HU218288B - Bombesin-antagonistic polypeptide derivatives and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Abstract

A találmány (I) általános képletű X-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszi-A9-Q (I) bombezinantagonista peptidekre ésfarmakológiailag elfogadható sóikra vonatkozik. A képletben Xjelentése hidrogénatom vagy R1CO– általános képletű csoport, ahol R1jelentése adott esetben fenilcsoporttal helyettesített 1–4 szénatomosalkilcsoport, A1 jelentése D-Cpa, D-Nal, L- vagy D-Pal, D-Phe, L- vagyD-Tpi, D-Trp, D-pGlu vagy Hca, A2 jelentése Gln, Glu[–], Glu(Y) vagyHis, ahol Y jelentése 1–3 szénatomos alkoxicsoport,[–] jelentése egy,a Glu2 gamma-karboxilcsoportját és az A1 aminosavmaradék alfa-aminocsoportját összekötő kötés, Leu-pszi- jelentése a Leu csoportredukált alakja, amelyben >C=O-csoport helyett –CH2– csoport vanjelen, amely a szomszédos A9 aminosavmaradék alfa-aminocsoportjávalpszeudopeptidkötést képez, A9 jelentése Tac, MTac, DMTac vagy Cys, Qjelentése –NH2 képletű csoport. Az (I) általános képletű vegyületekrosszindulatú daganatos betegségek kezelésére használhatók. ŕ

Description

A találmány új peptidekre vonatkozik, melyek emberekben befolyásolják a rákos daganatok növekedését. Közelebbről, a találmány tárgya bombezinantagonisták, melyek C-terminális helyzetben Tac, MTac vagy DMTac gyököket tartalmazó pszfi ⁹ pszeudopeptidek, azok sói, továbbá gyógyszerkészítmények, valamint ezen peptidek és alkalmazási módszerei.

A találmány olyan polipeptidekre vonatkozik, melyek a bombezin vagy bombezinszerű peptidek (mint a gasztrinfelszabadító peptid [GRP], a Neuromedin C és hasonlók) ellen antagonista tulajdonságokkal rendelkeznek (amelyeket a továbbiakban bombezinantagonista tulajdonságokként említünk), és amelyek hasznosak a meleg vérű szervezetek (például ember) rosszindulatú daganatos betegségeinek kezelésében. A találmány új polipeptidekre, ezen polipeptideket tartalmazó új gyógyszerkészítményekre, s ezen gyógyszerkészítmények melegvérű szervezetekben (például emberben) való alkalmazására (melynek során a készítmény bombezinantagonista hatást fejt ki) vonatkozik.

A bombezin egy tetradekapeptid-amid, amelyet elsőként Bombina bombina bőréből izoláltak (Anastasi, Erspamer és Bucci, Experientia, 27, 166,1971). Ismert, hogy a bombezin az egér Swiss 3T3 fibroblasztsejtek hatásos mitogénje (Rozengurt és Sinnett-Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2936, 1983), és hogy serkenti a tengerimalacok hasnyálmirigy-acinusaiból történő amilázelválasztást (Jensen, Jones, Folkers és Gardner, Natúré, 309, 61, 1984). Szintén ismert, hogy a bombezinszerű peptideket a humán kissejtes tüdőrák (SCLC) sejtek termelik és választják el (Moody, Pert, Gazdar, Camey és Minna, Science, 214, 1246, 1981), továbbá, hogy a kívülről adott bombezinszerű peptidek képesek serkenteni a humán SCLC sejtek in vitro növekedését (Camey, Cuttia, Moody és Minna, Cancer Research, 47, 821, 1987), és hogy a bombezin és GRP C-terminálisára specifikus monoklonális antitest képes gátolni a GRP receptorához történő kötődését, s képes megakadályozni a humán SCLC sejtek in vitro és in vivő növekedését (Cuttita, Camey, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler és Minna, Natúré, 316, 823, 1985).

A bombezinszerű tulajdonságokkal rendelkező GRP egy széles körben forgalmazott, 27 aminosavat tartalmazó peptidamid, amelyet sertésbélből izoláltak (McDonald, Jomvall, Milsson, Vagne, Ghatei, Bloom és Mutt, Biochem, Biophys. Rés. Commun., 90, 227. 1979). E peptid C-terminális aminosavszekvenciája majdnem azonos a bombezin C-terminálisával. A Neuromedin C vagy dekapeptidamid, melynek szerkezete azonos a GRP C-terminális régiójának utolsó tíz aminosavával, s amelyet kutyavékonybélből izoláltak (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke és Shively, J. Bioi. Chem., 258, 5582,1983). A GRP sokféle biológiai reakciót serkent, köztük a gasztrin nagyvérkörben történő felszabadítását, 3T3 egér-fibroblasztsejtekben és a kissejtes tüdőrák (SCLC) sejtekben növekedési faktorként is funkcionál. Emiatt feltételezték, hogy a GRP autokrin növekedési mechanizmuson keresztül közvetlen kórélettani szerepet játszik az SCLC kifejlődésében.

A bombezin, a Neuromedin C és a GRP C-terminális nonapeptidjének szekvenciái a következők:

bombezin: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂;

Neuromedin C: H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-GlyHis-Leu-Met-NH₂;

GRP C-terminális nonapeptidje: Asn-His-Trp-AlaVal-Gly-His-Leu-Met-NH₂.

Az egyéb kétéltű eredetű, bombezinszerű peptidek utáni kutatás egy Pápua Új-Guineából származó békafajból a Litorin (egy nonapeptid: pGlu-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-Leu-Met-NH₂) izolálását eredményezte. Ez a peptid különösen hatásos bombezinanalógnak mutatkozik (Yasukara és munkatársai, Chem. Pharm. Bull., 27, 492, 1979). A bombezinanalógokkal végzett vizsgálatokkal kimutatták, hogy a bombezin 6. aminosavától 14. aminosaváig terjedő, 9 aminosavból álló szakasza rendelkezik a bombezin aktivitásának teljes egészével.

Az utóbbi időben a bombezinantagonisták számos fajtáját leírták. A Substance P (Arg-Pro-Lys-Pro-GlnGln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂), melynek aminosavszekvenciája csekély homológiát mutat a bombezinnel, nem gátolja a bombezin és a bombezinszerű peptidek kötődését, de a több L-aminosavat D-aminosavval helyettesítve módosított Substance P analógokról, mint a (D-Arg¹, D-Pro², D-Trp^{7 9}, Leu^H)Substance P, és a (DArg¹, D-Phe⁵, D-Trp⁷·⁹, Leuⁿ)Substance P (Moody és munkatársai, Fed. Proceedings, 46, 2201, 1987) azt találták, hogy a hasnyálmirigy acinussejtjeiben blokkolják a bombezin elválasztását, és Swiss 3T3 sejtekben gátolják a bombezin növekedést elősegítő hatását. A bombezinből származó bombezinantagonisták két típusáról a (D-Phe⁶, D-Phe¹²)bombezinről és a (Leu¹³-pszz'-Leu¹⁴)bombezinről (Coy és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263, 5056, 1989) kimutatták, hogy a bombezin reakció hatásos in vitro és in vivő inhibitorai.

A bombezinantagonisták másik típusa, melyet Heimbrook és munkatársai (Bio. Chem., 264, 11258, 1989) mutatták ki, az N-acetil-GRP(20-26) és analógjai, melyekben a C-terminális metioningyök deléció miatt hiányzik a GRP(20-27) analógokból. Coy (J. Bioi. Chem. 264, 1989, 25, 14691) beszámolt arról, hogy néhány, a Litorin szekvencián alapuló, rövid láncú bombezinantagonista, mint a (D-Phe⁶, Leu¹³-/«zzPhe¹⁴)-bombezin(6-14) és a (D-Phe⁶, Leu¹³-/wzzLeu¹⁴)-bombezin(6-14) sokkal nagyobb hatást mutatott, mint a megfelelő származási peptidje, a (Leu¹³/wzz'-Leu¹⁴)bombezin.

A GRP és a kétéltű bombezin lineáris (nem ciklikus) bombezinanalógjait, melyek tetszőlegesen tartalmazhatnak CH₂-NH nem peptid kötést, a WO 90/03980 számú PCT szabadalmi leírásban (a rokon analógokat pedig a WO 91/02746 számú leírásban) írták le. Ezek az analógok, melyekről úgy tartják, hogy a természetes bombezinpeptidek inhibitoraiként működnek, az R₁,R₂-A°A¹-A²-Trp-A⁴-A⁵-A⁶-A⁷-A⁸-W képlettel írhatók le, melyben R, és R₂ jelentése hidrogénatom, A° hiányozhat, a többi lehetséges aminosav közül A¹ lehet D-Phe, D-Trp vagy D-Nal; A² jelentése Gin; A⁴ jelentése Alá;

HU 218 288 Β

A⁵ jelentése Val; A⁶ jelentése Gly; A⁷ jelentése His; W pedig a

Rs Z₃ Z₂ O

II II

-N-CH-R4-CH-C-V csoportot jelöli, melyben K, jelentése CH₂NH; bizonyos körülmények között Z, jelentése a leucin azonosító oldallánca, vagyis -CH₂CH(CH₃)₂; Z₂ jelentése a cisztein vagy a metionin azonosító oldallánca, vagyis -CH₂-SH vagy (CH₂)₂-S-CH₃; V jelentése N(R₆)R₇ (melyben R₆, R₇ és R₈ jelentése hidrogénatom); R, és R₂ jelentése hidrogénatom vagy COEj (melyben Ej jelentése 1-20 szénatomos alkilcsoport).

Az EP 0 309 297 számú európai szabadalmi leírásban szintén leírtak bombezin lineáris peptid analógokat. Ezek a peptidek rendelkezhetnek C-terminális Met gyökkel, és a C-terminális és a szomszédos gyök között (CH₂-NH) pszeudopeptidkötéssel.

A találmány tárgya új, hatásos bombezinantagonista polipeptidek, továbbá az említett polipeptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények.

A) Szintetikus peptidek

Részletesebben a találmány (I) általános képletü

X-A¹-A²-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pjzz'-A⁹-Q I bombezinantagonista peptidekre és farmakológiailag elfogadható sóikra vonatkozik. A képletben

X jelentése hidrogénatom vagy R*CO- általános képleté csoport, ahol R' jelentése adott esetben fenilcsoporttal helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoport,

A¹ jelentése D-Cpa, D-Nal, L- vagy D-Pal, D-Phe, Lvagy D-Tpi, D-Trp, D-pGlu vagy Hca,

A² jelentése Gin, Glu[-j, Glu(Y) vagy His, ahol Y jelentése 1-3 szénatomos alkoxicsoport, [-] jelentése egy, a Glu² gamma-karboxilcsoportját és az A¹ aminosavmaradék alfa-aminocsoportját összekötő kötés,

Leu-pszz- jelentése a Leu csoport redukált alakja, amelyben >C=O-csoport helyett -CH₂- csoport van jelen, amely a szomszédos A⁹ aminosavmaradék alfa-aminocsoportjával pszeudopeptidkötést képez,

A⁹ jelentése Tac, MTac, DMTac vagy Cys,

Q jelentése -NH₂ képleté csoport.

Ha A⁹ jelentése Tac, MTac vagy DMTac, az A⁹ helyen öttagú heterociklusos gyűrű van jelen. Ez a gyűrű az I általános képlet szerinti nonapeptid szintézisének bizonyos pontján, rendszerint az A⁹ gyök oldalláncának lehetőleg formaldehiddel vagy acetaldehiddel végzett oxidációjával képződik, miáltal az oldallánc az A⁹ alfaaminocsoportjával gyűrűvé záródik. A kapott, gyűrűvé zárt A⁹ gyök minősége az eredeti, oxidálatlan A⁹ gyök fajtájától és az alkalmazott oxidálószertől függ.

Ilyenformán, ha a Cys⁹ -CH2-SH csoportja a Cys⁹ Leu-pszz pszeudopeptidkötéssel szomszédos alfa-aminocsoportjával formaldehides reakcióval záródik gyűrűvé, a kapott gyűrű a II A képlet szerinti szerkezettel rendelkezik. A II A képlet az I általános képlet szerinti nonapeptid -Leu⁸-pízz'-Tac⁹-NH2 ffagmensét ábrázolja.

A gyűrűs pszeudopeptidek nagyobb biológiai aktivitással rendelkeznek, mint a nem gyűrűsek, melyekben

A⁹ jelentése Cys vagy Pen. Mindazonáltal, az I általános képlet szerinti peptidek bizonyos előnyben részesített megvalósításaiban, ahol A⁹ nem ciklusos, és X, A² és Q jelentése megegyezik a fentebb megadottakkal, A⁹ Cys-t, A¹ pedig természetben nem előforduló aminosavat, L- vagy D-Pal-t, L- vagy D-Tpi-t vagy Hca-t jelöl.

Bizonyos előnyben részesített megvalósítási módokban X jelentése R'CO, R¹ jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport (előnyösen metilcsoport); A¹ jelentése D-Cpa, D-Nal, D-Phe, D- vagy L-Tpi vagy D-Trp; A² jelentése Gin; A⁹ jelentése Tac vagy DMTac; és Q jelentése NH₂.

Ha azonban, más előnyös megvalósítási módokban, A¹ az R*CO csoport acilgyökét az A² alfa-aminocsoportjához kötő peptidkötési jelöl, úgy A² jelentése Gin vagy His; A⁹ jelentése Tac, MTac vagy DMTac, és Q jelentése NH₂-csoport. Ezen peptidek előnyben részesített formájában X jelentése Hca, Hna, Paa, Mpp, Hpp vagy Naa, A² jelentése Gin, A⁹ jelentése pedig Tac.

B) Szintetizálást módszerek

Az I általános képlet szerinti bombezinantagonisták szilárd fázisú szintézissel állíthatók elő. Az egyik eljárás szerint valamennyi aminosavat egymás után a szilárd gyanta (hordozó) fázishoz kötött C-terminális gyökhöz kapcsoljuk. Ha valamennyi amino-acil-gyököt a gyantához kötöttük, a pszeudopeptid öttagú heterociklusos gyűrűjét a C-terminális gyök oldalláncának oxidálószerrel való reakciójával alakítjuk ki. A pszeudopeptidet ezután HF-os kezeléssel távolítjuk el a gyantáról. Ez a reakció az oldalláncok védőcsoportjait is eltávolítja.

Egy másik eljárás szerint az I általános képlet szerinti pszeudopeptidek szilárd vagy folyadék fázisú szintézissel felépített két fragmensként is szintetizálhatók. A C-terminálist tartalmazó tripeptidet egy oligopeptidhez kapcsolva kapjuk a teljes, I általános képlet szerinti bombezinantagonistát.

Az öttagú heterociklusos gyűrűt az A⁹ oldallánc oxidálószerrel való reakciójával alakítjuk ki. A peptidet ezután HF-dal kezeljük, miáltal eltávolítjuk az összes amino-acil-gyök oldalláncának védőcsoportját, és lehasítjuk a peptidet a gyantáról.

C) Gyógyászati alkalmazás

Az I általános képlet szerinti pszeudopeptidek alkalmazhatók gyógyszerkészítményekben emlősök bizonyos rákos és egyéb betegségeinek kezeléséhez, melynek során gyógyszerhordozóban a pszeudopeptid vagy gyógyászatilag megfelelő sójának hatásos mennyiségét adjuk be a páciensnek. Az említett készítmények gyógyszerészetileg megfelelő hordozóban napi 1-1000 pg/testtömegkilogramm mennyiségben adhatók be. Az ilyen készítmények beadhatók parenterálisan, intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, intranazálisan, továbbá aeroszolok és depókészítmények formájában.

Az ábrák leírása

Az 1. ábrán a 7. példa II. táblázatának adatai alapján grafikusan mutatjuk be a bizonyos bombezinantagonistákkal végzett kezelés MXT egéremlőrákra gyakorolt hatását.

A 2. ábrán a 8. példa IV. táblázatának adatai alapján grafikusan mutatjuk be a csupasz egerekben bizonyos

HU 218 288 Β bombezinantagonistákkal végzett kezelés SCLC tumor térfogatára gyakorolt hatását.

A 3. ábrán a 9. példa V. táblázatának adatai alapján grafikusan mutatjuk be a csupasz egerekben bizonyos bombezinantagonistákkal végzett kezelés MIA PACA2 hasnyálmirigytumor térfogatára gyakorolt hatását.

A 4. ábrán a 10. példa VI. táblázatának adatai alapján grafikusan mutatjuk be a csupasz egerekben bizonyos bombezinantagonistákkal végzett kezelés CAPAN-2 hasnyálmirigytumor térfogatára gyakorolt hatását.

A) Szintetikus peptidek

1) Nevezéktan

A találmány leírásában az aminosavak, peptidek és származékaik hagyományos, a peptidkémiában általánosan elfogadott, az IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (European J. Biochem. 138, 9-37,1984) által ajánlott rövidítéseket alkalmazzuk.

Az egyes aminosavak rövidítései az aminosav triviális nevén alapulnak, például, Alá=alanin, Cys=risztéin, Gln=glutamin, Glu=glutaminsav, pGlu=piroglutaminsav, Gly=glicin, His=hisztidin, Leu=leucin, Phe=fenil-alanin, Trp=triptofán és Val=valin. A glutaminsav gamma-karboxil oldallánchoz kapcsolódva tartalmazhat funkcionális csoportokat; ezek a fentebb meghatározott [-] és Y. A Dpa a 2,3-diamino-propionsav rövidítése. Olyan aminosavak esetén, melyek izomer alakokkal rendelkeznek, ha az aminosav rövidítése előtt D vagy DL feltüntetésével másképpen nem jelöljük, a rövidítés az aminosav L alakját jelöli.

A találmányban alkalmazott, nem hagyományos aminosavak rövidítései a következők:

Cpa=para-klór-fenil-alanin;

Dpa=2,3-diamino-propionsav pGlu=piroglutaminsav;

Nal=3-(2-naftil)-alanin;

Pál=3-(3-piridil)-alanin;

Pen=penicillamin;

Tpi=2,3,4,9-tetrahidro-1 H-pirido[3,4-b]indol-3-karbonsav;

Tac=tiazolidin-4-karbonsav;

Mtac=2-metil-tiazolidin-4-karbonsav;

DMT ac=5,5-dimetil-tiazolidin-4-karbonsav.

Az aminosavanalógok rövidítései a következők:

Hca=dezamino-fenil-alanin (vagy hidro-fahéjsav);

Hna=3-hidroxi-2-naftilsav;

Hpp=3-(4-hidroxi-fenil)-propionsav;

Mpp=3-(4-metoxi-fenil)-propionsav;

Naa=naftil-ecetsav;

Paa=fenil-ecetsav.

Egyéb alkalmazott rövidítések:

AC=acilcsoport;

Ac=acetilcsoport;

AcOH=ecetsav;

BH A =benzhidril-amin;

Boc=t-butoxi-karbonil-csoport;

(BOC)₂O=di-(t-butil)-dikarbonát;

Bőm=benzil-oxi-metil-csoport;

But=butilcsoport;

Bzl=benzilcsoport;

B S A=szarvasmarhaszérum-albumin;

DIC = 1,3-diizopropil-karbodiimid;

DMEM=Dulbecco-féle módosított Eagle tápközeg;

DMF=dimetil-formamid;

Et=etilcsoport;

EDTA=etilén-diamin-tetraecetsav;

FCBS=magzati boíjúszérum;

Fmoc=9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoport;

For= formilcsoport;

HITES=RPMI 16 4D tápközeg+10^-8 M hidrokortizon, 5 μΐ/ml szarvasmarha-inzulin, 10 pg/ml humán transzferrin, 10 ⁸ M β-esztradiol és 3 χ 10~⁸ M Na₂SeOs;

HOBt=1-hidroxi-benzotriazol;

HPLC=nagy teljesítményű folyadékkromatográfra; Leu-/Kzz-=a Leu redukált alakja, melyben a Leu

C=O gyöke helyett -CH₂- gyök található, s ezen -CH₂- gyöknek a szomszédos A⁹ gyök alfa-aminocsoportjával képezett kötése pszeudopeptidkötés;

Me=metilcsoport;

MeCN=acetonitril;

MeOH=metil-alkohol;

PBS=foszfátpufferelt sóoldat;

TEA=trietil-amin;

TF A=trifluor-ecetsav.

A peptidszekvenciákat a megszokott módon írjuk le; az N-terminális aminosavat a bal oldalon, a C-terminális aminosavat pedig a jobb oldalon tüntetjük fel. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy a különálló peptidszakaszok aminosavszekvenciájának számozását - ha másképpen nem jelezzük - nem a teljes tetradekapeptid bombezinantagonista megfelelő szakaszának számozása szerint tüntetjük fel. Ha ezt a módszert követelnénk, a találmányban leirt, I képlet szerinti nonapeptid gyökeit 6-tól 14-ig terjedő számozással kellene jelölni, a bombezinantagonista Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu magját pedig A⁸-A⁹-A¹⁰-A^ll-A¹²-A¹³ szerint kellene számozni. A félreértések elkerülése érdekében a bombezinantagonisták gyökeit úgy számozzuk, hogy az Nterminális aminosav (vagy aminosavanalóg) az 1. számú (A¹), az N-terminális aminosav (vagy aminosavanalóg) a 9. számú (A⁹), a köztes aminosavak számozása pedig az N-terminális A¹ gyökkel szomszédos A²-től a C-terminális A⁹ gyökkel szomszédos A⁸-ig terjed.

2) Előnyben részesített megvalósítási módok

Az I általános képlet szerinti (X-A*-A²-Trp-AlaVal-Gly-His-Leu-/«zz-A⁹-Q; melyben X, A¹, A², Leu-p.vzz, A⁹ és Q jelentése megegyezik a fentebb megadottal) bombezinantagonista peptidek előnyben részesítettek.

Ezek a bombezinantagonista pszeudopeptidek az aminosavszekvenciával, különösen az A’, A² és A⁹ gyökökkel, valamint az A⁸ és A⁹ gyökök közötti pszeudopeptidkötés jelenlétével, és tetszés szerint az A⁹ gyökön található, öttagú heterociklusos gyűrűvel jellemezhetők. A gyűrű szerkezetét az A⁹ gyök és az oxidálásához használt vegyület fajtája határozza meg. Ha az A⁹ gyök Cys, és oxidálószerként formaldehidet alkalmazunk, a kialakuló gyűrű a II A képlet szerinti Tac szerkezetének felel meg. A II A képlet az I általános képlet

HU 218 288 Β szerinti peptid Leu⁸-pszi-Tac⁹-Q szakaszát ábrázolja, melyben Q jelentése NH₂.

Ha a ciszteint acetaldehiddel oxidáljuk, a kialakuló, öttagú heterociklusos gyűrű a IIB képlet szerinti MTac szerkezetének felel meg. A II B képlet az I általános képlet szerinti peptid Leu⁸-/wzz'-MTac⁹-Q szakaszát ábrázolja, melyben Q jelentése NH₂.

Ha A⁹ jelentése Pen, és ezt formaldehiddel oxidáljuk, a kialakuló gyűrű a II C képlet szerinti Tac szerkezetének felel meg. A II C képlet az I általános képlet szerinti nonapeptid Leu⁸-p5zz-DMTac⁹-Q szakaszát ábrázolja, melyben Q jelentése NH₂.

Ezekben az előnyben részesített megvalósítási módokban szükséges, hogy X jelentése H vagy Ac, A¹ jelentése D-Phe, A² jelentése Gin, Q jelentése pedig NH₂ legyen.

A találmány szerinti, leginkább előnyben részesített pszeudopeptid bombezinantagonisták az alábbiak :

1. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzTac-NH₂;

2. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-p.vzzTac-NH₂;

3. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-His-Leu-pjzz'-MTac-NH₂;

4. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pjzzTac-NH₂;

5. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzTac-NH₂;

6. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wzzMTac-NH₂;

7. D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzTac-NH₂;

8. Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pózz-Tac-NH₂;

9. D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pízzTac-NH₂;

10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/«zzTac-NH₂;

11. Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzTac-NH₂;

12. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pízzTac-NH₂;

13. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzTac-NH₂;

14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pjzzTac-NH₂;

15. D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psziTac-NH₂;

16. D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-HisLen-pszi-Ύ ac-NH₂;

17. D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzTac-NH₂;

18. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hís-Leu-pjzzDMTac-NH₂;

19. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzDMTac-NH₂;

20. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wzzDMTac-NH₂;

21. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzDMTac-NH₂;

22. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?.szzDMTac-NH₂.

A különösen előnyben részesített bombezinantagonisták a következők:

2. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzTac-NH₂;

13. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wzzTac-NH₂;

18. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzDMTac-NH₂.

B) Szintetizálási eljárások

Az I általános képlet szerinti pszeudopeptidek a peptidkémiában járatos szakember számára ismert technikák bármelyikével előállíthatók. Az alkalmas technikák összefoglalása megtalálható: M. Bodanszky: Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, (1984).

Az I általános képlet szerinti valamennyi pszeudopeptid előállítható a szilárd fázisú szintézis eljárásai szerint. Ezen peptidek és intermedierjeik előállításának különösen előnyös módja a szilárd fázisú szintézis. A szilárd fázisú szintézis módszereit J. M. Stewart és J. D. Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984, 2. kiadás), és G. Bárány és munkatársai (Int. J. Peptide Protein Rés., 30, 705-739, 1987) írták le. Az A⁹ gyök C-terminálisa oxidálásának lépése, mellyel a gyök jellemző oldallánca alfa-aminocsoportjával gyűrűvé zárható, az I általános képlet szerinti peptidek szintézisének több pontján végrehajtható.

Az I általános képlet szerinti bombezinantagonista pszeudopeptidek előállításához legalább két szintetikus eljárás alkalmazható. Az első eljárásban a szilárd gyanta hordozófázishoz kapcsolt A⁹ C-terminális gyökhöz valamennyi gyököt egyenként kapcsoljuk. A második eljárásban a gyantán egy tripeptidet építünk fel, majd ezt a bombezinantagonista kialakítása érdekében a többi aminosavat tartalmazó oligopeptidhez kapcsoljuk. A szintézis mindkét eljárás szerint a C-terminális A⁹ gyökön kezdődik, s az aminosavgyökök hozzáadása az N-terminális gyök felé haladva történik.

1/a) Első eljárás

A pszeudopeptidek szilárd fázisú szintéziséhez alkalmazott gyanta hordozófázis benzhidril-amin (BHA) gyanta vagy 1%-ban divinil-benzollal keresztkötött, klórmetilezett polisztiréngyanta lehet, melyek mindegyike beszerezhető a kereskedelemben. A C-terminális A⁹ gyököt karboxilcsoportján keresztül kötjük a gyantához. Két ilyen aminosavgyök egymás közötti reakcióját úgy akadályozzuk meg, hogy a gyantához való kapcsolás előtt valamennyi A⁹ gyök alfa-aminocsoportját védőcsoporttal látjuk el. Az A⁹ gyök és valamennyi utána kapcsolt aminosavgyök alfa-aminocsoportjának védőcsoportja a 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil- (Fmoc) vagy a t-butoxi-karbonil-csoport (Boc) lehet. A C-terminális A⁹-től az A²-ig terjedő gyökök összekapcsolását illetően az Fmoc az előnyben részesített, mivel a Boc védőcsoportot eltávolító reakció a Cterminális A⁹ gyök oldallánc-védőcsoportját is eltávolítja. Az összekapcsolási reakciók során az egyes aminosavgyökök jellemző oldalláncú funkciós csoportjai is védhetők a nem kívánt kémiai reakcióktól, oly módon, hogy azokat az összekapcsolási reakciót megelőzően

HU 218 288 Β védőcsoporttal (az A⁹ esetében alkalmasan butilcsoporttal) látjuk el.

Miután a C-terminális Fmoc-A⁹(But) gyököt a hordozófázishoz kapcsoltuk, alfa-aminocsoportjáról eltávolítjuk a védőcsoportot, és Fmoc-Leu-CHO gyököt kapcsolunk hozzá, s ezáltal pszeudopeptidkötést alakítunk ki.

A további aminosavgyököket, az alkalmasan Fmoc csoporttal védett A⁵, A⁴, A³ és A² gyököt, és az alkalmasan Boc csoporttal védett A¹ gyököt a kívánt pszeudopeptid kialakításához fordított sorrendben (A⁷, A⁸ stb.) kapcsoljuk egymás után.

Ha a pszeudopeptidben His vagy Glu van jelen, ezek oldalláncai az összekapcsolásuk vagy más gyökök összekapcsolása során nem kívánt kémiai reakciókkal támadhatók. Emiatt az aminosavak összekapcsolása előtt az ilyen oldalláncokhoz kémiai védőcsoportok kapcsolhatók.

Ha valamennyi aminosavgyököt a BHA gyantához kapcsoltuk, a pszeudopeptid N-terminálisán lévő Boc védőcsoportot eltávolítjuk. A Tac, MTac vagy DMTac öttagú, heterociklusos gyűrűt a Cys -CH₂-SH [vagy a Pen -C(CH₃)₂SH] oldalláncának, és az A⁸ és A⁹ gyököket összekapcsoló redukált kötés szekunder aminjának (vagyis az A⁹ alfa-aminocsoportjának) oxidálószerrel (mint a formaldehid vagy az acetaldehid) végzett reakciójával alakítjuk ki. Az intermedier pszeudopeptidet, amely még oldallánc-védőcsoportokkal van ellátva, a hordozófázisról való lehasítás és az oldallánc-védőcsoportok eltávolítása érdekében HF-dal kezeljük.

1/b) Második eljárás

A második eljárásban a BHA gyantán szilárd fázisú szintézissel védett tripeptidet alakítunk ki [Boc-His(Bom)⁷-Leu⁸-p.szz-Cys(But)⁹-BH A gyanta].

A Boc¹ és a butilcsoportot eltávolítjuk, és a Cys -CH2-SH oldalláncát az A⁸ és A⁹ gyököket összekapcsoló redukált kötés szekunder aminjával gyűrűvé zárjuk, miáltal a His(Bom)⁷-Leu⁸-p.vzz-Tac⁹-BHA gyantát kapjuk. HF-os kezelés után a His⁷-Leu⁸-pszz'-Tac⁹-NH2 szabad tripeptidet kapjuk. Szilárd fázisú szintézis standard módszereivel Gly-OCH₂ gyantán Boc-A*-A²-TrpAla-Val-Gly-OCH2 gyantát alakítunk ki, majd ezt - a Boc-oligopeptid lehasítása érdekében - 12 órán keresztül 1%-os KCN-ot tartalmazó, 95%-os metanolban kezeljük. Miután mindkét peptidszakaszt előállítottuk, a Bocoligopeptidet BOP reagenssel a szabad His⁷-Leu⁸-/wzzTac⁹-NH2 tripeptidhez kapcsoljuk, majd a Boc csoportot a kívánt peptid előállítása érdekében eltávolítjuk.

Az I képlet szerinti bombezinantagonísták szintézisének részletes ismertetése előtt a fenti eljárások egyikében vagy mindegyikében általános szintetikus műveleteket írunk le.

2) A polipeptidszintézis általános műveletei

1. művelet: bizonyos szintetikus gyökök és reaktánsok kialakítása

a) L- és D-Tpi: 2,04 g (10 mM) L-Trp-t 25 ml, 2,1 g citromsavat tartalmazó, fonásban levő vízben oldunk, majd 0,5 ml 40%-os vizes formaldehidet hozzáadva azonnal szilárd anyag kezd kialakulni. Az elegyet jeges fürdőben lehűtjük, a kicsapódott anyagot összegyűjtjük, hideg vízzel és levegővel mossuk, majd szobahőmérsékleten szárítjuk, miáltal 2,14 g (99%) szilárd anyagot kapunk, melynek olvadáspontja (lebomlással) 310 °C. A D-izomert hasonló módon D-Trp-ból kiindulva állítjuk elő. A D-izomer olvadáspontja (lebomlással) szintén körülbelül 310 °C.

b) L- és D-Boc-Tpi: 10,8 g (50 mM) D-Tpi 250 ml 0,2 N NaOH-oldatban és 7,5 ml trietil-aminban kevert szuszpenziójához 10 g di-t-butil-dikarbonátot adunk, az elegyet 4 órán keresztül keveqük, majd újabb 10 g dikarbonátot, s további 3 órás keverés után újabb 10 g dikarbonátot adunk hozzá. Az elegyet egy éjszakán keresztül keverjük, és éterrel (2 χ 100 ml) extraháljuk, melyet eltávolítunk. A vizes fázishoz pH=3-5 eléréséig citromsavat adunk, a szilárd anyagot összegyűjtjük, és levegőn egy éjszakán keresztül szárítjuk.

A szilárd anyagot 100 ml tetrahidrofuránban szuszpendáljuk, melyben majdnem az összes anyag feloldódik. Az oldhatatlan anyagot szűréssel, a THF-et pedig vákuum alatt távolítjuk el. A maradékot éterrel trituráljuk, miáltal 9,20 g (58%) terméket kapunk. A termék olvadáspontja azonos a kiindulási anyaggal, de oldékonysága és szilikagélen 85:15:0,5 arányú ChCl₃: MeOH: HOAc eleggyel végzett vékonyréteg-kromatográfiás jellemzői különböznek attól.

2,55 g L-Tpi-ból kiindulva a fenti eljárással 2,22 g (59%) Boc-Tpi-t kapunk.

c) Fmoc-Leu-CHO: Fmoc-leucin-metil-észtert (35 g, 134 mmol) vízmentes toluolban (250 ml) N₂ alatt szárazjég/aceton eleggyel hűtünk, és 30 percen keresztül, toluolban 150 ml 25%-os diizobutil-alumínium-hidridet adunk hozzá. Az elegyet ezután 20 percig szárazjég/aceton fürdőben keverjük, majd óvatosan 15 ml metanolt adunk hozzá. Az elegyet 1000 ml jéghideg vízbe öntjük, rázatjuk és szűrjük. A toluolt elválasztjuk, a vizes fázist pedig éterrel újraextraháljuk (3x300 ml). A toluolos és éteres extraktumokat összekeverjük, és nátrium-szulfáton szárítjuk. A kapott olajat szilikagéloszlopon (3x50 cm) 1500 ml 15%-os EtOAc/benzin elegyben gyorsan átengedjük. Az Fmoc-Leu-CHO-t szilárd anyagként kapjuk (27,6 g).

d) Szintetikus aminosavak vagy aminosavanalógok, melyeket a bombezinantagonista pszeudopeptidekbe építünk, általában kereskedelmi forrásokból beszerezhetők. A Hca az Aldrich Co.-től (1001 St. Paul Avenue, Milwaukee, WI 53233) szerezhető be. A Boc vagy Fmoc védőcsoporttal ellátott aminosavak az Advenced ChemTech-től (5609 Fém Valley Road, Louisville, K.Y 40228) vagy a Bachem Califomiától (3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505) vásárolhatók meg.

2. művelet: a hordozógyanta előkészítése és az A⁹ gyök hozzáadása

A BHA gyantát diklór-metánban f 0%-os trietil-aminnal kétszer három percig végzett kezeléssel (semlegesítés) készítjük elő, majd diklór-metánnal hatszor mossuk. Az Fmoc-A⁹(But) gyököt úgy kapcsoljuk a gyantához, hogy DMF-ben 1,35 mmol Fmoc-A⁹(But) gyököt és 1,50 mmol 1-hidroxi-benzotriazolt adunk hozzá, és három percig elegyítjük. Az elegyhez diklór-metánban 20%-os 1,3-diizopropil-karbodiimidet (DIC) (1,3 mmol)

HU 218 288 Β adunk, majd szobahőmérsékleten 60 percig rázatjuk. A kapott Fmoc-A⁹(But)-BHA gyantát diklór-metánban kétszer, metanolban kétszer, majd ismét diklór-metánban háromszor mossuk, és Kaiser-tesztnek (Anal. Biochem., 34, 595, 1970) vetjük alá. Nem tökéletes kapcsolódás esetén az eljárást megismételjük.

3. művelet: pszeudopeptidkötés kialakítása

Az A⁹ aminosav Fmoc védőcsoportjának eltávolítását DMF-ben 50%-os piperidin hozzáadásával és 30 percig végzett elegyítéssel; DMF-ben végzett (6x1 perc) mosással; majd i) 1%-os AcOH-t tartalmazó DMF-ben Fmoc-Leu-CHO (3 egyenérték) hozzáadásával, és ii) DMF-ben NaBH₃CN (3,5 egyenérték) hozzáadásával és 60 percig végzett rázással hajtjuk végre. Ezután 50%-os metanollal (3x1 perc), 100%-os metanollal (3x1 perc) és DMF-fel (3x1 perc) mosást végzünk.

4. művelet: az aminosavak összekapcsolása és a peptidkötések kialakítása

Az A⁹ gyök és valamennyi következő aminosavgyök alfa-aminocsoportjának védőcsoportja 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil- (Fmoc) vagy t-butoxi-karbonilcsoport (Boc) lehet. Az A⁹ gyök N-terminális aminosavval közvetlenül szomszédos aminosavon keresztül történő kapcsolása esetén az Fmoc védőcsoport az előnyben részesített, mivel a Boc védőcsoportot eltávolító reakció az A⁹ gyök oldallánc-védócsoportját is eltávolítja.

A) Fmoc-aminosav alkalmazása

Az alábbi lépéseket Fmoc-aminosav Fmoc-intermedier peptidbe való beépítéséhez alkalmazzuk.

1) Az Fmoc-intermedier peptidről eltávolítjuk a védőcsoportot, és semlegesítjük, majd diklór-metánnal (3x1 perc) és DMF-fel (3x1 perc) mossuk.

2) Az Fmoc-aminosavat i) DMF-ben Fmoc-aminosav (3 egyenérték) és HOBt (3,3 egyenérték) intermedier peptidhez való hozzáadásával; és ii) 3 egyenérték DIC (diklór-metánban 20%-os oldatként) hozzáadásával, és az elegy 90 perces rázatásával kapcsoljuk a védőcsoport nélküli intermedier peptidhez.

3) Az elegyet ezután etanollal (3x1 perc) és DMFfel (3x1 perc) mossuk.

További gyökök kapcsolása érdekében az utolsónak kapcsolt Fmoc-aminosavról DMF-ben 50%-os piperidinnel 30 percig kezelve eltávolítjuk a védőcsoportot, és DMF-ben (6x1 perc) mossuk. Az újabb aminosavak kapcsolását a 2) lépés szerint végezzük.

Valahányszor egy újabb aminosavat kapcsolunk a gyantához vagy a peptidhez, Kaiser-tesztet végzünk. Nem tökéletes kapcsolódás esetén a reakciót megismételjük.

Fmoc-Gly és Fmoc-Gln kapcsolása esetén e művelet 2) lépését az alábbiak szerint módosítjuk: Fmocaminosav (3 egyenérték) és HOBt (3,3 egyenérték) DMF-ben készített oldatához 0 °C-on 15 percig, majd szobahőmérsékleten újabb 15 percig 3 egyenérték DICet (diklór-metánban 20%-os oldatként) adtunk. A reakcióelegyet a peptid-gyantához adjuk, Fmoc-Gly esetén 1 óráig, Fmoc-Gln esetén 2 óráig rázatjuk.

B) Boc-aminosav alkalmazása

Az alábbi lépéseket Boc-aminosav Fmoc-intermedier peptidbe való beépítéséhez alkalmazzuk.

1) A Boc védőcsoportot diklór-metánban 50%-os TFA-val eltávolítjuk;

2) az elegyhez diklór-metánban 5% merkapto-etanolt és 5% anizolt tartalmazó 50%-os TFA-t adunk; és

3) az elegyet diklór-metánnal 2x1 percig, metanollal 2 χ 1 percig és DMF-fel 3x1 percig mossuk.

4) A Boc-aminosavat DMF-ben 3 egyenérték Bocaminosav és 3,3 egyenérték HOBt egymáshoz adásával és 3 perces elegyítésével kapcsoljuk a peptidhez, majd az elegyhez diklór-metánban 3 egyenérték 20%-os diizopropil-karbodiimidet adunk, és 90 percig rázatjuk. A reakcióelegyet metanollal 3x1 percig, majd diklórmetánnal 3x1 percig mossuk.

5) A Boc védőcsoportot a 4) lépés termékének diklór-metánban 5% merkapto-etanolt, illetve 5% anizolt tartalmazó 50%-os TFA-val végzett mosásával (5, illetve 25 percig) távolítjuk el. Ezután a peptidet diklórmetánban (2x1 perc), metanolban (2x1 perc) és DMFben (3x1 perc) mossuk.

Nem szabad elfelejteni, hogy a Boc védőcsoport eltávolítása az A⁹ oldallánchoz kapcsolt Bút védőcsoportot is eltávolítja, így a Boc csoportot rendszerint csak közvetlenül az A⁹ gyök gyűrűvé zárása előtt távolítjuk el.

5. művelet: öttagú heterociklusos gyűrű kialakítása

A II A képlet szerinti gyűrűs szerkezetet úgy alakítjuk ki, hogy a védőcsoport nélküli Cys⁹ gyökkel rendelkező intermedier peptidet 50%-os AcOH, 3,7%-os HCHO és DMF 1:1:8 arányú elegyében, szobahőmérsékleten 3 percig rázatjuk, majd leszűrjük. A terméket DMF-fel, metanollal és diklór-metánnal (mindegyikkel háromszor) mossuk.

A II B képlet szerinti gyűrűs szerkezetet úgy alakítjuk ki, hogy a védőcsoport nélküli Cys⁹ gyökkel rendelkező intermedier peptidet 50%-os AcOH, 10%-os CH₃CHO és DMF 1:1:8 arányú elegyében, szobahőmérsékleten 10 percig rázatjuk, majd leszűrjük. A terméket DMF-fel, metanollal és diklór-metánnal (mindegyikkel háromszor) mossuk.

A II C képlet szerinti gyűrűs szerkezetet úgy alakítjuk ki, hogy a védőcsoport nélküli Pen⁹ gyökkel rendelkező intermedier peptidet 50%-os AcOH, 3,7%-os HCHO és DMF 1:18 arányú elegyében, szobahőmérsékleten 10 percig rázatjuk, majd leszűrjük. A terméket DMF-fel, metanollal és diklór-metánnal (mindegyikkel háromszor) mossuk.

6. művelet: a peptid leválasztása a gyantáról

Miután valamennyi kívánt aminosavat összekapcsoltuk, a polipeptid hordozó fázisról való lehasítása érdekében az intermedier peptidet anizol jelenlétében folyékony HF-dal kezeljük. Ez a reakció az oldalláncok védőcsoportjait is eltávolítja. Ha BHA gyantát alkalmazunk, a kapott intermedier pepiidben Q=NH₂.

Amennyiben X jelentése nem hidrogén, az X csoportot úgy visszük az N-terminálisra, hogy X csoporttal rendelkező aminosavat építünk be (például Ac-D-Phe-t), vagy az intermedier pszeudopeptid N-terminális A¹ gyökének védőcsoport nélküli alfa-aminocsoportját megfelelő reagenssel reagáltatjuk. Ennek megfelelően, amint eltávolítjuk a teljes peptidet a gyanta hordozófázisról,

HU 218 288 Β alkalmas módon KOCN-dal reagáltathatuk, hogy X csoportként NH₂CO-csoportot kapjunk.

7. művelet: a peptidek tisztítása

Az I általános képlet szerinti pszeudopeptideket általában reveiz fázisú oszlopon, Rainin HPLC System (Rainin Inc., Co., Wobum, MA) (amely három Rainin Rabbit HP HPLC szivattyút tartalmaz, és Apple Macintosh Plus számítógép, Rheodyne Injector és változtatható hullámhosszúságú Knauer Model 87 UV-monitor szabályozása alatt áll) alkalmazásával nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával tisztítjuk (HPLC). A nyerspeptidet (10-40 mg) gömbölyű C₁₈ szilikagéllel (pórusméret: 300 A; részecskeméret: 12 pm) (Rainin Inc. Co.) feltöltött Dynamax Macro oszlopra (21,2x250 mm) visszük, és 70%-os vizes acetonitrilben 0,1%-os TFA-t (A) és 1%-os TFA-t (B) tartalmazó oldószerrendszer alkalmazásával lineáris gradienssel, 2,0 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. Valamennyi frakció tisztaságát és retencióidejét az alábbiakban leírt analitikai HPLC-vel értékeljük.

A nyers és tisztított peptid minőségét és elúciós jellemzőit 220 és 280 nm-nél diódasoros detektorral és reverz fázisú, 4,6x250 mm-es W porex C₁₈ oszloppal (pórusméret: 300A; részecskeméret: 5 pm) ellátott Hewlett-Packard Model 1090 folyadékromatográf alkalmazásával analitikai HPLC-vel állapítjuk meg. Az A és B oldószerrendszer átfolyási sebességét 1,2 ml/perc értéken tartjuk, és az elválasztásokat szobahőmérsékleten végezzük.

Az esetek többségében a bombezinantagonista pszeudopeptideket ugyanazon oszlopon, a gradiensfeltételek csekély módosításával végzett ismételt kromatografálással tovább tisztítottuk. A tisztított peptidek homogenitását az analitikai HPLC alapján 97%-osnál nagyobbnak találtuk.

Ha szükséges, az I általános képlet szerinti pszeudopeptidek aminosavanalízisét lezárt, vákuumos csövekben 0,2% 3-(2-amino-etil)-indolt tartalmazó 4 M metánszulfonsavval 110 °C-on 20 órán keresztül hidrolizált mintákkal, Beckmann 6300 aminosavanalizátor alkalmazásával végezhetjük el.

C) Szintetikus intermedierek

1. Oldallánc-védőcsoportok

A szilárd fázisú peptidszintézis során általános a különböző aminosavak és peptidszakaszok reaktív oldallánc funkciós csoportjainak védése. Ezeket az oldallánc funkciós csoportokat a nemkívánatos kémiai reakciók elkerülése érdekében védjük. Ennek megfelelően általános, hogy olyan intermedier peptidet állítunk elő, amelynek valamennyi amino-acil-gyöke a kívánt sorrendben helyezkedik el, s amelyben a megfelelő gyökökhöz oldallánc-védőcsoportok kapcsolódnak.

A peptidek szintéziséhez egy adott oldallánc-védőcsoport kiválasztása esetén általában az alábbi szabályokat követjük:

a) a védőcsoport az összekapcsolás körülményei között lehetőleg tartsa meg védő tulajdonságait;

b) a védőcsoportnak az összekapcsoláshoz használt reagensekkel szemben ellenállónak kell lennie, és a szintézis valamennyi lépésében az alfa-amino-védőcsoport eltávolításához kiválasztott kapcsolási reakciófeltételek mellett lehetőleg stabilnak kell lennie;

c) a kívánt aminosavszekvencia szintézisének befejezése után az oldallánc-védőcsoportnak - a peptidláncot károsan nem befolyásoló reakciófeltételek mellett - eltávolíthatónak kell lennie.

Az oldallánc-védőcsoportokat a tudományban jól ismert módon kapcsoljuk az aminosavgyökökhöz. A His esetén alkalmas védőcsoport a Bőm-, Glu és Cys esetén pedig a But-csoport.

2) Szintetikus intermedierek

A találmány tárgyát képezik a szintézis alábbi szakaszainak intermedier peptidjei is. (Három szakaszban a

2. peptid intermedier peptidjeit mutatjuk be.)

A szakasz: valamennyi aminosav és a gyanta összekapcsolását követően: Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-ValGly-His(Bom)-Leu-pszí-Cy(But)-BHA gyanta („1/02/A”);

B szakasz: az N-terminális Boc védőcsoport eltávolítását követően: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?.?zz-Cys-BHA gyanta („1/02/B”);

C szakasz: az A⁹ gyök gyűrűvé zárását követően: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/«zz-TacBHA gyanta („1/02/C”).

Egy további szakaszt, a D-t a 2. példában a 17. számú peptid szintézisénél mutatunk be. A D szakasz intermediere már le van hasítva a gyantáról, de még nincs meg az A'-et az A²-höz kötő egyszeres X kötése.

Gyógyászai/ alkalmazások

A bombezinantagonisták hasznosak a hipergasztrinémiás állapotok, például vészes vérszegénység, krónikus atrófíás gyomorhurut, Zollinger-Ellison-szindróma, vitiligo, melyek a gyomor enterokromaffmszerű sejtjeinek hiperpláziájával (túlburjánzásával), és többgócú rákos gyomordaganatok kifejlődésének fokozott valószínűségével állnak kapcsolatban. Az enterokromaffinszerü sejtek hiperpláziája a hipergasztrinémiás állatokban könnyen kialakul.

A bombezinantagonistákkal végzett kezelés a jelenlegi gyógyszerek alkalmazásánál előnyösebb, mivel a H₂-antagonisták, mint a cimetidin, emberben hipergasztrinémiát okoz, és rákos daganatok kialakulásához vezethet. Ráadásul a H₂-antagonistával végzett kezelés felfüggesztése a létező hipergasztrinémia miatt azonnal fekélyek kiújulását eredményezi.

Mivel a találmány szerinti vegyületek a bombezin/GRP receptorok antagonistái, felhasználhatók tüdőrák, vastagbélrák és gyomorrák kezeléséhez.

A találmány I általános képlet szerinti bombezinantagonistái gyógyszerészetileg megfelelő, nem toxikus savak és sók, például savhozzáadásos sók formájában adhatók be. Az ilyen savhozzáadásos sók jellemző példái a hidrokloridok, hidrobromidok, szulfátok, foszfátok, fumarátok, glukonátok, tárnátok, maleátok, acetátok, cifrátok, benzoátok, szukcinátok, alginátok, pamoátok, malátok, aszkorbátok, tartarátok és hasonlók.

Ezek a gyógyszerkészítmények az I általános képlet szerinti pszeudopeptideket hagyományos, gyógyszerészetíleg megfelelő hordozóval, például fiziológiás sóoldattal együtt tartalmazzák. A tudományban ismert egyéb hordozók is alkalmazhatók.

HU 218 288 Β

Ezekkel a gyógyszerkészítményekkel a betegek kezelése hasonló módon végezhető, mint az LHRH más agonistáival és antagonistáival, illetve a szomatosztatin analógjaival végzett kezelés. Ilyenformán, az I általános képlet szerinti bombezinantagonisták beadhatók intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, intranazálisan, aeroszol vagy biológiailag lebontható, alkalmas polimerből készített raktározókészítmény (például mikrokapszulák, mikrogranulumok vagy hengeres, rúdszerű implantátumok) formájában. Más, fentiekkel egyenértékű beadási módok szintén a találmány tárgyát képezik; ilyenek a folyamatos cseppinfuziós pumpák, időzített kibocsátású készítmények (mikrokapszulák) és hasonlók.

Az I általános képlet szerinti peptidek hatásos adagolása a beadás módjától és a kezelt emlős fajától függően változik. Parenterális alkalmazás esetén a peptid adagolása a beteg testtömegkilogrammjaira vonatkoztatva napi 1 pgtól napi 1000 pg-ig teljed. Ez az adagolási tartomány csupán előnyben részesített, s megfelelő körülmények között magasabb dózisok is választhatók. A peptidet tartalmazó fiziológiai sóoldat is alkalmazható, testtömegkilogrammra vonatkoztatva napi 0,01 mg-tól 0,20 mg-ig teijedő adagolásban (kivéve a raktározókészítményeket, melyeknél az injektált mennyiséget úgy kell kiszámítani, hogy körülbelül 15-30 napig vagy még tovább tartson).

Az alábbi példákban a szintézis bizonyos szakaszaiban az intermedier peptidek azonosítására három jelzésből álló kódot használunk. Az „1/01A” kóddal jelölt peptid az 1. példában előállított „01” számú peptid intermedier peptidje, melyet a szintézis „A” szakaszában állítunk elő. Hasonlóan, a „2/08/B” és „4/19/C” jelzésű peptid a 2., illetve 4. példában előállított „08.”, illetve „19.” számú peptid intermedier peptidje, amelyet a szintézis B, illetve C szakaszában állítunk elő.

1. példa

1. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszíTac-NH₂;

2. D-Phe-Gln-Trp-Alá-Val-Gly-H is-Leu-ywzz-TacNH₂;

4. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/«zzTac- NH₂;

5. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wzz'-TacNH₂;

7. D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/).yzz'-TacNH₂;

8. Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszf-TacNH₂;

9. D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pizz-TacNH₂;

10. D-Trp-Gln-Tip-Ala-Val-Gly-His-Leu-pjzz-TacNH₂;

11. Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/zízzTac- NH₂;

12. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszz-TacNH₂;

13. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszz-TacNH₂;

14. Hca-Gln-Trp-Alá-Val-Gly-His-Leu-pszz-TacNH₂.

Ezek a peptidek alkalmas módon az 1-1 közös intermedierből [Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p.S'zzCys(But)-BHA gyanta] szintetizálhatok, az alábbi eljárás szerint.

Az Fmoc-Leu-/«zz-Cys(But)-BHA gyantát (0,55 mmol NH₂/g) TEA 20 ml, 10%-os diklór-metános oldatával kétszer három percig végzett kezeléssel (semlegesítés) készítünk elő, és hatszor 20 ml diklór-metánnal mossuk, majd három percig DMF-ben 3,3 mmol FmocCys(But)-tal és 3,6 mmol HOBt-vel elegyítjük. Az elegyhez 3 egyenérték DIC-et (diklór-metánban 20%-os oldatként) adunk, majd szobahőmérsékleten 90 percig rázatjuk. A kapott Fmoc-Cys(But)-BHA gyantát diklór-metánnal kétszer, metanollal kétszer, majd diklór-metánnal háromszor mossuk, és Kaiser-teszttel vizsgáljuk.

A pszeudopeptidkötés kialakításához az Fmoc-LeuCHO kapcsolását az alábbiak szerint végezzük. Az A⁹ gyökről az Fmoc védőcsoportot piperidin 15 ml, 50%-os DMF-es oldatának hozzáadásával és 30 percig tartó elegyítéssel, majd 15 ml DMF-fel 6x1 percig végzett mosással távolítjuk el. Ezután a gyantához 1%-os AcOH-t tartalmazó DMF-ben 3,3 mmol Fmoc-LeuCHO (3 egyenérték), majd DMF-ben NaBHjCN-t (3,5 mmol) adunk, s az elegyet egy órán keresztül rázatjuk. Ezután a gyantához kapcsolt aminosavakat 15 ml 50%-os metanollal (3x1 perc), 15 ml 100%-os metanollal (3x1 perc) és 15 ml DMF-fel (3x1 perc) mossuk.

Az Fmoc-Leu-/wzz-Cys(But)-BHA gyantáról az Fmoc védőcsoportot a 4/A művelet szerint távolítottuk el.

Miután az FmocLeu-p.vzz-Cys(But)-BHA gyantáról eltávolítottuk az Fmoc védőcsoportot, és semlegesítettük, az Fmoc-His-(Bom) kapcsolását a 4/A műveletben leírtak szerint végezzük.

Az Fmoc-Gly kapcsolását a 4. művelet szerint hajtjuk végre. 3,3 mmol Fmoc-Gly és 3,6 mmol HOBt DMF-es oldatához 0 °C-on diklór-metánban készített 20%-os 1,3 diizopropil-karbodiimid (3,3 mmol) oldatot adunk, az elegyet hűtés közben 15 percig, majd szobahőmérsékleten további 15 percig rázatjuk, a csapadékot leszűrjük és a gyantához adjuk, majd 60 percig rázatjuk. A következő aminosavakat (Fmoc-Val, Fmoc-Ala és Fmoc-Trp) egymás után, hasonló módon kapcsoljuk a pepiidhez, miáltal az 1-1 intermedier peptid [FmocTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wzz-Cys(But)-BHA gyanta szerkezetű védett peptides gyanta] 3,80 g-ját kapjuk.

Az 1-1 intermedier pepiidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-pGlu-t egymás után kapcsolva a Boc-D-pGluGln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-pszz'-Cys(But)BHA gyantát („1/01/A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier pepiidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-Phe-t egymás után kapcsolva a Boc-D-Phe-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wzz'-Cys(But)-BHA gyantát („1/02/A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier pepdidhez az Fmoc-Gln-t és az Ac-D-Phe-t egymás után kapcsolva az Ac-D-PheGln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wzz'-Cys(But)BHA gyantát („1/04/A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-Cpa-t egymás után kapcsolva a Boc-D-Cpa9

HU 218 288 Β

Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?szz'-Cys(But)BHA gyantát („1/05/A”) kapjuk.

Az 1-1-intermedier pepiidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-Nal-t egymás után kapcsolva a Boc-D-Nal-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wzz-Cys(But)-BHA gyantát („1/07/A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-Pal-t egymás után kapcsolva a Boc-Pal-Gln-Tip-AlaVal-Gly-His(Bom)-Leu-/«zz-Cys(But)-BHA gyantát („1/08/A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-Pal-t egymás után kapcsolva a Boc-D-Pal-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wzz-Cys(But)-BHA gyantát („1/09/A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-Trp-t egymás után kapcsolva a Boc-D-Tip-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-pszz'-Cys(But)-BHA gyantát („1/10/A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és az Ac-D-Trp-t egymás után kapcsolva az Ac-D-Trp-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/«zz'-Cys(But)-BHA gyantát („1/11/A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-Tpi-t egymás után kapcsolva a Boc-Tpi-Gln-TrpAla-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wzz'-Cys(But)-BHA gyantát („1/12/A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-Tpi-t egymás után kapcsolva a Boc-D-Tpi-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/>Jzz'-Cys(But)-BHA gyantát („1/13A”) kapjuk.

Az 1-1 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Hca-t egymás után kapcsolva a Hca-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His(Bom)-Leu-pszz'-Cys(But)-BHA gyantát („1/14/A”) kapjuk.

Az 1/01/A intermedier peptid N-tenninális Boc védőcsoportját diklór-metánban 5% merkapto-etanolt és 5% anizolt tartalmazó 50%-os TFA oldattal végzett kezeléssel (először 5, majd 25 percig) távolítjuk el. Az intermedier peptidet ezután kétszer egy percig diklór-metánnal, kétszer egy percig metanollal, és háromszor egy percig DMF-fel mossuk. Ezzel a kezeléssel a Cys-ről is eltávolítjuk a Bút védőcsoportot, miáltal a D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-GlyHis(Bom)-Leu-p.vzz'-Cys-BHA gyanta intermedier peptidet („1/01/B”) kapjuk, melyet diklór-metánnal, metanollal és DMF-fel (mindegyikkel háromszor egy percig) mosunk.

Ennél a pontnál az 1/01/B intermedier peptid Cys gyökének oldalláncát a II A képleten bemutatott öttagú heterociklusos gyűrű kialakítása érdekében az 5. művelet szerint oxidációval gyűrűvé zárjuk. A peptidhez AcOH, 3,7%-os HCHO és DMF (1:1:8) elegyének 10 ml-ét adjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3 percig rázatjuk, vízzel, DMF-fel és diklór-metánnal (mindegyikkel háromszor) mossuk, miáltal az 1/01/C intermedier peptidet kapjuk [D-pGlu-Gln-Trp-Ala-ValGly-His(Bom)-Leu-/wzz-Tac-BHA gyanta].

Az 1/01/C intermedier peptidet ezután a hisztidin Bőm védőcsoportjának eltávolítása és a nonapeptid gyantáról való lehasítása érdekében a 6. művelet szerint hidrogén-fluoriddal és anizollal kezeljük, ami C-terminális Q csoportot (NH₂) eredményez. A peptidet a 7. művelet szerint HPLC-vel tisztítjuk, s így kapjuk az 1. számú bombezinantagonista peptidet.

Hasonló módon, az 1/02/A, 1/05/A, 1/07/A, 1/08/A, 1/09/A, 1/10/A és 1/12/A intermedier peptidekkel elvégeztük a Boc és Bút csoport eltávolításának, és a Cys -CH₂-SH csoportjának a redukált kötés szekunder aminjával való gyűrűvé zárásának lépéseit, miáltal az alábbi intermedier peptideket állítottuk elő:

1/02B D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-p.szí-Tac-BHA gyanta;

1/04/B Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-pszz-Tac-BHA gyanta;

1/05/B D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-p.szz-Tac-BHA gyanta;

1/07/B D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-pjzz-Tac-BHA gyanta;

1/08/B Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-p.szz-Tac-BHA gyanta;

1/09/B D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-pszz-Tac-BHA gyanta;

1/10/B D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-pszz'-Tac-BHA gyanta;

1/11/B Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-pjzz'-Tac-BHA gyanta;

1/12/B Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-/wzz'-Tac-BH A gyanta;

1/13/B D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-pízz-Tac-BHA gyanta;

1/14/B HCa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-pszz'-Tac-BHA gyanta.

E peptidek retencióideje az alábbiak szerint alakul: Analitikai HPLC-adatok

Peptid	Gradiens %	Retencióidő
száma	B/perc	D oszlopon
1.	25-65	14,40
2.	25-65	14,20
4.	25-75	15,17
5.	25-65	16,11
7.	20-60	23,75
8.	20-60	13,19
9.	25-65	12,00
10.	25-65	16,98
11.	25-65	24,50
12.	25-65	19,91
13.	25-65	16,99
14.	40-80	13,68
Az öttagú, heterociklusos gyűrű más módon, oldat·
bán is kialakítható, az alábbiak szerint.

A szilárd fázisú szintézissel előállított, Leu-p.vzz-CysNH₂ N-terminális szerkezettel rendelkező intermedier peptid 25 mg-ját 0,8 ml jégecetben, szobahőmérsékleten 30 másodpercig 100 μΐ 1 m/m%-os (vízben) formaldehiddel elegyítjük, majd 20 μΐ 50%-os ammóniumacetát-oldatot adunk hozzá. A reakcióelegy tisztításával a kívánt peptidet nyerjük, mely a Leu-/vzz-Tac-NH₂ Nterminális szerkezettel rendelkezik.

2. példa

15. D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pjzzTac-NH₂

HU 218 288 Β

16. D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leup.sz;-Tac-NH₂

17. D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/«zzTac-NH₂

E példa peptidjei alkalmas módon 0,5 g BHA gyantán (0,55 mmol NH₂/g) lépésenként felépített 1-2 közös intermedier peptidből [Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-pszz-Cys(But)-BHA gyanta] szintetizálhatok. Az 1-2 intermedier peptidet az 1. példában leírt műveletek és eljárások szerint állítjuk elő. Az 1-2 intermedier 150 mg-ját ezután három alikvotra osztjuk, s a nonapeptid gyanta végtermék előállításához a 4. műveletben leírt eljárással két további összekapcsolást végzünk.

Az 1-2 intermedier pepiidhez az Fmoc-His(Bom) és Boc-D-Phe gyököket egymás után kapcsolva a Boc-DPhe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psziCys(But)-BHA gyantát („2/15/A”) kapjuk.

Az 1-2 intermedier peptidhez az Fmoc-Glu(OMe) és Boc-D-Phe gyököket egymás után kapcsolva a Boc-DPhe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/«zzCys(But)-BHA gyantát („2/16/A”) kapjuk.

Az 1-2 intermedier peptidhez az Fmoc-Glu(But) és Boc-D-Phe gyököket egymás után kapcsolva a Boc-DPhe-Glu(But)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?jzzCys(But)-BHA gyantát („2/17/A”) kapjuk.

A 2/15/A intermedier peptid N-terminális Boc védőcsoportját a 4. művelet szerint, diklór-metánban 5% merkapto-etanolt és 5% anizolt tartalmazó 50%-os TFA oldattal végzett kezeléssel távolítjuk el. Ez a reakció az A⁹ gyök Bút csoportját is eltávolítja, ami a 2/15/B intermedier peptid [D-Phe-His(Bom)-Trp-AlaVal-Gly-His(Bom)-Leu-/wz/-Cys-BHA gyanta] kialakulását eredményezi.

Ennél a pontnál az 1/01/B intermedier peptid Cys gyökének oldalláncát a II/A képleten bemutatott öttagú heterociklusos gyűrű kialakítása érdekében az 5. művelet szerint, oxidációval gyűrűvé zárjuk. A peptidhez AcOH, 3,7%-os HCHO és DMF (1:1:8) elegyének 10 ml-ét adjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3 percig rázatjuk, vízzel, DMF-fel és diklór-metánnal (mindegyikkel háromszor) mossuk, miáltal a 2/15/C intermedier peptidet kapjuk [D-Phe-His(Bom)-Trp-AlaVal-Gly-His(Bom)-Leu-/wzi-Tac-BHA gyanta].

Ezután a 2/15/C intermedier peptidet 0 °C-on egy óráig frissen desztillált HF-dal (5 ml) és anizollal (0,25 ml) kezeljük, miáltal a hisztidin Bőm védőcsoportját is eltávolítjuk. Az oldószert in vacuo bepároljuk, etil-acetáttal mossuk, 70-80%-os vizes ecetsavval extraháljuk, és liofilizáljuk. Tisztítás után a 15. számú bombezinantagonista peptidet kapjuk.

Hasonló módon, a 2/16/A és 2/17/A intermedier pepiiddel elvégezzük az N-terminális Boc védőcsoport eltávolításának, a Cys⁹ gyűrűvé zárásának, az intermedier peptid BHA gyantáról való eltávolításának és HPLC-vel végzett tisztításának lépéseit, miáltal a 16. számú peptidet és a 2/17/D intermedier peptidet állítjuk elő: D-PheGlu-T rp-Alá-V al-Gly-His(Bom)-Leu-pszi-T ac-NH₂.

A 2/17/D intermedier 15 mg-jának és HOBt 15 mgjának 0,8 ml DMF-ben készített elegyét 0 °C-on 50 μΐ, diklór-metános 25% diizopropil-karbodiimid-oldathoz adjuk, s 0 °C-on 2 óráig keverjük, miáltal a 17. peptid D-Phe¹ aminosavának alfa-aminocsoportját a Glu² aminosav 3-propionil-gyökének gamma-karboxilcsoportjához kötő egyszeres kötést alakítjuk ki: D-Phe-Glu[-]Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-p5z/-Tac-NH₂.

A reakcióelegyet a 7. művelet szerint HPLC-vel tisztítjuk.

E peptidek retencióideje az alábbiak szerint alakul: Analitikai HPLC-adatok

Peptid	Gradiens %	Retencióidő
száma	B/perc	D oszlopon
15.	20-60	17,23
16.	25-65	19,13
17.	20-60	20,34
3. példa

3. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-p.vzzMTac-NH₂

6. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psziMTac-NH₂

Ezek a bombezinantagonisták alkalmas módon az 1-3 közös intermedierből [Fmoc-Gln-Trp-Ala-ValGly-His(Bom)-Leu-/Mzz-Cys(But)-BHA gyanta] szintetizálhatok, amelyet 1,0 g BHA gyantán (0,55 mmol NH₂/g) az 1. példában leírtak szerint, szilárd fázisú szintézissel Fmoc-Cys(But), Fmoc-Leu-CHO (NaBH₃CNdal), Fmoc-His(Bom) stb. egymás utáni összekapcsolásával állítunk elő. Az Fmoc-Gln-t a 4. művelet szerint kapcsoljuk az N-terminálishoz, miáltal az 1-3 intermediert hozzuk létre. A Boc-D-Phe, illetve Boc-D-Cpa 1-3 intermedierhez való kapcsolását szintén a 4. művelet szerint hajtjuk végre, miáltal a 3/3/A, illetve 3/6/A intermedier peptideket kapjuk.

A Boc védőcsoportot a 4. művelet szerint, diklórmetánban 5% merkapto-etanolt és 5% anizolt tartalmazó 50%-os TFA oldattal végzett kezeléssel távolítjuk el.

Ennél a pontnál a 3/3/B intermedier Cys gyökének oldalláncát a II/B képletben bemutatott öttagú heterociklusos gyűrű kialakítása érdekében az 5. művelet szerint oxidációval gyűrűvé zárjuk. A peptidhez 50%-os AcOH, 10%-os CH₃CHO és DMF 1,5:0,5:8 arányú elegyének 10 ml-ét adjuk, a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 10 percig rázatjuk, vízzel. DMF-fel és diklórmetánnal (mindegyikkel háromszor) mossuk, miáltal a 3/3/C intermedier peptidet kapjuk (D-Phe-Gln-TrpAla-Val-Gly-His-Leu-pszz-MTac-BHA gyanta).

A 3/3/C és 3/6/C intermedier peptideket a 6. művelet szerint HF-dal (5 ml) és anizollal (0,25 ml) 0 °C-on egy órán keresztül végzett kezeléssel távolítjuk el a gyantáról. Ez az eljárás a hisztidin Bőm védőcsoportját is eltávolítja, s a 3., illetve 6. nonapeptidet eredményezi.

A peptideket a 7. művelet szerint HPLC-vel tisztítjuk; a retencióidők az alábbiak szerint alakulnak;

Peptid	Analitikai HPLC-adatok Gradiens %	Retencióidő
száma	B/perc	D oszlopon
3.	25-65	15,71
6.	25-65	17,37

Az öttagú, heterociklusos gyűrű más módon, oldatban is kialakítható, melynek során a Leu-pszí-Cys-NH₂

HU 218 288 Β

N-terminális szerkezettel rendelkező intermedier peptid 25 mg-jához 0,8 ml jégecetben 100 μΐ 10%-os acetaldehidet adunk. Ezt 5 percig elegyítjük, majd 100 μΐ ammónium-acetát-oldatot adunk hozzá. A reakcióelegy tisztításával a kívánt peptidet nyerjük, mely a -Leu-/Mzz-MTac-NH₂ N-terminális szerkezettel rendelkezik.

4. példa

18. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszíDMTac-NH₂

19. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pízzDMTac-NH₂

20. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pjzzDMTac-NH₂

21. Tpi-Gln-Trp-Alá-V al-Gly-His-Leu-pszzDMTac-NH₂

22. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/«zzDMTac-NH₂

Ezek a polipeptidek alkalmas módon az 1-4 közös intermedierből [Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-pszz'-Pen(But)-BHA gyanta] szintetizálhatók, amelyet az 1. és 2. példában leírtak szerint, a szilárd fázisú szintézis standard eljárásaival, lépésenként benzhidrilamin (BHA) gyantán állítunk elő.

A 2. művelet szerint készített, TEA 10%-os diklórmetános oldatának 10 ml-ével kétszer három percig kezelt (semlegesítés), és 10 ml diklór-metánnal hatszor mosott 1,0 g BHA gyantát (0,55 mmol NH₂/g) DMFben három percig 1,6 mmol Fmoc-Pen(But) gyökkel és 1,8 mmol 1-hidroxi-benzotriazollal (HOBt) kezeljük. Az elegyhez diklór-metánban 20%-os 1,3-díizopropilkarbodiimid (DIC) (1,6 mmol) oldatot adunk, s ezt szobahőmérsékleten 90 percig rázatjuk. A kapott FmocPen(But)-BHA gyantát diklór-metánnal és metanollal (mindkettővel kétszer), majd diklór-metánnal háromszor mossuk, és Kaiser-tesztet végzünk.

Az Fmoc-Pen(But)-BHA gyantáról az Fmoc védőcsoport eltávolítását a 4/A művelet szerint végezzük.

Az Fmoc-Leu-CHO kapcsolását a 3. művelet szerint végezzük. Az A⁹(But)-BHA gyantát DMF-fel kétszer mossuk, majd 1%-os AcOH-t tartalmazó DMFben 1,6 mmol Fmoc-Leu-CHO-t, és 1,8 mmol NaBH₃CN-ot adunk hozzá. A reakcióelegyet 60 percig rázatjuk, majd kétszer egy percig 50%-os vizes metanollal, kétszer egy percig 100%-os metanollal, és háromszor egy percig diklór-metánnal mossuk.

Az Fmoc-Leu-/zsz/-Pen(But)-BHA gyanta intermedierről az Fmoc csoport eltávolítása és a semlegesítés után az Fmoc-His(Bom) kapcsolását a 4. műveletben leírtak szerint végezzük.

Az Fmoc-Gly kapcsolását is a 4. művelet szerint végezzük. 1,5 mmol Fmoc-Gly és 1,65 mmol HOBt DMF-es oldatához 0 °C-on 1,3-diizopropil-karbodiimid (1,5 mmol) 20%-os, diklór-metános oldatát adjuk, s az elegyet hűtéssel 15 percig, majd szobahőmérsékleten 15 percig keverjük, a csapadékot leszűrjük, a gyantához adjuk, és 60 percig rázatjuk. A következő aminosavakat (Fmoc-Val, Fmoc-Ala és Fmoc-Trp) hasonló módon, egymás után kapcsoltuk a peptidhez, miáltal az

1-4 intermedier [Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leii-/zszz'-Pen(But)-BHA gyanta] 1,9 g-ját állítjuk elő.

Az 1-4 intermedier 0,91 g-ját öt alikvotra osztjuk (egyenként körülbelül 200 mg), s ezeket a 4. műveletben leírt módon a védett polipeptid gyanták szintéziséhez használjuk.

Az 1-4 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-Phe-t egymás után kapcsolva a Boc-D-Phe-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?5zz-Pen(But)-BHA gyantát („4/18/A”) kapjuk.

Az 1-4 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és az Ac-D-Phe-t egymás után kapcsolva az Ac-D-Phe-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p5Z!-Pen(But)-BHA gyantát („4/19/A”) kapjuk.

Az 1-4 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-Cpa-t egymás után kapcsolva a Boc-D-CpaGln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz/-Pen(But)BHA gyantát („4/20/A”) kapjuk.

Az 1-4 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-Tpi-t egymás után kapcsolva a Boc-Tpi-Gln-TrpAla-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/«zz-Pen(But)-BHA gyantát („4/21/A”) kapjuk.

Az 1-4 intermedier peptidhez az Fmoc-Gln-t és a Boc-D-Tpi-t egymás után kapcsolva a Boc-D-Tpi-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wzz-Pen(But)-BHA gyantát („4/22/A”) kapjuk.

A 4/18/A intermedier pepiidről a Boc-csoportot 5% merkapto-etanolt és 5% anizolt tartalmazó diklór-metánban készített 50%-os TFA-val távolítjuk el, miáltal a 4/18/B intermedier peptidet [D-Phe-Gln-Trp-Ala-ValGly-His(Bom)-Leu-p.s'zz-Pen-BHA gyanta] kapjuk.

Ennél a pontnál a II C képletben bemutatott öttagú, heterociklusos gyűrű kialakítása érdekében a 4/18/B intermedier peptid Pen gyökének oldalláncát az 5. művelet szerint gyűrűvé záijuk. Az intermedier peptidhez AcOH, 3,7%-os HCHO és DMF 1:1:8 arányú elegyének 10 ml-ét adjuk, s a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3 percig rázatjuk, vízzel, DMF-fel és diklór-etánnal (mindegyikkel háromszor) mossuk, miáltal a 4/18/C intermedier peptidet [D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-ps'zz'-DMTac-BHA gyanta] kapjuk.

A 4/18/C intermedier peptidet ezután 5 ml diklórmetánnal, metanollal és diklór-metánnal (mindegyikkel háromszor) mossuk, majd 0 °C-on egy óráig frissen desztillált HF-dal (5 ml) és anizollal (0,25 ml) kezeljük. Az oldószert in vacuo elpárologtatjuk, éterrel vagy etilacetáttal mossuk, 70-80%-os ecetsavval extraháljuk, és liofílizálással a nyers nonapeptid gyantát kapjuk. A reakcióelegyet tisztítva a 18. számú bombezin-antagonista peptidet kapjuk.

Hasonló módon, a 4/19/A, 4/20/A, 4/21/A és 4/22/A intermedier peptidekkel is elvégezzük a védőcsoportok eltávolításának, a védőcsoport nélküli A⁹ gyök gyűrűvé zárásának, és az intermedier peptid BHA gyantáról való eltávolításának lépéseit, miáltal a 19., 20., 21. és 22. számú peptidet állítjuk elő.

A peptidek tisztítását a 7. művelet szerint, 70%-os acetonitrilben 0,1 %-os TFA-ból (A) és 1%-os TFA-ból (B) álló oldószerrendszer alkalmazásával HPLC-vel hajtjuk végre. A tisztított peptideket analitikai HPLC

HU 218 288 Β alapján 97%-osnál nagyobb tisztaságúnak bizonyultak. E peptidek retencióideje az alábbiak szerint alakul:

Peptid	Analitikai HPLC-adatok Gradiens %	Retencióidő
száma	B/perc	D oszlopon
18.	25-65	14,01
19.	25-65	22,96
20.	25-65	15,97
21.	25-65	19,19
22.	25-65	16,53

Az A⁹ gyök más módon, oldatban is gyűrűvé zárható, melynek során a Leu-pjzz'-Pen-NH₂ N-terminális szerkezettel rendelkező intermedier peptid 25 mg-ját 100 pl 10%-os acetaldehiddel elegyített 0,8 ml jégecetben 25 mg HOBt-hez adjuk. A reakcióelegyet 0 °C-on 30 percig keverjük, miáltal a Leu-/wzz'-DMTac-NH₂ öttagú gyűrűs szerkezettel rendelkező pepiidet nyerjük.

5. példa

Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszz-Cys-NH₂;

(5/08)

D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzCys-NH₂; (5/09)

Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wzz'-Cys-NH₂;

(5/12)

D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pszzCys-NH₂; (5/13)

Hca-Gln-T rp-Alá-V al-Gly-His-Leu-/wzz'-Cy s-NH₂; (5/14)

Ezek a peptidek az 1-5 közös intermedierből [Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-pszzCys(But)-BHA gyanta] állíthatók elő. Az FmocLeu-pszz'-Cys(But)-BHA gyantát úgy állítjuk elő, hogy a 2. és 3. műveletben leírt módszerrel 1,0 g BHA gyantához (0,55 mmol NH₂/g) egymás után Fmoc-Cys(But) és Fmoc-Leu-CHO aminosavakat kapcsolunk.

Az Fmoc-His(Bom), Fmoc-Gly-, Fmoc-Val, FmocAla, Fmoc-Trp és Fmoc-Gln egymás utáni kapcsolásával az Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu/wzz-Cys(But)-BHA gyanta intermediert állítjuk elő (1-5 intermedier peptid).

Az e példában szereplő peptidek közös 1-5 intermedierének 150 mg-os alikvotjához a 4. művelet szerinti eljárással egy további aminosavat kapcsolva a végtermék peptid gyantákat kapjuk.

Az 1-5 intermedier pepiidhez a Boc-Pal-t kapcsolva a Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leup.vzz'-Cys(But)-BHA gyantát („5/08/A”) kapjuk.

Az 1-5 intermedier peptidhez a Boc-D-Pal-t kapcsolva a Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-/wzz-Cys(But)-BHA gyantát („5/09/A”) kapjuk.

Az 1-5 intermedier peptidhez a Boc-Tpi-t kapcsolva a Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-VaI-Gly-His(Bom)-Leu-p,szzCys(But)-BHA gyantát („5/12/A”) kapjuk.

Az 1-5 intermedier peptidhez a Boc-D-Tpi-t kapcsolva a Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-pízz-Cys(But)-BHA gyantát („5/13/A”) kapjuk.

Az 1-5 intermedier peptidhez a Hca-t kapcsolva a Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p5^,z/-Cys(But)-BHA gyantát („5/14/A”) kapjuk.

Az 5/01/A intermedier peptidről az N-terminális Boc-csoportot 5% merkapto-etanolt és 5% anizolt tartalmazó diklór-metánban készített 50%-os TFA-val kétszer (először 5, majd 25 percig) végzett kezeléssel távolítjuk el. Ez a kezelés eltávolítja a cisztein védőcsoportját is. A pepiidet ezután a 4. művelet szerint diklór-metánnal, metanollal és DMF-fel mossuk, miáltal az 5/08/B intermedier pepiidet [Pal-Gln-TrpAla-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?szz'-Cys-BHA gyanta] kapjuk.

Az 5/08/B intermedier pepiidet ezután 0 °C-on egy órán keresztül frissen desztillált HF-dal (5 ml) és anizollal (0,25 ml) kezeljük, mellyel a hisztidin Bőm védőcsoportját is eltávolítjuk. Az oldószert in vacuo elpárologtatjuk, etil-acetáttal mossuk, 70-80%-os ecetsavval extraháljuk, és liofílizálással a Pal-Gln-Trp-Ala-ValGly-His-Leu-/wzz-Cys-NH₂ peptidet kapjuk.

Az 5/08/A, 5/09/A, 5/11/A, 5/12/A, 5/13/A és 5/14/A intermedier peptidekről a védőcsoportokat és a gyantát eltávolítva a példa elején felsorolt peptideket állítjuk elő. Ezek tisztaságát a 7. művelet szerint teszteljük.

Analitikai HPLC-adatok

Peptid	Gradiens %	Retencióidő
száma	B/perc	D oszlopon
5/08	20-60	5,56
5/09	25-65	4,60
5/12	25-65	12,78
5/13	25-65	9,62
5/14	40-80	7,39

Ezek a peptidek más módon, a szilárd fázisú szintézis standard módszereivel, BHA gyantán Boc-védett aminosavak lépésenkénti összekapcsolásával, a Cys⁹ -SH-csoportjának védéséhez Bz-csoport alkalmazásával is előállíthatok, miáltal az alábbi peptideket kapjuk:

Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/ZYz/Cys(Bz)-BHA gyanta (5/08/A);

Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-/wzz'-Cys(Bz)-BHA gyanta (5/09/A);

Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-/wz/-Cys(Bz)-BHA gyanta (5/12/A);

Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)Leu-/wzz'-Cys(Bz)-BHA gyanta (5/13/A);

Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/«zzCys(Bz)-BHA gyanta (5/14/A).

A Boc védőcsoportot 5% merkapto-etanolt és 5% anizolt tartalmazó 50%-os, diklór-metános TFA oldattal végzett kezeléssel távolítjuk el, a peptidet pedig HFdal és anizollal végzett kezeléssel hasítjuk le a gyantáról, eltávolítva ezzel a hisztidin Bőm és a cisztein Bz védőcsoportját is, miáltal a példa elején felsorolt peptideket kapjuk.

6. példa: vizsgálati eljárások

A) Receptorkötési vizsgálat

A ¹²⁵I-Tyr⁴-bombezin kötését és bombezinantagonista pszeudopeptiddel végzett helyettesítését 24 üregű szövettenyésztő lemezeken (GIBCO) Swiss 3T3 sejtek alkalmazásával teszteljük. Az egér Swiss 3T3 fibroblasztokat heten13

HU 218 288 Β kénti passzálással 10% FCBS-t és antibiotikumokat tartalmazó DMEM tápközegben tartjuk. A tenyészeteket 5% CO₂-ot tartalmazó levegőn 37 °C-on inkubáljuk. Minden üregbe 10⁵ sejtet helyezünk (95%-nál nagyobb életképesség), és a sejteket nyugalmi állapot eléréséig, konfluensségig tenyésztjük. A kötési eljárást a sejtek beültetése utáni 7. napon végezzük. A sejteket 0,5 ml kötőpufferrel [20 nM HEPES-NaOH-ot (pH=7,4), 0,2% BSA-t és 100 mcg/ml bacitracint tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle tápközeg] kétszer mossuk. A sejteket ezután különböző koncentrációjú (6x l0^-ll-6x 10 ⁶ M, teljes térfogat 0,4 ml) antagonisták jelenlétében vagy hiányában 0,2 nM '^I-Tyri-bombezinnel inkubáljuk.

A sejteket 37 °C-on 30 percig inkubáljuk, mivel a ¹²⁵IGRP kötődése 37 °C-on 30 percnél éri el maximumát, s később csökken (Zachary és Rozengurt, 1985; és Layton és munkatársai, 1988). Az inkubálás után a sejteket kétszer jéghideg kötőpufferrel, és kétszer jéghideg foszfátpufferelt sóoldattal (PBS-ben 138 mM NaCl, 2,8 mM KC1, 8 mM Na₂HPO₄, 1,45 mM KH₂PO₄, 0,91 mM CaCl₂, 0,49 mM MgCl₂) mossuk. A mosott tenyészeteket 0,5 ml 0,5 mM NaOH-oldatban extraháljuk, s az értékeléshez csövekbe töltjük. A szövettenyésztő lemez üregeit 0,5 ml steril desztillált vízzel mossuk (egyszer), s a mosóoldatot a megfelelő csövekbe töltjük. A minták radioaktivitását automatikus gamma-sugárzás-számlálóban (Micromedic System, Inc., Huntsville, Alá.) méijük.

A receptor kötési típusának, a disszociációs állandó (Kd), az asszociációs állandó (Ka) és a receptorok maximális kötési kapacitásának (B_max) meghatározásához a Munson és Rodbard-féle Ligand - PC komputerizált görbeilleszkedési programot alkalmazzuk.

A találmány szerinti polipeptidek kötődési adatait az I. táblázatban mutatjuk be. A helyettesített, specifikus ¹²⁵I-Tyr⁴-bombezinhez való kötődési képesség meghatározásához különböző dózisú jelöletlen peptidet alkalmaztunk. Valamennyi peptid esetében 2-3 független (három ismétléssel végzett) teszt átlagos értékét tüntetjük fel.

1. táblázat

A ¹²⁵I-Tyr⁴-bombezin Swiss 3T3 sejtekhez való kötődésének gátlása bombezinantagonistákkal

Peptid száma	Ki(nM)
1.	5,0
2.	0,078
3.	13
4.	13
5.	0,007
6.	4,3
7.	0,009
8.	4,5
9.	8,8

Peptid száma	Ki (nM)
10.	0,11
11.	5,4
12.	<0,001
13.	<0,001
14.	<0,001
15.	0,26
16.	12
17.	213
18.	0,93
19.	20
20.	13
21.	0,07
22.	0,074
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leu-pízt-Leu-NHj	0,20
bombezinb	0,28

^a 6 teszt átlaga; ^b 11 teszt átlaga.

7. példa

A bombezinantagonistával végzett kezelés ösztrogéntől független MXT egér-emlőrákdaganat térfogatára gyakorolt hatását az alábbiak szerint teszteljük.

A National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facilitytól (Frederick, Mayland) kapott 40 nőstény B6D2Fi egeret 21 ±1 °C hőmérsékleten és 55 ±5%-os páratartalom mellett, automatizált 12 óra megvilágítás/12 óra sötét ciklussal tartjuk. Az állatokat 50001-es laboratóriumi rágcsálótakarmánnyal és tetszés szerint csapvízzel látjuk el. A Dr. A. E. Bogdentől (Biomeasure Inc., Hopkinton, MA) kapott mélyhűtött, ösztrogéntől független MXT (3.2)/Ovex emlőrákszövetet egy mm³ MXT (3.2)/Ovex daganattal kifejlett nőstény egerekbe injektáljuk (szubkután). A daganat átültetése után két nappal az egereket véletlenszerűen négy csoportra osztjuk, s a kezelést késleltető hordozórendszerben (mikrokapszulák) adott peptidekkel kezdjük meg. A négy csoportot az alábbiak szerint kezeljük:

1) Kontroll, csak injekció vivőanyag;

2) [D-Tpi⁶, Leu^l3-/wz/-Leu¹⁴] Bn(6-14);

3) [D-Phe⁶, Leu^I3-pízz'-Tac¹⁴] Bn(6-14);

4) Kétoldali petefészek-eltávolítás.

A bombezinantagonisták itt alkalmazott rövidítésében a peptidszakasz gyökeinek hagyományos számozását használjuk; a gyököket a teljes pepiidben elfoglalt helyzetük alapján számozzuk. A bombezinantagonisták azonban könnyebben hasonlíthatók össze más pepti14

HU 218 288 Β dekkel, ha számozásukat az N-terminálison „l”-gyel kezdjük. Ilyenformán, a ,,[D-Tpi⁶-Leu^l3-/«z/Leu¹⁴]Bn(6-14)” a D-Tpi¹-Gln²-Trp³-Ala⁴-Val⁵Gly⁶-His⁷-Leu^s-p.vzz-Leu⁹-NH₂ (a továbbiakban Bl) peptidet jelenti, a ,,[D-Phe⁶-Leu¹³-p.vzz-Tac^l4]Bn(6-14)” pedig a fentebb említett 2. számú peptidet.

A két bombezinantagonistát szilárd fázisú eljárásokkal szintetizáljuk. Az egerek 2. csoportját a Bl-et tartalmazó, a 3. csoportot pedig a 2. számú peptidet tartalmazó, késleltetett kibocsátású készítménnyel kezeltük. A késleltetett kibocsátású készítmény a Bl, illetve 2. számú peptid 15 napon keresztül tartó, napi 25 mikrogrammos, folyamatos felszabadulását eredményezte.

Késleltetett hordozórendszerként Alzet ozmotikus pumpákat (Alzo Co., Palo Alto, CA) alkalmaztunk. Az egerek hátának alsó-szélső területére szubkután 0,48 μΐ/óra kibocsátású Alzet Pump Model 2002 ozmotikus pumpát ültettünk be. A peptideket 50 V/V%-os, vizes propilénglikolban oldottuk fel, s ezeket az oldatokat használtuk az ozmotikus pumpák feltöltéséhez.

Miután a daganatok láthatók és tapinthatók lettek, a daganatok térfogatát Szende B. és munkatársai leírása szerint [„Growth Inhibition of MXT Mammary Carcinoma by Enhancing Programmed Cell Depth” (apoptosis) LH-RH és szomatosztatin analógokkal; Breast Cancer Rés. Treat., 14, 307-314, 1989] mértük és számítottuk.

A kísérleteket a daganatnövekedés exponenciális fázisában fejeztük be. A daganat térfogatát először a 10. napon mértük. A kontroll és a valamelyik bombezinantagonistával (vagy mindkettővel) kezelt állatok daganatainak térfogata közötti különbségek statisztikus jelentőségűek. A daganatok térfogata mérésének eredményeit a II. táblázatban és az 1. ábrán mutatjuk be.

II. táblázat

Bombezinantagonisták hatása ösztrogéntől független MXT egér emlőrákos daganat térfogatára

Peptid	Daganat térfogata a
10.	14.	17.
napon
Kontroll	729	2565	5000
[D-Tpi6-Leu13-pszZ- Leu14] Bn(6-14) (Bl)	363*	2437	3742
[D-Phe6-Leu-IJ-p.vzz- Tac14] Bn(6-14) (2. peptid) Kétoldali petefészekeltávolítás	360*	1477*	3323**

* p<0,05 ** p<0,01

A kísérletek befejeztével az egereket metofános altatás közben kivéreztettük, megmértük a daganatok tömegét, és a Duncen- és a Student-féle teszttel statisztikai analízist végeztünk. Az eredményeket a III. táblázatban mutatjuk be.

III. táblázat

A kezeléshez alkalmazott peptid	A daganat tömege (g)
Kontroll	8,45 ±0,23
[D-Tpi6-Leu13-pszt-Leu14] Bn(6-14)	7,36±0,46
2. számú peptid	5,48±1,00**

Az adatok átlag± standard hiba értekeket jelentenek. ** p<0,01

8. példa

Egy szomatosztatinanalóg és három bombezinantagonista humán kissejtes tüdőrákra gyakorolt hatását csupasz egerekben vizsgáltuk. Tímuszhiányos, csupasz, hathetes hím egereket a National Cancer Institute-tól (Bethesda, MD) kaptunk. Az egereket kórokozóktól mentes körülmények között tartottuk.

A humán kissejtes tüdőrák (SCLC, H69 vonal) sejteket egy rétegben 10% szarvasmarhaszérum-albuminnal, antibiotikumokkal és gombaellenes szerekkel kiegészített RPMI 1640 tápközegben (Gibco, Grand Island, NY), 5% CO₂-ot tartalmazó párás levegőben, 37 °C-on tenyésztettük. A fertőző anyag átvitelét a sejttenyészet 1 χ 10⁷ exponenciálisan növekvő sejtjének öt csupasz egér jobb csípőjébe történő szubkután injektálásával végezzük. A kialakult daganatokat három hét elteltével sterilen kivágjuk, s feldaraboljuk. A daganatszövetek 3 mm³-es darabjait Trocar tűvel 60 egérbe transzplantáljuk. A transzplantáció után két hét elteltével a daganatok hozzávetőleg 10 mm³ térfogatúra nőttek, s az állatokat véletlenszerűen öt kísérleti csoportra osztottuk. A csoportokat a transzplantáció után két hét elteltével öt különböző vegyülettel kezeltük. Ezután a tumorokat öt héten keresztül, hetenként mértük. A tumor térfogatát a (hosszúság x szélesség x magasság xpi)/6 képlet szerint számítottuk. A tumorok tömegének méréséhez minden csoportból nyolc állatot öltünk le.

A csupasz egerek kezeléséhez használt vegyületek közül az első a D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-ValCys-Trp-NH₂ szomatosztatinanalóg (SÍ).

A bombezinantagonisták közül az első a D-Tpi²Gln²-Trp³-Ala⁴-Val⁵-Gly⁶-His⁷-Leu⁸-/«zz-Leu⁹-NH₂ (Bl). A második bombezinantagonista a [Tpi⁶-Leu¹³joszz-Tpi¹⁴] Bn(6-14), vagyis a D-Tpi'-Gln²-Trp³-Ala⁴Val⁵-Gly⁶-His⁷-Leu⁸-p.szí-Tpi⁹-NH12 (B2), a harmadik antagonista pedig a 2. számú peptid.

Az SÍ pamoát sójának poli(DL-laktid-koglikolid)ben készült mikrogranulumait a Cytotech SA-nél állítottuk elő, s úgy terveztük, hogy 16 mg alikvotból 2 héten keresztül napi 100 pg szabaduljon fel. Ezeket a mikrogranulumokat minden 15. napon a tumorral szemben szubkután injektáljuk. A bombezinantagonistákat sóoldatban készített, 0,1%-os dimetil-szulfoxidban oldjuk, s naponta kétszer 20 pg/nap adagolásban, szubkután injektáljuk.

A gyógyszeres kezelés daganattérfogatra gyakorolt hatását a IV. táblázatban és a 2. ábrán mutatjuk be.

HU 218 288 Β

IV. táblázat

Bombezinantagonisták hatása SCLC daganatok térfogatára

Peptid	A daganatok térfogata a
0.	7.	14.	21.	28.	35.
napon
Kontroll	10,5±0,5	19,3±1,4	31,6±5,6	63,8±10,6	142,8±37,5	249,7 ±74,3
SÍ	9,8±0,8	14,4±1,5	15,8±1,3	18,4±2,9	33,2±9,0	66,0± 12,1
B1	ll,2±0,8	13,3±1,2	17±3,4	24,7±8,2	55±24,5	80,2±27,2
B2	10±l,l	11,7±1,2	14,7 ±2,4	24,5 ±7,9	45±15	74,1±31,8
2. pept.	11,6±1,7	7,4±1,8	8,9±2,3	14,3 ±6,3	19,2±9,4	49,0±21,0

9. példa

A bombezinantagonisták MIA PACA-2 hasnyálmirigyrák-daganatokra gyakorolt hatását az alábbiak szerint vizsgáltuk.

A 8. példában alkalmazottakkal azonos csupasz egereket a 8. példában az SCLC-hez hasonlóan nevelt sejttenyészetekből származó MIA PACA-2 humán hasnyálmirigyráksejtekkel szubkután injektáljuk. A tumorok térfogatát mindkét kísérleti csoportban a 8. példában leírtak szerint mérjük. 25

Az egyik kísérleti csoport a 2. számú bombezinantagonista peptiddel kezelt egerekből áll, a másik a kontrollcsoport, melyet csak az injekció vivőanyagát képező oldattal kezelünk. Valamennyi egeret naponta 20 kétszer az injekció vivőoldatának vagy a 2. számú peptid 50 pg-jával kezeljük.

A daganat térfogat mérésének eredményeit az V. táblázatban és a 3. ábrán mutatjuk be.

V. táblázat

Bombezinantagonisták MIA PACA-2 hasnyálmirigy-daganat térfogatára (mm³) gyakorolt hatása

Peptid	A daganat térfogata a
0.	7.	11.	15.
napon
Kontroll	45,6±7,9	254,2±59,8	645,1±128,6	855,9± 145,4
2. peptid	29,8±4,3	252,3 ±98,9	427,9± 122,6	634,1 ±174,0

10. példa

A bombezinantagonistákkal végzett kezelés CAPAN-2 humán hasnyálmirigyrákot hordozó csupasz egerekre gyakorolt hatását vizsgáltuk.

A 7. példában alkalmazottakkal azonos egerekbe a 7. példában leírtak szerint nevelt sejttenyészetből származó CAPAN-2 humán hasnyálmirigy-daganatokat vi40 szünk át. Az egereket két csoportra osztjuk; az egyik csoportot csak az injekció vivőoldatával, a másik csoportot napi kétszeri szubkután injekcióval a 2. számú peptiddel oltjuk.

A daganatok térfogatát a 8. példában leírtak szerint mérjük, s a mérések eredményeit a VI. táblázatban és a 4. ábrán mutatjuk be.

VI. táblázat

Bombezinantagonisták CÁPÁN hasnyálmirigy-daganat térfogatára (mm³) gyakorolt hatása

Peptid	A daganat térfogata a
0.	7.	14.	21.	25.
napon
Kontroll	21,2±1,7	28,3±2,3	43,0±3,6	51,4±8,9	78,8± 16,7
2. peptid	19,7±1,7	27,8±3,3	32,2±3,5	46,4±3,0	50,5 ±17,8

Bár a találmányt az előnyben részesített megvalósítási módjaival kapcsolatban írtuk le, a találmány tárgyától való eltérés nélkül a szakemberek számára nyilvánvaló változtatások és módosítások végezhetők, 60 melyeket a szabadalmi igénypontokban sorolunk fel. A találmányban alkalmazhatók a tudományban ismert, a hatékonyságot jelentősen nem csökkentő módosítások is.

Claims (11)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. (I) általános képletű

   X-A¹-A²-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pjzz'-A⁹-Q (I) bombezinantagonista peptidek és farmakológiailag elfogadható sóik, a képletben

   X jelentése hidrogénatom vagy R'CO- általános képletű csoport, ahol R¹ jelentése adott esetben fenilcsoporttal helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoport,

   A¹ jelentése D-Cpa, D-Nal, L- vagy D-Pal, D-Phe, Lvagy D-Tpi, D-Trp, D-pGlu vagy Hca,

   A² jelentése Gin, Glu[-], Glu(Y) vagy His, ahol Y jelentése 1-3 szénatomos alkoxicsoport, [-] jelentése egy, a Glu² gamma-karboxilcsoportját és az A¹ aminosavmaradék alfa-aminocsoportját összekötő kötés,

   Leu-jwzi- jelentése a Leu csoport redukált alakja, amelyben >C=O-csoport helyett -CH₂- csoport van jelen, amely a szomszédos A⁹ aminosavmaradék alfaaminocsoportjával pszeudopeptidkötést képez,

   A⁹ jelentése Tac, MTac, DMTac vagy Cys,

   Q jelentése -NH₂ képletű csoport.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti peptid, melyben A⁹ jelentése Tac.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti peptid, melyben A⁹ jelentése DMTac.
4. 4. A 2. igénypont szerinti peptid, melyben X jelentése hidrogénatom vagy acetilcsoport;

   A¹ jelentése D-Phe, L- vagy D-Tpi; és

   A² jelentése Gin.
5. 5. A 3. igénypont szerinti peptid, melyben X jelentése hidrogénatom vagy acetilcsoport;

   A¹ jelentése D-Phe, L- vagy D-Tpi; és

   A² jelentése Gin.
6. 6. A 2. igénypont szerinti D-Phe-Gln-Trp-Ala-ValGly-His-Leu-/»zz-Tac-NH₂ képletű polipeptid.
7. 7. A 2. igénypont szerinti D-Tpi-Gln-Trp-Ala-ValGly-His-Leu-/»z/-Tac-NH₂ képletű polipeptid.
8. 8. A 3. igénypont szerinti D-Phe-Gln-Trp-Ala-ValGly-His-Leu-pszz-DMTac-NH₂ képletű polipeptid.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti Hca-Gln-Trp-Ala-ValGly-His-Leu-/wzz-Tac-NH₂ képletű peptid.
10. 10. Gyógyszerkészítmény, mely egy, az 1. igénypont szerinti polipeptidből vagy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sójából és gyógyszerészetileg megfelelő, folyékony vagy szilárd hordozóból áll.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti polipeptid vagy gyógyászatilag megfelelő savaddíciós sója emlősben rák kezelésére történő alkalmazásra.