CZ286750B6 - Peptide antagonistic to bombesin and pharmaceutical preparation containing thereof - Google Patents

Peptide antagonistic to bombesin and pharmaceutical preparation containing thereof Download PDF

Info

Publication number
CZ286750B6
CZ286750B6 CZ19942807A CZ280794A CZ286750B6 CZ 286750 B6 CZ286750 B6 CZ 286750B6 CZ 19942807 A CZ19942807 A CZ 19942807A CZ 280794 A CZ280794 A CZ 280794A CZ 286750 B6 CZ286750 B6 CZ 286750B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
leu
group
alkyl
peptide
carbon atoms
Prior art date
Application number
CZ19942807A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ280794A3 (en
Inventor
Andrew V Schally
Ren Zhi Cai
Original Assignee
Univ Tulane
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Tulane filed Critical Univ Tulane
Publication of CZ280794A3 publication Critical patent/CZ280794A3/cs
Publication of CZ286750B6 publication Critical patent/CZ286750B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/086—Bombesin; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Tento vynález byl učiněn s vládní podporou, poskytnutou N.C.I. (NIH). Vláda Spojených států má určitá práva k této přihlášce.
Oblast techniky
Vynález je zaměřen na nové peptidy, které ovlivňují růst rakovinných nádorů u člověka. Konkrétně se vynález týká bombesinových antagonístů, kterými jsou psF9 pseudopeptidy, obsahující v C-terminální poloze zbytek Tac, MTac nebo DMTac, jejich solí a farmaceutických prostředků, způsobů syntézy těchto peptidů a způsobů použití těchto peptidů. Tyto peptidy mají antagonistické vlastnosti vůči bombesinu nebo peptidům podobným bombesinu.
Dosavadní stav techniky
Vynález se týká polypeptidických sloučenin, které mají antagonistické vlastnosti vůči bombesinu nebo peptidům podobným bombesinu (jako je peptid uvolňující gastrin GRP, Neuromedin C apod.), označované zde jako vlastnosti antagonistů bombesinu, a které jsou cenné například při léčbě maligních onemocnění u teplokrevných organismů, jako je člověk. Vynález zahrnuje nové polypeptidické sloučeniny a způsoby jejich výroby; nové farmaceutické prostředky obsahující uvedené polypeptidické sloučeniny a způsoby výroby léčiv, obsahujících je, pro použití k vyvolání účinku antagonistů bombesinu u teplokrevných živočichů, jako je člověk.
Bombesin je tetradekapeptidamid, který byl poprvé izolován z kůže žáby Bombina bombina (Anastasi, Erspamar a Bucci, Experientia, 1971, 27, 1966). Je známo, že bombesin je účinným mitogenem pro myší fíbroblastové buňky Swiss 3T3 (Rozengurt a Sinnett-Smieth, Proč. Nati. Acad. Sci USA, 1983, 80, 2936) a že stimuluje sekreci amylasy z morčecích pankreatických acinů (Jensen, Jones, Folkers a Gardner, Nátuře, 1984, 309, 61). Je rovněž známo, že buňky lidské plicní rakoviny (SCLC) produkují a vylučují peptidy podobné bombesinu (Moody, Pert, Gazdar, Camey a Minna, Science, 1981, 214, 1246), že exogenně dodané peptidy podobné bombesinu mohou stimulovat růst lidských buněk SCLC in vitro (Camey, Cuttia, Moody a Minna, Cancer Research, 1987, 47, 821) a že monoklonální protilátka, specifická pro C-koncovou oblast bombesinu a GRP, může blokovat vazbu GRP kjeho receptorům a zamezovat růst lidských buněk SCLC n vitro i in vivo (Cuttia, Camey, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler a Minna, Nátuře, 1985, 316, 823).
GRP, který má vlastnosti analogické bombesinu, je široce rozšířený peptidamid s 27 aminokyselinami, izolovanými z vepřového střeva (McDonald, Jomvall, Nillson, Vagne, Ghatei, Bloom a Mutt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 90, 227), kde C-terminální sekvence aminokyselin je téměř shodná s bombisinem. Neuromedin C je dekapeptidamid, jehož struktura je identická s posledními deseti aminokyselinami C-koncové oblasti GRP a který byl izolován ze psího tenkého střeva (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke a Shively, J. Biol. Chem., 1983, 258, 5582). GRP stimuluje různé biologické odpovědi včetně uvolňování gastrinu do systémového oběhu. Funguje také jako růstový faktor u myších fíbroblastech 3T3 a buňkách plicní rakoviny SCLC. Byl tedy vysloven návrh, že GRP hraje přímou patofyziologickou roli při vývoji SCLC prostřednictvím autokrinního růstového mechanismu.
Bombesin, Neuromedin C a C-terminální nonapeptid GRP mají tuto strukturu:
Bombesin:
pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-Met-NH2
-1 CZ 286750 B6
Neuromedin C:
H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
C-terminální nonapeptid GRP:
Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
Výzkum v oblasti peptidů typu bombesinu u obojživelníků vedl k izolaci litorinu, nonapeptidu vzorce pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 z kůže žáby z Papuy a Nové Guineje, který se ukázal být velmi účinným analogem bombesinu (Yasukara a d., Chem. Parm. Bull. 1979, 27, 492). Studie analogů bombesinu ukázaly, že úplné spektrum bombesinové účinnosti má minimální segment 9 aminokyselinových zbytků v polohách 6 až 14 bombesinu.
Nyní bylo charakterizováno několik typů antagonistů bombesinu. Substance P
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 která má mírnou homologii aminokyselinové sekvence s bombesinem, neinhibuje vazbu bombesinu a bombesinu podobných peptidů, ale analogy substance P, modifikované náhradou několika L-aminokyselin D-aminokyselinami, jako je (D-Arg1, D-Pro2, D-Trp7’9, Leu11) substance P aíD-Arg1, D-Phe5, D-Trp7’9, Leu11) substance P (Moody a d., Fed. Proceedings, 1987, 46, 2201), jak se zjistilo, blokují sekreci bombesinu v pankreatických acinámích buňkách a antagonizují růst podporující účinky bombesinu u buněk Swiss 3T3. Dva typy antagonistů bombesinu, odvozených od bombesinu, například (D-Phe6, D-Phe 12)bombesin a [LeuI3-/wz'-LeuI4]bombesin (Coy a d., J. Biol. Chem., 1988, 263, 5056 a peptidy, 1989, 10, 597) prokázaly účinnost in vivo jako inhibitory odpovědi bombesinu.
Jiným typem antagonisty bombesinu, popsaným Heimbrookem a d., {Bio. Chem. 1989, 264, 11258), je N-acetyl-GRP(20-26) a jeho analogy, kde je z analogů GRP(20-27) vypuštěn Cterminální methioninový zbytek. Coy [J. Biol. Chem. 264, 1989, 25, 14691] uvádí, že někteří antagonisté bombesinu s krátkým řetězcem na bázi litorinové sekvence, jako je [D-Phe6, Leu13/tfz-PheI4]bombesin(6-14) a [D-Phe6, Leu13-p.sz'-Leu14] bombesin(6-14), vykazují mnohem vyšší účinnost než odpovídající původní peptid [Leu13-psz-Leu14]bombesin.
Lineární (necyklické) bombesinové analogy GRP a bombesin z obojživelníků, obsahující popřípadě nepeptidickou vazbu CH2-NH, jsou popsány v patentové přihlášce PCT č. WO 90/03980 (a příbuzné analogy v WO 91/02746). Tyto analogy, o nichž se uvádí, že působí jako inhibitory přirozených bombesinových peptidů, mají vzorec
Ri > A-A^A^Trp-A-A^-A^-W
R2 kde Rt i R2 je vodík, A° může být vypuštěno; mezi mnoha možnými aminokyselinami v každé poloze A1 může být D-Phe, D-Trp nebo D-Nal., A2 může být Gin, A4 může být Ala, A5 může být Val, A6 může být Gly, A7 může být His a W má vzorec
-2CZ 286750 B6
Re Z] Z2 O
II II
-N-CH-R4-CH-C-V kde R4 je CH2-NH; v určitých případech Z] může být identifikační boční řetězec Leu, tj. -CH2CH(CH3)2; Z2 může být identifikační boční řetězec Cys nebo Met, tj. -CH2-SH nebo (CH2)2-S-CH3; V je N(Ré)R7, kde R^, R7 a Rs mohou být vodík; Ri a R2 mohou být vodík nebo COEi, kde Ei může být C]_20alkyl.
Lineární peptidické analogy bombesinu jsou rovněž popsány v EP 0 309 297. Tyto peptidy mohou mít C-terminální zbytek Met a pseudopeptidíckou vazbu [CFL-NH] mezi C-koncem a sousedním zbytkem.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou nové polypeptidy, které jsou účinnými antagonisty bombesinu, způsoby syntézy těchto polypeptidů, medicínské aplikace včetně farmaceutických prostředků, obsahujících tyto polypeptidy, a těchto polypeptidů a farmaceutických prostředků jako farmaceuticky účinných látek.
A. Syntetické peptidy
Konkrétně jsou prvním předmětem vynálezu pseudopeptidy, antagonistické bombesinu, vzorce I
X-A^-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-A9-^ (I) kde
X je vodík, jednoduchá vazba spojující α-aminoskupinu A1 s gtwwza-karboxylovou skupinou na 3propionylové skupině A2, je-li A2 Glu, nebo skupina vzorce R'CO—, kde R1 je zvoleno ze skupin zahrnujících
a) vodík, C]_iOalkyl, fenyl, fenyl-Ci_iOalkyl, 72-Hl-fenyl, /?-Hl-fenyl-C]_ioalkyl, naftyl, naftyl-Ci_ioalkyl, indolyl, indolyl-Ci_10alkyl, pyridyl, pyridyl—C| ]Oalkyl, thienyl, thienylCi_ioalkyl, cyklohexyl nebo cyklohexyl-Ci_ioalkyl, například kde H1 je F, Cl, Br, OH, CH3 nebo OCH3,
b) R2 >NR3 kde R2 je vodík, Ci_I0alkyl, fenyl nebo fenyl-Ci_iOalkyl, R3 je vodík nebo Ci_]Oalkyl,
c) R4-O, kde R4 je Ci_10alkyl, fenyl nebo fenyl-Ci_iOalkyl,
A1 je zbytek D-, L- nebo DL-aminokyseliny zvolené ze skupiny zahrnujíc Phe, /T-Hl-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, nesubstituovaný Trp nebo Trp substituovaný nebo benzenovém kruhu jedním nebo více členy skupiny zahrnující F, Cl, Br, NH2 nebo Ci_3alkyl, nebo peptidická vazba spojující acylovou skupinu R'CO- s α-aminoskupinu A2,
-3CZ 286750 B6
A2 je Gin, Glu [-], Glu (Y) nebo His, kde [-] je jednoduchá vazba, je-li X jednoduchá vazba a A2 je Glu, spojující ga/nmo-karboxylovou skupinu 3-propionylové skupiny A2 s α-aminoskupinou A1,
Y je
a) -OR5, kde R5 je vodík, C]_3alkyl nebo fenyl, nebo
b) R6 >NR7 kde R6 je vodík nebo C]_3alkyl, R7 je vodík, Ci_3alkyl nebo -NHCONH2, a
Leu-psz je redukovaná forma Leu, kde místo skupiny C=O v Leu je -CH2-, takže vazba této skupiny-CH2- s α-aminoskupinou sousedního zbytku A9 je pseudopeptidická,
A9 je Tac, Mtac, DMTac, Cys nebo Pen a
Q je NH2 nebo -OQ1, kde Q1 je vodík, Ci_10alkyl, fenyl nebo fenyl-Ci_10alkyl, a jejich farmaceuticky přijatelné kyseliny nebo soli.
Je-li A1 jednoduchá vazba, jde v případě pseudopeptidu vzorce I o oktapeptid, ale je-li A1 aminokyselina nebo její analog, jedná se o nonapeptid.
Je-li A9 Tac, Mtac nebo DMTac, pak je v A9 přítomen 5členný heterocyklus. Tento kruh obvykle vzniká oxidací postranního řetězce zbytku A9 v některém okamžiku syntézy nonapeptidu vzorce I, výhodně cyklizací postranního řetězce s α-aminoskupinou A9 pomocí formaldehydu nebo acetaldehydu. Identita vzniklého cyklizovaného zbytku A9 závisí na identitě původního neoxidovaného A9 a použitém oxidačním činidle.
Například jestliže skupina -CH2-SH Cys9 cyklizuje s α-aminoskupinou Cys9, sousedící s pseudopeptidickou vazbou Leu-psí, reakcí s formaldehydem, má vzniklý kruh strukturu vzorce HA (znázorněnou zde jako -Leu8-psí-Tac9-NH2-fragment nonapeptidu vzorce I)
S
A h2c ch2
I I
...NH-CH-CH2-N-CH-CO-NH2 (IIA)
I
CH2-CH(CH3)2
Tyto pseudopeptidy mají větší biologickou aktivitu a delší stabilitu než nekruhové varianty, kde A9 je Cys nebo Pen. Nicméně v určitých výhodných variantách peptidů vzorce I, kde A9 je necyklické, X, A2 a Q mají výše uvedený význam, A9 je Cys nebo Pen a A1 je přirozeně se nevyskytující aminokyselina, vybraná ze skupiny zahrnující L- nebo D-Pal, L- nebo D-Tpi nebo Hca.
-4CZ 286750 B6
V určitých výhodných provedeních X je R'CO, R1 je vodík nebo Ci_iOalkyl (výhodně methyl), A1 je D-Cpa, D-Nal, D-Phe, D- nebo L-Tpi nebo D-Trp, A2 je Gin, A9 je Tac nebo DMTac a Q je NH2.
Je-li však vjiných výhodných provedeních A1 peptidická vazba spojující acylovou skupinu R’CO s α-aminoskupinou A2, pak A2 je Gin nebo His, A9 je Tac, Μ-Tac nebo DM-Tac a Q je NH2. ve výhodné formě těchto peptidů X znamená Hca, Hna, Paa, Mpp, Hpp nebo Naa, A2 je Gin a A9 je Tac.
B. Syntetické metody
Antagonisty bombesinu vzorce I je možno syntetizovat metodou v pevné fázi. Podle prvního protokolu se navazují postupně všechny aminokyseliny jedna po druhé poté, co byl C-terminální zbytek navázán na nosičovou fázi pryskyřice. Jakmile jsou k pryskyřici navázány všechny aminoacylové zbytky, vytvoří se 5členný heterocyklus pseudopeptidu reakcí bočního řetězce Cterminálního zbytku s oxidačním činidlem. Pseudopeptid se pak podrobí působení HF k oddělení od nosiče. Touto reakcí se zároveň odstraní chránící skupiny bočních řetězců.
Podle druhého protokoluje možno pseudopeptidy vzorce I syntetizovat jako dva fragmenty, které jsou vybudovány syntézou v pevné nebo kapalné fázi. Tripeptid, obsahující C-konec, se naváže k oligopeptidu za vzniku celého bombesinového antagonisty vzorce I.
5členný heterocyklus se vytváří reakcí bočního řetězce A9 s oxidačním činidlem. Peptid se pak podrobí působení HF, kterým se odstraní všechny chránící skupiny bočních řetězců aminoacylových zbytků a peptid se odštěpí od piyskyřice.
C. Léčebné aplikace
Pseudopeptidy vzorce I je možno používat ve farmaceutických prostředcích k léčbě určitých typů savčí rakoviny a rovněž dalších stavů, podáváním účinné dávky pseudopeptidu nebo jeho terapeuticky přijatelné kyseliny nebo soli ve farmaceutickém nosiči. Mohou být podávány s farmaceuticky přijatelným nosičem v dávkách asi 1 až 1000 pg na kg tělesné hmotnosti denně. Takový prostředek může být podáván parenterálně, intravenózně, subkutánně, intramuskulámě, intranasálně, ve formě plicního aerosolu nebo v deportní formě.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 graficky znázorňuje účinek podávání určitých antagonistů bombesinu na myší rakovinu mléčné žlázy MXT na základně údajů z tabulky 2 z příkladu 7.
Obr. 2 graficky znázorňuje účinek podávání určitých antagonistů bombesinu na objem nádoru SCLC u nahých myší na základě údajů z tabulky 4 z příkladu 8.
Obr. 3 graficky znázorňuje účinek podávání určitých antagonistů bombesinu na objem pankreatického nádoru MIA PACA-2 u nahých myší na základě údajů z tabulky 5 z příkladu 9.
Obr. 4 graficky znázorňuje účinek podávání určitých antagonistů bombesinu na objem pankreatického nádoru CAPAN-2 u nahých myší na základě údajů z tabulky 6 z příkladu 10.
-5CZ 286750 B6
Popis výhodných provedení
A. Syntetické peptidy
1. Názvosloví
Pro účely popisu tohoto vynálezu se používají konvenční zkratky aminokyselin, peptidů a jejich derivátů, obecně přijímané v oblasti peptidů a doporučené komisí IUPAC-IUB pro biochemickou nomenklaturu [European J. Biochem., 1984, 138, 9-37.
Zkratky pro jednotlivé zbytky aminokyselin jsou založeny na triviálním názvu aminokyseliny, například Ala je alanin, Cys je cystein, Gin je glutamin, Glu je kyselina glutamová, pGlu je kyselina pyroglutamová, Gly je glycin, His je histidin, Leu je leucin, Phe je fenylalanin, Trp je tryptofan a Val je valin. Glu může mít na svém ga/Mwa-karboxylovém bočním řetězci napojeny výše definované funkční skupiny [-] nebo Y. Dpa je kyselina 2,3-diaminopropionová. Má-li zbytek aminokyselin isomemí formy, je zastoupena L-forma, není-li jinak před symbolem aminokyseliny uvedeno D- nebo DL-.
V popisu jsou použity tyto zkratky neobvyklých aminokyselin:
Cpa /7-chlorfenylalanin
Dpa kyselina 2,3-diaminopropionová pGlu kyselina pyroglutamová
Nal 3-(2-naftyl)-alanin
Pal 3-(3-pyridyl)-alanin
Pen penicilamin
Tpi kyselina 2,3,4,9-tetrahydro-l/7-pyrido[3,4-b]indol-3-karboxylová
Tac kyselina tiazolidin-4-karboxylová
MTac kyselina 2-methylthiazolidi—4-karboxylová
DMTac kyselina 5,5-dimethyltiazolidin-4—karboxylová
Zkratky analogů aminokyselin:
Hca kyselina hydroskořicová, des-amino-fenylalanin
Hna kyselina 3-hydroxy-2-naftoová
Hpp kyselina 3-(4-hydroxyfenyl)propionová
Mpp kyselina 3-(4-methoxyfenyl)propionová
Naa kyselina naftyloctová
Paa kyselina fenyloctová
Další použité zkratky:
AC Ac
AcOH BHA Boc (BOC)2O
Bom But Bzl
BSA acyl acetyl kyselina octová benzhydrylamin terč .butoxykarbonyl diterc.butyldikarbonát benzyloxymethyl butyl benzyl hovězí sérový albumin
-6CZ 286750 B6
DIC 1,3-diisopropylkarbodiimid
DMEM Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium
DMF dimethylformamid
Et ethyl
EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová
FCBS fetální telecí sérum
Fmoc 9-fluorenylmethyloxykarbonyl
For formyl
HITES médium RPMI 16 4D plus ΙΟ’8 M hydrokortisonu, 5 μΐ/ml hovězího insulinu, 10 μg/ml lidského transferrinu, ΙΟ'8 M β-estradiolu a 3.1Ο’8 M Na2SeO3
HOBt 1 -hydroxybenzotriazol
HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie
Leu-/?sz redukovaná forma Leu, kde skupina C=O Leu je nahrazena skupinou -CH2takže vazba této skupiny -CH2- s aminoskupinou A9 tvoří pseudopeptidickou vazbu
Me methyl
MeCN acetonitril
MeOH methylalkohol
PBS fosfátem tlumený fyziologický roztok
TEA triethylamin
TFA kyselina trifluoroctová
Peptidické sekvence jsou zapisovány podle konvence, přičemž N-terminální aminokyselina je na levém konci a C-terminální aminokyselina na pravém konci. Je však nutno upozornit, že se zde nedodržuje konvence ohledně číslování aminokyselinových zbytků ve fragmentámím peptidu podle odpovídající polohy v úplném tetradekapeptidu antagonisty bombesinu, není-li uvedeno jinak. Kdyby byla tato konvence dodržována, byly by zbytky ve zde popisovaném nonapeptidu vzorce I číslovány od 6 do 14 a jádro bombesinového antagonisty Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu by bylo číslováno A8-A9-A10-AH-A12-A13. Aby nedošlo k omylu, jsou zde místo toho antagonisté bombesinu číslováni takto: zbytek N-terminální aminokyseliny (nebo analogu aminokyseliny) je A1, zbytek C-terminální aminokyseliny (nebo analogu aminokyseliny) je A9 a mezilehlé zbytky jsou číslovány postupně od A2 (sousedícího s N-terminálním zbytkem A1) vzestupně do A8 (sousedícího s C-terminálním zbytkem A9).
2. Výhodná provedení
Výhodná provedení představuje antagonistické peptidy bombesinu vzorce I
X-A-A^Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-TwzJV-Q (I) kde X, A1, A2, Leu-psí, A9 a Q mají výše uvedený význam.
Tyto pseudopeptidy, antagonistické bombesinu, jsou charakterizovány sekvencí aminokyselin, zejména ve zbytcích A1, A2 a A9, dále přítomností pseudopeptidické vazby mezi A8 a A9 a popřípadě 5členným heterocyklem v A9. Kruhová struktura je určována identitou zbytku A9 a sloučeniny použité kjeho oxidaci. Například je-li použit formaldehyd a A9 je Cas, má vzniklý kruh strukturu Tac vzorce IIA, znázorněnou zde jako fragment Leu8-/wí-Tac9-Q peptidu vzorce I, kdeQjeNH2:
S
A h2c ch2
...NH-CH-CH,-N-CH-CO-NH2 (IIA)
I
CH2-GH(CH3)2
Je-li Cys místo toho oxidován acetaldehydem, má vzniklý 5členný heterocyklus strukturu MTac vzorce IIB (znázorněnou zde jako fragment Leu8-/wz-MTac9-Q peptidu vzorce I, kde Q je NH2):
S
Λ ch3hc ch2
I I
...NH—CH-CH2—N-CH-CO—NIL· (IIB)
CH2-CH(CH3)2
Je-li místo toho A9 Pen a je oxidován formaldehydem, má vzniklý kruh strukturu DMTac vzorce IIC (znázorněnou zde jako fragment -Leu8-psz-DMTac9-Q nonapeptidu vzorce I, kde Q je NH2):
S
A
H2C C(CH3)2
I I
...NH-CH-CHt-N-€H-CO-NH2 (IIA)
I
CH2-CH(CH3)2
V těchto výhodných provedeních je žádoucí, je-li X vodík nebo AC, A1 je D-Phe, A2 je Gin a Q jeNH2.
Zvlášť výhodné pseudopeptidy, antagonistické bombesinu, jsou uvedeny dále:
č. struktura
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/zsz-Tac-NH2
D-Phe-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psí-T ac-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/>5z-MTac-NH2
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-GIy-His-Leu-/wz'-Tac-NH2
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5Z-Tac-NH2
D-Cpa-Gln-Trp-A!a-Val-Gly-His-Leu-/?5/-MTac-NH2
D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5z-Tac-NH2
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5z-Tac-NH2
D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps z-Tac-NH2
D—Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-jP5z-Tac-NH2
Ac-D-Trp-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-^íz-T ac-NH2
Tpi-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psz-T ac-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wz'-Tac-NH2
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz-Tac-NH2
-8CZ 286750 B6
D-Phe-His-Trj>-Ala-Val-Gly-His-Leu-/>5/-Tac-NH2
D-Phe-Glu(OMe)-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-/wz-T ac-NH2 c---------------1
D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- /wz'-Tac-NH2
D-Phe-Gln-Trp-A!a-Val-Gly-His-Leu-psí-DMTac-NH2
Ac-D-Phe-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5z-DMTac-NH2
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/75z'-DMTac-NH2
Tpi-Gln-Trp-AIa-Val-Gly-His-Leu-psz-DMTac-NHi
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5z-DMTac-NH2
Zvlášť výhodná provedení zahrnují:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz-Tac-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-j>sí-Tac-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wz-DMTac-NH2
B. Syntetické metody
1. Přehled
Pseudopeptidy vzorce I je možno připravovat kteroukoli z metod, známých odborníkům v oboru peptidů. Souhrn takto dostupných metod je možno nalézt v M. Bodanszky, Principles ofPeptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.
Všechny pseudopeptidy vzorce I je možno syntetizovat postupy syntézy v pevné fázi. Zvlášť výhodnou metodou přípravy těchto peptidů a jejich peptidických meziproduktů je syntéza v pevné fázi. Metody syntézy výlučně v pevné fázi jsou uvedeny v učebnici J.M. Stewarta J.D. Younga, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2. vyd.) a v přehledu G. Baranyho a d., Int. J. Peptide protein Res., 30, 705-739, 1987. (Dodatečný krok oxidace C-terminálního zbytku A9 kcyklizaci charakteristického bočního řetězce zbytku sjeho α-aminokyselinou může být prováděn v jednom nebo několika bodech syntézy peptidů vzorce I).
Při výrobě pseudopeptidů, antagonistických bombesinu, vzorce I je možno postupovat podle alespoň dvou protokolů. Podle prvního protokolu se navazují postupně všechny aminokyseliny jedna ke druhé poté, co byl C-terminální zbytek A9 navázán na nosičovou fázi pryskyřice. Podle druhého protokolu se na pryskyřici vybuduje tripeptid. Ten se pak naváže k oligopeptidu, nesoucímu zbylé aminokyseliny, za vzniku bombesinového antagonisty. Podle obou protokolů syntéza začíná C-terminálním zbytkem A9 a postupně se přidávají zbytky aminokyselin směrem k N-terminálnímu zbytku.
1. a) První protokol. Nosičovou fázi pryskyřice, použitou při syntéze pseudopeptidů v pevné fázi, může představovat benzhydrylaminová (BHA) pryskyřice nebo chlormethylovaná polystyrénová pryskyřice, zesítěná 1 % divinylbenzenu, které jsou obě komerčně dostupné. C-terminál zbytek A9 se k této pryskyřici připojuje přes svou karboxylovou skupinu. Vzájemné reakci mezi dvěma těmito zbytky se zamezuje navázáním chemické chránící skupiny na α-aminoskupinu každého zbytku A9 před jeho navázáním na pryskyřici. Chrániči skupinou pro α-aminoskupinu zbytku A9 i každého následně navázaného aminokyselinového zbytku může být buď 9-fluorenyImethyloxykarbonylová (Fmoc), nebo terc.butoxykarbonylová (Boc) skupina. Fmoc je výhodná při kondenzaci zbytků od C-terminálního A9 do A2, poněvadž reakcí, kterou se odštěpuje Boc, se odštěpí rovněž skupina chránící boční řetězec C-terminálního zbytku A9. Během těchto vazebních reakcí mohou být charakteristické funkční skupiny bočních řetězců určitých aminokyselinových zbytků navázáním chemické chránící skupiny (pro A9 výhodně But) před kondenzační reakcí rovněž chráněny před nežádoucími chemickými reakcemi.
-9CZ 286750 B6
Poté, co je C-terminál zbytek Fmoc-A9 (But) navázán na nosičovou fázi, odštěpí se chránící skupina z jeho α-aminoskupiny a naváže se na něj Fmoc-Leu-CHO za vzniku pseudopeptidické vazby.
Zbývající zbytky A5, A4, A3 a A2, výhodně chráněné Fmoc, a A1, výhodně chráněný Boc, se pak přidávají postupně v obráceném číselném pořadí (A7, A6 atd.), a tak se konstruuje požadovaný pseudopeptid.
Je-li v pseudopeptidu přítomen His nebo Glu, mohou jejich boční řetězce být ohroženy nežádoucími chemickými reakcemi během jejich vazebních reakcí nebo vazebních reakcí ostatních zbytků. Proto je možno před vazbou těchto aminokyselin vazební reakcí zavést do těchto bočních řetězců chemickou chránící skupinu.
Jakmile jsou k pryskyřici BHA navázány všechny aminoacylové zbytky, je možno z pseudopeptidu odštěpit Boc na N-konci. 5členný heterocyklus Tac, MTac nebo DMTac se vytvoří reakcí přístupné skupiny -CH2-SH Cys (nebo -C(CH3)2SH zbytku Pen) a sekundární aminoskupiny redukované vazby, spojující zbytky A8 a A9 (tj. α-aminoskupinu zbytku A9), s oxidačním činidlem, jako je formaldehyd nebo acetaldehyd. Pseudopeptidický meziprodukt, dosud nesoucí chránící skupiny bočních řetězců, se pak podrobí působení HF k oddělení od nosičové fáze pryskyřice a zároveň k odstranění chránících skupin bočních řetězců.
1. b) Druhý protokol. Podle druhého protokolu metod syntézy v pevné fázi se na BHA pryskyřici vybuduje tripeptid za vzniku pryskyřice s navázaným chráněným tripeptidem:
Boc-His(Bom)7-Leu8-/wz'-Cys(But)9-BHA pryskyřice.
Skupina Boc1 a skupina But se odštěpí a skupina -CH2-SH zbytku Cys se cyklizuje se sekundářním aminem redukované vazby, spojující zbytky A a A , za vzniku His(Bom) -Leu -psí-Tac BHA pryskyřice. Po zpracování HF se získá volný tripeptid His7-Leu8-/wz-Tac9-NH2. Boc-A1A2-Trp-Ala-Val-Gly-OCH2-pryskyřice se vybudují postupně na Gly-OCH2-pryskyřici standardními metodami syntézy v pevné fázi a pak se na 12 h podrobí působení 95% methanolu, obsahujícího 1% K.CN k odštěpení Boc-oligopeptidu. Po zkonstruování obou fragmentů se Boc-oligopeptid pomocí činidla BOP spojí s volným tripeptidem His7-Leus-/?sí-Tac9-NH2. Pak se odštěpí skupina BOC za vzniku požadovaného peptidu.
Před podrobným popisem syntézy antagonistů bombesinu vzorce I se popisuje několik syntetických operací, běžných projeden nebo oba výše popsané protokoly.
2. Obecné operace při syntéze polypeptidů
Operace 1: Tvorba určitých syntetických zbytků nebo činidel
a) L- a D-Tpi: 2,04 g (10 mM) L-Trp se rozpustí ve 25 ml vroucí vody, obsahující 2,1 g kyseliny citrónové. Přidá se 0,5 ml 40% vodného formaldehydu a okamžitě začnou vznikat pevné látky. Směs se chladí na ledové lázni a odebírá se sraženina, která se promyje studenou vodou a vzduchem a pak suší při teplotě místnosti na 2,14 g 99% pevné látky o teplotě tání (za roztoku) cca 310 °C. D-isomer vzniká stejným způsobem z D-Trp a má také teplotu tání (rozklad) cca 310 °C.
b) L- a D-Boc-Tpi: K míchané suspenzi 10,8 g (50 mM)D-Tpi ve 250 ml 0,2 N NaOH a 7,5 ml triethylaminu se přidá 10 g diterc.butyldikarbonátu, směs se míchá 4 h a pak se přidá dalších 10 g dikarbonátu a pak dalších 10 g po dalších 3 h míchání. Směs se míchá přes noc a extrahuje
-10CZ 286750 B6 (2 x 100 ml) etherem; extrakt se zničí. K vodné vrstvě se přidá kyselina citrónová do pH 3 až 5. Pevný podíl se shromáždí, promyje vodou a přes noc suší vzduchem.
Pevný podíl se suspenduje ve 100 ml tetrahydrofuranu. Rozpustí se téměř veškerý pevný podíl. Nerozpustný podíl se odfiltruje a THF se odstraní ve vakuu, zbytek se trituruje s etherem a poskytne 9,20 g, tj. 58%. Tato látka má stejnou teplotu tání jako výchozí látka, ale liší se rozpustností a TLC na silikagelu s použitím CHCl3:MeOH:HOAc 85:15:0,5.
2,55 g L-Tpi poskytuje stejnou metodu 2,22 g, tj. 59 % Boc-Tpi.
c) Fmoc-Leu-CHO
Fmoc-leucinmethylester (35 g, 134 mmol) v suchém toluenu (250 ml) pod N2 se chladí směsí suchý led/aceton a během 30 min se přidá 150 ml 25% diisobutylaluminiumhydridu v toluenu. Směs se po přídavku diisobutylaluminiumhydridu míchá 20 min v lázni suchý led/aceton, pak se opatrně přidá methanol (15 ml). Směs se vlije do 1000 ml ledově studené vody, protřepe a přefiltruje. Toluen se oddělí a vodná fáze se reextrahuuje etherem (3 x 300 ml). Toluenový a etherový extrakt se spojí a suší nad Na2SO4. Vzniklý olej se nechá rychle projít sloupcem silikagelu (3 x 50 cm) v 1500 ml 15% EtOAc/benzín. Jako pevná látka se získá Fmoc-Leu-CHO (27,6 g).
d) Syntetické aminokyseliny nebo analogy aminokyselin, zabudovávané do pseudopeptidů, antagonistických bombesinu, jsou obvykle dostupné z komerčních zdrojů. Například Hca je obchodně dostupný od Aldrich Co., 1001 St. Paul Avenue, Milwaukee, W1 53233. Boc- nebo Fmoc-chráněné aminokyseliny jsou obchodně dostupné od Advenced ChemTech, 5609 Fem Valley Road, Louisville, KY 40228, nebo Bachem Califomia, 3132 Kaschiwa Street, Torrance, CA 90505.
Operace 2: Příprava pryskyřice a přídavek zbytku A9.
Pryskyřice BHA se připraví dvojím 3min působením 10% TEA v CH2C12 (neutralizace) a šestinásobným promytím CH2C12. Zbytek Fmoc-A9 (But) se na pryskyřici naváže přídavkem 1,35 mmol Fmoc-A9 (But) a 1,500 mmol 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) v DMF a 3 min promícháním. Přidá se 20% 1,3-diisopropylkarbodiimid (DIC) s 1,3 mmol vCH2Cl2. Směs se třepe 60 min při teplotě místnosti. Vzniklá Fmoc—A9 (But)-BHA pryskyřice se promyje vždy dvakrát CH2C12 a methanolem a třikrát CH2C12 a pak se podrobí Kaiserovu testu (Anal. Biochem. 34, 595 (1970)).
V případě neúplné kondenzace se procedura opakuje.
Operace 3. Tvorba pseudopeptidické vazby
Odštěpení chránící skupiny Fmoc z A9 se provádí přídavkem 50% piperidinu v DMF a mícháním po dobu 30 min; směs se promyje DMF (6 x 1 min), pak i) se přidá Fmoc-Leu-CHO (3 ekv.) v DMF, obsahujícím 1 % AcOH a ii) se přidá NaBH3CN (3,5 ekv.) v DMF a třepe se 60 min. Nato se provede promytí 50% MeOH (3 x 1 min), 100% MeOH (3 x 1 min) a DMF (3 x 1 min).
Operace 4: Kondenzace aminokyselin a tvorba peptidické vazby
Chrániči skupino pro α-aminoskupinu zbytku A9 a každého následně navázaného aminokyselinového zbytku může být buď 9-fluorenylmethyloxykarbonyIová (Fmoc), nebo terc.butoxykarbonylová (Boc) skupina. Fmoc je výhodná pro kondenzaci od zbytku A9 po zbytek aminokyseliny přímo sousedící s N-terminálním zbytkem aminokyseliny, poněvadž reakcí, kterou se odštěpuje Boc, se zároveň odštěpuje chránící skupina bočního řetězce A9.
-11CZ 286750 B6
A. Použití Fmoc-aminokyseliny
Při zavádění Fmoc-aminokyseliny do Fmoc-peptidového meziproduktu se používá tento postup:
1) Z Fmoc-peptidového meziproduktu se odstraní chránící skupina a provede se neutralizace, pak se promyje CH2C12 (3 x 1 min) a DMF (3 x 1 min).
2) Fmoc-aminokyselina se kondenzuje s peptidovým meziproduktem i) přídavkem Fmoc-aminokyseliny (3 ekv.) a HOBt (3,3 ekv.) v DMF (3 min) k peptidovému meziproduktu, ii) přídavkem 3 ekv. DIC (jako 20% roztok v CH2C12) a třepáním směsi po dobu 90 min.
3) Směs se pak promyje ethanolem (3 x 1 min) a DMF (3x1 min).
Za účelem kondenzace s ostatními zbytky se z nově kondenzované Fmoc-aminokyseliny odstraní chránící skupiny působením 50% piperidinu v DMF po dobu 30 min a promyje se DMF (6 x 1 min). Další kondenzace probíhají jako ve stupni 2.
Pokaždé, když je s pryskyřicí nebo peptidem kondenzována nová aminokyselina, provádí se Kaiserům test; dojde-li k neúplné kondenzaci, reakce se opakuje.
Pro kondenzaci Fmoc-Gly a Fmoc-Gln je stupeň 2 této operace modifikován takto: 3 ekv. DIC (jako 20% CH2C12) se přidají ke směsi DMF-roztoku Fmoc-aminokyseliny (3,0 ekv.) a HOBt (3,3 ekv.) a směs se ponechá 15 min při 0 °C a 15 min při teplotě místnosti. Reakční směs se přidá k peptidové pryskyřici a třepe se 1 h v případě Fmoc-Gly a 2 h, jde-li o Fmoc-Gln.
B. Použití Boc-aminokyseliny
Při zavádění Boc-aminokyseliny do Fmoc-peptidového meziproduktu se postupuje tímto způsobem:
1) Odstraní se Boc skupina přídavkem 50% TFA v Ch2Cl2,
2) po dobu 25 min se přidává 50% TFA v CH2C12 obsahující 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu a
3) promývá se CH2C12 (2x1 min), MeOH (2 x 1 min) a DMF (3 x 1 min).
4) Navázání zbytku Boc-aminokyseliny se provádí přídavkem 3 ekv. Boc-aminokyseliny a 3,3 ekv. HOBt a DMF a mícháním po dobu 3 min. Pak se přidají 3 ekv. 20% diisopropylkarbodiimidu v CH2CI2 a směs se 90 min třepe. Reakční směs se pak promyje MeOH (3x1 min) a pak CH2C12 (3 x 1 min).
5) Skupina Boc se odštěpí promytím produktu stupně 5 50% TFA v CH2C12 s obsahem 5 % merkaptoethanolu (5 min) a 5 % anisolu (25 min). Pak následuje promývání CH2C12 (2x1 min), MeOH (2x1 min) a DMF (3 x 1 min).
Je třeba mít na paměti, že odštěpením skupiny Boc se současně odstraní i chránící skupina But, případně navázaná na boční řetězec A9. Proto se skupina Boc obvykle odštěpuje až těsně před cyklizací zbytku A9.
-12CZ 286750 B6
Operace 5: Tvorba 5členného heterocyklu
Kruhová struktura vzorce IIA se vytvoří třepáním peptidického meziproduktu s chránící skupinou odstraněnou z Cys9 ve směsi 50% AcOH, 3,7% HCHO a DMF (1:1:8) po dobu 3 min při teplotě místnosti a přefiltrováním. Produkt se promyje vždy třikrát DMF, MeOH a CH2CL.
Kruhová struktura vzorce IIB se vytvoří třepáním peptidického meziproduktu s chránící skupinou odstraněnou z Cys9 ve směsi 50% AcOH, 10% CH3CHO a DMF (1,5:0,5:8) po dobu 10 min při teplotě místnosti a přefiltrováním. Produkt se promyje vždy třikrát DMF, MeOH a CH2CI2.
Kruhová struktura vzorce IIC se vytvoří třepáním peptidického meziproduktu s chránící skupinou odstraněnou zPen9 ve směsi 50% AcOH, 3,7% HCHO a DMF (1:1:18) po dobu 10 min při teplotě místnosti a přefiltrováním. Produkt se promyje vždy třikrát DMF, MeOH a CH2C12.
Operace 6: Odštěpení peptidu od pryskyřice
Poté, co byly navázány všechny požadované aminokyselinové zbytky, působí se na peptidový meziprodukt na pryskyřici kapalným HF v přítomnosti anisolu za účelem odštěpení polypeptidu z nosičové fáze. Touto reakcí se rovněž odstraní chránící skupiny bočních řetězců. Při použití pryskyřice BHA je ve výsledném peptidu Q = NH2.
Je-li X jiné než vodík, je skupina X umístěna na N-konci buď zavedením aminokyseliny již nesoucí skupinu X (například Ac-D-Phe), nebo reakcí volné α-aminoskupiny na N-terminálním A1 pseudopeptidického meziproduktu s vhodným činidlem. Například kompletní peptid po oddělení od nosičové fáze může výhodně reagovat s KOCN a pak X = NH2CO-.
Operace 7: Čištění peptidů
Pseudopeptidy vzorce I se obvykle čistí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografíi (HPLC) v koloně s reverzními fázemi v systému Rainin HPLC (Rainin lne., Wobum, MA), tvořeném třemi čerpadly Reinin Rabbit HP HPLC, řízenými počítačem Apple Macintosh Plus, injektorem Rheodyne a monitorem UV s měnitelnou vlnovou délkou Knauer model 87. Surové peptidy (10 až 40 mg) se nastříknou do kolony Dynamax Macro (21,2 x 250 mm), plněnou sférickým silikagelem Cig (velikost pórů 300 Á, velikost částic 12 pm, Rainin lne. Co.) a vymývají lineárním gradientem s použitím rozpouštědlového systému, tvořeného (A) 1% TFA a (B) 0,1% TFA v 70% vodném acetonitrilu, s průtokem 2,0 ml/min. U všech frakcí se zjišťuje pomocí dále popsané analytické HPLC čistota a retenční doba.
Kvalita a eluční charakteristiky surového a čištěného peptidu se zjišťují analytickou HPLC na kapalinovém chromatografu Hewlett-Packard model 1090, vybaveném detektorem s diodovým polem, nastaveným na 220 a 280 nm a kolonou s reverzními fázemi 4,6 x 250 mm W-porex C]8 (velikost pórů 300 A, velikost částic 5 pm). Udržuje se průtok 1,2 ml/min systému výše popsaných rozpouštědel (A) a (B) a separace se provádějí při teplotě místnosti.
Ve většině případů byli pseudopeptidičtí antagonisté bombesinu dále čištěni rechromatografií na stejné koloně s mírnou modifikací podmínek gradientu. Analytickou HPLC prokázala homogenita čištěných peptidů čistotu nad 97 %.
Je-li to žádoucí, je možno provést analýzu aminokyselin v pseudopeptidech vzorce I v analyzátoru aminokyselin Beckman 6300 na vzorcích, hydrolyzovaných 20 h při 110 °C v zatavených evakuovaných zkumavkách se 4 M kyselinou methansulfonovou s obsahem 0,2 % 3-(2aminoethyl)-indolu.
-13CZ 286750 B6
C. Syntetické meziprodukty
1. Chránící skupiny postranních řetězců
Při syntéze v pevné fázi je obvyklé chránit reaktivní funkční skupiny v postranních řetězcích různých aminokyselinových zbytků nebo peptidových fragmentů. Tyto funkční skupiny postranních řetězců mohou být chráněny proti nežádoucí chemické reakci na těchto řetězcích. Proto je běžné vyrobit peptidický meziprodukt, který obsahuje v peptidickém řetězci všechny aminokyselinové zbytky v požadované sekvenci a s chránícími skupinami postranních řetězců navázanými na příslušných zbytcích.
Při volbě konkrétní chránící skupiny postranního řetězce při syntéze peptidů se obvykle dodržují tato pravidla: a) chránící skupina si obvykle podržuje své chránící vlastnosti za podmínek kondenzace, b) chránící skupina by měla být stabilní vůči kondenzačním činidlům, výhodně je stabilní za podmínek kondenzační reakce zvolených k odstranění chránící skupiny a-aminoskupiny v každém stupni syntézy a c) chránící skupina postranního řetězce musí být odštěpitelná po dokončení syntézy požadované sekvence aminokyselin za reakčních podmínek, které nebudou nežádoucím způsobem ovlivňovat peptidický řetězec.
Chrániči skupiny postranního řetězce se navazuj í na aminokyselinové zbytky známými metodami. Vhodné chránící skupiny postranního řetězce His zahrnují Bom a pro Glu a Cys zahrnují But.
2. Syntetické meziprodukty
Za spadající do rozsahu vynálezu se rovněž považují peptidické meziprodukty v následujících stupních syntézy. Zde jsou znázorněny peptidické meziprodukty peptidů 2 ve třech stupních:
stupeň A: po navázání všech aminokyselin a pryskyřice:
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p5Í-Cys(But)-BHA pryskyřice ( 1/02/A) stupeň B: po odstranění N-terminální skupiny Boc:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Cys(But)-BHA pryskyřice ( 1 /02/B) stupeň C: po cyklizaci A9:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?5/-Tac-BHA pryskyřice ( 1/02/C)
Existuje jeden další stupeň, stupeň D, znázorněný dále v syntéze peptidů č. 17 v příkladu 2. Meziprodukt stupně D se odštěpí z pryskyřice, avšak nemá ještě jednoduchou vazbu X, spojující A1 s A2.
TERAPEUTICKÉ APLIKACE
Sloučeniny antagonistické bombesinu jsou vhodné k léčbě hypergastrinemických stavů, například pemiciosní anemie, chronické atrofické gastritidy, Zollinger-Ellisonova syndromu a vitiliga, spojených s difusní hyperplasií gastrických buněk podobných enterochromaffinu a se zvýšeným rizikem vývinu multifokálních gastrických karcinoidních tumorů. Hyperplasie buněk podobných enterochromaffinu navíc snadno vzniká u hypergasrinemických zvířat.
-14CZ 286750 B6
Taková léčba je oproti současným léčivům výhodná, poněvadž H2-antagonisté, jako je cimetidin, vyvolávají hypergastrinemii a mohou vést u lidí ke karcinoidním tumorům. Navíc přerušení léčby H2-antagonisty vyvolává okamžitý návrat vředů v důsledku trvající hypergastrinemie.
Protože sloučeniny podle vynálezu jsou antagonistické receptorům bombesinu/GRP, je možno je používat při léčbě rakoviny plic, rakoviny tlustého střeva a rakoviny žaludku.
Antagonisty bombesinu vzorce I podle vynálezu je možno podávat ve formě farmaceuticky přijatelných netoxických kyselin nebo solí, jako jsou adiční soli s kyselinami. Příklady takových adičních solí s kyselinami jsou hydrochlorid, hydrobromid, síran, fosforečnan, fumarát, glukonát, sůl kyseliny tříslové, maleát, acetát, citrát, benzoát, sukcinát, alginát, pamoát, malát, askorbát, tartrát apod.
Tyto farmaceutické přípravky obsahují pseudopeptidy vzorce I ve spojení s běžným farmaceuticky přijatelným nosičem, například fyziologickým solným roztokem; je však možno použít i jiných známých nosičů.
Léčbu subjektů těmito farmaceutickými přípravky je možno provádět stejným způsobem jako klinické ošetření s použitím jiných agonistů a antagonistů LHRH nebo analogů somatostatinu. Antagonisty bombesinu vzorce I je tedy možno podávat intravenózně, subkutánně, intramuskulámě, intranasálně, formou plicního aerosolu nebo v depotní formě (například jako mikrokapsle, mikrogranule nebo válcovité tyčinkovité implantáty), formulované z vhodného biodegradabilního polymeru (jako je DL-laktid-koglykolid). Do rozsahu vynálezu spadají i jiné rovnocenné způsoby podávání, tj. trvalá kapačka, infuzní pumpa a systémy s časovým uvolňováním, jako jsou mikrokapsle apod.
Účinná dávka peptidů vzorce I se liší podle formy podávání a konkrétního druhu ošetřovaného savce. Dávka činí asi 1 až asi 1000 pg peptidu na kg tělesné hmotnosti hostitele za den při parenterálním podání. Tato rozmezí dávek jsou pouze výhodná a za příslušných podmínek je možno volit vyšší dávky. Je možno podávat fyziologický solný roztok, umožňující dávkování v rozmezí asi 0,01 až 0,20 pg/kg tělesné hmotnosti za den, s výjimkou depotních forem, kde se injekčně aplikované množství počítá tak, aby vydrželo asi 15 až asi 30 dní nebo déle.
Příklady provedení vynálezu
V následujících příkladech se k označení peptidických meziproduktů v určitých stupních syntézy používá třímístný kód. Peptid, kódovaný jako 1/01/A, je peptidický meziprodukt peptidu „01“, vyráběného v příkladu „1“, po dokončení stupně A syntézy. Podobně „2/08/B“ a „4/19/C“ jsou meziprodukty peptidu „08“, resp. „19“, v příkladu 2, resp. 4, po dokončení stupně B, resp. C syntézy.
Příklad 1 peptid #
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wz-Tac-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tac-NH2
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz-Tac-NH2
D-Cpa-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-/xsz-T ac-NH2
D—Nal-Gln-Trp—Ala-Val—Gly-His-Leu—psř-Tac—NH2
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/75z-Tac-NH2
-15CZ 286750 B6
D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/zs7-Tac-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5z-Tac-NH2
Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5z-Tac-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5z-Tac-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz-Tac-NH2
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5z'-Tac-NH2
Tyto peptidy mohou být výhodně syntetizovány ze společného meziproduktu 1-1
Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-£>sz-Cys(But)-BHA pryskyřice, a postupuje se následujícím způsobem.
Fmoc-Leu-/25z'-Cys(But)-BHA pryskyřice se připraví takto: 2,0 g pryskyřice BHA (0,55 mmol NH2/g) se preparuje působením 20 ml 10% TEA v CH2C12 (neutralizace) dvakrát vždy po 3 min a promytí šestkrát 20 ml CH2C12; pak se 3 min míchá s 3,3 mmol Fmoc-Cys(But) a 3,6 mmol HOBt v DMF. Přidá se 3 ekv. DIC (jako 20% roztok v CH2C12). Směs se třepe 90 min při teplotě místnosti. Vzniklá Fmoc-Cys(But)-BHA pryskyřice se promyje vždy dvakrát CH2C12 a methanolem a třikrát CH2C12 a pak podrobí Kaiserovu testu.
Navázání Fmoc-Lue-CHO za vzniku pseudopeptidické vazby se provádí následujícím způsobem. Odštěpení skupiny Fmoc z A9 se provede přídavkem 15 ml 50% piperidinu v DMF, mícháním po dobu 30 min a promytím 15 ml DMF (6 x 1 min). Pak se přidá 3,3 mol Fmoc-LeuCHO (3 ekv.) v DMF s obsahem 1 % AcOH a pak NaBH3CN (3,5 ekv.) v DMF a třepe se 1 h. Pak se provede promytí 15 ml 50% meOH (3 x 1 min), 15 ml 100% MeOH (3 x 1 min) a 15 ml DMF (3 x 1 min).
Odštěpení skupiny Fmoc z Fmoc-Leu-/?5z'-Cys(But)-BHA pryskyřice se provede operací 4A.
Po odštěpení skupiny Fmoc z Fmoc-Leu-/zsz'-Cys(But)-BHA pryskyřice a neutralizaci se provede navázání Fmoc-His(Bom) podle operace 4A.
Navázání Fmoc-Gly se provádí podle operace 4. K DMF roztoku 3,3 mmol Fmoc-Gly a 3,6 mmol HOBt o teplotě 0 °C se přidá 20% 1,3-diisopropylkarbodiimidu (3,3 mmol) v CH2C12 a míchá se 15 min za chlazení a 15 min při teplotě místnosti, sraženina se odfiltruje a přidá k pryskyřici a třepe se 60 min. Pak se postupně stejným způsobem naváží následující aminokyselinové zbytky Fmoc-Val, Fmoc-Ala a Fmoc-Trp za vzniku 3,80 g meziproduktu I—1, tj. chráněného peptidů navázaného na pryskyřici se strukturou Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/uz-Cys(But)-BHA pryskyřice.
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-D-pGlu na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Boc-D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?5z'-Cys(But)-GHA pryskyřice (1/01/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-D-Phe na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Boc-D-Phe-Gln—Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Cys(But)-BHA pryskyřice (1/02/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Ac-D-Phe na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Ac-D-Phe-Gln-T rp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wz-Cys(But)-BHA pryskyřice ( 1/04/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-D-Cpa na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?sz'-Cys(But)-BHA pryskyřice (1/05/A).
-16CZ 286750 B6
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-D-Nal na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Boc-E>-Nal-Gln-Trp-Ala-Vla-Gly-His(Bom)-Leu-psř-Cys(But)-BHA pryskyřice ( 1/07/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-Pal na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Cys(But}-BHA pryskyřice ( 1/08/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-D-Pal na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz'-Cys(But)-BHA pryskyřice (ΓΊ/09/Α).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-D-Trp na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Cys(But)-BHA pryskyřice (1/10/A”).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Ac-D-Trp na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?sz-Cys(But)-BHA pryskyřice (1/11/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-Tpi na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-ps/-Cys(But)-BHA pryskyřice ( 1/12/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-D-Tpi na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Vla-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Cys(But)-BHA pryskyřice (1/13/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Hca na peptidický meziprodukt 1-1 se získá Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz'-Cys(But)-BHA pryskyřice ( 1/14/A).
N-terminální skupina Boc peptidického meziproduktu 1/01/A se pak odštěpí působením 50% TFA v CH2C12 s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu nejprve po dobu 5 min a pak znovu po dobu 25 min. Peptidický meziprodukt se pak promyje CH2C12 (2krát 1 min), MeOH (2 krát 1 min) a DMF (3krát 1 min). Tím se současně odštěpí chránící skupina But z Cys a získá se peptidický meziprodukt
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/>sz'-Cys-BHA pryskyřice ( 1/01/B), který se pak promyje CH2C12, MeOH a DMF, vždy třikrát po dobu 1 min.
V tomto okamžiku se cyklizuje postranní řetězec Cys peptidického meziproduktu 1/01/B oxidací za vzniku 5členného heterocyklu, znázorněného vzorcem IIA, operací 5. Přidá se 10 ml směsi AcOH, 3,7 % HCHO a DMF (1:1:8). Reakční směs se třepe 3 min při teplotě místnosti, promyje vždy třikrát vodou DMF a CH2C12 a získá se peptidický meziprodukt 1/01 PC D-pGlu-Gln-Trp-AIa-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Tac-BHA pryskyřice.
Na peptidický meziprodukt 1/01/C se pak působí HF a anisolem podle operace 6 za účelem odstranění chránící skupiny Bom z His a současného odštěpení nonapeptidu z nosičové fáze pryskyřice, načež je C-terminální Q skupinou -NH2. Peptid se v operaci 7 čistí HPLC. Získá se tak bombesinu antagonistický peptid č. 1.
Stejné stupně, při nichž se odštěpuje skupina Boc a But a skupina -CH2-SH Cys se cyklizuje sekundárním aminem redukované vazby, se provedou u peptidických meziproduktů 1/02/A, 1/05/A, 1/07/A, 1/08/A, 1/09/A, 1/10/S a 1/12/A za vzniku následujících peptidických meziproduktů:
1/02/B D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-jp5/-Tac-BHA prysk.
1/04/B Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bomý-Leu-/>sí-Tac-BHA prysk.
1/05/B D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/zsz-Tac-BHA prysk.
-17CZ. 286750 B6
1/07/B D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?5z-Tac-BHA prysk.
1/08/B Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Tac-BHA prysk.
1/09/B D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/25z-Tac-BHA prysk.
1/10/B D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-7?5z-Tac-BHA prysk.
1/11/B Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wz-Tac-BHA prysk.
1/12/B Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?5z-Tac-BHA prysk. 1/13/B D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Tac-BHA prysk.
1/14/B Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/25z-Tac-BHA prysk.
Surové peptidy se odštěpí od BHA pryskyřice a pak se v operacích 6 a 7 čistí za vzniku čistých peptidů 2, 4, 5 a 7 až 14.
Retenční časy těchto peptidů jsou následující:
Analytické údaje HPLC
č. peptidů gradient % B/min retenční čas na koloně D
1 25-65 14,40
2 25-65 14,20
4 25-75 15,17
5 25-65 16,11
7 20-60 23,75
8 20-60 13,19
9 25-65 12,00
10 25-65 16,98
11 25-65 24,50
12 25-65 19,91
13 25-65 16,99
14 40-80 13,68
Alternativně je možno 5ělenný heterocyklus vytvořit v roztoku následujícím postupem:
mg peptidického meziproduktu, zahrnujícího strukturu Leu-/J5z'-Cys-NH2, získaného syntézou v pevné fázi, v 0,8 ml ledové kyseliny octové se míchá 30 s při teplotě místnosti se 100 μΐ 1% formaldehydu (hm. koncentrace roztoku ve vodě) a pak se přidá 20 μΐ 50% roztoku acetátu amonného. Reakční směs se podrobí čištění a poskytne požadovaný peptid, který obsahuje strukturu -Leu-psz-Tac-NH2.
Příklad 2 peptid #
D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/»5z-Tac-NH2
D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psz-Tac-NH2
E--------------1
D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- psz-Tac-NH2
Peptidy v tomto příkladu je možno výhodně syntetizovat ze společného meziproduktu 1-2 Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?sz'-Cys(But)-BHA pryskyřice, vybudovaného postupně na 0,5 g BHA pryskyřice (0,55 mmol NH2/g). Peptidický meziprodukt 1-2 se připraví s použitím operací a postupů uvedených v příkladu 1. Podíl 150 mg meziproduktu 1-2 se pak rozdělí na 3 elikvoty a podrobí se dvěma dalším kondenzacím postupem, popsaným v operaci 4, za vzniku finálních nonapeptidů navázaných na pryskyřici.
-18CZ 286750 B6
Postupným navázáním Fmoc-His(Bom) a Boc-D-Phe na peptidický meziprodukt 1-2 se získá Boc-D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psA-Cys(But)-BHA pryskyřice (2/15/A).
Postupným navázáním Fmoc-Glu(OMe) a Boc-D-Phe na peptidický meziprodukt 1-2 se získá Boc-D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/75z-Cys(But)-BHA pryskyřice (2/16/A).
Postupným navázáním Fmoc-Glu(But) a Boc-D-Phe na peptidický meziprodukt 1-2 se získá Boc-D-Phe-Glu(But}-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz'-Cys(But)-BHA pryskyřice (2/17/A).
Odštěpení skupiny Boc z peptidického meziproduktu 2/15/A se provede působením 50% TFA v CH2CI2 s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5% anisolu podle operace 4. Touto reakcí se současně odštěpí skupina But ze zbytku A9 a získá se peptidický meziprodukt 2/15/B: D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wZ-Cys-BHA pryskyřice ( 1/01/B).
V tomto okamžiku se cyklizuje postranní řetězec Cys peptidického meziproduktu 2/15/B oxidací za vzniku 5členného heterocyklu, znázorněného vzorcem IIA, operací 5. Přidá se 10 ml směsi AcOH, 3,7 % HCHO a DMF (1:1:8). Reakční směs se třepe 3 min při teplotě místnosti, promyje vždy třikrát vodou, DMF a CH2CI2 a získá se peptidický meziprodukt 2/15/C: D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/>5z-Tac-BHA pryskyřice.
Na peptidický meziprodukt 2/15/C se pak působí 1 h při 0 °C čerstvě předestilovaným HF (5 ml) a anisolem (0,25 ml), čímž se odstraní chránící skupina Bom z His. Ve vakuu se odpaří rozpouštědlo a zbytek se promyje ethylacetátem, extrahuje 70-80% vodnou kyselinou octovou a lyofilizuje. Po přečištění se získá bombesinu antagonistický peptid č. 15.
Stejné stupně, při nichž se odštěpuje N-terminální skupina Boc, cyklizuje se Cys9, peptidický meziprodukt se odštěpuje od BHA pryskyřice a provádí se čištění HPLC, se provedou u peptidických meziproduktů 2/16/A a 2/17/A a získá se peptid č. 16 a peptidický meziprodukt 2/17/D: D-Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?5/-Tac-NH2.
Směs 15 mg 2/17/D a 15 mg HOBt v 0,8 ml DMF o teplotě 0 °C se přidá k 50 μΐ 25% diisopropylkarbodiimidu v CH2C12 a směs se 2 h míchá při 0 °C. V peptidů 17 se vytvoří jednoduchá vazba, spojující α-aminoskupinu D-Phe1 s gíwwwa-karboxylovou skupinou 3-propionylové skupiny Glu2 LD-Phe-Glu[-!-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-píř'-Tac-NH2.
Reakční směs se podrobí čištění HPLC podle operace 7.
Retenční časy těchto peptidů jsou následující:
Analytické údaje HPLC
peptidů gradient % B/min retenční čas na koloně D
15 20-60 17,23
16 25-65 19,13
17 20-60 20,34
-19CZ 286750 B6
Příklad 3 peptid #
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz-MTac-NH2
D-Cpa-G ln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-píz-MTac-NH2
Tyto antagonisty bombesinu je možno syntetizovat ze společného meziproduktu 1-3, tj.
Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p5/-Cys(But)-BHA pryskyřice. Ten se vybuduje na 1,0 g BHA pryskyřice (0,55 mmol) NH2/g) postupnou kondenzací metodou v pevné fázi, popsanou v příkladu 1 počínaje s Fmoc-Cys(But) přes Fmoc—Leu-CHO (s NaBH3CN) a FmocHis(Bom) atd. podle příkladu 1. Podle operace 4 se na N-nakonec naváže Fmoc-Gln za vzniku meziproduktu 1-3. Konečná kondenzace Boc-D-Phe nebo Boc-D-Cpa s meziproduktem 1-3 se provádí postupy, uvedenými v operaci 4, za vzniku peptidických meziproduktů 3/3/A, resp.
3/6/A.
Odštěpení skupiny Boc se provádí pomocí 50% TA v CH2C12 s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu podle operace 4.
V tomto okamžiku se cyklizuje postranní řetězec Cys peptidického meziproduktu 3/3/B oxidací za vzniku 5členného heterocyklu, znázorněného ve vzorci IIB, podle operace 5. Přidá se 10 ml směsi 50% AcOH, 10% CH3CHO a DMF (1,5:0,5:5,8). Reakční směs se třepe 10 min při teplotě místnosti, promyje vždy třikrát vodu, DMF a CH2C12 a získá se peptidický meziprodukt 3/3PC: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/7s/-MTac-BHA pryskyřice.
Meziprodukty 3/3/C a 3/6/C se od pryskyřice odštěpí podle operace 6 působením HF (5 ml) a anisolu (0,25 ml) při 0 °C po dobu 1 h. Tímto postupem se rovněž odštěpí chránící skupina Bom z His a získají se finální nonapeptidy 3 a 6.
Peptidy se čistí HPLC podle operace 7; jejich retenční časy jsou následující:
Analytické údaje HPLC
č. peptidů gradient % B/min retenční čas na koloně D
25-65 15,71
25-65 17,37
Alternativně je možno 5členný heterocyklus vytvořit v roztoku tak, že se 25 ml peptidického meziproduktu, obsahujícího strukturu Leu-psí-Cys-NH2, v 0,8 ml ledové kyseliny octové míchá při teplotě místnosti se 100 μΐ 10% acetaldehydu. Směs se míchá 5 min; pak se přidá 100 μΐ acetátu amonného. Reakční směs se podrobí čištění a poskytne požadovaný peptid, který obsahuje strukturu Leu-psz-MTac-NH2.
Příklad 4 peptid #
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz-DMTac-NH2
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz-DMTac
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/?sz'-DMTac-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz'-DMTa-NH2
D-Tp i-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz-DMTac-NH2
-20CZ 286750 B6
Tyto polypeptidy je možno výhodně syntetizovat ze společného meziproduktu 1-4 Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wí-Pen(But)-BHA pryskyřice. Tento meziprodukt se postupně vybuduje na benzhydrylaminové (BHA) pryskyřici standardními metodami syntézy v pevné fázi, popsanými v příkladech 1 a 2.
Přitom se podle operace 2 připraví 1,0 g BHA pryskyřice (0,55 mmol NH2/g) působením dvakrát vždy po dobu 3 min 10 ml 10% TEA v CH2CI2 (neutralizace); pak se míchá 3 min s 1,6 mmol Fmoc-Pen(But) a 1,8 mmol 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) vDMF. Přidá se 1,6 mmol 20% 1,3-diisopropylkarbodiimidu (DIC) v CH2CI2. Směs se třepe 90 min při teplotě místnosti. Vzniklá Fmoc-Pen(But)-BHA pryskyřice se promyje vždy dvakrát CH2CI2 a methanolem a třikrát CH2C12 a pak se podrobí Kaiserovu testu.
Odštěpení chránící skupiny Fmoc z Fmoc-Pen(But)-BHA pryskyřice se provádí podle operace A4.
Kondenzace s Fmoc-Leu-CHO se provádí podle operace 3. A9 (But)-BHA pryskyřice se promyje 2krát DMF. Pak se přidá 1,6 mmol Fmoc-Leu-CHO v DMF s obsahem 1 % AcOH a pak 1,8 mmol NaBH3CN v DMF. Reakční směs se 60 min třepe a pak se promyje 2krát 50% methanolem v H2O, 2 krát 100% MeOH a 3 krát CH2CI2, vždy po dobu 1 min.
Po odštěpení skupiny Fmoc z Fmoc-Leu-psú-Pen(But)-BHA pryskyřice a neutralizaci se podle operace 4 provede kondenzace s Fmoc-His(Bom).
Kondenzace s Fmoc-Gly se provede podle operace 4. KDMF roztoku 1,5 mmol Fmoc-Gly a 1,65 mmol HOBt o teplotě 0 °C se přidá 20% 1,3-diisopropylkarbodiimid (1,5 mmol) VCH2CI2, směs se míchá 15 min za chlazení a 15 min při teplotě místnosti, sraženina se odfiltruje a přidá k pryskyřici a třepe se 60 min. Pak se stejným způsobem naváží následující zbytky Fmoc-Val, Fmoc-Ala a Fmoc-Trp a získá se 1,9 g meziproduktu 1-4, tj. chráněného peptidů na pryskyřici o struktuře Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/>s/-Pen(But)-BHA pryskyřice.
0,91 g meziproduktu 1-4 se rozdělí na pět alikvotů (po asi 200 mg), které se použijí k syntéze chráněných peptidů na pryskyřici postupy popsanými v operaci 4:
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-D-Phe na peptidický meziprodukt 1-4 se získá Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Pen(But)-BHA pryskyřice (4/18/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Ac-D-Phe na peptidický meziprodukt 1—4 se získá Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Pen(But)-BHA pryskyřice (4/19/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-D-Cpa na peptidický meziprodukt 1-4 se získá Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Pen(But)-BHA pryskyřice (4'720/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-Tpi na peptidický meziprodukt 1-4 se získá Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/w/-Pen(But)-BHA pryskyřice (4/21/A).
Postupným navázáním Fmoc-Gln a Boc-Tpi na peptidický meziprodukt 1-4 se získá Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val—Gly—His(Bom)-Leu-/?5z-Pen(But)-BHA pryskyřice (4/22/A).
Z peptidického meziproduktu 4/18/A se pak odštěpí skupina Boc pomocí 50% TFA v CH2CI2 s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu za vzniku peptidického meziproduktu 4/18/B:
-21CZ 286750 B6
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-j?5Í-Pen BHA pryskyřice.
V tomto okamžiku se podle operace 5 cyklizuje postranní řetězec Pen v peptidickém meziproduktu 4/18/B oxidací za vzniku 5členného heterocyklu znázorněného ve vzorci IIC. Přidá se 10 ml směsi AcOH, 3,70 HCHO a DMF (1:1:8) za vzniku reakční směsi, která se 3 min třepe při teplotě místnosti, promyje vždy 3krát vodou, DMF a CH2CI2 a získá se peptidický meziprodukt 4/18/C:
D-Phe-Gl n-T rp-Ala-V al-G ly-His(Bom)-Leu-psz-DMT ac-BHA pryskyřice.
Peptidický meziprodukt 4/18/C se pak promyje vždy třikrát 5 ml CH2C12, methanolem a CH2C12 a pak se na něj 1 h působí čerstvě předestilovaným HF (5 ml) a anisolem při 0 °C. Ve vakuu se odpaří rozpouštědlo, zbytek se promyje etherem nebo ethylacetátem a pak extrahuje 70-80% kyselinou octovou a lyofilizuje na surový nonapeptid na pryskyřici. Přečištěním reakční směsi se získá bombesinu antagonistický peptid č. 18.
Stejné stupně, při nichž se odstraňují chránící skupiny, cyklizuje se nechráněný A9 a peptidický meziprodukt se odštěpuje od pryskyřice, se provedou na peptidických meziproduktech 4/19/A, 4/20/A, 4/21/A a 4/22/A za vzniku peptidů č. 19, 20, 21 a 22.
Čištění se provádí pomocí HPLC s rozpouštědlovým systémem tvořeným (A) 0,1% TFA a (B) 1% TFA v 70% acetonitrilu podle operace 7. Přečištěné peptidy vykazují při analytické HPLC čistotu nad 97 %. Retenční časy těchto peptidů jsou následující:
Analytické údaje HPLC
peptidu gradient % B/min retenční čas na koloně D
18 25-65 14,01
19 25-65 22,96
20 25-65 15,97
21 25-65 19,19
22 25-65 16,53
Alternativně je možno zbytek A9 cyklizovat v roztoku tak, že se 25 mg volného peptidu, obsahujícího strukturu -Leu-/wz-Pen-NH2, přidá k 25 mg HOBt v 0,8 ml ledové kyseliny octové, smísí se se 100 μΐ 10% formaldehydu a míchá 30 min při 0 °C za vzniku peptidu s 5člennou kruhovou strukturou Leu-psz-DMTac-NH2.
Příklad 5
Pal-GIn-Trp—Ala-Val-Gly-His-Leu-psz'-Cys-NH2 D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-^z-Cys-NHi Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wz-Cys-NH2 D-T pi-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-/?sz'-Cy s-NH2 Hca-Oln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-p5z'-Cys-NH2
Tyto peptidy je možno syntetizovat ze společného meziproduktu 1-5 Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p5z'-Cys(But)-BHA pryskyřice.
Fmoc-Leu-psz-Cys(But)-BHA pryskyřice se získá takto: 1,0 g BHA pryskyřice (0,55 mmol NH2/g) se kondenzuje způsob uvedeným v operacích 2 a 3 postupně s Fmoc-Cys(But) a FmocLeu-CHO.
-22CZ 286750 B6
Postupnou kondenzací s Fmoc-His(Bom), Fmoc-Gly, Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Trp a Fmoc-Gln se získá peptidický meziprodukt 1-5:
Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psí-Cys(But)-BHA pryskyřice.
Alikvot 150 mg tohoto meziproduktu 1-5, společného všem peptidům v tomto příkladu, se podrobí postupy popsanými v operaci 4 jedné další kondenzaci za vzniku konečných peptidů na pryskyřici.
Postupným navázáním Boc-Pal na peptidický meziprodukt 1-5 se získá Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wz'-Cys(But)-BHA pryskyřice (5/08/A).
Postupným navázáním Boc-D-Pal na peptidický meziprodukt 1-5 se získá Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz'-Cys(But)-BHA pryskyřice (5/09/A).
Postupným navázáním Boc-Tpi na peptidický meziprodukt 1-5 se získá Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Cys(But)-BHA pryskyřice (5/12/A).
Postupným navázáním Boc-D-Tpi na peptidický meziprodukt 1-5 se získá Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-JD5Í-Cys(But)-BHA pryskyřice (5/13/A).
Postupným navázáním Hca na peptidický meziprodukt 1-5 se získá Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p5z'-Cys(But)-BHA pryskyřice (5/14/A).
N-terminální skupina Boc se z peptidického meziproduktu 5/01/A odštěpí nejprve 5min a pak 25 min působením 50% TFA v CH2C12 s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu. Tímto zpracováním se odštěpí i chránící skupina Cys. Peptid se pak promyje podle operace 4 CH2C12, MeOH a DMF za vzniku peptidického meziproduktu 5/08/B: Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz-Cys-BHA pryskyřice.
Na peptidický meziprodukt 5/08/B se pak působí 1 h čerstvě předestilovaných HF (5 ml) a anisolem (0,25 ml) při 0 °C, čímž se současně odštěpí chránící skupina Bom z His. Po odpaření rozpouštědla ve vakuu se zbytek promyje ethylacetátem, extrahuje 70-80% kyselinou octovou a lyofilizuje za vzniku peptidů Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-jzw-Cys-NH^
Z peptidických meziproduktů 5/08/A, 5/09/A, 5/11/A, 5/12/A, 5/13/A a 5/14/A se odštěpí chránící skupina a BHA pryskyřice za vzniku peptidů uvedených v úvodu příkladu. Ty se podrobí testu čistoty podle operace 7.
Analytické údaje HPLC
peptidů gradient % B/min retenční čas na koloně D
5/08 20-60 5,56
5/09 25-65 4,60
5/12 25-65 12,78
5/13 25-65 9,62
5/14 40-80 7,39
Alternativně je možno tyto peptidy výhodně vybudovat postupně na BHA pryskyřici standardními metodami syntézy v pevné fázi s Boc-chráněnými aminokyselinami a s ochranou skupiny -SH v Cys9 skupinou Bz, za vzniku následujících peptidických meziproduktů: Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-p5z'-Cys(Bz)-BHA pryskyřice (5/08/A) Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psz'-Cys(Bz)-BHA pryskyřice (5/09/A) Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/wz-Cys(Bz)-BHA pryskyřice (5/12/A)
-23CZ 286750 B6
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-/?5z-Cys(Bz)-BHA pryskyřice (5/13/A”) Hca-Gln-Trp-AIa-V al-Gly-His(Bom)-Leu-/wz'--Cys(Bz)-BHA pryskyřice ( 5/14/A).
Skupina Boc se odštěpí působením 50% TFA v CH2C12 s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu a pak se působením HF a anisolu odštěpí peptid od pryskyřice a současně se odstraní chránící skupina Bom z His a Bz z Cys za vzniku peptidů uvedených na začátku příkladu.
Příklad 6 - zkušební postupy
A) Test vazby na receptory
Vazba 125I-Tyr4-bombesinu a jeho odštěpení antagonistickými pseudopeptidy se testuje na 24jamkových tkáňových kultivačních plotnách (GIBCO) s použitím buněk Swiss 3T3. Myší fibroblasty Swiss 3T3 se udržují každotýdenním průchodem DMEM s obsahem 10% FCBS a antimykotik. Kultury se inkubují při 37 °C ve vzduchu s 5% CO2. Jamky se očkují 105 buněk/jamku (životnost > 95 %) a kultivují do souvislého nárůstu a klidového stavu. Vazebná procedura se provádí 7 dní po zaočkování. Buňky se promyjí 2krát 0,5 ml vazebního pufru (Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium s obsahem 20 nM HEPES-NaOH o pH 7,4, 0,2 % BSA a 100 pg/ml bacitracinu). Buňky se pak inkubují s 0,2nM 125I-Tyr4-bombesinem v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentrací antagonistů (6.10'11 až 6.1 θ'6 M, celkový objem 0,4 ml).
Buňky se inkubují 30 min při 37 °C, poněvadž vazba 125I-GRP při 37 °C dosahuje po 30 min maxima a pak klesá, jak uvádí Zachary a Rozengurt (1985) a Layton a d. (1988). Potom se buňky promyjí 2krát ledovým (4 °C) vazebním pufrem a 2krát ledovým fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS, mM): NaCl 138, KC1 2,8, Na2HPO4 8, KH2PO4 1,45, CaCl2 0,91, MgCl2 0,49. Pro měření se promyté kultury extrahují 0,5 ml 0,5M NaOH a přenesou do zkumavek. Jamky se promyjí jednou 0,5 ml destilované vody (sterilní) a tento roztok se přidá do příslušných zkumavek. Pak se měří na automatickém gamma čítači (Micromedic Systém, lne., Huntsville, Ala.) radioaktivita vzorků.
S pomocí komputerizovaného programu aproximace křivky Ligand-PC se stanoví typy vazby receptor, disociační konstanta (Kd), asociační konstanta (Ka) a maximální vazebná kapacita receptorů (Bmax).
Vazebné údaje pro polypeptidy podle vynálezu jsou uvedeny v tabulce I. Různé dávky neznačeného peptidů byly použity ke stanovení schopnosti potlačení specifické vazby 125I-Tyr4bombesinu. Pro každý peptid je uvedena střední hodnota z 2 až 3 nezávislých testů (každý proveden třikrát).
Tabulka 1. Inhibice vazby 125I-Tyr4-bombesinu na Swiss 3T3
č. peptidů buňky při antagonistech bombesinu KJnM]
01 5,0
02 0,078
03 13
04 13
05 0,007
06 4,3
07 0,009
08 4,5
09 8,8
-24CZ 286750 B6
Tabulka 1. Inhibice vazby 125I-Tyr4-bombesinu na Swiss 3T3 - pokračování
č. peptidu
D-T pi-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psz-Leu -NH2 bombesinb buňky při antagonistech bombesinu K;[nM]
0,11
5,4 <0,001 <0,001 <0,01
0,26
213
0,93
0,07
0,074
0,20
0,28 a: střední hodnota ze 6 testů b: střední hodnota z 11 testů
Příklad 7
Vliv léčby antagonisty bombesinu na objem nádoru u estrogenně nezávislé rakoviny mléčné žlázy MXT u myší se zjišťuje takto: 40 samic myší B6D2F] se získá z National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility (Frederick, Maryland) a udržuje při teplotě 21 ± 1 °C a vlhkosti 55 + 5 %. Zvířatům se automaticky udržuje rozvrh 12 h světla a 12 h tmy a podává se laboratorní krmivo pro hlodavce 50001 a vodovodní voda ad libitum. Kryo-konzervované tkáň karcinomu mléčné žlázy MXT (3.2)/Ovex, nezávislého na estrogenu, získaná od Dr. A.E. Bogdena (Biomeasure lne., Hopkinton, MA), se v množství 1 mm3 nádoru MXT (3.2)/Ovex subkutánně injekčně aplikuje dospělým myším samicím.
Po 2 dnech od transplantace nádorů se myši náhodně rozdělí do čtyř skupina a zahájí se terapie pomocí systémů dlouhodobého uvolňování peptidů (mikrokapsle). Vytvoří se tyto čtyři skupiny:
1. kontrola, pouze injekční vehikulum
2. [D-Tpi6, Leu,3-/wz-Leu14]Bn(6-14)
3. [D-Phe6, Leu13-/wz-Tacl4]Bn(6-14)
4. chirurgická oboustranná ovariektomie
Ve zkratkách pro antagonisty bombesinu je použito konvenční číslování zbytků v peptidickém fragmentu: každý zbytek se čísluje podle polohy v kompletním fragmentu. Antagonisté bombesinu se však zde snadněji srovnávají s ostatními peptidy, jsou-li číslovány tak, že N-konec má číslo 1.
,,[D-Tpi-LeuI3-psí-Leu14]Bn(6-14)“ je tedy D-TpiI-Gln2-Trp3-AIa4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psz'-Leu9-NH2 (dále ,31“), zatímco ,,[D-Phe6Leu13-/wz-Tac14]Bn(6-14)“ je totéž jako výše uvedený peptid č. 2.
-25CZ 286750 B6
Oba antagonisté bombesinu se syntetizují v pevné fázi. Skupina 2 myší dostávala dlouhodobým uvolňováním formulaci „Bl“ a skupina 3 formulaci svýše uvedeným peptidem č. 2. Tato formulace s dlouhodobým uvolňováním udržuje konstantní uvolňování Bl nebo peptidu č. 2 po dobu 15 dní na hodnotě 25 pg/den.
Pro dlouhodobé uvolňování se používají osmotická čerpadla Alzet (Alzo Co., Palo Alto, CA). Čerpadlo Alzet model 2002, uvolňující 0,48 μΐ/h, se implantuje subkutánně na spodní boční části zad. Do osmotických miničerpadel se peptidy rozpustí v 50% (obj./obj.) propylenglykolu ve vodě.
Poté, co jsou nádory viditelné a hmatatelné, měří se jejich objem a výpočet se provede podle Szendeho a d., „Growth Inhibition of MXT Mammary Carcinoma by Enhancing Programmed Cell Depth“ (appoptosis), s analogy LH-RH a somatostatinu (Breast Cancer Res. Treat. 14, 307314(1989)).
Experimenty se ukončí v exponenciální fázi růstu nádoru. První měření objemu nádoru se provádí po 10 dnech. Rozdíly v objemu nádoru mezi kontrolou a ošetřením oběma antagonisty bombesinu stejně jako mezi oběma antagonisty navzájem jsou statisticky významné. Výsledky měření objemu nádorů jsou uvedeny v tabulce 2 a znázorněny na obr. 1.
Tabulka 2. Vliv antagonistů bombesinu na objem nádoru při estrogenně nezávislé rakovině myší mléčné žlázy MXT peptid kontrola [D-Tpi6-Leu13-psz-Leu14]Bn(6-14) („Bl“) [D-Phe-Leu13-psz-Tac14]Bn(6-14) (č. 2( objem nádoru v čase (dny)
10 14 17
729 2565 5000
363* 2437 3742*
360* 1477* 3323**
bilaterální ovariektomie * p < 0,05 ** p < 0,01
Po skončení experimentů se myši nechají vykrvácet pod anestesií Metofenem, pak se změří hmotnost nádoru a podrobí se statistické analýze Duncanovým testem a Studentovým testem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
sloučenina podaná myši s estrogenně nezávislým nádorem mléčné žlázy MXT kontrola [D-Tpi6-Leu13-/wz-Leu14]Bn(6-l 4) peptid č. 2 střední hodnoty ± stát. obch. hmotnost nádoru (g) 8,45 ± 0,23 7,36 ± 0,46 5,48 ± 1,00**
**p0,01
-26CZ 286750 B6
Příklad 8
Účinek jednoho analogu somatostatinu a tří antagonistů bombesinu na lidský malobuněčný plicní karcinom u nahé myši se testuje takto: Athymičtí samci nahé myši o stáří přibližně 6 týdnů při 5 příchodu se získají zNational Cancer Institute (Bethesda, MD) a udržují se v limitovaných patogenních podmínkách.
Lidský malobuněčný plicní karcinom (SCLC, linie H69) se pěstuje jako monovrstva v rpmi 1640 (Gibco, Grand Island, NY), doplněném 10 % hovězího sérového albuminu, antibiotik 10 a antimykotik, při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 5% CO2. Cizí štěpy se iniciují subkutánní injekcí 1.107 buněk z exponenciálně rostoucích buněk buněčné tkáňové kultury do pravého boku pěti nahých myší. Vzniklé nádory se po třech týdnech asepticky vyříznou a mechanicky rozmělní. Kousky nádorové tkáně 3 mm3 se pak subkutánně transplantují Trocarovou jehlou 60 zvířatům. Po dvou týdnech po transplantaci vzrostly nádory na objem přibližně 10 mm3 a zvířata 15 byla náhodně rozdělena do 5 experimentálních skupin, ošetřovaných pěti různými sloučeninami počínaje dnem, kdy uplynuly dva týdny od transplantace. Nádory se pak měří každý týden po dobu pěti týdnů. Objem národu se vypočte jako (délka x šířka x výška x pi)/6. Osm zvířat v každé skupině se usmrtí za účelem měření hmotnosti nádoru.
První z terapeutických léčivých sloučenin, podávaných nahé myši, je analog samotostatinu D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NIL, zde označovaný „Sl“.
První ze tří bombesinových antagonistů je D-Tpi^ln^Trp-Ala-Vař-Gly-His-Leu^z-Leu-NHj,tj. Bl.
Druhým antagonistou bombesinu je [Tpi6-Leu13-p5z-Tpi14]Bn(6-14), tj.
D-Tpi’-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-/)5z'-Tpi9-NH2, označovaný „B2“, a třetím antagonistou je peptid 2.
Mikrogranule pamoátu Sl v poly(DL-laktid-koglykolid) se připraví pomocí Cytotech SA tak, aby uvolňovaly z alikvotu 16 mg po dobu 2 týdnů asi 100 pg/den. Tyto mikrogranule se každých 15 injekčně subkutánně vpravují na opačné straně než je nádor. Každý z antagonistů bombesinu se rozpustí v 0,1 % dimethylsulfoxidu ve fyziologickém rozsahu a dvakrát denně subkutánně injekčně aplikuje v dávce 20 pg/den.
Účinek této léčebné terapie na objem nádoru je uveden v tabulce 4 a znázorněn na obr. 2.
Tabulka 4. Účinek antagonistů bombesinu na objem nádoru SCLD peptid objem nádoru v čase (dny)
0 7 14 21 28 35
kontrola 10,5 + 0,5 19,3 ± 1,4 31,6 ±5,6 63,8 ± 10,6 142,8 249,7
±37,5 ±74,3
Sl 9,8 ± 0,8 14,4 ± 1,5 15,8 ± 1,3 18,4 ±2,9 33,2 66,0
±9,0 ±12,1
Bl 11,2 ±0,8 13,3 ± 1,2 17 ±3,4 24,7 ± 8,2 55 80,2
±24,5 ±27,2
B2 10+1,1 11,7 ± 1,2 14,7 ±2,4 24,5 ± 7,9 45 74,1
±15 ±31,8
peptid 11,6 ± 1,7 7,4 ±1,8 8,9 ± 2,3 14,3 ± 6,3 19,2 49,0
č.2 ±9,4 ±21,0
-27CZ 286750 B6
Příklad 9
Účinek antagonistů bombesinu na nádory rakoviny slinivky MIA PACA-2 se zjišťuje takto.
Nahým myším, podobným jako v příkladu 8, se subkutánně injekčně vpraví buňky lidské rakoviny slinivky MIA PACA-2, odvozené z tkáňové kultury, pěstované jako v případě SCLC v příkladu 8. Objem nádorů se měří u obou experimentálních skupin jako v příkladu 8.
Dvě experimentální skupiny tvoří: skupina myší, jimž se podává peptid č. 2, antagonistický bombesinu, a kontrolní skupina, dostávající pouze injekční vehikulum. Každé myši se dvakrát denně injekčně subkutánně vpravuje 50 pg injekčního vehikula nebo peptidu č. 2.
Výsledky měření objemu nádorů jsou uvedeny v tabulce 5 a znázorněny na obr. 3.
Tabulka 5. Účinek antagonistů bombesinu na objem (mm3) slinivkových nádorů MIA PACA-2
peptid objem nádoru v čase (dny) 0 7 11 15
kontrola peptid č. 2 45,6 ±7,9 254,2 ±59,8 645,1 ± 128,6 855,9 ±145,4 29,8 ± 4,3 252,3 ± 98,9 427,9 ± 122,6 634,1 ± 174,0
Příklad 10
Účinek léčby antagonisty bombesinu na nahou myš s lidskou rakovinou slinivky CAPAN-2 se zjišťuje takto:
Nahým myším, podobným jako v příkladu 7, se implantují nádory lidské rakoviny slinivky CAPAN-2, odvozené z tkáňové kultury, pěstované jako v příkladu 7. Myši se rozdělí na dvě skupiny, z nichž kontrolní dostává pouze injekční vehikulum a druhá bombesinu antagonistický peptid č. 2, z něhož se denně podává subkutánní injekcí 50 mg.
Objem nádorů se měří jako v příkladu 8 a výsledky měření objemu nádorů jsou uvedeny v tabulce 6 a znázorněny na obr. 4.
Tabulka 6. Účinek antagonistů bombesinu na objem (mm3) slinivkových nádorů CAPAN
peptid objem nádoru v čase (dny) 0 7 14 21 28
kontrola peptid č. 2 21,2 ± 1,7 28,3 ±2,3 43,0 ± 3,6 51,4 ±8,9 78,8 ±16,7 19,7 ± 1,7 27,8 ±3,3 32,3 ± 3,5 46,4 ±3,0 50,5 ± 17,8
Přestože je vynález popsán s ohledem na výhodná provedení, je třeba jej chápat tak, že je možno provádět odborníkům zřejmé změny a modifikace bez překročení jeho rozsahu, který je uveden v připojených patentových nárocích, ve vynálezu je možnou použít známé substituce, které významně nesnižují jeho účinnost.
-28CZ 286750 B6
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÁ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Schally, Andrew V.
Cai, Renzhi (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: POLYPEPTIDIČTÍ ANTAGONISTÉ
BOMBESINU (iii) POČET SEKVENCÍ: 37 (iv) KONTROLNÍ ADRESA:
(A) ADRESÁT: OMRIM. BEHR, ESQ (B) ULICE. 325 PIERSON AVENUE (C) MĚSTO: EDISON (D) STÁT: NEW JERSEY (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 08827 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: PC IBM kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, verse #1,25 (vi) ÚDAJE O TÉTO PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/031, 325 (B) DATUM PODÁNÍ: 15. 3. 1993 (C) ZATŘÍDĚNÍ:
(vii) ÚDAJE O DŘÍVĚJŠÍCH PŘIHLÁŠKÁCH:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: us 07/619, 747 (B) DATUM PODÁNÍ: 29. 11. 1990 (viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI/AGENTOVI:
(A) JMÉNO: BEHR, OMRI m.
(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 22, 940 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: SHAL3,0-0,14 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON: (908) 494-5240 (B) TELEFAX: (908) 494-0428 (C) TELEX: 511642 BEPATEDIN (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscfeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-pGlu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“
-29CZ 286750 B6 (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 1: Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-pGlu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 2: Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Phe“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = MTac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 3:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5
-30CZ 286750 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc.feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = Ac-D-Phe“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 4:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Cpa“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 5:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid
-31CZ 286750 B6 (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscfeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Cpa“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ . (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = MTac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 6:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Nal“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 7:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = Pal“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“
-32CZ 286750 Β6 (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 80:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Pal“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: mise Jeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 9:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Trp“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 10:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5
-33CZ 286750 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = Ac-D-Trp“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 11:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = Tpi“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 12:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (Β) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid
-34CZ 286750 B6 (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Tpi“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 - redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH,“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 13:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = Hca-Gln“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 7 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 7 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 14:
Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Phe“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“
-35CZ 286750 B6 (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 15:
Xaa His Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Phe“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 2 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 2 = Glu(OMe)“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 16:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Phe“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 2 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 2 = Glu[-J“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8
-36CZ 286750 B6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 17: Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Phe“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 18:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = Ac-D-Phe“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 19:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5
-37CZ 286750 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Cpa“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc jeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 20:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = Tpi“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc jeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc jeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 21:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid
-38CZ 286750 B6 (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Tpi“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 22:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = pGlu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 14 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 14 = Met-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 23:
Xaa Gin Arg Leu Gly Asn Gin Trp Ala Val Gly His Leu Xaa
5 10 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = H-Gly“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 10 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 10 = Met-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 24:
Xaa Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Xaa
5 10
-39CZ 286750 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Met-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 25:
Asn His Trp Ala Val Gly his Leu Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 11 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 11 = Met-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 26:
Arg Pro Lys Pro Gin Gin Phe Phe Gly Leu Xaa
5 10 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = (R^^j-A^A1, kde A° = delece, A1 = D-Phe, D-Trp nebo D-Nal, R1 a R2 * = H“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = A8-W, kde W = -N(R8)-CH(Z1)-R4 *CH(Z2)-CO-V, kde R4 = CH2NH; Z1 = -CH2CH(CH3)2; Z2 = -CH2SH nebo (CH2)2-S-CH3; V = N(R6)R7, kde R6, R7 a R8 může být H; R1 a R2 = H nebo COE1, kde E1 = C^alkyl“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 27:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa
5
-40CZ 286750 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = X-Al, kde X = H, jednoduchá vazba spojující α-aminoskupinu A1 s gamwa-karboxylem na 3-propionylu Glu, je-li Res 2 = Glu; nebo R'CO, kde R1 = H, Cj_ioalkyl, fenyl fenyl-Ci_ioalkyl, p-Hlfenyl, p-hl-fenyl-Ci_iOalkyl, naftyl, naftyl-C]_ioalkyl, indolyl, indolyl-Ci_ loalkyl, pyridyl, pyridyl-Ci_iOalkyl, thienyl, thienyl-Ci_I0alkyl, kde Hl = F, Cl, Br, ON, CH3 nebo OCH3; nebo R1 = N(R2)(R3), kde R2 = H, Ci_10alkyl, fenyl nebo fenyl-Ci_10alkyl, R3 = H nebo Ci_iOalkyl; nebo R1 = R4O, kde R4 = Ct_ iOalkyl, fenyl nebo fenyl-Ci_10alkyl; a A1 * * * = zbytek D-, L- nebo DLaminokyseliny zvolené zPhe, /z-Hl-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, Nesubstituovaného Trp nebo Trp substituovaného na benzenovém kruhu jedním nebo několika členy souboru zahrnujícího F, Cl, Br, NH2 nebo Ci_3alkyl; nebo peptidická vazba spojující acylovou skupinu R’Co s α-aminoskupinou Res 2“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc jeature (B) UMÍSTĚNÍ: 2 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 2 = Gin, Glu[~], Glu (Y) nebo His“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = A9-Q, kde A9 = Tac, MTac nebo DMTac; a Q = NH2 nebo OQ1, kde Q1 = H, fenyl nebo fenyl-Ci_ioalkyl“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 28:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (Β) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Phe“
-41CZ 286750 B6 (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 29:
Xaa Glu Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Tpi“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Leu-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 30:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Phe“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 4 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 4 = D-Trp“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8
-42CZ 286750 B6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = Trp-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 31:
Xaa Cys Tyr Xaa Lys Val Cys Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = D-Tpi“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tpi-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 32:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = X-A1, kde X ~ H nebo Ac; A1 D-Phe, L- nebo D-Tpi“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 33:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5
-43CZ 286750 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 34:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscfeature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = X-A1, kde X = H nebo Ac; A1 = D-Phe, L- nebo D-Tpi“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = DMTac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 34:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = X-A1, kde X = H, jednoduchá vazba spojující α-aminoskupinu A1 sga/M/na-karboxylem na 3-propionylu Glu, je-li Res 2 = Glu; nebo R'CO, kde R1 = H, Ci_i0 alkyl, fenyl, fenyl-Ci_]oalkyl; nebo R1 = N(R2)(R3), kde R2 = H, Ci_iOalkyl, fenyl nebo fenyl-Ci_]Oalkyl, R3 = H nebo Ci_ioalkyl; nebo R1 = R4O, kde R4 = Ci_ioalkyl, fenyl nebo fenylCi-ioalkyl a A1 = L- nebo D-Pal nebo L- nebo D-Tpi“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 2 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 2 = Gin, Glu[-], Glu(Y) nebo His“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: miscjeature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = A9-Q, kde A9 = Cys nebo Pen; a Q =
-44CZ 286750 B6
NH2 nebo OQ1, kde Q1 = H, Ci_iOalkyl, fenyl nebo fenyl-Ci_iOalkyl“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 35:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 36:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = Χ-Α'-Gln, kde X = Hca, Hna, Paa, Mpp, Hpp nebo Naa; a A1 = peptidická vazba spojující acylovou skupinu X s α-aminoskupinou Gin“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: Ί (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 7 = redukovaný isoster Leu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 8 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 8 = Tac-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 36:
Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č. 37:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 1 = pGlu“ (ix) ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_feature (B) UMÍSTĚNÍ: 9 (D) DALŠÍ INFORMACE: /pozn. „Res 9 = Met-NH2“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 37:
Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Leu Xaa
5
-45CZ 286750 B6

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Bombesinu antagonistický peptid obecného vzorce:
    X-A^A^Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-A9ve kterém:
    X je vodík, jednoduchá vazba spojující α-aminoskupinu A1 s gazno-karboxylovou skupinou na 3-propionylové skupině A2, je-li A2 Glu[-J, nebo skupina vzorce R’CO~, kde R1 je zvoleno ze souboru, do kterého náleží:
    (a) vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenyl, fenylalkylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku, p-Hl-fenylová skupina, p-Hl-fenylakylová skupina obsahující v alkylová části 1 až 10 atomů uhlíku, naftylová skupina, naftylalkylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku, indolylová skupina, indolylalkylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku, pyridylová skupina, pyridylalkylová skupina obsahující v alkylová části 1 až 10 atomů uhlíku, thienylová skupina, thienylalkylová skupina obsahující v alkylová části 1 až 10 atomů uhlíku, cyklohexylová skupina nebo cyklohexylalkylová skupina obsahující v alkylová části 1 až 10 atomů uhlíku, kde H1 je F, Cl, Br, OH, CH3 nebo OCH3, (b)
    R2 >NR3 ve které:
    R2 je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku, a
    R3 je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, (c) skupina R4-O, ve které: R4 znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylovou skupinu obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku,
    A1 je zbytek D- nebo L-aminokyseliny zvolené ze souboru zahrnujícího Phe,/?-Hl-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, nesubstituovaný Trp nebo Trp substituovaný na benzenovém kruhu jedním nebo více členy souboru zahrnujícího F, Cl, Br, NH2 nebo alkylové skupiny obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, nebo peptidická vazba spojující acylovou skupinu R*CO- s α-aminoskupinou A2, pokud X = R’CO;
    -46CZ 286750 B6
    A2 je Gin, Glu[—], Glu(Y) nebo His, kde [-] je jednoduchá vazba, je-li X jednoduchá vazba a A2 je Glu[-J, přičemž toto [-] spojuje ga?Míz-karboxylovou skupinu 3-propionylové skupiny tohoto zbytku A2 s α-aminoskupinou A1,
    Y je (a) -OR5, kde R5 je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo fenylová skupina, nebo
    b) R6 >NR7 ve kterém:
    R6 je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku,
    R7 je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo -NHCONH2,
    Leu-/wz' je redukovaná forma Leu, kde místo skupiny C=O v Leu je -CH2-, takže vazba této skupiny-CH2- s α-aminoskupinou sousedního zbytku A9 je pseudopeptidická,
    A9 je Tac, MTac, DMTac, Cys nebo Pen, a
    Q je NH2 nebo -OQ1, kde Q1 je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku, a jeho farmaceuticky přijatelné kyseliny nebo soli.
  2. 2. Peptid podle nároku 2, ve kterém X je vodík nebo R’CO, kde R1 je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, A1 je D-Cpa, D-Nal, L- nebo D-Pal, D-Phe, L- nebo D-Tpi nebo D-Trp, A2 je Gin nebo His a Q je NH2.
  3. 3. Peptid podle nároku 2, ve kterém A9 je Tac.
  4. 4. Peptid podle nároku 2, ve kterém A9 je DMTac.
  5. 5. Peptid podle nároku 3, kde X je atom vodíku nebo Ac, A1 je D-Phe, L- nebo D-Tpi a A2 je Gin.
  6. 6. Peptid podle nároku 4, kde X je H nebo Ac, A1 je D-Phe, L- nebo D-Tpi a A2 je Gin.
  7. 7. Peptid podle nároku 3 obecného vzorce
    D-Phe-G ln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-ps z-T ac-NH2.
  8. 8. Peptid podle nároku 3 obecného vzorce
    D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psz-Tac-NH2.
    -47CZ 286750 B6
  9. 9. Peptid podle nároku 4 obecného vzorce
    D-Phe-Gln-T rp-Ala-V al-G ly-His-Leu-psz-DMT ac-NH2.
  10. 10. Bombesinu antagonistický peptid podle nároku 1, obecného vzorce
    X-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-/wz'-A9-Q ve kterém:
    X je atom vodíku, jednoduchá vazba spojující α-aminoskupinu A1 s gíz/wo-karboxylovou skupinou na 3-propionylové skupině A2, je-li A2 Glu[-], nebo skupina vzorce R’CO_, kde R1 je zvoleno ze souboru, do kterého náleží (a) vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina, fenylalkylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku, (b)
    R2 >NR3 ve které:
    R2 je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku,
    R3 je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, (c) skupina R4-O ve které R4 je alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku,
    A1 je přirozeně se nevyskytující aminokyselina zvolená ze skupiny zahrnující L- nebo D-Pal nebo L- nebo D-Tpi,
    A2 je Gin, Glu[-], Glu(Y) nebo His, kde [-] je jednoduchá vazba, je-li X jednoduchá vazba a A2 je Glu[-], přičemž [-] spojuje gamakarboxylovou skupinu 3-propionylové skupiny tohoto zbytku A2 s α-aminoskupinou A1,
    Y je (a) -OR5, kde R5 je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo fenylová skupina, nebo
    -48CZ 286750 B6 (b)
    R6 >NR7 ve které:
    R6 je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, a
    R7 je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo -NHCONH2, a
    Leu-jPxz' je redukovaná forma Leu, kde místo skupiny C=O v Leu je -CH2-, takže vazba této skupiny-CH2- s α-aminoskupinou sousedního zbytku A9 je pseudopeptidická,
    A9 je Cys nebo Pen a
    Q je NH2 nebo -OQ1, kde Q1 je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 10 atomů uhlíku, a jeho farmaceuticky přijatelné kyseliny nebo soli.
  11. 11. Bombesinu antagonistický peptid podle nároku 1, kde X je R’CO-, A1 je peptidická vazba spojující acylovou skupinu R^O- s α-aminoskupinou A2, A2 je Gin nebo His a Q je NH2.
  12. 12. Peptid podle nároku 11, ve kterém X je Hca, Hna, Paa, Mpp, Hpp nebo Naa, A2 je Gin a A9 je Tac.
  13. 13. Peptid podle nároku 12, obecného vzorce
    Hca-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psz-T ac-NH2.
  14. 14. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1, jeho terapeuticky přijatelnou adiční sůl nebo komplex a farmaceuticky přijatelný kapalný nebo pevný nosič.
  15. 15. Polypeptid podle nároku 1 nebo jeho terapeuticky přijatelné kyseliny nebo soli pro léčbu rakoviny u savců.
CZ19942807A 1993-03-15 1994-03-07 Peptide antagonistic to bombesin and pharmaceutical preparation containing thereof CZ286750B6 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/031,325 US5369094A (en) 1990-11-29 1993-03-15 Polypeptide bombesin antagonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ280794A3 CZ280794A3 (en) 1995-07-12
CZ286750B6 true CZ286750B6 (en) 2000-06-14

Family

ID=21858823

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19942807A CZ286750B6 (en) 1993-03-15 1994-03-07 Peptide antagonistic to bombesin and pharmaceutical preparation containing thereof

Country Status (27)

Country Link
US (1) US5369094A (cs)
EP (1) EP0646127B1 (cs)
JP (1) JP3838656B2 (cs)
KR (1) KR100306506B1 (cs)
AT (1) ATE167874T1 (cs)
AU (1) AU666270B2 (cs)
BR (1) BR9404341A (cs)
CA (1) CA2135787C (cs)
CZ (1) CZ286750B6 (cs)
DE (1) DE69411342T2 (cs)
DK (1) DK0646127T3 (cs)
EE (1) EE03180B1 (cs)
ES (1) ES2120615T3 (cs)
FI (1) FI945378A (cs)
HR (1) HRP940164B1 (cs)
HU (1) HU218288B (cs)
IL (2) IL108851A (cs)
NO (1) NO313418B1 (cs)
NZ (2) NZ299913A (cs)
PL (1) PL180372B1 (cs)
RU (1) RU2114118C1 (cs)
SI (1) SI9420001B (cs)
SK (1) SK282267B6 (cs)
TW (1) TW325478B (cs)
UA (1) UA34456C2 (cs)
WO (1) WO1994021674A1 (cs)
ZA (1) ZA941767B (cs)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5877277A (en) 1987-09-24 1999-03-02 Biomeasure, Inc. Octapeptide bombesin analogs
US5723578A (en) * 1987-09-24 1998-03-03 The Administrators Of Tulane Educational Fund Peptide analogs of bombesin
US5650395A (en) * 1995-03-13 1997-07-22 Hurel; Steven Treatment of pulmonary hypertension
US6989371B1 (en) 1996-08-16 2006-01-24 Dabur Research Foundation Bombesin analogs for treatment of cancer
DE69840647D1 (de) 1997-04-22 2009-04-23 Curator Of The University Of M Konjugate aus peptiden, die liganden von gastrinrezeptoren sind
KR20040062416A (ko) * 2000-11-17 2004-07-07 워너-램버트 캄파니 엘엘씨 봄베신 길항제를 이용한 성기능 장애의 치료
ATE435035T1 (de) * 2003-01-13 2009-07-15 Bracco Imaging Spa Verbesserte linker für radiopharmazeutische verbindungen
US7922998B2 (en) * 2003-01-13 2011-04-12 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7850947B2 (en) * 2003-01-13 2010-12-14 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US20060239923A1 (en) * 2003-01-13 2006-10-26 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7611692B2 (en) 2003-01-13 2009-11-03 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7226577B2 (en) * 2003-01-13 2007-06-05 Bracco Imaging, S. P. A. Gastrin releasing peptide compounds
US8420050B2 (en) * 2003-01-13 2013-04-16 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US8709998B2 (en) 2003-04-22 2014-04-29 Ipsen Pharma S.A.S. Peptide vectors
US7795385B2 (en) * 2004-12-17 2010-09-14 Bexar Global, Inc. Use of bombesin/gastrin-releasing peptide antagonists for the treatment of inflammatory conditions, acute lung injury and bipolar disorder
FR2918566B1 (fr) * 2007-07-11 2009-10-09 Pierre Fabre Medicament Sa Composition pharmaceutique stable d'un sel hydrosoluble de vinflunine.
EP2100900A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-16 Universitätsspital Basel Bombesin analog peptide antagonist conjugates
EP2198878A1 (en) * 2008-12-18 2010-06-23 University Of Miami Polypeptide bombesin antagonists
JP2013507364A (ja) 2009-10-07 2013-03-04 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 新規なｔｒｐａ１アンタゴニスト

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5084555A (en) * 1989-08-21 1992-01-28 The Administrators Of The Tulane Educational Fund An octapeptide bombesin analog
JP2795449B2 (ja) * 1987-09-24 1998-09-10 ジ・アドミニストレーターズ・オブ・ザ・ツーレイン・エデュケイショナル・ファンド 治療用ペプチド
US5162497A (en) * 1987-09-24 1992-11-10 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Bradykinin analogs with non-peptide bond
AU618029B2 (en) * 1987-11-02 1991-12-12 Imperial Chemical Industries Plc Polypeptide compounds
GB8813356D0 (en) * 1988-06-06 1988-07-13 Ici Plc Polypeptide compounds
GR1000608B (el) * 1988-07-21 1992-08-31 Erba Carlo Spa Μεθοδος για την παρασκευη ανταγωνιστων bombesin.
HU208439B (en) * 1988-10-14 1993-10-28 Univ Tulane Process for producing pharmaceutical peptides
US5217955A (en) * 1989-09-15 1993-06-08 Biomeasure, Inc. Treatment of cancer with peptide analog of bombesin, grp, litorin or neuromedin
US5244883A (en) * 1990-11-29 1993-09-14 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Nonapeptide bombesin antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
FI945378A0 (fi) 1994-11-15
IL108851A0 (en) 1994-06-24
NZ299913A (en) 2000-07-28
RU2114118C1 (ru) 1998-06-27
DE69411342D1 (de) 1998-08-06
RU94046091A (ru) 1996-09-27
CZ280794A3 (en) 1995-07-12
EP0646127A1 (en) 1995-04-05
AU666270B2 (en) 1996-02-01
ES2120615T3 (es) 1998-11-01
EE03180B1 (et) 1999-04-15
KR950701646A (ko) 1995-04-28
NO313418B1 (no) 2002-09-30
IL154995A0 (en) 2003-10-31
SI9420001B (sl) 1999-08-31
ATE167874T1 (de) 1998-07-15
SK282267B6 (sk) 2001-12-03
HRP940164A2 (en) 1996-08-31
NO944293D0 (no) 1994-11-10
US5369094A (en) 1994-11-29
PL180372B1 (pl) 2001-01-31
KR100306506B1 (ko) 2001-12-01
SI9420001A (en) 1995-08-31
PL306209A1 (en) 1995-03-06
ZA941767B (en) 1994-10-06
HUT69727A (en) 1995-09-28
NZ263668A (en) 1997-06-24
TW325478B (en) 1998-01-21
EP0646127B1 (en) 1998-07-01
BR9404341A (pt) 1999-08-31
HRP940164B1 (en) 2000-02-29
JPH07507330A (ja) 1995-08-10
IL108851A (en) 2003-05-29
DK0646127T3 (da) 1999-04-12
UA34456C2 (uk) 2001-03-15
DE69411342T2 (de) 1998-11-19
NO944293L (no) 1995-01-02
SK136494A3 (en) 1995-08-09
WO1994021674A1 (en) 1994-09-29
FI945378A (fi) 1994-11-15
AU6444694A (en) 1994-10-11
CA2135787C (en) 2008-08-12
JP3838656B2 (ja) 2006-10-25
HU218288B (en) 2000-07-28
CA2135787A1 (en) 1994-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ286750B6 (en) Peptide antagonistic to bombesin and pharmaceutical preparation containing thereof
EP0559756B1 (en) Nonapeptide bombesin antagonists
WO1995000542A1 (en) Bombesin receptor antagonists and uses thereof
WO1994021674A9 (en) Polypeptide bombesin antagonists
EP2198878A1 (en) Polypeptide bombesin antagonists
JP3040166B2 (ja) ノナペプチドのボンベシン拮抗薬
JP3743794B2 (ja) ボンベシン類似体
HRP921277A2 (en) Nonapeptide bombestin antagonists

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20080307