PT95486A - Processo para a preparacao de derivados peptidicos anticoagulantes - Google Patents

Description

MERRELL DOW PHAKMACEUTICALS, INC. "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS PEPTlDICOS ANTICOAGULANTES" A presente invenção refere-se a novos péptidos anticoagu-lantes e que, como tal são também valiosos reagentes para o desenvolvimento de anticoagulantes.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

Os anticoagulantes são agentes terapêuticos úteis no tratamento farmacológico de, por exemplo, trombose venosa profunda aguda, embolia pulmonar, embolia arterial aguda das extremidades, enfarte do miocárdio e coagulação irtraascular disseminada. Cri-se que a administração profilática de anticoagulantes evita a recidiva de embolias em doentes com doença cardíaca reumática ou arterioesclerótica e evita determinadas complicações trombo--embólicas de actos cirúrgicos. A administração de anticoagulantes é ainda indicada no tratamento de doenças cerebrovascu-lares e das artérias coronárias. A trombose arterial, especialmente nas artérias que alimentam o músculo cardíaco e o cérebro, constiui uma das causas de morte. A hirudina consiste num polipéptido de 65 resíduos que se isolou nas glândulas salivares de sanguessugas. Ê um agente anti coagulante que é um inibidor específico da trombina. Apesar de -2- | ser bastante potente, a utilização clínica de hirudina, isolada dos extractos de sanguessugas, parece ser pouco vantajosa, devido à sua limitada quantidade, custos e reacções alérgicas que usualmente se seguem â administração de qualquer proteína estranha com estas dimensões.

Originalmente os requerentes descobriram uma região específica de hirudina que era responsável, pelo menos em parte, pela sua actividade anticoagulante. Sintetizou-se quimicamente a região peptídica (do aminoácido 55 ao 65 de hirudina) que demonstrou ligar-se ao sítio de reconhecimento da trombina sendo o sítio de reconhecimento espacialmente distinto do sítio de clivagem enzimática. A ligação dos péptidos de síntese também demonstrou evitar, de um modo competitivo a ligação do fibrinogénio ao sítio de reconhecimento da trombina, um pré-requesito importante para a produção da fibrina e formação do coágulo, sendo por esse motivo de potencial valor, no campo médico, como anticoagulante.

Os requerentes prepararam depois derivados deste péptido contendo eliminações de aminoácidos simples, da sequência original. De um modo específico, esta série de eliminações de aminoácidos, tomadas na sua totalidade, definem a extensão da dependência sequencial do péptido, posicionai e composicionamente e proporcionam a base para a concepção alargada do fármaco, de um modo racional. Muitos dos análogos peptídicos deste tipo possuem os atributos do péptido que lhes são inerentes e, por esse -3- \ motivo, também são úteis como coadjuvantes com interesse do ponto de vista cientifico e significativos do ponto de vista médico, na terapia anticoagulante. Para além disso, os análogos de aminoácidos podem conter em si mesmos uma maior potência e uma duração de acção mais prolongada.

SUMÃRIO DA PRESENTE INVENÇÃO

Os derivados peptídicos de fórmula geral

X A-j^ “A^ A.^ "A^ “Ag Ay ™Ag “A^q Y na qual o símbolo X representa um resíduo amino terminal seleccionado de entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, um ou dois grupos acilo com 2 a 10 átomos de carbono, grupos carbobenziloxi ou t-butiloxi-carbonilo? 0 símbolo A-j^ representa sequências de hidrudina ou as suas variantes naturais ou as suas porções, uma ligação, ou representa um péptido que contém de 1 a 11 resíduos de qualquer aminoácido; 0 símbolo A2 representa Phe, SubPhe, pCloroPhe, pgl, 3- e 4-piridil)-alanina,

Tha, His, Nap, Ç> -(2- e 3-tienil)-alanina, (b (2-, e 3-furanil)-alanina, (j -(2-, -4-

β -(benzotienil-2- e 3-)-alanina, -(benzotienil-2-e 3-)-alanina), ^> -(1- e 2-naftil)-alanina, Tyr, I-Tyr, ou Trp; 0 símbolo representa uma ligação, ou representa Glu, Asp ou Ala; 0 símbolo representa uma ligação, ou representa qualquer grupo aminoãcido; 0 símbolo A^ representa uma ligação ou representa Ile, Vai, Leu, Nle, Phe, Ala; 0 símbolo Ag representa uma ligação, ou representa Pro, Hyp, 3,4-dihidroPro, tiazolidina-4-carboxilato,

Sar,NMePgl,Azt, Pip ou D-Ala; 0 símbolo Ay representa uma ligação, ou representa qualquer L-aminoácido; 0 símbolo Ag representa uma ligação ou representa qualquer L-aminoácido; 0 símbolo A^ representa Tyr, I-Tyr, D-Tyr, His, Ala, Met, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, Cha, e Pro ou representa um dipéptido que contenha, pelo menos, um destes aminoácidos ou aminoácidos lipof ílicos ·, 0 símbolo A10 representa sequências de hirudina as suas variantes naturais ou as suas porções, uma ligação, ou representa um péptido que contenha de 1 a 11 resíduos de qualquer aminoãcido; 0 símbolo Y representa um resíduo carboxi terminal seleccionado entre grupos OH, alcoxi C-^-Cg, amino, ou aminoácidos mono ou di-substituídos por mono- ou di-alquilo são úteis como agentes anticoagulantes e, em que, pelo menos uma das posições Ag a Ag representa uma ligação.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO

Abreviaturas usuais, utilizadas ao longo da presente memória descritiva : 1) aminoácidos e o seu código de três letras, 2) aminoácidos não usuais e modificados e 3) substituintes amino e carboxi terminais -6-

(1): OS AMINOÃCIDOS E O SEU CÕDIGO DE TRÊS LETRAS L - AMINOÁC IDOS D-AMINOÂCIDOS

Ala (ou A) - alanina D-Ala (ou a) - D-alanina Arg (ou R) - arginina D-Arg (ou r) - D-arginina Asn (ou N) - asparagina D-Asn (ou n) - D-asparagina Asp (ou D) - ácido aspártico D-Asp (ou d) - D-ãcido aspár : tico Cys (ou C) - cisteína D-Cys (ou c) - D-cistelna Gly (ou G) - glicina Glu (ou E) - ácido glutâmico D-Glu (ou e) - D-ácido glutâmico Vai (ou V) - valina D-Val (ou v) - D-valina Gin (ou Q) - glutamina D-Gin (ou q) - D-glutamina His (ou H) - histidina D-His (ou h) - D-histidina Ile (ou I) - isoleucina D-Ile (ou i) - D-isoleucina Leu (ou L) - leucina D-Leu (ou 1) - D-leucina Lys (ou K) - lisina D-Lys (ou k) - D-lisina Phe (ou F) - fenilalanina D-Phe (ou f) - D-fenil- alanina Met (ou M) - metionina D-Met (ou m) - D-metionina Pro (ou P) - prolina D-Pro (ou p) - D-prolina Ser (ou S) - serina D-Ser (ou s) - D-serina Thr (ou T) - treonina D-Thr (ou t) - D-treonina Trp (ou W) - triptofano D-Trp (ou w) - D-triptofano Tyr (ou Y) - tirosina D-Tyr (ou y) - D-tirosina -7- \

(2): AMINOÁCIDOS MODIFICADOS E POUCO USUAIS

Aba - ácido oí-amino-n butírico pCIPhe - para-cloro-fenilalanina Cha - ciclo-hexilalanina Chg - ciclo-hexilglicina Hyp - hidroxiprolina I-Tyr - 3-iodotirosina, 5-iodotirosina, 3,5-di-iodotirosina yMeGlu - éster gama metílico do ácido D-glutâmico NMePhe - N-metilfenilalanina NMePgl - N-metil-fenilglicina

Npa - - (naftil)-alanina 3,4-di-hidroPro - 3,4-di-hidroProlina pJK^Phe - para-nitro-fenilalanina

Nle - norleucina

Orn - ornitina

Pip - pipecolato

Pba - ácido p-aminofenil-butírico pSubPhe - fenilalanina substituída na posição para

Pgl - fenilglicina

Sar - sarcosina (N-metilglicina)

SubPhe - fenilalanina mono ou di-substituída nas posições orto, meta ou para.

Tha -β -(2-tienil)-alanina

Tiq - 3-carboxilato de tetra-hidroisoquinolina -8- : 'ν' / *

SUBSTITUINTES AMINOÁCIDOS DAS EXTREMIDADES CARBOXI T AMINO

Ac - acetilo

Azt - azetidina-2-carboxilato Cin - cinamoílo 3,4-di-hidroCin - 3,4-di-hidrocinamoílo Glt - glutanílo Mal - maleilo

Oac - ácido 8-amino-octanoico

Oct - n-octilo

Suc - succinilo

Glt - glutarilo T£a - trifluoroacetilo #- amida C-terminal

As sequências que se seguem designam as variações das sequências aminoácidas naturais de Hirudin :

VARIAÇÕES DAS SEQUÊNCIAS AMINOÂCIDA DE HIRUDIN 1 Vai Ile 2 Vai Thr 3 Tyr 4 Thr 5 Asp 6 Cys 7 Thr 8 Glu 9 10 Ser Gly 11 Gin 12 Asn 13 Leu 14 Cys 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys 9- 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Asn Lys Gly Gin Asp 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glx Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Asn Glu 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin Pro Asp Asp Glu (Ala63 Tyr64 Leu/Asp64 Glu65)

DEFINIÇÕES DA PRESENTE INVENÇÃO

Os aminoácidos naturais, com excepção da glicina, contêm um átomo de carbono quirálico. Salvo indicação em contrário, os aminoácidos ópticamente activos, a que aqui se faz referência, possuem a configuração L. Por exemplo, qualquer um dos aminoácidos dos grupos A^ ou A^q podem possuir a configuração D ou a configuração L. Tal como habitual, a estrutura dos péptidos aqui designada encontra-se disposta de tal modo que a extremidade amino--terminal se encontra do lado esquerdo da cadeia e a extremidade carboxi terminal encontra-se do lado direito da cadeia.

Considera-se que qualquer grupo alquilo e a porção alquilo de um grupo alcoxi engloba grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada ou cíclicos, como por exemplo, grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, sec-pentilo, ciclopentilo, bexilo, iso-hexilo, ciclo--hexilo, e ciclopentilmetilo, heptilo, octilo (Oct), ácido 8-amino-octanoico (Dac). Considera-se que um grupo acilo com 2 a 10 átomos de carbono inclui grupos acilo de cadeia linear, ramificada, cíclicos, saturados ou insaturados que possuem 1 ou 2 radicais carbonilo por grupo, por exemplo, acetilo (Ac), azeti-dina-2-carboxilato (Azt), benzoil-succinilo, cinamoílo (Cin), 3,4-di-hidrocinamoilo (3,4-di-hidroCin), maleilo (Mal) e gluta-rilo (Glt). Consideram-se que os substituintes dos grupos acilo e alquilo incluem os grupos com substituintes halogeno-, em que o grupo halogéneo representa um átomo de fluor cloro, bromo ou iodo, por exemplo trifluoroacetilo (Tfa). 0 termo "qualquer aminoãcido", tal como aqui se utiliza, não tem como intenção abranger qualquer ácido carboxílico que possua um substituinte amino, mas utiliza-se de preferência, tal como se utiliza habitualmene pelos especialistas de derivados polipeptí-dicos e incluem os aminoácidos naturais assim como outros oi --aminoácidos "não-proteicos" vulgarmente utilizados pelo especialista de química peptídica quando prepara análogos de síntese de péptidos naturais. Os aminoácidos naturais, são os aminoácidos de configuração L, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, -11- serina, metionina, treonina, fenilalanina, tirosina, triptofano, cistelna, prolina, histidina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, arginina, ornitina e lisina. Também se encontra incluído como "qualquer aminoácido" os isómeros de confi guração D ("D-aminoácidos") dos L-aminoácidos naturais; D-alanina, D-valina, D-leucina, D-isoleucina, D-serina, D-metioniona, D-treonina, D-fenilalanina, D-tirosina, D-triptofano, D-cisteína, D-prolina, D-histidina, ácido aspártico, D-asparagina, ácido D-glutâmico, D-glutamina, D-arginina. Também se encontram incluídos os o(-aminoácidos "não-proteicos" cujos exemplos são norleucina, norvalina, alo-isoleucina, homoarginina, tiaprolina, di-hidroprolina, hidroxiprolina (Hyp), homoserina, ciclo-hexil-glicina (Chg), ácido tf-amino-n-butírico (Aba), ciclo-hexilalanina (Cha), ácido aminofenilbutírico (Pba), fenilalaninas mono ou di-substituldas nas posições orto, meta ou para, tal como fenilalanina substituída na posição para (pSubPhe) e para-elorofenilala-nina e para-nitrofenilalanina (pNC^Phe) ou nas posições do grupo fenilo por um ou dois dos substituintes que se seguem: átomos de halogéneo, grupos alquilo C^-C^ alcoxi C-^-C^, ou grupos nitro, ou substituído por um grupo metilenodioxi,^-2- e 3-tienilalanina, ^ -2 e 3-furanilalanina, -2-, 3- e 4-piridilalanina, -(benzo-tienil-2 e 3-il)-alanina,-(1- e 2-naftil)-alanina (NPA), derivados O-alquilados de serina, treonina ou tirosina, ésteres metílicos de ácido aspártico e de ácido glutâmico, cisteína S-alquilada, éster de O-sulfato de tirosina e tirosina haloge-nadas tais como 3-iodotirosina, 5-iodotirosina, 3,5-di-iodotiro-sina. -12-

Pela expressão "sequência de hirudina ou as suas variantes naturais" os requerentes referem as sequências aminoãcidas que descobriram para a hirudina existente na natureza.

Os termos "suas porções" de hirudina e das suas variantes significam uma região consecutiva de 4 aminoácidos derivados da sequência de hirudina ou das suas variantes. 0 termo "aminoácido lipofílico" inclui Tyr, Phe, Leu, Met, Nle, Ile, Vai e Pro. Para além disso, o termo "iminoácidos" refere-se a todos os N-alquil-aminoácidos. Constituem exemplos de iminoácidos a N-metil-fenilalanina (NMePhe), N-metil-fenilgli-cina (NMePgl), 2,4-di-hidroprolina (3,4-di-hidroPro), ácido p-aminofenil-butirico (Pba), sarcosina (Sar) e Prolina (Pro), pipecolato (Pip).

Com a expressão "um péptido que contenha de 1 a 11 resíduos de aminoácidos" pretende-se reflectir que a adição de aminoácidos quer ao grupo amino terminal quer ao grupo carboxi terminal do núcleo de aminoácidos (k^-k^) abrange a estrutura do núcleo com a sua actividade intrínseca.

Os polipêptidos de formula geral 1 podem formar sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico com qualquer ácido não--tóxico, orgânico ou inorgânico. Exemplos de ácidos inorgânicos que formam sais adequados incluem o ácido clorídrico, o ácido 13- // -,¾ bromídrico, o ácido sulfúrico e o ácido fosfórico e os sais de metais ácidos tais como o mono-hidrogeno-ortofosfato de sódio e hidrogeno-sulfato de potássio. Exemplos de ácidos orgânicos que formam sais adequados que incluem os ácidos mono, di e tricarbo-xílicos. Constituem exemplos de tais ácidos, por exemplo, os ácidos acético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, siccínico, glutárico, fumárico, mãlico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroxi-maleico, benzoico, hidroxibenzoico, fenilacético, cinâmico, salicílico, 2-fenoxibenzoico e ácidos sulfónicos, tais como o ácido metassulfónico e o ácido 2-hidroxietanossulfónico.

Os sais da porção aminoãcida carboxi terminal incluem os sais de ácidos carboxílicos não tóxicos formados com qualquer base orgânica ou inorgânica adequada. De um modo exemplificativo, estes sais incluem os de metais alcalinos, como por exemplo, de sódio e de potássio; os de metais alcalino-terrosos, tais como os de cálcio e magnésio; os sais de metais leves do Grupo IIIA, incluindo o alumínio; e de aminas orgânicas primárias, secundárias e terciárias, como por exemplo, de trialquilaminas, incluindo trietilamina, procalna, dibenzilamina, 1-etenamina, N,N'-dibenzil-etilenodiamina, di-hidroabietilamina, N-alquil-(inferior)-piperi-dina e de outras aminas adequadas.

Tal como acontece com qualquer grupo genérico de compostos químicos, dá-se preferência a determinados grupos. Os requerentes preferem os derivados peptídicos de fórmula geral 1 na qual o símbolo X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo acetilo ou succinilo; -14-

o símbolo Α·^ represente uma ligação ou represente Hirudina ou as suas variantes naturais, inclusive, dos aminoácidos de 1 a 54 ou as suas regiões, ou uma ligação; o símbolo A^ represente uma ligação ou represente Tyr, Trp, Glu, His, Leu, Phe, D-Phe, SubPhe, pCloroPhe, NMePhe, Tha, 3,4-di--hidroCin, Cin, Nap,(b-(2- e 3-tienil) .alanina,β -(2- e 3-fura-nil)-alanina,β - (2-, 3-, e 4-piridil)-alanina, (b - (benzotienil-2-e 3-il)-alanina ou^-(l- e 2-naftil)-alanina; o símbolo Α^, represente uma ligação ou Glu, Ala; o símbolo A^ represente uma ligação ou Glu, Asp, Pro, Ala, Azt, Pip, imino-ácidos ou D-aminoácidos; o símbolo Ag represente uma ligação, ou Ile, Leu; Ag represente uma ligação ou Pro, Sar, D-Ala, Hyp ou NMePgl; o símbolo Ay represente uma ligação ou Glu, Gin, Asp ou Ala; o símbolo Ag represente uma ligação ou Glu, Asp ou Ala; o símbolo Ag represente uma ligação ou Ala, Pro, Cha, ou os dipéptidos, Ala-Tyr, Tyr-Leu, Ala-Phe, Tyr-Tyr, Ala-Leu, Tyr-Ala, Glu-Leu, D-Tyr-Leu, Leu-Phe, Sar-Cha, Pro-Cha, Cha-Leu, Ala-Cha, Tyr-Cha; o símbolo A-^q represente uma ligação ou MeGlu, Glu, D-Glu, Asn, D-Asn, Asn-ol, Pro, Gin, Ala, Lys, D-Lys, Asp, Asp, Orn, Asp, ou representa Ala; e -15- Ç·* ο símbolo Υ represente um resíduo carboxi terminal seleccionado entre OH, alcoxi C-^-Cg, amino, aminoácidos mono ou di-alquil substituídos ou represente um resíduo terminal alcoólico; em pelo menos uma das posições de Ag a Ag represente uma ligação.

Da-se especial preferência aos derivados peptídicos de fórmula geral 1, em que o símbolo X represente Suc, Mal; o símbolo A-j^ represente uma ligação; o símbolo k^ represente Tyr, Phe, Nap; o símbolo Ag represente Glu, ou represente uma ligação; o símbolo A^ represente Glu, Pro, Tiq, ou represente uma ligação; o símbolo Ag represente Ile, ou represente uma ligação; o símbolo Ag represente Pro, ou represente uma ligação; o símbolo k-j represente Glu, ou represente uma ligação; o símbolo Ag represente Glu, ou represente uma ligação; o símbolo Ag represente Ala-Cha, Tyr-Leu, Ala, Cha; o símbolo A1q represente Gin, D-Glu, Asn; e o símbolo Y represente o grupo OH ou o grupo em que, pelo menos uma das posições de Ag a Ag representa uma ligação. -16- -16-

SÍNTESE

Podem preparar-se as proteínas da presente invenção, de acordo com diversos procedimentos conhecidos pelos especialistas. Tais procedimentos incluem síntese de péptidos em fase solúvel, síntese sequencial em fase sólida e a síntese em bloco, adcnagpn de genes e as combinações destas técnicas. Pode levar-se a efeito o procedimento sequencial em fase sólida utilizando métodos automatizados estabelecidos tal como a utilização de um sintetizador de péptidos automatizado. Neste procedimento constroem-se os péptidos sobre resina, iniciando-se com o aminoácido C-terminal protegido. 0 suporte de resina utilizado pode ser qualquer uma das resinas que se utilizam convencionalmente para a preparação em fase sólida de polipêptidos, de preferência poliestireno, que se ligou de modo reticular com 0,5 a cerca de 3 por cento de divinil-benzeno, que se clorometilou ou hidroximetilou para se proporcionarem sítios para a formação de ésteres com o aminoãcido protegido em O^-amino inicialmente introduzido. Para as amidas C terminais pode utilizar-se uma resina de pimetilbenzidrilamina. Após ter-se completado o acoplamento da sequência ou se remove o grupo Boc ou se conserva no mesmo local ou se remove o grupo Boc e se efectua a acilação do grupo amino terminal. Efectuou-se o deslocamento do fragmento protegido da resina utilizando o amino-álcool adequado. -17- η

Encontra-se descrito por Bodanszki e outros; "Chem. Ind."; Londres; 38; 1966; p. 1957-98, um exemplo de uma resina de hidroximetilo. Uma resina clorometilada encontra-se comercialmente disponível nos BioRad Laboratories, Richmond, Califórnia e a preparação de tal resina encontra-se descrita por Stewart e outros, "Solid Phase Peptide Syntesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Capítulo 1, p. 1-6. Pode ligar-se o aminoãcido protegido ã resina de acordo com o procedimento de Gisin; "Helv. Chem. Acta", 56; 1973; p. 1476. Encontram-se comercialmente disponíveis diversas resinas ligadas a aminoácidos protegidos. A título de exemplo,' para se preparar um polipéptido da presente invenção em que o grupo carboxi terminal consiste num resíduo de D-Glu, pode utilizar-se um D-Glu protegido por um grupo terc--butiloxicarbonilo (Boc) ligado a uma resina de fenilacetamido-metilo (PAM), benzilada, hidroximetilada. A seguir â ligação do aminoãcido protegido emO(-amino ao suporte de resina, elimina-se o grupo deprotecção utilizando qualquer um dos procedimentos adequados, como por exemplo ácido trifluoro-acêtico em cloreto de metileno, apenas ácido trifluoroacético ou HC1 em dioxano. Efectua-se a desprotecção a uma temperatura compreendida entre 0°C e a temperatura ambiente. Podem utilizar-se outros reagentes e condições de clivagem normalizadas para a eliminação de grupos específicos de protecção,¢(-amino. Após eliminação do grupo de protecção-amino faz-se o acoplamento dos outros aminoácidos protegidos pelo grupo amino, passo a passo, segundo a ordem desejada. Como alternativa, podem acoplar-se grupos aminoãcidos múltiplos de acordo com o método de solução antes de se acoplarem â sequência aminoácida suportada pela resina. 0 grupo de protecção o^-amino utilizado em cada aminoãcido introduzido na sequência polipeptídica pode ser qualquer dos grupos de protecção conhecidos na especialidade. Entre as classes de grupos de protecção o(-amino contempladas encontram-se os grupos de protecção (1) de tipo acilo tais como: grupos formilo, trifluoroacetilo, ftalailo, toluenossulfonilo (tosilo), benzenos-sulfonilo, nitrofenilsulfenilo, tritilsulfenilo, o-nitrofenoxi-acetilo e o<-clorobutirilo; 2) grupos de protecção aromáticos de tipo uretano tais como os grupos benziloxicarbonilo e benziloxi-carbonilo substituído, tais como os grupos p-clorobenziloxicar-bonilo, p-nitrobenzil-carbonilo, p-bromobenziloxicarbonilo, p-metoxibenziloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletiloxicarbo-nilojO^c^-dimetil-S,5-dimetoxibenziloxicarbonilo e benzidriloxi-carbonilo; 3) grupos de protecção de tipo uretano alifáticos tais como os grupos terc-butiloxicarbonilo (Boc), di-isopropilmetoxi-carbonilo, isopropoxicarbonilo, etoxicarbonilo e aliloxicarbonilo; 4) grupos de protecção cicloalquilicos de tipo uretano, tais como os grupos ciclopentiloxi carbonilo, adamantiloxicarbonilo e ciclo-hexiloxicarbonilo; 5) grupos de protecção de tipo tiouretano tal como o grupo feniltiocarbonilo; e 6) grupos de protecção de tipo alquilo, tais como trifenilmetilo (tritilo) e benzilo. 0 grupo de protecção -amino preferido é o grupo terc-butiloxicar-nilo. -19- ί .¾

Como é do conhecimento da técnica de síntese de péptidos em fase sólida, muitos dos aminoácidos englobam funcionalidades que necessitam de protecção durante a preparação da cadeia. A utilização e selecção dos grupos de protecção adequados é da competência do especialista e dependerá do aminoãcido que se pretenda proteger e da presença, no péptido, de outros resíduos amino--ácidos protegidos. A selecção de um tal grupo de protecção de cadeia lateral é crítica devido ao facto de ter de ser um grupo que não seja eliminado pela clivagem durante a clivagem do grupo de protecção do radical -amino. Os grupos de protecção da cadeia lateral, para a lisina, são, por exemplo, o grupo benziloxicarbo-nilo e o grupo benziloxicarbonilo substituído, sendo o referido substituinte seleccionado entre átomos de halogéneo (como por exemplo, átomos de cloro, bromo ou flúor) e o grupo nitro (como por exemplo os grupos 2-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenziloxi-carbonilo, 3,4-di-clorobenziloxicarbonilo), grupos tosilo, t-amiloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo e di-isopropilmetoxicar-bonilo. Podem proteger-se os grupos hidroxilo acoõlicos da treo-nína e da serina com um grupo acetilo, um grupo benzoílo, um grupo terc-butilo, um grupo tritilo, um grupo benzilo, um grupo 2,6-diclorobenzilo ou um grupo benziloxicarbonilo. 0 grupo de protecção preferencial é o grupo benzilo. A selecção de um agente de acoplamento adequado é da competência do especialista. Os agentes de acoplamento adequados quando o aminoãcido que se pretende adicionar é Gin, Asn ou Arg são os i -20/ compostos N,N'-di-isopropilcarbodi-imida e 1-hidroxibenzotriazol. A utilização destes agentes evita a formação de nitrilo e lactama. Outros agentes de acoplamento são: 1) carbodi-imidas (como por exemplo N,N'-diciclo-hexilcarbodi-imida e N-etil-N'--(^-dimetilaminopropilcarbodi-imida); 2) cianamidas (como por exemplo, Ν,Ν-dibenzilcianamida); 3) ceteniminas; 4) sais de isoxazôlio (como por exemplo N-etil-5-fenil-isoxazólio-3'-sulfo-nato; 5) amidas heterocíclicas contendo azoto monocíclico de características aromáticas contendo de um a quatro átomos de azoto no anel, tal como as imidazolidas, as pirazolidas e 1,2,4--triazolidas. As amidas heterocíclicas específicas úteis abrangem N,N'-carbonildi-imidazol e N,N’-carbonil-di-l,2,4-triazol; 6) acetileno alcoxilado (como por exemplo etoxiacetileno); 7) reagentes que formam um anidrido misto com o radical carboxilo do aminoácido (como por exemplo etilcloroformato e isobutilcloro-formato) ou o anidrido cimétrico do aminoácido que se pretende acoplar (por exemplo Boc-Ala-D-O-Ala-Boc), 8) compostos etero-cíclicos que contêm azoto e que possuem um grupo hidroxi num anel de azoto (como por exemplo N-hidroxiftalimida, N-hidroxissuccini-mida e 1-hidroxibenzotriazol) e 9) o reagente de Castro (BOP). Kapoor e outros; "J. Parm. Sei." ; 59; 1970; p. 1-27, descreveram outros reagentes de activação e a sua utilização no acoplamento de pêptidos. Os requerentes dão preferência à utilização do anidrido cimétrico como reagente de acoplamento para todos os aminoãcidos, com excepção de Arg, Asn e Gin.

Introduziu-se cada um dos aminoácidos protegidos ou cada uma das sequências aminoácidas no reactor de fase sólida num excesso de aproximadamente quatro vezes e efectuaram-se os acoplamentos num meio de dimetilformamida: cloreto de metileno (1:1) ou apenas em dimetilformamida ou, de preferência, em apenas cloreto de metileno. Nos casos em que surgiram acoplamentos incompletos, repetiu-se o procedimento antes de se eliminarem os grupos de protecção 0(-amino, antes de se efectuar o acoplamento do amino-ácido seguinte, no reactor de fase sólida. Monitorizou-se a efectivação da reacção de acoplamento em cada uma das fases de síntese, pela reacção da ninidrina, tal como descrito por E.

Kaiser e outros; "Analyt. Biochem."; 34; 1970; p. 595. A seguir ao acoplamento do aminoãcido^-amino protegido, ao suporte de resina, eliminou-se o grupo de protecção utilizado qualquer um dos procedimentos adequados, como por exemplo utilizando ácido trifluoroacético em cloreto de metileno, ácido trifluoro-acêtico sozinho, ou HC1 em dioxano. efectuou-se a desprotecção a uma temperatura compreendida entre 0°C e a temperatura ambiente. Podem utilizar-se outros reagentes e condições de clivagem normalizadas para a eliminação de grupos específicos de protecção p(-amino. Após a eliminação do grupo de protecção 0(-amino, acopla ram-se passo a passo os outros aminoácidos protegidos, pela ordem desejada. Como alternativa, podem acoplar-se grupos múltiplos de aminoácidos, de acordo com o método de solução, antes de se efectuar o acoplamento â sequência aminoácida suportada pela resina. -22-

Após ter-se obtido a sequência aminoãcida desejada, sepa-rou-se o pêptido da resina e desprotegeu-se. Pode efectuar-se esta operação por hidrólise, como por exemplo, por tratamento do polipéptido ligado â resina com HF líquido anidro na presença de agentes de limpeza (como por exemplo, anisol). Usualmente, efectua-se a remoção dos grupos de protecção, após a síntese da cadeia peptídica se encontrar completa, mas pode remover-se os grupos de protecção em qualquer altura adequada.

Leva-se a efeito a purificação e a análise dos péptidos desprotegidos de acordo com diversos procedimentos normalizados. A selecção dos procedimentos de purificação e análise adequados é da competência do especialista. Um procedimento de purificação adequado consiste na CLEP preparatória. Pode efectuar-se a análise dos péptidos purificados por CLEP analítica, análise aminoãcida, espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos e quaisquer outros meios de análise adequados. UTILIZAÇÃO TERAPÊUTICA : A dose anticoagulante de um derivado peptídico da presente invenção encontra-se compreendida entre 0,2 mg/kg a 250 mg/kg de peso corporal do doente por dia, dependendo do doente, da gravidade da situação trombótica que se pretende tratar e do derivado peptídico seleccionado. Pode determinar-se facilmente a dose adequada para um dado doente. De um modo preferencial, adminis- -23- trar-se-ão, habitualmente de 1 a 4 doses diárias com, aproximada-mente, 5 mg a 100 mg de ingrediente activo, por dose. Pode ser facilmente determinada pelo especialista a quantidade de um péptido da presente invenção necessária para inibir ou evitar a coagulação sanguínea num meio extracorporal tal como sangue total armazenado. A terapia anticoagulante é indicada para tratamento e prevenção de diversas situações trombóticas, especialmente nas doenças das artérias coronárias e cerebrovasculares. Os especialistas neste campo determinarão facilmente as circunstâncias em que é necessária a terapia anticoagulante. 0 termo "doente" aqui utilizado refere-se a mamíferos tais como primatas, incluindo seres humanos, caprinos, equinos, gado, suínos, caninos, gatos, ratazanas e ratos. A inibição da coagulação sanguínea é útil não apenas na terapia anticoagulante de indivíduos que padecem de situações trombóticas, mas é também útil sempre que se pretenda uma inibição da coagulação sanguínea, tal como para evitar a coagulação do sangue total armazenado e para evitar a coagulação em outras amostras biológicas para ensaio ou armazenamento.

Embora alguns derivados peptídicos possam penetrar através dos intestinos, após administração oral, os requerentes preferem a administração não oral, por exemplo a via subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intr^peritoneal; a administração por injecção de libertação constante; a administração per preparação de uma implantação; ou por aplicação às membranas mucosas, tais como a do nariz, da garganta, da árvore brônquica, por exemplo num aerossol que contenha um derivado peptidico da presente invenção sob a forma de uma aspersão ou de um pó seco.

Podem administrar-se os compostos, por administração paren-térica, sob a forma de doses injectáveis de uma solução ou suspensão do composto num diluente fisiologicamente aceitável com um veículo farmaceuticamente aceitável que pode ser um líquido esterilizado, tal como a água e óleos, com ou sem adição de um agente tencioactivo e de outros coadjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Como exemplos de óleos que se podem utilizar nestas preparações, referir-se-ão os óleos de petróleo, os óleos animais, os óleos vegetais, os óleos sintéticos, como por exemplo o óleo de amendoim, o óleo de soja e o óleo mineral. Os veículos líquidos preferenciais, especialmente para soluções injectáveis são, geralmente, a água, a solução salina, a dextrose aquosa, e soluções de açucares que lhe estão associados, etanol, e glicóis tais como propileno-glicol, ou polietileno-glicol.

Podem administrar-se os compostos sob a forma de uma injecção de libertação constante ou de uma preparação de implantação que se pode formular de tal modo que permita uma libertação constante do ingrediente activo. Pode comprimir-se o ingrediente activo em comprimidos ou pequenos cilindros e implantar-se subcutaneamente ou intramuscularmente sob a forma de injecção ou de implantações -25-

fi de libertação constante. Nas implantações podem utilizar-se materiais inertes tais como polímeros biodegradáveis ou silicones de síntese, como, por exemplo, "Silastic", borracha de silicone, fabricada pela Down-Corning Corporation.

EXEMPLOS A presente invenção encontra-se ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLO 1

Preparação de Péptidos Anticoagulantes

Sintetizou-se o péptido de acordo com os métodos de fase sólida, utilizando 8,3 mmole de uma resina de Merrifield Bod-D-Glu (Bzl) 0,56 mmol/g, num sintetisador de péptido semi-automático "Vega". Efectuaram-se os acoplamentos simples dos anidridos simétricos com 18,3 mmole de Νλ-Boc-aminoácido (Peptides International), com excepção do caso de Boc-Cha em que foram necessárias duas reacções de acoplamento para se obter um ensaio de Kaiser negativo. Removeram-se porções de péptido-resina (0,7 a 1,5 g) e puseram-se de parte após o 39 ciclo ao 89 cilco; para des-Glu reservou-se, apos o 89 ciclo, 1,36 g (0,50 mmol) de Boc-Pro-Ile-Pro-Glu(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-D-Glu(Bzl) resina de Merrifield. Transferiu-se a resina do fragmento de péptido protegido para um tubo de reacção dos Applied Biosystems, onde -26-

se adicionou Boc-Tyr (2-BrZ) utilizando o método de acoplamento duplo do anidrido simétrico com 2,0 mmole de aminoácido. Eliminou-se o grupo de protecção IW-Boc com ácido trifluoroacético em cloreto de metileno a 50%, neutralizou-se com três lavagens com di-isopropiletilamina em cloreto de metileno a 10%, lavou-se três vezes com cloreto de metileno e secou-se sob toma corrente de azoto. 0 péptido foi N«(-succinilado de acordo com o método de acoplamento duplo de anidrido succinico, em dimetilformamida, lavou-se tris vezes com dimetilformamida, neutralizou-se com duas lavagens de di-isopropiletilamina em cloreto de metileno, a 10% lavou-se tris vezes com cloreto de metileno e secou-se no vácuo. Desprotegeu-se o péptido e clivou-se da resina com HF anidro contendo 5% de anisol, a 0°C, durante 60 minutos. Removeu-se o HF no vácuo, a 0°C; extraíu-se o péptido da resina com acetonitrilo em solução aquosa, a 25%, congelou-se e liofili-zou-se. - 18

Efectuou-se a CLEP preparatória, numa coluna de C Beckman de 50,8 x 150 mm, com um gradiente linear de acetonitrilo compreendido entre 29,6 e 31,6%, durante 15 minutos em ácido trifluoroacético em solução aquosa a 0,1% a 80 ml/minuto. Recolheu-se o pico principal (monitorizado a 280 nm) e liofilizou-se, obtendo-se 281 mg do produto pretendido. Determinou-se a homogeneidade por CLEP: coluna de "Vydac 218TP54 (4,6 x 250 mm), 2,0 ml/minuto, t=l,5 minutos, o tempo de eluição com um gradiente linear de acetonitrilo entre 15 e 40%, durante 25 minutos de ácido trifluoro -27-

acético a 0,1% foi de 17,1 minutos. A análise dos péptidos purificados marcados, proporcionou o pico iônico molecular pretendido, por EM-BAR e demonstrou uma análise aminoácida em concordância com o péptido desejado. Deste modo, os péptidos que se seguem possuem as propriedades físicas referidas que se especificam adiante.

Ensaiaram-se as amostras num ensaio de inibição do coágulo de fibrina induzido pela trombina. Todas as soluções de ensaio se efectuaram com um tampão de ensaio que continha 0,12 M de cloreto de sódio, 0,01 M de fosfato de sódio, 0,01% de azida de sódio e 0,1% de albumina de soro de bovino a pH 7,4. Efectuou-se a titulação da trombina de bovino para uma concentração adequada de modo a que se pudesse monitorizar a formação do coágulo de fibrina, através de um leitor de placa de microtitulação (Bio-Tek EL 309), durante 60 minutos a 405 nm. Adicionou-se esta solução de trombina (50 jjI·, 0,2 pmole) aos tubos de uma placa de microtitulação contendo 50 de uma solução do péptido de síntese que se pretendia ensaiar. Após ter-se agitado durante 1 minuto e de se ter efectuado a inubação durante mais 10 minutos, a 20°C, adicionou-se 100 JXl de plasma diluído (1:10) em EDTA a 0,1% e agitou-se em turbilhão durante 20 segundos. Monitorizou-se a turvação da solução através de um autoleitor a intervalos de 5 minutos. Calculou-se CI^q a partir dos resultados e definiu-se como a concentração de péptido que conduzia a metade da turvação -28- / /

observada relativamente a um controlo que nao continha nenhum inibidor. Isto é equivalente a um duplo acréscimo no tempo de formação do coágulo de fibrina. Para os ensaios em que se utilizou trombina humana, titulou-se a referida trombina e a trombina de bovino para concentrações que proporcionam um coágulo de fibrina na mesma proporção, decorrido um período de 30 minutos. Deste modo, os seguintes péptidos possuem as propriedades biológicas referidas, nos exemplos que adiante se especificam em que o símbolo + representa uma IC^q J25 y&l e <200 jM e os símbolos ++ representam uma CI^q^25 uM. 1) Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu OH MW 1200 EM-BAR (MH)+ 1201 Z(3) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 3,08 1,97 0,96 0,99 0,99 potência in vitro: + 2) H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH MW 1370 EM-BAR (MH)+ 1371 Z(5) Ile(l) Tyr(l) Gly(l) B(l) Phe(l) Leu(l) 4,93 0,85 0,95 1,09 1,10 1,08 0,99 potência in vitro: + 3) Suc-Tyr-Glu-Pro-Tiq-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH MW 1278 EM-BAR (MH)+ 1279 Z(4) Pro(l) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) Cha(l) 4,05 0,93 0,96 0,95 1,03 1,03 potência in vitro: ++ 4) Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-NH2 MW 1158 EM-BAR (MH)+ 1175 Z(4) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 4.15 1,94 0,96 1,01 0,95 potência in vitro: ++ 5) Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Cha-Gln-NH2 MW 1256 EM-BAR (MH)+ 1257 Z(4) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 4.15 1,98 0,91 0,97 1,05 potência in vitro: ++ 6) Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Ala-Cha-Asn-OH MW 1184 EM-BAR (MH)+ 1185 B(l) Z(2) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 1,02 2,09 1,98 0,93 1,01 0,97 potência in vitro: ++

Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Asn-OH MW 1161 EM-BAR (MH)+ 1162 7) Ζ(3) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) B(l) 3,14 1,95 0,95 1,00 0,96 1,01 potência in vitro: ++ 8) Mal-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH MW 1198 EM-BAR (MH)+ 1198 Z(3) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 3.06 2,01 0,95 0,99 1,01 potência in vitro: 4- 9) Suc-Nap-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH MW 1234 EM-BAR (MH)+ 1234 Z(3) Pro(2) Ile(l) Ala(l) 3,08 2,00 0,94 0,97 potência in vitro: ++ 10) Suc-Tyr-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH MW 1232 EM-BAR (MH)+ 1233 Z(4) Pro(l) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 4.07 0,99 0,96 0,98 0,99 potência in vitro: + 11) Suc-Tyr-Glu-Pro-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH MW 1216 EM-BAR (MH)+ 1217 Z(4) Pro(2) Tyr(l) Ala(l) 4,05 1,97 0,98 1,00 potência in vitro: + 12) Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH MW 1232 EM-BAR (MH)+ 1233 Z(4) Pro(l) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 4.10 1,01 0,94 0,96 0,99 potência in vitro: ++ 13) Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH MW 1200 EM-BAR (MH)+ 1201 Z(3) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 3,16 1,97 0,93 0,96 0,98 potência in vitro: ++ 14) Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-D-Glu-OH MW 1176 EM-BAR (MH)+ 1177 Z(4) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 4,08 1,97 0,96 0,99 1,00 potência in vitro: ++

15) Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Cha-D-Glu-OH MW 1258 EM-BAR (MH)+ 1259 Z(4) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) 4.10 2,01 0,91 0,98 potência in vitro: ++

Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-OH MW 1175 EM-BAR (MH)+ 1175 16) Ζ (4) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 4,11 1,98 0,93 1,01 0,97 potência in vitro: ++ 17) Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-NH^ MW 1158 EM-BAR (MH)+ 1159 Z(4) Pro(2) Ile(l) Ala(l) Phe(l) 4,10 2,05 0,93 0,96 0,97 potência in vitro: + 18) Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-OH MW 1200 EM-BAR (MH)+ 1201 Glx(3) Pro(2) Ile(l) Tyr(l) Ala(l) 3,10 1,94 0,98 0,99 0,99 potência in vitro: ++ 19) Suc-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH MW 1166 EM-BAR (MH)+ 1167 Glx(4) Pro(2) Ile(l) Ala(l) 4,12 1,95 0,96 0,98 potência in vitro: +

Claims (11)

1. -33- -33-

   REXVINDICAÇÕES 1,- Processo para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral X~A1 “A2-A3 ~ A4 ”A5 ”A6 -A7 "^8” A9 ~A10 na qual: X representa um resíduo aminoterminal seleccionado de entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alqui lo com 1 a 10 átomos de carbono, um ou dois grupos acilo com 2 a 10 átomos de carbono, carbobenziloxi, ou t-butiloxi-carbonilo; representa sequências de hirudina ou as suas va-

   riantes naturais ou as suas porções, uma ligação, ou representa um piptido contendo entre 1 e 11 resíduos de qualquer aminoãcido; A2 representa uma ligação ou representa Phe, SubPhe, pCloroPhe, D-Phe, NMePhe, Pgl, Tha, His, Cin, Nap,

   P~(l- e 2-naftil)-alanina, Tyr ou Trp? Ag representa uma ligação, ou representa Glu, Asp ou Ala; A^ representa uma ligação, ou representa qualquer aminoãcido; A5 representa uma ligação, ou representa Ile, Vai, Leu, Nle, Phe, Ala ou D-Leu; Ag representa uma ligação, ou representa Pro, Hyp ou 3,4-di-hidroPro, tiazolidina-4-carboxilato, Sar, NMePgl, Azt, Pip, Ala ou D-Ala; Αη representa uma ligação, ou representa qualquer and noãcido; Ag representa uma ligação, ou representa qualquer aminoãcido; Ag representa uma ligação, ou representa um Tyr, Ι-Tyr, D-Tyr, His, Ala, Met, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, Cha e Pro, ou representa um dipeptido contendo -35 pelo menos um destes aminoãcidos ou aminoãcidos lipo-fílicos; A10 representa sequências de hirudina ou as suas variantes naturais ou as suas porções, uma ligação, ou representa um péptido contendo entre 1 e 11 resíduos de qualquer aminoãcido; Y representa um resíduo carboxi terminal selecciona-do entre um grupo QH, alcoxi C-^-Cg, amino, aminoãcidos substituídos por mono- ou di-alquilo C^-C^, ou re presenta um resíduo ãlcool terminal; e em que pelo me nos uma das posições em Ag através de Ag representa uma ligação, ou um seu sal aceitável. sob o ponto de vista farmacêutico, carac terizado pelo facto; a) de se utilizar uma resina com um aminoãcido protegido C-terminal adequadamente ligado a partir do grupo A1Q; b) de se ligar sequencialmente os outros aminoãcidos protegidos por ^-amino, Ag até A^, para proporcionar a sequência de aminoãcidos protegida desejada; e c) de se remover os referidos grupos protectores e se purificar o péptido desejado;
2. 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paraçao de um derivado peptídico de fórmula geral I na qual A2 representa Tyr, Nap ou Phe, caracterizado por se utilizarem com -36-

   postos iniciais correspondentemente substituídos.
3. 3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paração de um derivado peptídico de fórmula geral I na qual A^ representa uma ligação ou. Glu, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
4. 4.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paração. de um derivado peptídico de fórmula geral I na qual representa uma ligação, Pro, Tiq, iminoãcido ou D-aminoãcido, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um derivado peptídico de fórmula geral I na qual A5 representa uma ligação ou Ile, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
6. 6. - Processo de acordo, com a reivindicação 1, para a pre paração de um derivado peptídico de fórmula geral I na qual A^ representa uma ligação ou Pro, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
7. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paração de um derivado peptídico de fórmula geral I na qual A^ -37-

   representa uma ligação, Glu ou Ala, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .
8. 8.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paração de um derivado peptídico de fõrmula geral I na qual Ag representa uma ligação, Glu ou Asp, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
9. 9.- Processo de acordo com a-reivindicação 1, para a preparação de derivados peptídicos de fõrmula geral I na qual Ag re presenta Ala, Cha, Ala-Cha, Tyr-Leu, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
10. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paração de derivados peptídicos de fõrmula geral I na qual A^q representa Gin, Asn ou D-Glu., caracterizado pelo facto de se uti lizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
11. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paração de derivados peptídicos de fõrmula geral I na qual X re presenta um átomo de hidrogénio ou um grupo N^, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemen- te substituídos. Lisboa, 2 de Outubro de 1990 O Agente ϋηοαι ca Propriedade Industrial