sa chladí na ľadovom kúpeli a odoberá sa zrazenina, ktorá sa premyje studenou vodou a vzduchom a potom suší pri teplote miestnosti na 2,14 g 99 % pevnej látky s teplotu topenia (za rozkladu) cca 310 °C. D-izomér vzniká rovnakým spôsobom z D-Trp a má tiež teplotu topenia (rozklad) cca 310 °C.
b) L- a D-Boc-Tpi: K miešanej suspenzii 10,8 g (50 nN) D-Tpi v 250 ml 0,2 N NaOH a 7,5 ml trietylamínu sa pridá 10 g diterc. butyldikarbonátu, zmes sa mieša 4 hodiny a potom sa pridá ďalších 10 g dikarbonátu a potom ďalších 10 g po ďalších 3 hodinách miešania; Zmes sa mieša cez noc a extrahuje (2 x 100 ml) éterom; extrakt sa zničí. K vodnej vrstve sa pridá kyselina citrónová do pH 3 až 5. Pevný podiel sa zhromaždí, premyje vodou a cez noc suší vzduchom.
Pevný podiel sa suspenduje v 100 ml tetrahydrofuránu. Rozpustí sa takmer všetok pevný podiel. Nerozpustný podiel sa odfiltruje a THF sa odstráni vo vákuu. Zvyšok sa trituruje s éterom a poskytne 9,20 g, t. j. 58 %. Táto látka má rovnakú teplotu topenia ako východisková látka, ale líši sa rozpustnosťou a TLC na silikagéli s použitím CHC13 : MeOH : HOAc 85 : 15 : 0,5.
2,55 g L-Tpi poskytuje rovnakou metódou 2,22 g, t. j. 59 % Boc-Tpi.
c) Fmoc-Leu-CHO
Fmoc-leucínmetylester (35 g, 134 mmól) v suchom toluéne (250 ml) pod N2 sa chladí zmesou suchý ľad/acetón a v priebehu 30 minút sa pridá 150 ml 25 % diizobutylalumíniumhydridu v toluéne. Zmes sa po prídavku diizobutylalumíniumhydridu mieša 20 minút v kúpeli suchý ľad/acetón, potom sa opatrne pridá metanol (15 ml). Zmes sa vleje do 1 000 ml ľadovo studenej vody, pretrepe a prefiltruje sa. Toluén sa oddelí a vodná fáza sa reextrahuje éterom (3 x 300 ml). Toluénový a éterový extrakt sa spojí a suší nad Na2SO4. Vzniknutý olej sa nechá rýchlo prejsť stĺpcom silikagélu (3 x 50 cm) v 1500 ml 15 % EtO -Ac/benzín. Ako pevná látka sa získa Fmoc-Leu-CHO (27,6 g).
d) Syntetické aminokyseliny alebo analógy aminokyselín, zabudovávané do pseudopeptidov, antagonistických bombezínu, sú zvyčajne dostupné z komerčných zdrojov. Napríklad Hca je obchodne dostupný od Aldrich Co., 1001 St. Paul Avenue, Milwaukee, Wl 53233. Boe- alebo Fmocchránené aminokyseliny sú obchodne dostupné od Advanced ChemTech, 5609 Fem Valley Road, Louisville, KY 40228, alebo Bachem Califomia, 3132 Kashiva Street, Torrance, CA 90505.
Operácia 2: Príprava živice a prídavok zvyšku A9
Živica BHA sa pripraví dvojitým 3 minútovým pôsobením 10% TEA v CH2C12 (neutralizácia) a šesťnásobným premytím CH2C12. Zvyšok Fmoc-A9 (But) sa na živici naviaže prídavkom 1,35 mmól Fmoc-A9 (But) a 1,50 mmól 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) v DMF a 3 minútovým premiešaním. Pridá sa 20 % 1,3-diizopropylkarbodiimid (DIC) s 1,3 mmól v CH2C12. Zmes sa trepe 60 minút pri teplote miestnosti. Vzniknutá Fmoc-A9 (But)-BHA živica sa premyje vždy dvakrát CH2C12 a metanolom a trikrát CH2C12 a potom sa podrobí Kaiserovmu testu (Anál. Biochem. 34, 595 (1970)). V prípade neúplnej kondenzácie sa procedúra opakuje.
Operácia 3. Tvorba pseudopeptidickej väzby
Odštiepenie chrániacej skupiny Fmoc z A9 sa vykonáva prídavkom 50 % piperidínu v DMF a miešaním počas minút; zmes sa premyje DMF (6 x 1 min.), potom i) sa pridá Fmoc-Leu-CHO (3 ekv.) v DMF, obsahujúcom 1 %
AcOH a ii) sa pridá NaBH3CN (3,5 ekv.) v DMF a trepe sa
SK 282267 Β6 minút. Potom sa vykoná premytie 50 % MeOH (3 x 1 min.), 100 % MeOH (3 x 1 min.) a DMF (3 x 1 min.).
Operácia 4: Kondenzácia aminokyselín a tvorba peptidickej väzby
Chrániacou skupinou pre α-aminoskupinu zvyšku A9 a každého následne naviazaného aminokyselinového zvyšku môže byť buď 9-fluórenylmetyloxykarbonylová (Fmoc) alebo terc.butoxykarbonylová (Boe) skupina. Fmoc je výhodná na kondenzáciu od zvyšku A9 po zvyšok aminokyseliny priamo susediacou s N-terminálnym zvyškom aminokyseliny, pretože reakciou, ktorou sa odštepuje Boe, sa zároveň odštepuje chrániaca skupina bočného reťazca A9.
A. Použitie Fmoc-aminokyseliny
Pri zavádzaní Fmoc-aminokyseliny do Fmocpeptidového medziproduktu sa používa tento postup:
1) Z Fmoc-peptidového medziproduktu sa odstráni chrániaca skupina a vykoná sa neutralizácia, potom sa premyje CH2C12 (3 x 1 min.) a DMF (3x1 min.).
2) Fmoc-aminokyselina sa kondenzuje s peptidovým medziproduktom i) prídavkom Fmoc-aminokyseliny (3 ekv.) a HOBt (3,3 ekv.) v DMF (3 min.) k peptidovému medziproduktu, ii) prídavkom 3 ekv. DIC (ako 20 % roztok v CH2C12) a trepaním zmesi počas 90 minút.
3) Zmes sa potom premyje etanolom (3 x 1 min.) a DMF (3 x 1 min.).
Za účelom kondenzácie s ostatnými zvyškami sa z novo kondenzovanej Fmoc-aminokyseliny odstránia chrániace skupiny pôsobením 50 % piperidínu v DMF počas 30 minút a premyje sa DMF (6 x 1 min.). Ďalšie kondenzácie prebiehajú ako v stupni 2.
Zakaždým, keď je so živicou alebo peptidom kondenzovaná nová aminokyselina, vykonáva sa Kaiserov text; ak príde k neúplnej kondenzácii, reakcia sa opakuje.
Pre kondenzáciu Fmoc-Gly a Fmoc-Gln je stupeň 2 tejto operácie modifikovaný takto: 3 ekv. DIC (ako 20 % CH2C12) sa pridajú k zmesi DMF - roztoku Fmocaminokyseliny (3,0 ekv.) a HOBt (3,3 ekv.) a zmes sa ponechá 15 minút pri 0 °C a 15 minút pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa pridá k peptidovej živici a trepe sa 1 hodinu v prípade Fmoc-Gly a 2 hodiny, ak ide o Fmoc-Gln.
B. Použitie Boc-aminokyseliny
Pri zavádzaní Boc-aminokyseliny do Fmocpeptidového medziproduktu sa postupuje týmto spôsobom:
1) Odstráni sa Boe skupina prídavkom 50 % TFA v CH2C12,
2) Počas 25 minút sa pridáva 50 % TFA v CH2C12 obsahujúcom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu a
3) premýva sa CH2C12 (2 x 1 min.), MeOH (2 x 1 min.) a DMF (3 x 1 min ).
4) Naviazanie zvyšku Boc-aminokyseliny sa vykonáva prídavkom 3 ekv. Boc-aminokyseliny a 3,3 ekv. HOBt v DMF a miešaním počas 3 minút. Potom sa pridajú 3 ekv. 20 % diizopropylkarbodiimidu v CH2C12 a zmes sa 90 minút trepe. Reakčná zmes sa potom premyje MeOH (3 x 1 min.) a potom CH2C12 (3 x 1 min.).
5) Skupina Boe sa odštiepi premytím produktu stupňa 5 50 % TFA v CH2C12 s obsahom 5 % merkaptoetanolu (5 min.) a 5 % anizolu (25 min.). Potom nasleduje premývanie CH2C12 (2 x 1 min.), MeOH (2 x 1 min.) a DMF (3 x 1 min.).
Treba si pamätať, že odštiepením skupiny Boe sa súčasne odstráni i chrániaca skupina But, prípadne naviazaná na bočný reťazec A9. Preto sa skupina Boe zvyčajne odštiepuje až tesne pred cyklizáciou zvyšku A9.
Operácia 5: Tvorba 5-členného heterocyklu
Kruhová štruktúra vzorca (IIA) sa vytvorí trepaním peptidického medziproduktu s chrániacou skupinou odstránenou z Cys9 v zmesi 50 % AcOH, 3,7 % HCHO a DMF (1:1:8) počas 3 minút pri teplote miestnosti a prefiltrovaním. Produkt sa premyje vždy trikrát DMF, MeOH a CH2C12.
Kruhová štruktúra vzorca (IIB) sa vytvorí trepaním peptidického medziproduktu s chrániacou skupinou odstránenou z Cys9 v zmesi 50 % AcOH, 10 % CH3CHO a DMF (1,5 : 0,5 : 8) počas 10 minút pri teplote miestnosti a prefiltrovaním. Produkt sa premyje vždy trikrát DMF, MeOH aCH2Cl2.
Kruhová štruktúra vzorca (IIC) sa vytvorí trepaním peptidického medziproduktu s chrániacou skupinou odstránenou z Pen9 v zmesi 50 % AcOH, 3,7 % HCHO a DMF (1:1:8) počas 10 minút pri teplote miestnosti a prefiltrovaním. Produkt sa premyje vždy trikrát DMF, MeOH a CH2C12.
Operácia 6: Odštiepenie peptidu od živice
Potom, čo boli naviazané všetky požadované aminokyselinové zvyšky, pôsobí sa na peptidový medziprodukt na živicu kvapalným HF v prítomnosti anizolu s cieľom odštiepenia polypeptidu z nosičovej fázy. Touto reakciou sa tiež odstránia chrániace skupiny bočných reťazcov. S použitím živice BHA je vo výslednom peptide Q = NH2.
Ak je X iné ako vodík, je skupina X umiestnená na N-konci buď zavedením aminokyseliny už nesúcej skupinu X (napríklad Ac-D-Phe) alebo reakciou voľnej a-aminoskupiny na N-terminálnom A1 pseudopeptidického medziproduktu s vhodným činidlom. Napríklad kompletný peptid po oddelení od nosičovej fázy môže výhodne reagovať s KOCN a potom X = NH2CO-.
Operácia 7: Čistenie peptidov
Pseudopeptidy vzorca (I) sa zvyčajne čistia vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) v kolóne s reverznými fázami v systéme Rainin HPLC (Rainin Inc., Wobum, MA), tvorenej tromi čerpadlami Rainin Rabbitt HP HPLC, riadenými počítačom Apple Macintosh Plus, injektorom Rheodyne a monitorom UV s meniteľnou vlnovou dĺžkou Knauer model 87. Surové peptidy (10 až 40 mg) sa nastriekajú do kolóny Dynamax Macro (21,2 x 250 mm), plnenou sférickým silikagélom C18 (veľkosť pórov 300 A, veľkosť častíc 12 pm, Rainin Inc. Co.) a vymývajú lineárnym gradientom s použitím rozpúšťadlového systému, tvoreného (A) 1 % TFA a (B) 0,1 % TFA v 70 % vodnom acetonitrile, s prietokom 2,0 ml/min. Pri všetkých frakciách sa zisťuje pomocou ďalej opísanej analytickej HPLC čistota a retenčný čas.
Kvalita a eluačné charakteristiky surového a čisteného peptidu sa zisťujú analytickou HPLC na kvapalinovom chromatografe Hewlett-Packard model 1090, vybavenom detektorom s diódovým poľom, nastaveným na 220 a 280 nm a kolónou s reverznými fázami 4,6 x 250 mm W-porex Cis (veľkosť pórov 300, veľkosť častíc 5 pm). Udržiava sa prietok 1,2 ml/min. systému opísaných rozpúšťadiel (A) a (B) a separácie sa vykonávajú pri teplote miestnosti.
Vo väčšine prípadov boli pseudopeptidické antagonisty bombezínu ďalej čistené rechromatografiou na rovnakej kolóne s miernou modifikáciou podmienok gradientu. Analytickou HPLC preukázala homogenita čistených peptidov čistotu nad 97 %.
Ak je to žiaduce, je možné vykonať analýzu aminokyselín v pseudopeptidoch vzorca (I) v analyzátore aminokyselín Beckman 6300 na vzorkách, hydrolyzovaných 20 hodín pri 110 °C v zatavených evakuovaných skúmavkách so
M kyselinou metánsulfónovou s obsahom 0,2 % 3-(2-aminometyl)-indolu.
C. Syntetické medziprodukty
1. Chrániace skupiny bočných reťazcov
Pri syntéze v pevnej fáze je bežné chrániť reaktívne funkčné skupiny v bočných reťazcoch rôznych aminokyselinových zvyškov alebo peptidových fragmentov. Tieto funkčné skupiny bočných reťazcov môžu byť chránené voči nežiaducej chemickej reakcii na týchto reťazcoch. Preto je bežné vyrobiť peptidický medziprodukt, ktorý obsahuje v peptidickom reťazci všetky aminokyselinové zvyšky v požadovanej sekvencii a s chránenými skupinami bočných reťazcov naviazanými na príslušných zvyškoch.
Pri voľbe konkrétnej chrániacej skupiny bočného reťazca pri syntéze peptidov, sa zvyčajne dodržiavajú tieto, pravidlá: a) chrániaca skupina si zvyčajne udržiava svoje chrániace vlastnosti za podmienok kondenzácie, b) chrániaca skupina by mala byť stabilná voči kondenzačným činidlám, výhodne je stabilná za podmienok kondenzačnej reakcie zvolených na odstránenie chrániacej skupiny a-aminoskupiny v každom stupni syntézy a c) chrániaca skupina bočného reťazca musí byť odštiepiteľná po dokončení syntézy požadovanej sekvencie aminokyselín za reakčných podmienok, ktoré nebudú nežiaducim spôsobom ovplyvňovať peptidický reťazec.
Chrániace skupiny bočného reťazca nadväzujú na aminokyselinové zvyšky známymi metódami. Vhodné chrániace skupiny bočného reťazca His zahrňujú Bom a pre Glu a Cys zahrňujú But.
2. Syntetické medziprodukty
Za spadajúce do rozsahu vynálezu sa tiež považujú peptidické medziprodukty v nasledujúcich stupňoch syntézy. Tu sú znázornené peptidické medziprodukty peptidu 2 v troch stupňoch:
Stupeň A: po naviazaní všetkých aminokyselín a živice: Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-Bha- živica („1/02/A“)
Stupeň B: po odstránení N-terminálnej skupiny Boe: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živica („1/02/B“)
Stupeň C: po cyklizácii A9: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živica („1/02/C“)
Existuje jeden ďalší stupeň, stupeň D, znázornený ďalej v syntéze peptidu č. 17 v príklade 2. Medziprodukt stupňa D sa odštiepi zo živice, ale nemá ešte jednoduchú väzbu X, spájajúcu A1 s A2.
Terapeutické aplikácie
Zlúčeniny antagonistické bombezínu sú vhodné na liečenie hypergastrinemických stavov, napríklad pemicióznej anémie, chronickej atrofickej gastritídy, Zollinger- Ellisonovho syndrómu a vitiliga, spojených s difúznou hyperplaziou gastrických buniek podobných enterochromafínu a so zvýšeným rizikom vývinu multifokálnych gastrických karcinoidných tumorov. Hyperplazia buniek podobných enterochromafínu navyše ľahko vzniká u hypergastrinemických zvierat.
Takáto liečba je oproti súčasným liekom výhodná, pretože H2-antagonisty, ako je eimetidín, vyvolávajú hypergastrinémiu a môžu viesť, u ľudí, ku karcinoidným tu morom. Navyše prerušenie liečenia H2-antagomstanii vyvoláva okamžitý návrat vredov v dôsledku trvajúcej hypergastrinémie.
Pretože zlúčeniny podľa vynálezu sú antagonistické receptorom bombezínu/GRP, je možné ich používať pri liečení rakoviny pľúc, rakoviny hrubého čreva a rakoviny žalúdka.
Antagonisty bombezínu vzorca (I), podľa vynálezu, je možné podávať vo forme farmaceutický prijateľných netoxických kyselín alebo solí, ako sú adičné soli s kyselinami. Príklady takýchto adičných solí s kyselinami sú hydrochlorid, hydrobromid, síran, fosforečnan, fúmarát, glukonát, soľ kyseliny trieslovej, maleát, acetát, citrát, benzoát, sukcinát, alginát, pamoát, malát, askorbát, tartrát a pod.
Tieto farmaceutické prípravky obsahujú pseudopeptidy vzorca (I) v spojení s bežným farmaceutický prijateľným nosičom, napríklad fyziologickým soľným roztokom; je však možné použiť i iné známe nosiče.
Liečenie subjektov týmito farmaceutickými prípravkami je možné vykonávať rovnakým spôsobom ako klinické ošetrenie, s použitím iných agonistov a antagonistov LHRH alebo analógov somatostatínu. Antagonisty bombezínu vzorca (I) je teda možné podávať intravenózne, subkutánne, intramuskuláme, intranasálne, formou pľúcneho aerosólu alebo v depotnej forme (napríklad ako mikrokapsule, mikrogranule alebo valcovité tyčinkovité implantáty), formulované z vhodného biodegradabilného polyméru (ako je DL-laktid-koglykolid). Do rozsahu vynálezu spadajú i iné rovnocenné spôsoby podávania, t. j. trvalá kvapačka, ínfuzna lampa a systémy s časovým uvoľňovaním, ako sú mikrokapsule a pod.
Účinná dávka peptidov vzorca (I) sa líši podľa formy podávania a konkrétneho druhu ošetrovaného cicavca. Dávka je asi 1 až 1000 pg peptidu na kg telesnej hmotnosti hostiteľa za deň pri parenterálnom podaní. Tieto rozmedzia dávok sú iba výhodné a za príslušných podmienok je možné voliť vyššie dávky. Je možné podávať fyziologicky soľný roztok, umožňujúci dávkovanie v rozmedzí asi 0,01 až 0,20 pg/kg telesnej hmotnosti za deň, s výnimkou depotných foriem, kde sa injekčné aplikované množstvo vypočíta tak, aby vydržalo asi 15 až 30 dní alebo dlhšie.
Príklady uskutočnenia vynálezu
V nasledujúcich príkladoch sa k označeniu peptidických medziproduktov v určitých stupňoch syntézy používa trojmiestny kód. Peptid, kódovaný ako „1/01/A“, je peptidický medziprodukt peptidu „01“, vyrábané v príklade „1“, po dokončení stupňa A syntézy. Podobne „2/08/B“ a „4/19/C“ sú medziprodukty peptidu „08“, resp. „19“, v príklade 2, resp. 4 po dokončení stupňa B, resp. C syntézy.
Príklad 1 Peptid #
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
D-Phe-Gln-Trp- Ala-V al-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
Ac-D-Phe-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
Tieto peptidy môžu byť výhodne syntetizované zo spoločného medziproduktu 1-1 Fmoc-Trp-Aía-VaI-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice a postupuje sa nasledujúcim spôsobom.
Fmoc-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice sa pripraví takto. 2,0g živice BHA (0,55 mmól NH2/g) sa preparuje pôsobením 20 ml 10 % TEA v CH2C12 (neutralizácia) dvakrát vždy po 3 minútach a premytím šesťkrát 20 ml CH2C12; potom sa 3 minúty mieša s 3,3 mmól Fmoc-Cys(But) a 3,6 mmól HOBt v DMF. Pridá sa 3 ekv. DIC (ako 20 % roztok v CH2C12). Zmes sa trepe 90 minút pri teplote miestnosti. Vzniknutá Fmoc-Cys(But)-BHA živica sa premyje vždy dvakrát CH2C12 a metanolom a trikrát CH2C12 a potom podrobí Kaiserovmu testu.
Naviazanie Fmoc-Leu-CHO za vzniku pseudopeptidickej väzby sa vykonáva nasledujúcim spôsobom. Odštiepenie skupiny Fmoc z A9 sa vykonáva prídavkom 15 ml 50 % piperidínu v DMF, miešaním počas 30 minút a premytím ml DMF (6 x 1 min.). Potom sa pridá 3,3 mmól FmocLeu-CHO (3 ekv.) v DMF s obsahom 1 % AcOH a potom NaBH3CN (3,5 ekv.) v DMF a trepe sa 1 hodinu. Potom sa vykonáva premytie 15 ml 50 % MeOH (3 x 1 min.), 15 ml 100 % MeOH (3 x 1 min.) a 15 ml DMF (3 x 1 min.).
Odštiepenie skupiny Fmoc z Fmoc-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice sa vykoná operáciou 4A.
Po odštiepení skupiny Fmoc z Fmoc-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice a neutralizáciou sa vykoná naviazanie FmocHis(Bom) podľa operácie 4A.
Naviazanie Fmoc-Gly sa vykonáva podľa operácie 4. K DMF roztoku 3,3 mmól Fmoc-Gly a 3,6 mmól HOBt s teplotou 0 °C sa pridá 20 % 1,3-diizopropylkarbodiimidu (3,3 mmól) v CH2C12 a mieša sa 15 minút za chladenia a 15 minút pri teplote miestnosti, zrazenina sa odfiltruje a pridá sa k živici a trepe sa 60 minút. Potom sa postupne rovnakým spôsobom naviažu nasledujúce aminokyselinové zvyšky Fmoc-Val, Fmoc-Ala a Fmoc-Trp za vzniku 3,80 g medziproduktu 1-1, t. j. chráneného peptidu naviazaného na živicu so štruktúrou Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živica.
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-D-pGlu na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Boc-D-pólu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/01/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-D-Phe na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/02/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Ac-D-Phe na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA živice („1/04/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-D-Cpa na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/05/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-D-Nal na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Boc-D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/07/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-Pal na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/08/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-D-Pal na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/09/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-D-Trp na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/10/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Ac-D-Trp na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/11/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-Tpi na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/12/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-D-Tpi na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/13/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Hca na peptidický medziprodukt 1-1 sa získa Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („1/14/A“).
N-terminálna skupina Boe peptidického medziproduktu 1/01/A sa potom odštiepi pôsobením 50 % TFA v CH2C12 s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu najprv počas 5 minút a potom znova počas 25 minút. Peptidický medziprodukt sa potom premyje CH2C12 (2 krát 1 min.), MeOH (2 krát 1 min.) a DMF (3 krát 1 min.). Tým sa súčasne odštiepi chrániaca skupina But z Cys a získa sa peptidický medziprodukt
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-BHA živice („1/01/B“), ktorý sa potom premyje CH2C12, MeOH a DMF, vždy trikrát počas 1 minúty.
V tomto okamihu sa cyklizuje bočný reťazec Cys peptidického medziproduktu 1/01/B oxidáciou za vzniku 5-členného heterocyklu, znázorneného vzorcom (HA), operáciou 5. Pridá sa 10 ml zmesi AcOH, 3,76 % HCHO a DMF (1:1:8). Reakčná zmes sa trepe 3 minúty pri teplote miestnosti, premyje sa vždy trikrát vodou, DMF a CH2C12 a získa sa peptidický medziprodukt 1/01/C D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice.
Na peptidický medziprodukt 1/01/C sa potom pôsobí HF a anizolom podľa operácie 6 za účelom odstránenia chrániacej skupiny Bom z His a súčasného nonapeptidu z nosičovej fázy živice, načo je C-terminálny Q skupinou -NH2. Peptid sa v operácii 7 čistí PHLC. Získa sa tak bombezínu antagonistický peptid č. 1.
Rovnaké stupne, pri ktorých sa odštepuje skupina Boe a But a skupina -CH2-SH Cys sa cyklizuje sekundárnym amínom redukovanej väzby, vykonajú sa u peptidických medziproduktov 1/02/A, 1/05/A, 1/07/A, 1/08/A, 1/09/A, 1/10/A a 1/12/A za vzniku nasledujúcich peptidických medziproduktov:
1/01/B D-Phe-Gln-Trp-Ala-V al-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-BHA živice /04/B Ac-D-Phe-Gln-Trp- Ala- Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice
1/05/B D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice
1/07/B D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice /08/B Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice
SK 282267 Β6
1/09/B D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice
1/10/B D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice
1/11/B Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice
1/12/B Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice
1/13/B D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice
1/14ZB Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice
Surové peptidy sa odštiepia od BHA živice a potom sa v operáciách 6 a 7 čistia za vzniku čistých peptidov 2, 4, 5 a 7 až 14.
Retenčné časy týchto peptidov sú nasledujúce:
¢.peptídu Analytická údaje HPLC Gradient % B/nin. Retančný čas na kolóne D
1 25-65 14.40
2 25-65 14.20
4 25-75 15.17
5 25-65 16.11
7 20-60 23.75
8 20-60 13.19
9 25-65 12.00
10 25-65 16.98
11 25-65 24.50
12 25-65 19.91
13 25-65 16.99
14 40-80 13.68
Alternatívne je možné 5-členný heterocyklus vytvoriť v roztoku nasledujúcim postupom:
mg pcptidického medziproduktu, zahrňujúceho štruktúru Leu-psí-Cys-NH2, získaného syntézou v pevnej fáze, v 0,8 ml ľadovej kyseliny octovej sa mieša 30 sekúnd pri teplote miestnosti so 100 μΐ 1 % formaldehydu (hm. koncentrácia roztoku vo vode) a potom sa pridá 20 μΐ 50 % roztoku acetátu amónneho. Reakčná zmes sa podrobí Čisteniu a poskytne požadovaný peptid, ktorý obsahuje štruktúru -Leu-psí-Tac-NH2.
Príklad 2 peptid #
D-Phe-His-Trp-AJa-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
I------------------------------------------------| L D-Phe-Glu [-.•'Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NHj
Peptidy v tomto príklade je možno výhodne syntetizovať zo spoločného medziproduktu 1-2 Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice, vybudovaného postupne na 0,5 g BHA živice (0,55 mmól NH2/g). Peptidický medziprodukt 1-2 sa pripraví s použitím operácií a postupov uvedených v príklade
1. Podiel 150 mg medziproduktu 1-2 sa potom rozdelí na 3 alikvóty a podrobí sa dvom ďalším kondenzáciám postupom, opísaným v operácii 4, za vzniku finálnych nonapeptidov naviazaných na živici.
Postupným naviazaním Fmoc-His(Bom) a Boc-D-Phe na peptidický medziprodukt 1-2 sa získa Boc-D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („2/15/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Glu(OMe) a Boc-D-Phe na peptidický medziprodukt 1-2 sa získa Boc-D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („2/16/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Glu(But) a Boc-D-Phe na peptidický medziprodukt 1-2 sa získa Boc-D-Phe-Glu(But)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice („2/17/A“).
Odštiepenie skupiny Boe z peptidického medziproduktu 2/15/A sa vykoná pôsobením 50 % TFA v CH2C12 s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu podľa operácie 4. Touto reakciou sa súčasne odštiepi skupina But zo zvyšku A9 a získa sa peptidický medziprodukt 2/15/B: D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys-BHA živice („1/01/B“).
V tomto okamihu sa cyklizuje bočný reťazec Cys peptidického medziproduktu 2/15/B oxidáciou za vzniku 5-členného heterocyklu, znázorneného vzorcom (IIA), operáciou 5. Pridá sa 10 ml zmesi AcOH, 3,7 % HCHO a DMF (1:1:8). Reakčná zmes sa trepe 3 minúty pri teplote miestnosti, premyje vždy trikrát vodou, DMF a CH2C12 a získa sa peptidický medziprodukt 2/15/C: D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Tac-BHA živice.
Na peptidický medziprodukt 2/15/C sa potom pôsobí 1 hodinu pri 0 °C čerstvo predestilovaným HF (5 ml) a anizolom (0,25 ml), čím sa odstráni chrániaca skupina Bom z His. Vo vákuu sa odparí rozpúšťadlo a zvyšok sa premyje etylacetátom, extrahuje 70 - 80 % vodnou kyselinou octovou a lyofilizuje sa. Po prečistení sa získa bombezínu antagonistický peptid č. 15.
Rovnaké stupne, pri ktorých sa odštepuje N-terminálna skupina Boe, cyklizuje sa Cys9, peptidický medziprodukt sa odštepuje od BHA živice a vykonáva sa čistenie HPLC, sa vykoná u peptidických medziproduktov 2/16/A a 2/17/A a získa sa peptid č. 16 a peptidický medziprodukt 2/17/D: D-Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2.
Zmes 15 mg 2/17/D a 15 mg HOBt v 0,8 ml DMF s teplotou 0 °C sa pridá k 50 μΐ 25 % diizopropylkarbodiimidu v CH2C12 a zmes sa 2 hodiny mieša pri 0 °C. V peptide 17 sa vytvorí jednoduchá väzba, spájajúca a-aminoskupinu D-Phe1 s gamma-karboxylovou skupinou 3-propionylovej skupiny Glu2:
LD-Phe-Glu [-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2.
Reakčná zmes sa podrobí čisteniu HPLC podľa operácie 7.
Retenčné časy týchto peptidov sú nasledujúce:
Analytické údaje HPLC
Č.peptídu Cradient V B/nin. Retenóný čas na kolóne D
20-6017-23
25-6519.13
20-6020.34
Príklad 3 peptid #
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-MTac-NH2
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-MTac-NH2 Tieto antagonisty bombezínu je možné syntetizovať zo spoločného medziproduktu 1-3, t. j. Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)BHA živice. Ten sa vybuduje na 1,0 BHA živice (0,55 mmól NH2/g) postupnou kondenzáciou metódou v pevnej fáze, popísanou v príklade 1 začínajúc s FmocCys(But) cez Fmoc-Leu-CHO (s NaBH3CN) a FmocHis(Bom) atď. podľa príkladu 1. Podľa operácie 4 sa na N-koniec naviaže Fmoc-Gln za vzniku medziproduktu 1-3. Konečná kondenzácia Boc-D-Phe alebo Boc-D-Cpa s medziproduktom 1-3 sa vykonáva postupmi, uvedenými v operácii 4, za vzniku peptidických medziproduktov „3/3/A/, resp. „3/6/A“.
Odštiepenie skupiny Boe sa vykonáva pomocou 50 %
TFA v CH2C12 s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu podľa operácie 4.
SK 282267 Β6
V tomto okamihu sa cyklizuje bočný reťazec Cys peptidického medziproduktu 3/3/B oxidáciou za vzniku 5-členného heterocyklu, znázorneného vo vzorci IIB, podľa operácie 5. Pridá sa 10 ml zmesi 50 % AcOH, 10 % CH3CHO a DMF (1,5 : 0,5 : 5,8). Reakčná zmes sa trepe 10 minút pri teplote miestnosti, premyje sa vždy trikrát vodou, DMF a CH2C12 a získa sa peptidický medziprodukt 3/3/C: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-MTac-BHA živica.
Medziprodukty 3/3/C a 3/6/C sa od živice odštiepia podľa operácie 6 pôsobením HF (5 ml) a anizolu (0,25 ml) pri 0 °C počas 1 hodiny. Týmto postupom sa tiež odštiepi chrániaca skupina Bom z His a získajú sa finálne nonapeptidy 3 a 6.
Peptidy sa čistia HPLC podľa operácie 7; ich retenčné časy sú nasledujúce:
Alternatívne je možné 5-členný heterocyklus vytvoriť v roztoku tak, že sa 25 mg peptidického medziproduktu, obsahujúceho štruktúru Leu-psí-Cys-NH2, v 0,8 ml ľadovej kyseliny octovej sa mieša pri teplote miestnosti so 100 μΐ 10 % acetaldehydu. Zmes sa mieša 5 minút, potom sa pridá 100 μΐ acetátu amónneho. Reakčná zmes sa podrobí čisteniu a poskytne požadovaný peptid, ktorý obsahuje štruktúru Leu-psí-MTac-NH2.
Príklad 4 peptid #
D-Phe-Gln-Trp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psí-DMTac-NH2
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-DMTac
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-DMTac-NH2
Tpi-GIn-Trp-Ala· Val-Gly-His-Leu-psí-DMTac-NHj
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-DMTac-NH2
Tieto polypeptidy je možné výhodne syntetizovať zo spoločného medziproduktu 1-4 Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Pen(But)-BHA živice. Tento medziprodukt sa postupne vybuduje na benzhydrylamínovej (BHA) živici štandardnými metódami syntézy v pevnej fáze, opísanými v príkladoch 1 a 2.
Pritom sa podľa operácie 2 pripraví 1,0 g BHA živice (0,55 mmól NH2/g) pôsobením dvakrát vždy počas 3 minút 10 ml 10 % TEA v CH2C12 (neutralizácia); potom sa mieša 3 minúty s 1,6 mmól Fmoc-Pen(But) a 1,8 mmól 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) v DMF. Pridá sa 1,6 mmól 20 % l,3-diizopropylkarbodiimidu (DIC) v CH2C12. Zmes sa trepe 90 minút pri teplote miestnosti. Vzniknutá FmocPen(But)-BHA živica sa premyje vždy dvakrát CH2C12 a metanolom a trikrát CH2C12 a potom sa podrobí Kaiserovmu testu.
Odštiepenie chrániacej skupiny Fmoc z FmocPen/But)BHA živice sa vykonáva podľa operácie 4A.
Kondenzácia s Fmoc-Leu-CHO sa vykonáva podľa 0perácie 3. A’(But)-BHA živice sa premyje 2-krát DMF. Potom sa pridá 1,6 mmól Fmoc-Leu-CHO v DMF s obsahom 1 % AcOH a potom 1,8 mmól NaBH3CN v DMF. Reakčná zmes sa 60 minút trepe a potom sa premyje 2-krát 50 % metanolom v H2O, 2-krát 100 % MeOH a 3-krát CH2C12, vždy počas 1 minúty.
Po odštiepení skupiny Fmoc z Fmoc-Leu-psí-Pen(But)-BHA živice a neutralizácii sa podľa operácie 4 vykoná kondenzácia s Fmoc-His(Bom).
Kondenzácia s Fmoc-Gly sa vykoná podľa operácie 4. K DMF roztoku 1,5 mmól Fmoc-Gly a 1,65 mmól HOBt s teplotou 0 °C sa pridá 20 % 1,3-diizopropylkarbodiimid (1,5 mmól) v CH2C12, zmes sa mieša 15 minút za chladenia a 15 minút pri teplote miestnosti, zrazenina sa odfiltruje a pridá k živici a trepe sa 60 minút. Potom sa rovnakým spôsobom navážia nasledujúce zvyšky Fmoc-Val, Fmoc-Ala a Fmoc-Trp a získa sa 1,9 g medziproduktu 1-4, t. j. chráneného peptidu na živici so štruktúrou Fmoc-Trp-Ala-ValGly-His(Bom)-Leu-psí-Pen(But)-BHA živice.
0,91 g medziproduktu 1-4 sa rozdelí na päť alikvótov (po asi 200 mg), ktoré sa použijú na syntézu chránených peptidov na živici, postupmi opísanými v operácii 4.
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-D-Phe na peptidický medziprodukt 1-4 sa získa Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Pen(But)-BHA živica („4/18/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Ac-D-Phe na peptidický medziprodukt 1-4 sa získa Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Pen(But)-BHA živica („4/19/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-D-Cpa na peptidický medziprodukt 1-4 sa ziska Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Pen(But)-BHA živica („4/20/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-Tpi na peptidický medziprodukt 1-4 sa získa Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Pen(But)-BHA živica („4/21/A“).
Postupným naviazaním Fmoc-Gln a Boc-Tpi na peptidický medziprodukt 1-4 sa získa Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-VaI-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Pen(But)-BHA živica („4/22/A“).
Z peptidického medziproduktu 4/18/A sa potom odštiepi skupina Boe pomocou 50 % TFA v CH2C12 s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu za vzniku peptidického medziproduktu 4/18/B: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Pen-BHA živica.
V tomto okamihu sa podľa operácie 5, cyklizuje bočný reťazec Pen v peptidickom medziprodukte 4/18/B oxidáciou za vzniku 5-členného heterocyklu, znázorneného vo vzorci IIC. Pridá sa 10 ml zmesi AcOH, 3,7 % HCHO a DMF (1 : 1 : 8) za vzniku reakčnej zmesi, ktorá sa 3 minúty trepe pri teplote miestnosti, premyje sa vždy 3-krát vodou, DMF a CH2C1j a získa sa peptidický medziprodukt D-PheGln-Trp-Ala-Val-Cily-His(Bom)-Leu-psí-DMTac-BHA živica.
Peptidický medziprodukt 4/18/C sa potom premyje vždy trikrát 5 ml CH2C12, metanolom a CH2C12 a potom sa na neho 1 hodinu pôsobí čerstvo predestilovaným HF (5 ml) a anizolom pri 0 °C. Vo vákuu sa odparí rozpúšťadlo, zvyšok sa premyje éterom alebo etylacetátom a potom extrahuje 70 - 80 % kyselinou octovou a lyofilizuje na surový nonapeptid na živicu. Prečistením reakčnej zmesi sa získa bombezínu antagonistický peptid č. 18.
Rovnaké stupne, pri ktoiých sa odstraňujú chrániace skupiny, cyklizuje sa nechránený A9 a peptidický medziprodukt sa odštepuje od živice, vykonajú sa na peptidických medziproduktoch 4/19/A, 4/20/A, 4/21/A a 4/22/A za vzniku peptidov č. 19,20,21 a 22.
Čistenie sa vykonáva pomocou HPLC s rozpúšťadlovým systémom tvoreným (A) 0,1 % TFA a (B) TFA v % acetonitrilu podľa operácie 7. Prečistené peptidy vykazujú pri analytickej HPLC čistotu nad 97 %. Retenčné časy týchto peptidov sú nasledujúce:
Č. peptidu Analytické údaje HPLC Gradient % B/min. Ratenčný čas na kolóne D
18 2S-65 14.01
19 25-65 22.96
20 25-65 15-97
21 25-65 19.19
22 25-65 16.53
Alternatívne je možné zvyšok A9 cyklizovať v roztoku tak, že sa 25 mg voľného peptidu, obsahujúceho štruktúru Leu-psi-Pen-NH2, pridá k 25 mg HOBt v 0,8 ml ľadovej kyseliny octovej, zmieša sa so 100 μΐ formaldehydu a mieša 30 minút pri 0 °C za vzniku peptidu s 5-člennou kruhovou štruktúrou Leu-psí-DMTac-NH2.
Príklad 5 Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Cys-NH2 D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Cys-NH2 Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Cys-NH2 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Cys-NH2 Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Cys-NH2
Tieto peptidy je možné syntetizovať zo spoločného medziproduktu 1-5 Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živice.
Fmoc-Leu-psí-Cys(But)-BHA živica sa získa takto: 1,0 g BHA živice (0,55 mmól NH2/g) sa kondenzuje spôsobom uvedeným v operáciách 2 a 3 postupne s FmocCys(But) a Fmoc-Leu-CHO.
Postupnou kondenzáciou s Fmoc-His(Bom), Fmoc-Gly, Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Trp a Fmoc-Gln sa získa peptidický medziprodukt 1-5: Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-BHA živica.
Alikvót 150 mg tohto medziproduktu 1-5, spoločného všetkým peptidom v tomto príklade sa podrobia postupom opísaným v operácii 4 jednej ďalšej kondenzácie za vzniku konečných peptidov na živicu.
Postupným naviazaním Boc-Pal na peptidický medziprodukt 1-5 sa získa Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živica („5/08/A“).
Postupným naviazaním Boc-D-Pal na peptidický medziprodukt 1-5 sa získa Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živica („5/09/A“).
Postupným naviazaním Boc-Tpi na peptidický medziprodukt 1-5 sa získa Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živica („5/12/A“).
Postupným naviazaním Boc-D-Tpi na peptidický medziprodukt 1-5 sa získa Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živica („5/13/A“).
Postupným naviazaním Hca na peptidický medziprodukt 1-5 sa získa Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA živica („5/14/A“).
N-terminálna skupina Boe sa z peptidického medziproduktu 5/01/A odštiepi najprv 5 minút a potom 25 minút pôsobením 50 % TFA v CH2C12 s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu. Týmto spracovaním sa odštepí i chrániaca skupina Cys. Peptid sa potom premyje podľa operácie 4 CH2C12, MeOH a DMF za vzniku peptidického medziproduktu 5/08/B: Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys-BHA živica.
Na peptidický medziprodukt 5/08/B sa potom pôsobí 1 hodinu čerstvo predestilovaným HF (5 ml) a anizolom (0,25 ml) pri 0 °C, čím sa súčasne odštepí chrániaca skupi na Bom z His. Po odparení rozpúšťadla vo vákuu sa zvyšok premyje etylacetátom, extrahuje 70 - 80 % kyselinou octovou a lyofilizuje za vzniku peptidu Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Cys-NH2.
Z peptidických medziproduktov 5/08/A, 5/09/A, 5/11/A, 5/12/A, 5/13/A a 5/14/A sa odštepí chrániaca skupina a BHA živica za vzniku peptidov uvedených v úvode príkladu. Tie sa podrobia testu čistoty podľa operácie 7.
Alternatívne je možné tieto peptidy výhodne vybudovať postupne na BHA živici štandardnými metódami syntézy v pevnej fáze s Boc-chránenými aminokyselinami a s ochranou skupiny -SH v Cys9 skupinou Bz, za vzniku nasledujúcich peptidických medziproduktov: Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(Bz)-BHA živice („5/08/A“) Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(Bz)-BHA živice („5/09/A“) Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(Bz)-BHA živice („5/12/A“) Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA živice („5/13/A“) Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-BHA živice („5/14/A“).
Skupina Boe sa odštiepi pôsobením 50 % TFA v CH2C12 s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu a potom sa pôsobením HF a anizolu odštiepi peptid od živice a súčasne sa odstráni chrániaca skupina Bom z His a Bz z Cys za vzniku peptidov uvedených za začiatku príkladu.
Farmakologické skúšky účinnosti
Príklad 6
A) Test väzby na receptory
Väzba 125I-Tyr4-bombezínu a jeho odštiepovanie antagonistickými pseudopeptidmi sa testuje na 24-jamkových tkanivových kultivačných platniach (GIBCO) s použitím buniek Swiss 3T3. Myšie fibroblasty Swiss 3T3 sa udržiavajú každotýždenným prechodom DMEM s obsahom 10 % FCBS a antimykotík. Kultúry sa inkubujú pri 37 °C vo vzduchu s 5 % CO2. Jamky sa očkujú 105 buniek/jamka (životnosť >95 %) a kultivujú do súvislého nárastu a pokojového stavu. Väzobná procedúra sa vykonáva 7 dní po zaočkovaní. Bunky sa premyjú 2-krát 0,5 ml väzobného pufra (Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium s obsahom 20 nM HEPES-NaOH o pH 7,4, 0,2 % BSA A 100 mg/ml bacitracínu). Bunky sa potom inkubujú s 0,2 nM 12SI-Tyr4-bombezínom v prítomnosti alebo neprítomnosti rôznych koncentrácií antagonistov (6.10 až 6.10 M, celkový objem 0,4 ml).
Bunky sa inkubujú 30 minút pri 37 °C, pretože väzba 125I-GRP pri 37 °C dosahuje po 30 minútach maximá a potom klesá, ako uvádza Zachary a Rozengurt (1985) a Layton a i. (1988). Potom sa bunky premyjú 2 krát ľadovým (4 °C) väzobným pufrom a 2-krát ľadovým fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS, mM): NaCl 138, KC1 2,8, Na2HPO4 8, KH2PO4 1,45, CaCl2 0,91, MgCl2 0,49. Kvôli meraniu sa premyté kultúry extrahujú 0,5 ml 0,5 M NaOH a prenesú do skúmaviek. Jamky sa premyjú raz 0,5 ml destilovanej vody (sterilnej) a tento roztok sa pridá do príslušných skúmaviek. Potom sa meria na auto matickom gamma čitači (Micromedic Systém, Inc., Huntsville, Ala.) rádioaktivita vzoriek.
S pomocou komputerizovaného programu aproximácie krivky Ligand-PC sa stanovia typy väzby receptorov, disociačná konštanta (Kd), asociačná konštanta (Ka) a maximálna väzobná kapacita receptorov (Bmax).
Väzobné údaje pre polypeptidy, podľa vynálezu, sú uvedené v tabuľke I. Rôzne dávky neznačeného peptidu boli použité na stanovenie schopnosti potlačenia špecifickej väzby 125I-Tyr4-bombezínu. Pre každý peptid je uvedená stredná hodnota z 2 až 3 nezávislých testov (každý vykonaný trikrát).
Tabuľka 1 Inhibícia väzby 125I-Tyr4-bombezínu na Swiss 3T3 bunky pri antagonistoch bombezínu
C. peptidu Κ4 (nM]
5.0
0.078
13
13
0.007
4.3
0.009
4.5 fl,8
0.11
5.4 <0.001 <0.001 <0.001
0.26
12
213
0.93
20
13
0.07
0.074
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiBLeU-psi-LeU-HHn 0.20 bonbezínb 0.28 *: stredná hodnota zo 6 testov b stredná hodnota t 11 testov
Príklad 7
Vplyv liečenia antagonistami bombezínu na objem nádoru pri estrogénne nezávislej rakovine mliečnej žľazy MXT u myší sa zisťuje takto: 40 samíc myší B6D2F, sa získa z National Cancer Inštitúte, Frederick Cancer Research Facility (Frederick, Maryland) a udržiava pri teplote 21 ± 1 °C a vlhkosti 55 + 5 %. Zvieratám sa automaticky udržiava rozvrh 12 hodín svetla a 12 hodín tmy a podáva sa laboratórne krmivo pre hlodavce 50001 a vodovodná voda ad libitum. Kryo-konzervované tkanivo karcinómu mliečnej žľazy MXT (3.2)/Ovex, nezávislého od estrogénu, získané od Dr. A. E. Bodgena (Biomeasure Inc., Hopkinton, MA) sa v množstve 1 mm3 nádoru MXT (3.2)/Ovex subkutánne injekčnej aplikuje dospelým myším samiciam.
Po 2 dňoch od transplantácie nádorov sa myši náhodne rozdelia do štyroch skupín a zaháji sa terapia pomocou systému dlhodobého uvoľňovania peptidov (mikrokapsula). Vytvoria sa tieto štyri skupiny:
1. kontrola, iba injekčné vehikulum
2. [D-Tpi6, Leul3-psí-Leu14]Bn(6-14)
3. [D-Phe6, Leul3-psí-Tacl4]Bn(6-14)
4. chirurgická obojstranná ovariolctómia
V skratkách pre antagonistov bombezínu je použité konvenčné číslovanie zvyškov v peptidickom fragmente: každý zvyšok sa čísluje podľa polohy v kompletnom fragmente. Antagonisty bombezínu sa tu však ľahšie porovnávajú s ostatnými peptidmi, ak sú číslované tak, že N-koniec má číslo 1.
„ [D-Tpi6-Leu13-psí-Leul4]Bn(6-14)“ je teda D-Tpi'-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psí-Leu9 10 11 12-NH2 (ďalej „BI“), zatiaľ čo ,,[D-Phe6-Leul3-psí-Tac'4]Bn(6-14)“ je to isté ako uvedený peptid č. 2.
Oba antagonisty bombezínu sa syntetizujú v pevnej fáze. Skupina 2 myší dostávala s dlhodobým uvoľňovaním formuláciu „BI“ a skupina 3 formuláciu s uvedeným peptidom č. 2. Táto formulácia s dlhodobým uvoľňovaním udržiava konštantné uvoľňovanie BI alebo peptidu č. 2 počas 15 dní na hodnote 25gg/deň.
Na dlhodobé uvoľňovanie sa používajú osmotické čerpadlá Alzet (Alzo Co., Palo Alto, CA). Čerpadlo Alzet model 2002, uvoľňujúci 0,48 μΐ/h., sa implantuje subkutánne na spodnú bočnú časť chrbta. Do osmotických miničerpadiel sa peptidy rozpustia v 50 % (obj./obj.) propylénglykolu vo vode.
Potom, čo sú nádory viditeľné a hmatateľné, meria sa ich objem a výpočet sa vykoná podľa Szendeho a i., „Growth Inhibition of MXT Mammary Carcinoma by Enhancing Programmed Celí Depth“ (apoptosis) s analógmi LH-RH a somatostatínu (Breast Cancer Res. Treat. 14, 307-314(1989)).
Experimenty sa skončia v exponenciálnej fáze rastu nádoru. Prvé meranie objemu nádoru sa vykonáva po 10 dňoch. Rozdiely v objeme nádoru medzi kontrolou a ošetrením oboma antagonistami bombezínu rovnako ako medzi oboma antagonistami navzájom, sú štatisticky významné. Výsledky merania objemu nádoru sú uvedené v tabuľke 2 a znázornené na obr. 1.
Tabuľka 2 Vplyv antagonistov bombezínu na objem nádoru pri estrogénne nezávislej rakovine myšej mliečnej žľazy MXT
Po skončení experimentu sa myši nechajú vykrvácať pod anestéziou Metofanom, potom sa zmeria hmotnosť nádorov a podrobia sa štatistickej analýze Duncanovým testom a Študentovým testom. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
Zlúčenina podaná myái a eatrogánne nezávislým nádorom mliečnej iíazy MXT Hmotnosť nádoru (g)
kontrola 8.45 t 0.23
(D-Tpi6-Leu13-psi-Leu14 15 * 17 18 19 20 21 22]Bn(6-14) 7.36 t 0.46
peptid č. 2 5.48 t 1.00
stredné hodnoty i štát. odch.
“ p 0.01
Príklad 8
Účinok jedného analógu somatostatínu a troch antagonistov bombezínu na ľudský malobunečný pľúcny karcinóm u nahej myši sa testuje takto: Atymickí samci nahej myši staré približne 6 týždňov pri príchode sa získajú z National Cancer Inštitúte (Bethesda, MD) a udržiavajú sa v limitovaných patogénnych podmienkach.
Ľudský malobunečný pľúcny karcinóm (SCLC, línia H69) sa pestuje ako monovrstva v rpmi 1640 (Gibco, Grand Island, NY), doplnenom 10 % hovädzieho sérového albumínu, antibiotík a antimykotík, pri 37 °C vo zvlhčenej atmosfére s 5 % CO2. Cudzie štepy sa iniciujú subkutánnou injekciou 1.107 buniek z exponenciálne rastúcich buniek bunečnej tkanivovej kultúry do pravého boku piatich nahých myší. Vzniknuté nádory sa po troch týždňoch aseptický vyrežú a mechanicky rozdrvia. Kúsky nádorového tkaniva 3 mm3 sa potom subkutánne transplantujú Trocarovou ihlou 60 zvieratám. Po dvoch týždňoch po transplantácii vzrástli nádory na objem približne 10 mm3 a zvieratá boli náhodne rozdelené do 5 experimentálnych skupín, ošetrovaných piatimi rôznymi zlúčeninami počínajúc dňom, kedy uplynuli dva týždne od transplantácie. Nádory sa potom
SK 282267 Β6 merajú každý týždeň počas piatich týždňov. Objem nádoru sa vypočíta ako (dĺžka x šírka x výška x pi)/6. Osem zvierat v každej skupine sa usmrtí s cieľom merania hmotnosti nádoru.
Prvá z terapeutických liečivých zlúčenín, podávaných nahej myši, je analóg somatostatínu D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NHj, tu označovaný SI.
Prvý z troch bombezínových antagonistov je D-Tpi'-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psí-Leu9-NH2, t. j. BI. Druhým antagonistom bombezínu je [Tpi6-Leu13-psí-Tpi14]Bn(6-14), t. j. D-Tpi1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psí-Tpi9-NH2, označovaný B2, a tretím antagonistom je peptid 2.
Mikrogranule pamoátu SI v poly(DL-laktidkoglykolid) sa pripravia pomocou Cytotech SA tak, aby uvoľňovali z alikvótu 16 mg počas 2 týždňov asi 100 pg/deň. Tieto mikrogranule sa každých 15 dní injekčné subkutánne vpravujú na opačnej strane ako je nádor. Každý z antagonistov bombezínu sa rozpustí v 0,1 % dimetylsulfoxidu vo fyziologickom roztoku a dvakrát denne subkutánne injekčné aplikuje v dávke 20 pg/deň.
Účinok tejto liečebnej terapie na objem nádoru je uvedený v tabuľke 4 a znázornený na obr. 2.
Tabuľka 4 Účinok antagonistov bombezínu na objem nádoru SCLC
Peptid Objem nádoru v čase (dni) 28 35
0 7 14 21
kontrola 10.5*0.5 19.3*1.4 31.6*5.6 63.8*10.6 142.8 249.7
*37.5 ♦74.3
81 9.8*0.8 14.4+1.5 15.8+1.3 18.4*2.9 33.2 88.0
±9.0 +12.1
BI 11.2+0.8 13.3+1.2 17.0+3.4 24.7*8.2 55 80.2
*24.5 *27.2
BI 10X1.1 11.7+1.2 14.712.4 24.5*7.9 45 74.1
*15 ±31.8
peptid 11.6*1.7 7.4+1.8 8.912.3 14.3*6.3 19.2 49.0
i. 2 *9.4 *21.0
Príklad 9
Účinok antagonistov bombezínu na nádory rakoviny slinivky MIA PACA-2 sa zisťuje takto:
Nahým myšiam, podobným ako v príklade 8, sa subkutánne injekčné vpravia bunky ľudskej rakoviny slinivky MIA PACA-2, odvodené z tkanivovej kultúry, pestovanej ako v prípade SCLC v príklade 8. Objem nádorov sa meria u oboch experimentálnych skupín ako v príklade 8.
Dve experimentálne skupiny tvoria: skupina myší, ktorým sa podáva peptid č. 2, antagonistický bombezínu a kontrolná skupina, dostávajúca iba injekčné vehikulum. Každej myši sa dvakrát denne injekčné subkutánne vpravuje 50 pg injekčného vehikula alebo peptidu č. 2.
Výsledky merania objemu nádorov sú uvedené v tabuľke 5 a znázornené na obr. 3.
Tabuľka 5 Účinok antagonistov bombezínu na objem (mm3) slinivkových nádorov MIA PACA-2
Peptid Objem nádoru v čase (dni)
O 7 14 21
kontrola 45.6*7.9 254.2+59.8 645.1*128.6 855.9*145.4
peptid č. 2 29.8+4.3 252.3+98.9 427.9+122.6 634.1+174.0
Príklad 10
Účinok liečby antagonistami bombezínu na nahú myš s ľudskou rakovinou slinivky CAPAN-2 sa zisťuje takto:
Nahým myšiam, podobným ako v príklade 7, sa implantujú nádory ľudskej rakoviny slinivky CAPAN-2, odvodenej z tkanivovej kultúry, pestovanej ako v príklade 7. Myši sa rozdelia na dve skupiny, z ktorých kontrolná dostáva iba injekčné vehikulum a druhá bombezínu antagonistický peptid č. 2, z ktorého sa denne podáva subkutánna injekcia 50 mg.
Objem nádorov sa meria ako v príklade 8 a výsledky merania objemu nádorov sú uvedené v tabuľke 6 a znázornené na obr. 4.
Tabuľka 5 Účinok antagonistov bombezínu na objem (mm3) slinivkových nádorov MIA PACA-2
Peptid objen nádoru v čase (dni)
7 14 21 28 kontrola 21.2*1.7 28.312.3 43.0*3.6 51.4*8.9 78.8*16.7 peptid Č.2 19.7+1.7 27.8*3.1 32.2*3.5 46.4*3.0 -50.5*17.8
Napriek tomu, že je vynález opísaný s ohľadom na výhodné vyhotovenie, je potrebné ho chápať tak, že je možné vykonávať odborníkom zrejmé zmeny a modifikácie bez prekročenia jeho rozsahu, ktorý je uvedený v pripojených patentových nárokoch, vo vynáleze je možné použiť známe substitúcie, ktoré významne neznižujú jeho účinnosť.
ZOZNAM SEKVENCII (1) VŠEOBECNÁ INFORMÁCIA (1) PRIHLASOVATEĽ: Schally, Andrew V.
Cai, Renzhi (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: POLYPEPTIDICKÍ ANTAGONISTI BOMBEZÍNU (iii) POČET SEKVENCII: 37 (iv) KONTAKTNÁ ADRESA:
(A) ADRESÁT: OMRI M. BEHR, ESQ (B) ULICA: 325 PIERSON AVENUE (C) MESTO: EDISON (D) ŠTÁT: NEW JERSEY (E) ZEM: USA (F) : PSČ: 08837 (v) STROJOM ČITATEĽNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: floppy disk (B) POČÍTAČ: PC IBM kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release # 1,0, verzia# 1,25 (vi) ÚDAJE O TEJTO PRIHLÁŠKE:
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/031,325 (B) DÁTUM PODANIA: 15.3.1993 (C) ZATRIEDENIE:
(vii) ÚDAJE O SKORŠÍCH PRIHLÁŠKACH:
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 07/619, 747 (B) DÁTUM PODANIA: 29.11.1990 (viii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI/AGENTOVI:
(A) MENO: BEHR, OMRI M.
(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: 22,940 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: SHAL3,0-014 (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:
(A) TELEFÓN: (908) 494-5240 (B) TELEFAX: (908) 494-0428 (C) TELEX: 511642 BEPATEDIN (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-pGlu“) (ix) ZNAK:
SK 282267 Β6 (A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 1:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 2:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Phe“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 2:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 3:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA; lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Phe“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = MTac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 3:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = Ac-D-Phe“) (ix)ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix)ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 4:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 5:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Cpa“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 5:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Cpa“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = MTac-NH2“)
SK 282267 Β6 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 6:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 7:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Nal“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 7:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 8:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: l (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = Pal“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = TacNH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. C. 8:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Pal“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE; (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = TacNH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 9:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 10:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Trp“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE; (pozn, „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = TacNH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 10:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 11;
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn.“Res 1 = Ac-D-Trp“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = TacNH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 11:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché
SK 282267 Β6 (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = Tpi“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 12:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 13:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn.“Res 1 = D-Tpi“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE; (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 13:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn.“Res 1 = Hca-Gln“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 7 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 7 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 14:
Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 15:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Phe“) (ix)ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 15:
Xaa His Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 16:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Phe“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 2 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 2 = Glu(OMe)“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 16:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix)ZNAK:
SK 282267 Β6 (A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Phe“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 2 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 2 = Glu[-J“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix)ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 17:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 18:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Phe“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 18:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = Ac-D-Phe“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 19:
Xaa Gin Tip Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 20:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Cpa“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = DMTacNH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 20:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 21:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = Tpi“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 21:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: mise feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Tpi“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: mise feature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 22:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 23:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 14 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 =pGlu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 14 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 14 = Met-NHj (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 23:
Xaa Gin Arg Leu Gly Asn Gin Trp Ala Val Gly His Leu Xaa
5 10 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 24:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = H-Gly“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 10 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 10 = Met-NH2 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 24:
Xaa Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Xaa
5 10 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Met-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 25:
Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 26:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 11 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 11 = Met-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 26:
Arg Pro Lys Pro Gin Gin Phe Phe Gly Leu Xaa
5 10 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 27:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = (R*)(R2)A°-A’, kde A° = delece, A1 = D-Phe, D-Trp alebo al, R' a R2 = H“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = A8-W, W = -N(R8)-CH(Z’)-R4 *-CH(Z2)-CO-V, kde R4 = NH; Z1 = -CH2CH(CH3)2; Z2 = -CH2SH alebo (CH2)2-S-CH3; V = N(R6)R7, kde R6, R7 a R8 môže byť H; R1 a R2 môže = H alebo COE1, kde E^C^lkyl“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 27:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Leu Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = X-A1, kde X = H, jednoduchá väzba spájajúca a-aminoskupinu A1 s gamma-karboxylom na 3-propionyle Glu, ak je Res 2 = Glu; alebo R’CO, kde R1 = H, Cmo alkyl, fenyl, fenyl-C|.iOalkyl, p-Hl-fenyl,p-Hl-fenyl-Ci.]0alkyl, naftyl, naftyl-Cj.toalkyl, indolyl, indolyl-C].10- alkyl, pyridyl, pyridyl-Cpioalkyl, tienyl, tienyl-C|.1()alkyl, cyklohexyl alebo cyklohexyl- C^oalkyl, kde Hl = F, Cl, Br, OH, CH3 alebo OCH3; alebo R* = N(R2)(R3), kde R2 = H, C|.10alkyl, fenyl alebo fenyl- Cj.joalkyl, R3 = H alebo C|.10alkyl; alebo R1 = R4O, kde R4 = Cuoalkyl, fenyl, fenyl alebo fenyl- C1_ioalkyl; kde R4 = Ci_10alkyl, fenyl alebo fenyl-CMoalkyl; a A1 = zvyšok D-, L- alebo DL-aminokyseliny zvolenej z Phe, p-Hl-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, nesubstituovaného na benzínovom kruhu jedným alebo niekoľkými členmi súboru zahrňujúceho F, Cl, Br, NH2 alebo C^alkyl; alebo peptidická väzba spájajúca acylovú skupinu R’CO s α-aminoskupinou Res 2“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 2 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 2 = Gin,
Glu[-],Glu(Y), alebo His“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = A9-Q, kde A9 = Tac, MTac, alebo DMTac; a Q = NH2 alebo OQ1, kde Q1 = H, fenyl alebo fenyl-C,.iOalkyľ‘) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 28: Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 29:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Phe“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: mise feature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 29:
Xaa Glu Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Tpi“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = LeuNH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 30:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 31:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature ' (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Phe“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 4 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 4 = D-Trp“) (ix)ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscfeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = Trp· -NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 31:
Xaa Cys Tyr Xaa Lys Val Cys Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 32:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = D-Tpi“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = redukovaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tpi· -NH2“) (xi) POPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 32:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = X-A1, kde X = H alebo Ac; A1 = D-Phe, L- alebo D-Tpi“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc_feature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = Tac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 33:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 34:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = X-A1, kde X = H alebo Ac; A1 = D-Phe, L- alebo D-Tpi“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = reduko vaný izoster Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: misc jeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 34:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = X-A1, kde X = H jednoduchá väzba spájajúca a-aminoskupinu A1 s gamma-karboxylom na 3-propionyle Glu, ak je Res 2 = Glu; alebo R*CO, kde R1 = H, C|_iOalkyl, fenyl, fenyl- C110alkyl; alebo R1 - N(R2)(R3), kde R2 = H, CMoalkyl, fenyl alebo fenyl- CMoalkyl, R3 = H alebo CMoalkyl ale bo R1 = R4O, kde R4 = Ci_]oalkyl, fenyl alebo fenyl-Cj.joalkyl a A1 * * = L- alebo D-Pal alebo L- alebo D-Tpi“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 2 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 2 = Glu, Glu[-J, Glu(Y) alebo His“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = redukovaný izostér Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 9 = A9-Q, kde A9 = Cys alebo Pen; a Q = NH2 alebo OQ1, kde Q1 = H, Cbioalkyl, fenyl alebo fenyl- C,.10alkyl“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 35:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 36:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 = X-A1-Gln, kde X = Hca, Hna, Paa, Mpp, Hpp alebo Naa; a A1 = peptidická väzba spájajúca acylovú skupinu X s a-aminoskupinou Gin“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 7 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 7 = reduko vaný izostér Leu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 8 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 8 = Tac-NH2) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 36:
Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMÁCIE O SEKV. ID Č. 37:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 1 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 1 =pGlu“) (ix) ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: miscjeature (B) UMIESTNENIE: 9 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: (pozn. „Res 7 = Met-NH2“) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID. Č. 37:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Leu Xaa
5

Claims (15)

1. Bombezínu antagonistický peptid vzorca (I)
X-A'-A^Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-A’-Q (I), kde
X je vodík jednoduchá väzba spájajúca α-aminoskupinu A1 s gammakarboxylovou skupinou na 3-propionylovej skupine A2, ak je A2 Glu [-] alebo skupina vzorca R'CO-, kde R1 je zvolené zo skupín zahrňujúcich
a) vodík, C1.1oalkyl, fenyl, fenyl-C1.10alkyl, p-Hl-fenyl, p-Hl-fenyl-C|.10alkyl, naftyl, naftyl-CMoalkyl, indolyl, indolyl-Ci loalkyl, pyridyl, pyridyl-Ci lcalkyl, tienyl, tienyl-Ci.joalkyl, cyklohexyl alebo cyklohexyl-Ci.i0alkyl, kde Hl je F, Cl, Br, OH, CH3 alebo OCH3.
b) kde R2 je vodík, C|.loalkyl, fenyl alebo fenyl-Ci_10alkyl, R3 je vodík alebo Ci_iOalkyl,
c) R4-O, kde R4 je C1_iOalkyl, fenyl alebo fenyl-Ci_toalkyl·
A1 je zvyšok D-,alebo L -aminokyseliny zvolenej zo skupiny zahrňujúcej Phe, p-Hl-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, nesubstituovaný Trp alebo Trp substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viacerými členmi skupiny zahrňujúcej F, Cl, Br, NH2 alebo Ci_3alkyl, alebo peptidová väzba spájajúca acylovú skupinu R’CO- s a-aminoskupinou A2, pokiaľ X = R*CO;
A2 je Gin, Glu [-], Glu (Y) alebo His, kde [-] je jednoduchá väzba, ak je X jednoduchá väzba a A2 je Glu, pričom toto [-] spája gamma-karboxylovú skupinu 3-propionylovej skupiny tohto zvyšku A2 s a-aminoskupinou A1, Y je
a) -OR5, kde R5 je vodík, Ci.3alkyl alebo fenyl, alebo
b)
R6 kde R6 je vodík alebo C^jalkyl, R7 je vodík, C!.3alkyl alebo -NHCONH2, a
Leu-psí je redukovaná forma Leu, kde namiesto skupiny C=O v Leu je -CH2-, takže väzba tejto skupiny -CH2- s a-aminoskupinou susedného zvyšku A9 je pseudopeptidová,
A9 je Tac, MTac alebo DMTac a
Q je NH2 alebo -OQ1, kde Q1 je vodík, C]_!0 alkyl, fenyl alebo fenyl- Cm0 alkyl, a ich farmaceutický prijateľné kyseliny alebo soli.
2. Peptid podľa nároku 1, kde X je vodík alebo R’CO, kde R je H alebo Ci.10alkyl, A1 je D-Cpa, D-Nal, L- alebo D-Pal, D-Phe, L- alebo D-Tpi alebo D-Trp, A2 je Gin alebo HisaQjeNH2.
3. Peptid podľa nároku 2, kde A9 je Tac.
4. Peptid podľa nároku 2, kde A9 je DMTac.
5. Peptid podľa nároku 3, kde X je H alebo Ac, A1 je D-Phe, L- alebo D-Tpi a A2 je Gin.
6. Peptid podľa nároku 4, kde X je H alebo Ac, A1 je D-Phe, L- alebo D-Tpi a A2 je Gin.
7. Peptid podľa nároku 3, vzorca:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2.
8. Peptid podľa nároku 3, vzorca: D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2.
9. Peptid podľa nároku 4, vzorca: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-DMTac-NH2.
10. Bombezínu antagonistický peptid vzorca (I) X-A’-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-A9-Q (I) kde
X je vodík jednoduchá väzba spájajúca α-aminoskupinu A1 s gammakarboxylovou skupinou na 3-propionylovej skupine A2, ak je A2 Glu [-] alebo skupina vzorca R’CO-, kde R1 je zvolené zo skupín zahrňujúcich
a) vodík, Cj 10alkyl, fenyl, fenyl-C] 10alkyl,
b)
R2
Nkde R2 je vodík, Ci_iOalkyl, fenyl alebo fenyl-Cl_|(lalkyl, R3 je vodík alebo Ci_10alkyl,
c) R4-O, kde R4 je Cuoalkyl, fenyl alebo fenyl-C^joalkyl.
A1 je prirodzene sa nevyskytujúca aminokyselina, zvolená zo skupiny zahrňujúcej L- alebo D-Pal alebo L- alebo D-Tpi,
A2 je Gin, Glu [-], Glu (Y) alebo His, kde [-] je jednoduchá väzba, ak toto X je jednoduchá väzba a A2 je Glu [-], pričom toto [-] spája gamma-karboxylovú skupinu 3-propionylovej skupiny tohto zvyšku A2 s a-aminoskupinou A1,
Y je
a) -OR5, kde R5 je vodík, Ci_3alkyl alebo fenyl, alebo kde R6 je vodík alebo Cb3alkyl a
R7 je vodík, Ci_3a1kyl alebo -NHCONH2, a
Leu-psí je redukovaná forma Leu, kde namiesto skupiny C=O v Leu je -CH2-, takže väzba tejto skupiny -CH2- s α-aminoskupinou susedného zvyšku A9 je pseudopeptidická.
A9 je Cys alebo Pen a
Q je NH2 alebo -OQ1, kde Q1 je vodík, Cmo alkyl, fenyl alebo fenyl- C|.lo alkyl, a ich farmaceutický prijateľné kyseliny alebo soli.
11. Bombezínu antagonistický peptid podľa nároku 1, kde X je R'CO-, A1 je peptidická väzba spájajúca acylovú skupinu R'CO-s α-aminoskupinou A2, A2 je Gin alebo His aQjeNH2.
12. Peptid podľa nároku 11, kde X je Hca, Hna, Paa, Mpp, Hpp alebo Naa A2 je Gin a A9 je Tac.
13. Peptid podľa nároku 12 vzorca Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2.
14. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje polypeptid podľa nároku 1, jeho terapeuticky prijateľnú adičnú soľ alebo komplex a farmaceutický prijateľný kvapalný alebo pevný nosič.
15.Použitie polypeptidu podľa nároku 1, alebo jeho terapeuticky prijateľnej kyseliny, alebo soli, na výrobu liečiva na liečenie rakoviny u cicavcov.
SK1364-94A 1993-03-15 1994-03-07 Bombezínu antagonistický peptid, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie SK282267B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/031,325 US5369094A (en) 1990-11-29 1993-03-15 Polypeptide bombesin antagonists
PCT/US1994/002511 WO1994021674A1 (en) 1993-03-15 1994-03-07 Polypeptide bombesin antagonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK136494A3 SK136494A3 (en) 1995-08-09
SK282267B6 true SK282267B6 (sk) 2001-12-03

Family

ID=21858823

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1364-94A SK282267B6 (sk) 1993-03-15 1994-03-07 Bombezínu antagonistický peptid, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie

Country Status (27)

Country Link
US (1) US5369094A (sk)
EP (1) EP0646127B1 (sk)
JP (1) JP3838656B2 (sk)
KR (1) KR100306506B1 (sk)
AT (1) ATE167874T1 (sk)
AU (1) AU666270B2 (sk)
BR (1) BR9404341A (sk)
CA (1) CA2135787C (sk)
CZ (1) CZ286750B6 (sk)
DE (1) DE69411342T2 (sk)
DK (1) DK0646127T3 (sk)
EE (1) EE03180B1 (sk)
ES (1) ES2120615T3 (sk)
FI (1) FI945378A (sk)
HR (1) HRP940164B1 (sk)
HU (1) HU218288B (sk)
IL (2) IL108851A (sk)
NO (1) NO313418B1 (sk)
NZ (2) NZ299913A (sk)
PL (1) PL180372B1 (sk)
RU (1) RU2114118C1 (sk)
SI (1) SI9420001B (sk)
SK (1) SK282267B6 (sk)
TW (1) TW325478B (sk)
UA (1) UA34456C2 (sk)
WO (1) WO1994021674A1 (sk)
ZA (1) ZA941767B (sk)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5723578A (en) * 1987-09-24 1998-03-03 The Administrators Of Tulane Educational Fund Peptide analogs of bombesin
US5877277A (en) 1987-09-24 1999-03-02 Biomeasure, Inc. Octapeptide bombesin analogs
US5650395A (en) * 1995-03-13 1997-07-22 Hurel; Steven Treatment of pulmonary hypertension
US6989371B1 (en) 1996-08-16 2006-01-24 Dabur Research Foundation Bombesin analogs for treatment of cancer
JP2002506424A (ja) 1997-04-22 2002-02-26 キュレイター オブ ザ ユニバーシィティ オブ ミズーリ ガストリン受容体−親和性ペプチド結合体
IL155814A0 (en) * 2000-11-17 2003-12-23 Warner Lambert Co Treatment of sexual dysfunction using bombesin antagonist
US8420050B2 (en) * 2003-01-13 2013-04-16 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7226577B2 (en) * 2003-01-13 2007-06-05 Bracco Imaging, S. P. A. Gastrin releasing peptide compounds
US7611692B2 (en) 2003-01-13 2009-11-03 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US20060239923A1 (en) * 2003-01-13 2006-10-26 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
ATE435035T1 (de) * 2003-01-13 2009-07-15 Bracco Imaging Spa Verbesserte linker für radiopharmazeutische verbindungen
US7850947B2 (en) 2003-01-13 2010-12-14 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7922998B2 (en) * 2003-01-13 2011-04-12 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
CN1777439A (zh) 2003-04-22 2006-05-24 研究及应用科学协会股份有限公司 生长抑素的载体
US7795385B2 (en) * 2004-12-17 2010-09-14 Bexar Global, Inc. Use of bombesin/gastrin-releasing peptide antagonists for the treatment of inflammatory conditions, acute lung injury and bipolar disorder
FR2918566B1 (fr) * 2007-07-11 2009-10-09 Pierre Fabre Medicament Sa Composition pharmaceutique stable d'un sel hydrosoluble de vinflunine.
EP2100900A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-16 Universitätsspital Basel Bombesin analog peptide antagonist conjugates
EP2198878A1 (en) * 2008-12-18 2010-06-23 University Of Miami Polypeptide bombesin antagonists
AU2010303822A1 (en) 2009-10-07 2012-03-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel TRPA1 antagonists

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2795449B2 (ja) * 1987-09-24 1998-09-10 ジ・アドミニストレーターズ・オブ・ザ・ツーレイン・エデュケイショナル・ファンド 治療用ペプチド
US5162497A (en) * 1987-09-24 1992-11-10 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Bradykinin analogs with non-peptide bond
US5084555A (en) * 1989-08-21 1992-01-28 The Administrators Of The Tulane Educational Fund An octapeptide bombesin analog
AU618029B2 (en) * 1987-11-02 1991-12-12 Imperial Chemical Industries Plc Polypeptide compounds
GB8813356D0 (en) * 1988-06-06 1988-07-13 Ici Plc Polypeptide compounds
GR1000608B (el) * 1988-07-21 1992-08-31 Erba Carlo Spa Μεθοδος για την παρασκευη ανταγωνιστων bombesin.
WO1990003980A1 (en) * 1988-10-14 1990-04-19 Administrators Of The Tulane Educational Fund Therapeutic peptides
US5217955A (en) * 1989-09-15 1993-06-08 Biomeasure, Inc. Treatment of cancer with peptide analog of bombesin, grp, litorin or neuromedin
US5244883A (en) * 1990-11-29 1993-09-14 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Nonapeptide bombesin antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
PL306209A1 (en) 1995-03-06
RU94046091A (ru) 1996-09-27
NO944293D0 (no) 1994-11-10
HUT69727A (en) 1995-09-28
JPH07507330A (ja) 1995-08-10
CZ280794A3 (en) 1995-07-12
JP3838656B2 (ja) 2006-10-25
EP0646127B1 (en) 1998-07-01
TW325478B (en) 1998-01-21
HRP940164A2 (en) 1996-08-31
CA2135787A1 (en) 1994-09-29
KR950701646A (ko) 1995-04-28
EE03180B1 (et) 1999-04-15
IL108851A (en) 2003-05-29
NO313418B1 (no) 2002-09-30
BR9404341A (pt) 1999-08-31
ES2120615T3 (es) 1998-11-01
ATE167874T1 (de) 1998-07-15
SK136494A3 (en) 1995-08-09
DE69411342T2 (de) 1998-11-19
US5369094A (en) 1994-11-29
NO944293L (no) 1995-01-02
UA34456C2 (uk) 2001-03-15
SI9420001A (en) 1995-08-31
IL154995A0 (en) 2003-10-31
AU6444694A (en) 1994-10-11
CA2135787C (en) 2008-08-12
HU218288B (en) 2000-07-28
PL180372B1 (pl) 2001-01-31
AU666270B2 (en) 1996-02-01
EP0646127A1 (en) 1995-04-05
FI945378A0 (fi) 1994-11-15
SI9420001B (sl) 1999-08-31
IL108851A0 (en) 1994-06-24
NZ299913A (en) 2000-07-28
FI945378A (fi) 1994-11-15
DK0646127T3 (da) 1999-04-12
WO1994021674A1 (en) 1994-09-29
ZA941767B (en) 1994-10-06
CZ286750B6 (en) 2000-06-14
KR100306506B1 (ko) 2001-12-01
RU2114118C1 (ru) 1998-06-27
HRP940164B1 (en) 2000-02-29
NZ263668A (en) 1997-06-24
DE69411342D1 (de) 1998-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK282267B6 (sk) Bombezínu antagonistický peptid, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie
EP0559756B1 (en) Nonapeptide bombesin antagonists
WO1994021674A9 (en) Polypeptide bombesin antagonists
RU2248982C9 (ru) Антагонисты lhrh, их получение, фармацевтическая композиция и ее получение, способ лечения опухолей и бесплодия у млекопитающих
JP2004002331A (ja) 肝臓癌の治療
EP2198878A1 (en) Polypeptide bombesin antagonists
JP3040166B2 (ja) ノナペプチドのボンベシン拮抗薬
HRP921277A2 (en) Nonapeptide bombestin antagonists
JPH08253498A (ja) ボンベシン類似体