JP3743794B2 - ボンベシン類似体 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、良性の或は悪性の組織の増殖を治療するのに有用なボンベシン類似体に関する。
【０００２】
【従来技術】
両生類のペプチドボンベシン（Ａｎａｓｔａｓｉ等、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ２７巻：１６６〜１６７、１９７１参照）は、哺乳動物の同類体ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ニューロメジンＢ（ＮＭＢ）、ニューロメジンＣ（ＮＭＣ）、及びリトリン（ｌｉｔｏｒｉｎ）に密接に関係する。Ｍｉｎａｍｉｎｏ等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５４７巻：３７３〜３９０（１９８８）参照。ＧＲＰ及びＮＭＢの両レセプターはヒトの腫瘍に関して識別されかつ特性表示された。Ｔａｙｌｏｒ等、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（Ｍｏｏｄｙ，Ｔ．編集、１９９３）参照。ボンベシンは、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む多数のヒトの癌細胞系統についての成長因子になることが見出され、かつヒトの胸部及び前立腺癌において検出されてきた。Ｈａｖｅｍａｎ等、編集、Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ − Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎＬｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８６。これらの癌の多くはＧＲＰ或はボンベシンに関連したペプチドホルモンを分泌することが知られている。よって、ボンベシンに対する拮抗物質がこれらの癌を治療するための薬剤として提案された。
【０００３】
Ｃｕｔｔｉｔｔａ等は、ボンベシンに対する特異的モノクローナル抗体がヌードマウスに異種移植したヒトの小細胞肺癌細胞系統の増殖をインビボで抑制することを立証した。Ｃｕｔｔｉｔｔａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙ ４巻：７０７〜７２７、１９８５。Ｚａｃｈａｒｙ及びＲｏｚｅｎｇｕｒｔは、ボンベシンの有糸分裂作用に応答する３Ｔ３マウス線維芽細胞において、サブスタンスＰアンタゴニストであるＳｐａｎｔｉｄｅがボンベシンアンタゴニストとして作用することを観測した。Ｚａｃｈａｒｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８２巻：７６１６〜７６２０、１９８５。
【０００４】
Ｈｅｉｎｚ−Ｅｒｉａｎ等は、ボンベシンの１２位におけるＨｉｓをＤ−Ｐｈｅで置換し、テンジクネズミの膵臓からの分散された腺房においてボンベシンアンタゴニスト活性を観測した。Ｈｅｉｎｚ−Ｅｒｉａｎ等、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５２：Ｇ４３９〜Ｇ４４２、１９８７。Ｒｉｖｅｒは、ボンベシンの生物学的に活性なＣ末端のデカペプチドの立体配座自由度を、分子内ジスルフィドブリッジを加入することによって制限することを指向する研究を報告した。しかし、Ｒｉｖｅｒは、これまでは、この変更を有するボンベシン類似体が何らアンタゴニスト活性を何ら示すことができないと述べた。Ｒｉｖｅｒ、等、イタリー、ローマ、１９８７年１０月、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｏｍｂｅｓｉｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅにおける「Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ＰｅｐｔｉｄｅＨｏｒｍｏｎｅｓ」。
【０００５】
ボンベシンの合成類似体が、また、ＰＣＴ出願ＷＯ ９１／１７１８１（１９９１）；Ｃｏｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２５）：１６４４１（１９９１）；及びＳｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｊ．，Ａｎａｔ．Ｒｅｃｏｒｄ ２３６巻：２４１−２４７（１９９３）において報告された。ボンベシンは、ホルモンの放出並びに膵臓、胃、及び腸の分泌及び腸の可動性の刺激を含む胃腸管に対する直接及び間接の両方の作用を示す。ボンベシンによって放出されるＧＲＰ及びコレシストキニンは正常の胃腸粘膜の維持並びに正常の及び腫瘍性の組織の増加する成長において役割を果たすことが示された。
【０００６】
ヌードマウスにおける異種移植されたヒトの結腸及び胃の癌の増殖が、ガストリンを投与することによって刺激された後に、セクレチンを加えることによって抑制され（タナカ等、Ｔｏｋａｋｕ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：４５９，１９８６）、ガストリンレセプターを持つＭＣ−２６マウス結腸癌の増殖がペンタガストリンによって刺激され（Ｗｉｎｓｅｔｔ等、Ｓｕｒｇｅｒｙ ９９：３０２１９８０）、かつガストリン−レセプターアンタゴニストであるプログルミド（ｐｒｏｇｌｕｍｉｄｅ）によって抑制される（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ等、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２０２：３０３，１９８５）。ボンベシンは正常の宿主膵臓についての栄養剤及び異種移植されたヒトの膵臓腫瘍組織において成長抑制剤の両方として同時に作用することが見出された。Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等、Ｐａｎｃｒｅａｓ ３：２４７、１９８８。ＮＭＢは、癌細胞の増殖をもたらし（Ｍｏｏｄｙ等、Ｊ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．２６１：１（１９９２））、食品摂取量を抑制させ、かつガストリン放出を減少させる（カワイ等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．日本 ３７（６）：８５７（１９９０））のが示された。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
略語
Ｃｈｘ−Ａｌａ＝シクロヘキシル−Ａｌａ（３−シクロヘキシルアラニン）
ｐＧｌｕ＝ピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｄ−Ｃｐａ＝Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニン
ＨｙＰｒｏ＝ヒドロキシプロリン
Ｎａｌ＝３−（α−ナフチル）−アラニン、或は３−（β−ナフチル）−アラニン
ＤＯＰＡ＝３、４−ジヒドロキシフェニルアラニン
【０００８】
Ｔｃｃ＝１、２、３、４−テトラヒドロ−２−カルボリン（ｃａｒｂｏｌｉｎｅ）−３−カルボン酸
Ｔｉｃ＝１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸
Ａｚａ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ＝３−（５−ヒドロキシ−２−ピリジル）−アラニンＳａｒ＝サルコシン
１−或は３−メチル−Ｈｉｓ＝１或は３位複素環式窒素上にメチル基を有するＨｉｓ
ε−アルキル−Ｌｙｓ＝アルキル基によって置換された
【化２】

を有するＬｙｓ
β−Ａｌａ＝３−アミノプロピオン酸
【０００９】
発明は、下記式の線状治療ペプチド：
【化３】

式中、Ａ¹ はＤ−α−芳香族アミノ酸或はＤ−α−テザード（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）アミノ酸であり；
Ａ² はＧｌｎ、Ｈｉｓ，１−メチル−Ｈｉｓ、或は３−メチル−Ｈｉｓであり；
Ａ³ はＮａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、及びｐ−Ｘ−Ｐｈｅ（ここで、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ₂ 、ＯＨ或はＣＨ₃ である）から選ぶＤ−或はＬ−異性体であり；Ａ⁴ はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、或はα−アミノ酪酸であり；
Ａ⁵ はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｔｈｒ、或はα−アミノ酪酸であり；
Ａ⁶ はβ−Ａｌａであり；
【００１０】
Ａ⁷ はＨｉｓ，１−メチル−Ｈｉｓ、３−メチル−Ｈｉｓ、Ｌｙｓ，或はε−アルキル−Ｌｙｓであり；
Ａ⁸ はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｌｅ、α−アミノ酪酸、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、ＨｙＰｒｏ、Ｎａｌ、Ｃｈｘ−Ａｌａ、Ｐｈｅ、或はｐ−Ｘ−Ｐｈｅ（ここで、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ₂ 、ＯＨ或はＣＨ₃ である）であり；
Ａ⁹ はＭｅｔ，Ｍｅｔ−オキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、α−アミノ酪酸、或はＣｙｓであり；
【００１１】
各々のＲ₁ 及びＲ₂ は、独立に、Ｈ、Ｃ_1-12アルキル、Ｃ_7-10フェニルアルキル、或はＣＯＥ₁ （ここで、Ｅ₁ はＣ_1-20アルキル、Ｃ_3-20アルケニル、Ｃ_3-20アルキニル、フェニル、３、４−ジヒドロキシフェニルアルキル、ナフチル、或はＣ_7-10フェニルアルキルである）である；但し、Ｒ₁ 或はＲ₂ のいずれかがＣＯＥ₁ である時、他方はＨでなければならない；及び
Ｒ₃ はＯＨ、ＮＨ₂ 、Ｃ_1-12アルコキシ、Ｃ_7-10フェニルアルコキシ、Ｃ_11-20 ナフチルアルコキシ、Ｃ_1-12アルキルアミノ、Ｃ_7-10フェニルアルキルアミノ、Ｃ_11-20 ナフチルアルキルアミノである；或はこのようなペプチドの製薬上許容し得る塩を特徴とする。
【００１２】
「芳香族α−アミノ酸」によって意味するものは、ＮＨ₂ −ＣＨ（ＣＨ₂ −Ｚ）−ＣＯＯＨ式（式中、Ｚは芳香族環を含有する部分である）のアミノ酸残基である。Ｚの例は下記を含み、これらに限定されない：フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、３−インドリル、１−Ｍｅ−３−インドリル、ビフェニル、及びイミダゾリル、Ｚの芳香族環上に置換基Ｘ（Ｘはハロゲン、ＮＯ₂ 、ＣＨ₃ 或はＯＨである）を１個又はそれ以上有し或は有しない。
「テザードα−アミノ酸」によって意味するものは、側鎖の炭素原子がα−アミノ基のＮ原子に結合された（テザード）アミノ酸である。例は下記を含み、これらに限定されない：Ｐｒｏ、ＨｙＰｒｏ、Ｔｉｃ、及びＴｃｃ。
【００１３】
Ａ¹ 、Ａ² 、等の記号は、本明細書中α−アミノ酸の残基を表わす。そのような記号は、テザードアミノ酸（例えば、Ｐｒｏ、ＨｙＰｒｏ、Ｔｃｃ、或はＴｉｃ）及びＳａｒの他は、Ｎ−末端にある時は、一般構造−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−もしくは＝Ｎ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−を表わし或はＮ−末端にない時は、−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−を表わす（ここで、Ｒはα−アミノ酸の側鎖（もしくは識別基）を表わし、例えば、Ｒは、Ａｓｐについて、−ＣＨ₂ ＣＯＯＨである）。ポリペプチド鎖の慣用の表示に従えば、Ｎ−末端は左にあり、Ｃ−末端は右にあることに留意すること。Ａ⁶ がＳａｒである時、−Ｎ（ＣＨ₃ ）−ＣＨ₂ −ＣＯ−の構造を有する。他方、テザードアミノ酸の残基は−Ｎ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−構造（ここで、Ｎ、Ｃ及びＲは一緒になって環を形成する）である。ＨｙＰｒｏとは、本明細書中２−ヒドロキシ−Ｐｒｏ、３−ヒドロキシ−Ｐｒｏ、４−ヒドロキシ−Ｐｒｏ、及び５−ヒドロキシ−Ｐｒｏの内のいずれかを言い、４−ヒドロキシ−Ｐｒｏが好適である。
【００１４】
その上、アミノ酸残基が光学的に活性な場合、それは、Ｄ−体を明らかに表示しなければ、Ｌ−体構造を意図する。アルキル基は、特定しない場合、炭素原子１〜１２を含有する。ＣＯＥ₁ は
【化４】

を表わす。
【００１５】
上に挙げた（１）式において、Ｒ₁ 或はＲ₂ のいずれかが脂肪族、芳香族、或は親油性基である時、インビボ活性が長く続くことができ、かつ発明の化合物の標的組織への送達を容易にさせることができる。
（１）式において、Ａ¹ はＮａｌ、ＤＯＰＡ、Ｔｒｐ、Ｔｃｃ、Ｔｉｃ、Ａｚａ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びｐ−Ｘ−Ｐｈｅ（ここで、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ₂ 、ＯＨ或はＣＨ₃ である）から選ぶＤ−異性体であるのが好ましい。Ａ³ はＰｈｅ、Ｔｒｐ、及びｐ−Ｘ−Ｐｈｅ（ここで、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ₂ 、ＯＨ或はＣＨ₃ である）から選ぶＤ−異性体であり；Ａ⁷ はＨｉｓ，１−メチル−Ｈｉｓ、或は３−メチル−Ｈｉｓであるのが特に好適である。
【００１６】
また、（１）式において、Ａ¹ はＤ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、或はＤ−Ｔｙｒであり；Ａ² はＧｌｎであり；Ａ³ はＴｒｐであり；Ａ⁴ はＡｌａであり；Ａ⁵ はＶａｌであり；Ａ⁷ はＨｉｓであり；Ａ⁸ はＬｅｕ或はＨｉｓであり；Ａ⁹ はＭｅｔ、Ｌｅｕ、及びＮｌｅであるのが好ましい。
【００１７】
発明の特に好適なペプチドは下記を含む：
Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−ＮＨ₂ ；
Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂ ；
Ｈ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−ＮＨ₂ ；
Ｈ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−ＮＨ₂ ；及び
Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＮＨ₂ 。
【００１８】
発明の類似体は製薬上許容し得る塩の形態で提供することができる。好適な塩の例は、治療上許容し得る有機酸、例えば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トルフルオロ酢酸、或はパモン酸（ｐａｍｏｉｃ ａｃｉｄ）、並びにポリマー酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、例えばタンニン酸或はカルボキシメチルセルロースとの塩、及び無機酸、例えば塩酸のようなハロゲン化水素酸、硫酸或はリン酸との塩である。
発明のその他の特徴及び利点は、下記の発明の好適な実施態様の記述及び特許請求の範囲の記載から明らかになると思う。
【００１９】
好適な実施態様の記述
今、本発明の好適な実施態様の構造、合成、生物学的アセイ及び用途について記載する。
【００２０】
【実施例】
構造
発明のペプチドはリトリン、ニューロメジンＢ（ＮＭＢ）、ニューロメジンＣ（ＮＭＣ）、ボンベシン（最後の１０のアミノ酸）、及びヒトＧＲＰ（最後の１０のアミノ酸）から誘導される。
【００２１】
類似体の合成
発明の化合物の内の一つである類似体＃１（すなわち、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−ＮＨ₂ ）の合成は下記の通りである。
４−メチルベンズヒドリルアミン−ポリスチレン樹脂（Ｂａｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）（０．７２ｍ当量／ｇ）を、クロリドイオン形態で、ＡＣＴ２００ペプチド合成装置（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）の反応容器に入れた。その合成装置は下記の反応サイクルを行うようにプログラムを組み込んだ：（ａ）塩化メチレン；（ｂ）クロロホルム中トリエチルアミン１０％；（ｃ）塩化メチレン；及び（ｄ）ジメチルホルミド。中和した樹脂に、塩化メチレン中のＢＯＣ−ノルロイシン及びジイソプロピルカルボジイミド（各々３モル当量）を１時間混合した。生成したアミノ酸樹脂を合成装置においてジメチルホルムアミドで洗浄しかつジメチルホルムアミド中の無水酢酸５％で５分間処理した。次いで、それをジメチルホルムアミド及び塩化メチレンで洗浄した。
【００２２】
ペプチド合成装置を下記の反応サイクルを行うようにプログラムを組み込んだ：（ａ）塩化メチレン；（ｂ）塩化メチレン中トリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）３３％（各々５分及び２５分の２回）；（ｃ）塩化メチレン；（ｄ）イソプロピルアルコール；（ｅ）クロロホルム中トリエチルアミン１０％；及び（ｆ）塩化メチレン．
【００２３】
次いで、下記のアミノ酸（３モル当量）を同じ手順によって逐次に結合させる：Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ＣＢＺ）、Ｂｏｃ−β−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ（ヒドロキシベンゾトリアゾール１当量の存在において結合させる）、及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ（ヒドロキシベンゾトリアゾール１当量の存在において結合させる）。完了した樹脂を、次いでメタノールで洗浄しかつ風乾した。
【００２４】
上記のペプチド樹脂（３．５０７６ｇ）にアニソール（１０ｍｌ）、ジチオスレイトール（１００ｍｇ）、及び無水フッ化水素（５０ｍｌ）を０℃で１時間混合した。過剰のフッ化水素を乾燥窒素を流しながら急速に蒸発させ、残分をエーテル中で洗浄した。粗製ペプチドを４Ｍ酢酸１００ｍｌに溶解し、次いで溶液を減圧下で蒸発させた。粗製ペプチドを最少容積のメタノール／水に溶解し、酢酸エチルで粉砕した。粉砕したペプチドをオクタデシルシラン−シリカ（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐａｒｔｉｓｉｌ １０ ＯＤＳ−２Ｍ９）のカラム（内直径９．４ｍｍ×５０ｃｍ）にかけた。ペプチドを水中５０／５０ ０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルｉ０．１％ＴＦＡ２０〜８０％の線状勾配で溶離させた。フラクションを分析用高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、適当なフラクションを蒸発させて小容積にし、これを更に凍結乾燥させて生成物８０ｍｇを無色粉末として得た。
【００２５】
本発明のその他の化合物、例えば類似体＃２（すなわち、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂ ）を、上記の合成方法を適当に修正することにより類似の方法で調製することができる。
【００２６】
生物学的アッセイ
（１）ＧＲＰレセプター結合アッセイ
ラットＡＲ４２Ｊ膵臓腺房細胞を、ダルベッコの改質イーグル培地に、抗生物質を用いないで、牛胎児血清１０％（容積／容積）を補足して、培養した。そのインキュベーション雰囲気は３７℃のＣＯ₂１０％−給湿空気９０％からなるものであった。
【００２７】
ボンベシンレセプター結合アッセイ用膜を、氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（バッファーＡ）においてＡＲ４２Ｊ細胞をホモジェナイズし（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、設定６、１５秒）（ニューヨーク、ウエストベーリ在、Ｂｒｉｎｋｍａｎ）かつフレッシュなバッファーＡに中間再懸濁させて３９，０００×ｇ（１０分）で２回遠心分離することによって得た。最終ペレットを、バシトラシン０．１ｍｇ／ｍｌ及びＢＳＡ０．１％を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（バッファーＢ）に再懸濁させ、レセプター結合アセイのために氷上に保った。
【００２８】
アッセイのために、アリコート（０．４ｍｌ）を、０．０５ｍｌの［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴］ボンベシン（〜２２００Ｃｉ／ｍモル、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）及びバッファーＢと共に、未標識の競合類似体０．０５ｍｌを用い及び用いないで、インキュベートした。３０分インキュベート（４℃）した後に、Ｂｒａｎｄｅｌろ過マニホールド使用して、あらかじめポリエチレンイミン０．１％に浸漬して置いたＷｈａｔｍａｎ（登録商標）ＧＦ／Ｂフィルターを通して急速ろ過することにより、結合された［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴］ボンベシンを結合されないもの（ｆｒｅｅ）と分離した。次いで、フィルターを氷冷バッファーＡのアリコート５ｍｌで３回洗浄した。特異的結合を、結合された全［ ¹²⁵ Ｉ−Ｔｙｒ ⁴ ］ボンベシンから１μＭの未標識ボンベシンの存在下において結合されたものを減じたものと定義した。
【００２９】
試験した化合物の結果（ｎＭにおけるＩＣ⁵⁰として表わす）及び構造を表１に示す。従来技術の化合物（すなわち、リトリン、Ｌｅｕ−リトリン、及び［Ｄ−Ｐｈｅ¹、Ｌｅｕ^8、9］リトリン）におけるＡ⁶位のＧｌｙをβ−Ａｌａで置換すると、予期されないことに、ＧＲＰレセプターについてのそれらの親和性を大きく増大させるに至った。例えば、Ｇｌｙをβ−Ａｌａで置換すると、親和性は２．８〜２３倍増大した（類似体＃２を［Ｄ−Ｐｈｅ¹、Ｌｅｕ^8、9］リトリン或はＬｅｕ−リトリンと比較）。Ａ¹、Ａ⁸、或はＡ⁹位を改変すると、親和性は更に増大する。例えば、類似体＃３は、ＩＣ₅₀が、リトリンについての２．４ｎＭ、Ｌｅｕ−リトリンについての２３ｎＭ、或は［Ｄ−Ｐｈｅ¹ 、Ｌｅｕ^8、9］リトリンについての２．８ｎＭに比べて、０．０３ｎＭ程に小さく、ＧＲＰレセプターに対するその親和性が８０〜７６６倍増大する。
【００３０】
【表１】

【００３１】
（２）ＮＭＢレセプター結合アッセイ
ラットＮＭＢレセプターをＢＡＬＢ−３Ｔ３線維芽細胞にトランスフェクトする手順は、ワダ等、Ｎｅｕｒｏｎ、６巻：４２２１−４３０（１９９１）及びＢｅｎｙａ等、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４２巻：１０５８（１９９２）において検討されている。
【００３２】
ボンベシンレセプター結合アッセイ用膜を、氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（バッファーＡ）においてラットＮＭＢレセプターをトランスフェクトさせたＢＡＬＢ−３７３線維芽細胞をホモジェナイズし（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、設定６、１５秒）かつフレッシュなバッファーＡに中間再懸濁させて３９，０００×ｇ（１０分）で２回遠心分離することによって得た。最終ペレットを、バシトラシン０．１ｍｇ／ｍｌ及びＢＳＡ０．１％を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（バッファーＢ）に再懸濁させ、レセプター結合アッセイのために氷上に保った。
【００３３】
アッセイのために、アリコート（０．４ｍｌ）を、０．０５ｍｌの［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴ ］ボンベシン（〜２２００Ｃｉ／ｍモル、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）及びバッファーＢと共に、未標識の競合類似体０．０５ｍｌを用い及び用いないで、インキュベートした。３０分インキュベート（４℃）した後に、Ｂｒａｎｄｅｌろ過マニホールドを使用して、あらかじめポリエチレンイミン０．３％に浸漬して置いたＷｈａｔｍａｎ（登録商標）ＧＦ／Ｂフィルターを通して急速ろ過することにより、結合された［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴］ボンベシンを結合されないものと分離した。次いで、フィルターを氷冷バッファーＡのアリコート５ｍｌで３回洗浄した。特異的結合を、結合された全［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ⁴］ニューロメジン−Ｂから１μＭの未標識のニューロメジン−Ｂの存在下で結合されたものを減じたものと定義した。
【００３４】
試験した化合物の結果（ｎＭにおけるＩＣ⁵⁰として表わす）及び構造を表１に示す。従来技術の化合物（すなわち、リトリン、ｌｅｕ−リトリン、及び［Ｄ−Ｐｈｅ¹、Ｌｅｕ^8、9］リトリン）におけるＡ⁶位のＧｌｙをβ−Ａｌａで置換すると、予期されないことに、ＮＭＢレセプターについてのそれらの親和性を大きく増大させるに至った。例えば、Ｇｌｙをβ−Ａｌａで置換すると、親和性は１１．７倍増大した（類似体＃２を［Ｄ−Ｐｈｅ¹、Ｌｅｕ^8、9］リトリンと比較）。Ａ¹、Ａ⁸、或はＡ⁹位を改変すると、親和性を更に増大させる。例えば、類似体＃４は、ＩＣ₅₀が、リトリンについての１．６６ｎＭ或は［Ｄ−Ｐｈｅ¹、Ｌｅｕ^8、9］リトリンについての４８０ｎＭに比べて、０．０４ｎＭ程に小さく、ＮＭＢレセプターについてのそれらの親和性が４１．５〜１２，０００倍増大する。Ｌｅｕ−リトリンは、ＮＭＢレセプターに関して結合親和性をほとんど有しないことが分かった。
【００３５】
【表２】

【００３６】
（３）インビボの前立腺腫瘍成長に関するアッセイ
アンドロゲン応答性Ｒ−３３２７／Ｈ前立腺腫瘍系統を３８の精巣無傷の同系コペンハーゲン雄ラットに移植した。腫瘍を植え付けた（ｔｕｍｏｒｅｄ）動物を、それらの腫瘍が２３５ｍｇｓに近い大きさに達した際に、個々に去勢の処理をした。次いで、２つの逐次の腫瘍測定値が、腫瘍成長速度の増大によって立証される通りの「去勢抑制からの逸脱」状態を示した際に、腫瘍をボンベシン類似体治療する処理をした。前立腺腫瘍組織のアンドロゲン感受性からアンドロゲン非感受性への変化は、腫瘍を外科的にかき乱さなくても起き、これよりボンベシン類似体の抗前立腺腫瘍活性を評価するための臨床上実際的なモデルとなった。
【００３７】
腫瘍を植え付けた動物を、１９動物の２つのグループに分けた。治療は、腫瘍が「去勢抑制からの逸脱」状態に達した際にだけ開始した。グループ１は２．６％のグリセロール／水ビヒクル０．２ｍｌ／注射（皮下、一日二回）を受けた。グループ２は類似体＃５を２００ｍｇ／注射（皮下、一日二回）受けた。両方の注射は、腫瘍と反対の脇腹に施与した。治療期間は２４日間続いた。腫瘍測定値を３日、７日、１０日、１４日、１７日、２１日、及び２４日に取った。腫瘍をバーニアーキャリパースを使用して測定しかつ容積を下記式：（０．５）（長さ）（幅）² を使用して計算した。
【００３８】
図１は、グループ１及びグループ２における治療の腫瘍成長抑制効果を例示する。相対的な腫瘍容積を下記式によって測定した：
【数１】

データは、平均の相対的腫瘍容積±標準誤差によって与える。治療の初めの２１日の間、ビヒクルで治療した対照用腫瘍（グループ１）及び類似体＃５で治療した腫瘍（グループ２）の大きさに定常的に増大する開きがあった。腫瘍成長速度は、類似体＃５での治療により１７日後において有意に（ｐ＜０．０５）抑制された。
【００３９】
用途
発明の類似体は、結腸癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌或は肺癌を治療するために、平滑筋の増殖を防ぐために、食欲を抑制するために、膵臓分泌を刺激するために、或はアルコール渇望を抑制するために有用である。発明の類似体は、哺乳動物特にヒトに、慣用の様式（例えば、経口、非経口、経皮、経粘膜、或は薬剤放出用インプラントによる投与）の内の一つで、生物分解性の生体適合性ポリマーを使用した持続的放出用配合物で、或はミセル、ゲル及びリポソームを使用したオンサイト送達により、或は直腸から（例えば、座薬もしくは注腸により）投与する。類似体は、ヒト患者に、０．２５〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の主治医によって決められるべき投与量で投与することができる。
【００４０】
その上、本発明の化合物、特にＮ−末端にＴｙｒを有するものは、診断用に及び¹³¹ ヨウ素のような放射性同位体の腫瘍ターゲティング用に用いることができる。
その他の実施態様
上記の記述は本発明の特定の実施態様に限った。しかし、発明の利点の内のいくつか或はすべてを達成する変更及び変更態様を発明になすことができよう。そのような実施態様は特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化合物の前立腺腫瘍に対する成長抑制作用を示すグラフである。

Claims (9)

1. 下記式の、腫瘍成長を阻害するための治療用ペプチド：
   

   

   式中、Ａ¹はＮａｌ、ＤＯＰＡ、Ｔｒｐ、Ｔｃｃ、Ｔｉｃ、Ａｚａ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びｐ−Ｘ−Ｐｈｅ（ここで、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ ₂ 、ＯＨ或はＣＨ ₃ である）から選ぶＤ−異性体であり；
   Ａ²はＧｌｎであり；
   Ａ³ はＴｒｐであり；
   Ａ⁴はＡｌａであり；
   Ａ⁵はＶａｌであり；
   Ａ⁶はβ−Ａｌａであり；
   Ａ⁷はＨｉｓであり；
   Ａ⁸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｌｅ、α−アミノ酪酸、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、ＨｙＰｒｏ、Ｎａｌ、Ｃｈｘ−Ａｌａ、Ｐｈｅ、或はｐ−Ｘ−Ｐｈｅ（ここで、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ₂、ＯＨ或はＣＨ₃である）であり；
   Ａ⁹はＭｅｔ、Ｍｅｔ−オキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、α−アミノ酪酸、或はＣｙｓであり；
   各々のＲ₁及びＲ₂は、独立に、Ｈ、Ｃ_1-12アルキル、Ｃ_7-10フェニルアルキル、或はＣＯＥ₁(ここで、Ｅ₁はＣ_1-20アルキル、Ｃ_3-20アルケニル、Ｃ_3-20アルキニル、フェニル、３、４−ジヒドロキシフェニルアルキル、ナフチル、或はＣ_7-10フェニルアルキルである）である；但し、Ｒ₁或はＲ₂のいずれかがＣＯＥ₁である時、他方はＨでなければならない；及び
   Ｒ₃はＯＨ、ＮＨ₂、Ｃ_1-12アルコキシ、Ｃ_7-10フェニルアルコキシ、Ｃ_11-20ナフチルアルコキシ、Ｃ_1-12アルキルアミノ、Ｃ_7-10フェニルアルキルアミノ、Ｃ_11-20ナフチルアルキルアミノである；或はこのようなペプチドの製薬上許容し得る塩。
2. Ａ⁸がＬｅｕ或はＰｈｅである請求項１の治療用ペプチド。
3. Ａ⁹がＭｅｔ、Ｌｅｕ、或はＮｌｅである請求項２の治療用ペプチド。
4. Ａ¹がＤ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｙｒ、或はＤ−Ｔｒｐである請求項３の治療用ペプチド。
5. 下記式：
   Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−ＮＨ₂の請求項４の治療用ペプチド。
6. 下記式：
   Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂の請求項４の治療用ペプチド。
7. 下記式：
   Ｈ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−ＮＨ₂の請求項４の治療用ペプチド。
8. 下記式：
   Ｈ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−ＮＨ₂の請求項４の治療用ペプチド。
9. 下記式：
   Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−β−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＮＨ₂の請求項４の治療用ペプチド。

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