DE69032258T2 - Antikoagulierende Peptide - Google Patents

Antikoagulierende Peptide

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    • C07K7/04Linear peptides containing only normal peptide links
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/815Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
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Description

  • Die Erfindung betrifft neue antikoagulierende Peptide, die auch wertvolle Reagenzien zur Entwicklung von Antikoagulanzien sind.
  • Antikoagulanzien sind nützliche therapeutische Wirkstoffe beispielsweise für die pharmakologische Behandlung einer akuten tiefen Venenthrombose, Lungenembolie, akuten arteriellen Embolusbildung der Extremitäten, eines Herzinfarkts und einer disseminierten intravasalen Koagulation. Es wird angenommen, daß eine prophylaktische Verabreichung von Antikoagulanzien ein Rezidiv einer Embolie in Patienten mit einer rheumatischen oder arteriosklerotischen Herzerkrankung und bestimmte operative thromboembolische Komplikationen verhindert. Eine Verabreichung von Antikoagulanzien ist auch bei der Behandlung von Erkrankungen der Koronararterien und Hirngefäße indiziert. Die arterielle Thrombose, besonders in Herzmuskel und Gehirn versorgenden Arterien, ist eine der Haupttodesursachen.
  • Hirudin ist ein Polypeptid von 65 Aminosäuren, das aus den Speicheldrüsen von Blutegeln isoliert wurde. Es ist ein antikoagulierendes Mittel, das Thrombin spezifisch hemmt. Obwohl aus Blutegelextrakten isoliertes Hirudin sehr wirksam ist, ist seine klinische Verwendung aufgrund seiner begrenzten Menge, den Kosten und den üblicherweise nach einer Verabreichung eines jeden Fremdproteins dieser Größe auftretenden allergischen Reaktionen unwahrscheinlich.
  • Die Anmelder haben ursprünglich festgestellt, daß eine spezifische Region von Hirudin zumindest teilweise für seine Aktivität als Antikoagulans verantwortlich ist. Die Peptidregion (Aminosäuren 55 bis 65 von Hirudin) wurde chemisch synthetisiert, und es wurde gezeigt, daß sie an die Erkennungsstelle von Thrombin bindet, wobei die Erkennungsstelle von der enzymatischen Spaltstelle räumlich getrennt ist. Es wird ferner gezeigt, daß eine Bindung der synthetischen Peptide eine Bindung des Fibrinogens an die Erkennungsstelle von Thrombin, eine wichtige Vorbedingung für die Fibrinerzeugung und Blutgerinnselbildung, kompetitiv verhindert, und die Peptide sind daher von potentiellem medizinischem Wert als Antikoagulanzien; vgl. EP-A-0 276 014 und EP-A-0 333 356.
  • Die Anmelder stellten ferner Derivate dieses Peptids her, die einzelne Aminosäuredeletionen in der Ausgangssequenz enthielten. Insbesondere definiert diese Reihe von Aminosäuredeletionen insgesamt das Maß der Sequenzabhängigkeit des Peptids in bezug auf die Position der Aminosäuren im Peptid und die Aminosäurezusammensetzung des Peptids, und ist die Grundlage für eine umfassende rationelle Arzneimittelentwicklung. Viele Peptidanaloge diesen Typs haben Eigenschaften des Elternpeptids und können daher auch als ein wissenschaftlich interessanter und therapeutisch signifikanter Zusatz für die Antikoagulanstherapie dienen. Die Aminosäureanalogen können ferner selbst eine erhöhte Wirksamkeit und eine verlängerte Wirkungsdauer aufweisen.
  • Ein Peptidderivat, ausgewählt aus
  • oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, ist ein nützliches antikoagulierendes Mittel.
  • Die nachstehenden üblichen Abkürzungen von (1) Aminosäuren und ihrem Drei-Buchstaben-Code, (2) modifizierten und ungewöhnlichen Aminosäuren und (3) Substituenten des Amino- und Carboxy-Terminus werden in dieser Beschreibung verwendet: (1) : Die Aminosäuren und ihr Drei-Buchstaben-Code
  • (2): Modifizierte und ungewöhnliche Aminosäuren
  • Aba - α-Amino-n-buttersäure
  • pClPhe - para-Chlorphenylalanin
  • Cha - Cyclohexylalanin
  • Chg - Cyclohexylglycin
  • Hyp - Hydroxyprolin
  • I-Tyr-3-Iodtyrosin, 5-Iodtyrosin,
  • 3,5-Diiodtyrosin
  • γMeGlu - D-Glutaminsäure-γ-methylester
  • NMePhe - N-Methylphenylalanin
  • NMePgl - N-Methylphenylglycin
  • Npa - β-(Naphthyl)alanin
  • 3,4-DehydroPro-3,4-Dehydroprolin
  • pNO&sub2;Phe - para-Nitrophenylalanin
  • Nle - Norleucin
  • Orn - Ornithin
  • Pip - Pipecolat
  • Pba - p-Aminophenylbuttersäure
  • pSubPhe - para-substituiertes Phenylalanin
  • Pgl - Phenylglycin
  • Sar - Sarcosin (N-Methylglycin)
  • SubPhe - ortho-, meta- oder para-, mono- oder disubstituiertes Phenylalanin
  • Tha - β-(2-Thienyl)-alanin
  • Tiq - Tetrahydroisochinolin-3-carboxylat
  • Saure Substituenten des Amino- und Carboxyterminus
  • Ac - Acetyl
  • Azt - Azetidin-2-carboxylat
  • Cin - Cinnamoyl
  • 3,4-DihydroCin - 3,4-Dihydrocinnamoyl
  • Glt - Glutaryl
  • Mal - Maleyl
  • Oac - 8-Aminooctansäure
  • Oct - n-Octyl
  • Suc - Succinyl
  • Glt - Glutaryl
  • Tfa - Trifluoracetyl
  • # - C-terminales Amid
  • Nachstehend sind die bekannten natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzvariationen von Hirudin dargestellt: Aminosäuresequenzvariationen von Hirudin
  • Die natürlich vorkommenden Aminosäuren mit der Ausnahme von Glycin enthalten ein chirales Kohlenstoffatom. Sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, haben die hier beschriebenen optisch aktiven Aminosäuren die L-Konfiguration. Alle Aminosäuren können beispielsweise die D- oder L-Konfiguration aufweisen. Wie es üblich ist, ist in der Struktur der hier ausgeschriebenen Peptide der Aminoterminus auf der linken Seite der Kette und der Carboxyterminus auf der rechten Seite der Kette.
  • Es wird angenommen, daß ein Alkylrest und der Alkylteil eines Alkoxyrestes gerade, verzweigte oder cyclische Alkylreste enthalten, beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert-Butyl-, Pentyl-, Isopentyl-, sec-Pentyl-, Cyclopentyl-, Hexyl-, Isohexyl-, Cyclohexyl- und Cyclopentylmethyl-, Heptyl-, Octyl(Oct)- und 8-Aminooctansäure(Oac)reste. Es wird angenommen, daß ein Acylrest mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen gerade, verzweigte, cyclische, gesättigte und ungesät tigte Acylreste mit 1 oder 2 Carbonyleinheiten pro Rest enthält, beispielsweise Acetyl(Ac)-, Azetidin-2-carboxylat(Azt)-, Benzoyl-, Succinyl-, Cinnamoyl(Cin)-, 3,4- Dihydrocinnamoyl(3,4-DihydroCin)-, Maleyl(Mal)- und Glutaryl(Glt)gruppen. Es wird angenommen, daß sowohl die Alkyl- als auch die Acylsubstituenten diese Gruppen mit Halogensubstituenten enthalten, wobei ein Halogenrest ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodrest, beispielsweise eine Trifluoracetyl(Tfa)-Gruppe, ist.
  • Der Begriff "jede beliebige Aminosäure", wie hier verwendet, soll nicht jede beliebige Carbonsäure mit einem Aminogruppensubstituenten einschließen, sondern wird so verwendet, wie er üblicherweise vom Fachmann für Polypeptidderivate verwendet wird, und schließt die natürlich vorkommenden Aminosäuren sowie andere, üblicherweise bei der Herstellung von synthetischen Analogen von natürlich vorkommenden Peptiden in der Peptidchemie verwendeten "Nicht-Protein"-α-Aminosäuren ein. Die natürlich vorkommenden Aminosäuren sind die "L-Aminosäuren" Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Methionin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Prolin, Histidin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Arginin, Ornithin und Lysin. Ebenfalls eingeschlossen als "jede beliebige Aminosäure" sind die D-Isomere ("D-Aminosäuren") der natürlich vorkommenden L- Aminosäuren wie D-Alanin, D-Valin, D-Leucin, D-Isoleucin, D-Serin, D-Methionin, D-Threonin, D-Phenylalanin, D-Tyrosin, D-Tryptophan, D-Cystein, D-Prolin, D- Histidin, D-Asparaginsäure, D-Asparagin, D-Glutaminsäure, D-Glutamin und D- Arginin. Beispiele von "Nicht-Protein"-α-Aminosäuren sind Norleucin, Norvalin, Alloisoleucin, Homoarginin, Thiaprolin, Dehydroprolin, Hydroxyprolin (Hyp), Homoserin, Cyclohexylglycin (Chg), α-Amino-n-buttersäure (Aba), Cyclohexylalanin (Cha), Aminophenylbuttersäure (Pba) und Phenylalanine, die an der ortho-, meta- oder para-Stellung mono- oder disubstituiert sind wie para-substituiertes Phenylalanin (pSubPhe), z. B. para-Chlorphenylalanin und para-Nitrophenylalanin (pNO&sub2;Phe), oder bei denen Positionen der Phenyleinheit mit einer oder zwei der nachstehend aufgeführten Gruppen wie einer (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl- oder (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxygruppe, Halogenatomen oder Nitrogruppen oder mit einer Methylendioxygruppe substituiert sind, β-2- und -3-Thienylalanin, β-2- und -3-Furanylalanin, β-2-, -3- und -4- Pyridylalanin, β-(Benzothienyl-2- und -3-yl)alanin, β-(1- und 2-Naphthyl)alanin (Npa), O-alkylierte Derivate von Serin, Threonin oder Tyrosin, Methylester von Glutamin- und Asparaginsäure, S-alkyliertes Cystein, der O-Sulfatester von Tyrosin und halogenierte Tyrosine wie 3-Iodtyrosin, 5-Iodtyrosin und 3,5-Diiodtyrosin.
  • Mit dem Begriff "Sequenzen von Hirudin oder seinen natürlichen Varianten" meinen die Anmelder natürlich vorkommende Aminosäuresequenzen von Hirudin.
  • Der Begriff "Teile davon" von Hirudin und seinen Varianten bedeutet den Einschluß von 4 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die von der Sequenz von Hirudin oder seinen Varianten stammen.
  • Der Begriff "lipophile Aminosäure" schließt Tyr, Phe, Leu, Met, Nle, Ile, Val und Pro ein. Der Begriff "Iminosäuren" soll ferner alle N-Alkylaminosäuren einschließen. Beispiele für Iminosäuren sind N-Methylphenylalanin (NMePhe), N- Methylphenylglycin (NMePgl), 3,4-Dehydroprolin (3,4-DehydroPro), p-Aminophenylbuttersäure (Pba), Sarcosin (Sar), Prolin (Pro) und Pipecolat (Pip).
  • Der Begriff "ein Peptid, das 1 bis 11 Reste von jeder beliebigen Aminosäuren enthält", meint das Anfügen von Aminosäuren entweder an den Amino- oder den Carboxyterminus der Kernaminosäuren, die die Kernstruktur mit der eigentlichen Aktivität umfassen.
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide können pharmazeutisch verträgliche Salze mit jeder nichttoxischen, organischen oder anorganischen Säure bilden. Zu den anorganischen Säuren, die geeignete Salze bilden, gehören beispielsweise die Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure und saure Metallsalze, beispielsweise Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat. Zu den geeignete Salze bildenden organischen Säuren gehören beispielsweise die Mono-, Di- und Tricarbonsäuren. Zu solchen Säuren gehören beispielsweise die Essig-, Glycol-, Milch-, Brenztrauben-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Äpfel-, Wein-, Zitronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl-, 2-Phenoxybenzoe- und Sulfonsäuren, beispielsweise Methansulfon- und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Zu den Salzen der carboxyterminalen Aminosäureeinheit gehören die nichttoxischen, mit allen geeigneten anorganischen oder organischen Basen gebildeten Salze der Carbonsäuren. Zu diesen Salzen gehören beispielsweise die der Alkalimetalle, beispielsweise Natrium und Kalium, Erdalkalimetalle, beispielsweise Calcium und Magnesium, Leichtmetalle der Gruppe IIIA einschließlich Aluminium, und organische primäre, sekundäre und tertiäre Amine, beispielsweise Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1- Ethenamin, N, N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydrodiethylamin, N-(Nieder)alkylpiperidin und jedes andere geeignete Amin.
  • Synthese:
  • Die erfindungsgemäßen Proteine können durch unterschiedliche, dem Fachmann gut bekannte Verfahren hergestellt werden. Zu solchen Verfahren gehören die Lösungsphasen-Peptidsynthese, die Festphasensequenz- und -Blocksynthese, die Genclonierung und die Kombinationen dieser Verfahren. Das Festphasensequenzverfahren kann unter Verwendung von etablierten automatischen Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthesegeräts. Durch dieses Verfahren wurden die Peptide, beginnend mit der geschützten C- terminalen Aminosäure, an einem Harz hergestellt. Der verwendete Träger aus Harz kann jegliches geeignete Harz sein, das im Stand der Technik üblicherweise für die Herstellung von Polypeptiden an festen Phasen verwendet wird, vorzugsweise Polystyrol, das mit 0,5 bis etwa 3 Prozent Divinylbenzol vernetzt worden ist und das entweder chlormethyliert oder hydroxymethyliert worden ist, um Stellen zur Esterbildung mit der zuerst eingeführten, an der α-Aminogruppe geschützten Aminosäure zu erzeugen. Für C-terminale Amide kann ein Dimethylbenzhydrylaminharz verwendet werden. Nach dem Ende der Kupplungsreaktion der Sequenz wurde entweder die Boc-Schutzgruppe entfernt oder belassen oder sie wurde entfernt und die N-terminale Aminogruppe acyliert. Die Entfernung des geschützten Fragments vom Harz wurde unter Verwendung des geeigneten Aminoalkohols durchgeführt.
  • Ein Beispiel eines Hydroxymethylharzes wird von Bodanszky et al., Chem. Ind. (London) 38 (1966), 1597-98, beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist im Handel von BioRad-Laboratories, Richmond, Kalifornien, erhältlich, und die Herstellung eines solchen Harzes wird von Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, S. 1-6, beschrieben. Die geschützte Aminosäure kann durch das Verfahren von Gisin, Helv. Chem. Acta 56 (1973), 1476, an das Harz gebunden werden. Viele an Harz gebundene, geschützte Aminosäuren sind im Handel erhältlich. Als Beispiel zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, in dem der Carboxyterminus ein D-Glu-Rest ist, kann ein mit einer tert-Butyloxycarbonylgruppe (Boc) geschütztes D-Glu, das an ein mit einer Benzylgruppe versehenes, hydroxymethyliertes Phenylacetamidomethyl (PAM)-Harz gebunden ist, verwendet werden.
  • Nachdem die an der α-Aminogruppe geschützte Aminosäure an den Träger aus Harz gekoppelt ist, wird die Schutzgruppe unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens, beispielsweise unter Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan, entfernt. Die Entfernung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen 0ºC und Raumtemperatur durchgeführt. Andere übliche Reagenzien zur Abspaltung der Schutzgruppe und andere Bedingungen zur Entfernung von spezifischen α- Aminoschutzgruppen können verwendet werden. Nachdem die α-Aminoschutzgruppe entfernt worden ist, werden die anderen Aminosäuren mit einer geschützten Aminogruppe schrittweise in der gewünschten Reihenfolge daran gebunden. Mehrere Aminosäurereste können alternativ vor der Bindung an die vom Harz getragene Aminosäuresequenz durch das Lösungsverfahren aneinander gekoppelt werden.
  • Die α-Aminoschutzgruppe, die bei jeder in die Polypeptidsequenz eingeführten Aminosäure verwendet wird, kann jede beliebige im Stand der Technik bekannte Schutzgruppe sein. Zu den Klassen von α-Aminoschutzgruppen gehören (1) Schutzgruppen vom Acyltyp, beispielsweise Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Toluolsulfonyl- (Tosyl-), Benzolsulfonyl-, Nitrophenylsulfenyl-, Tritylsulfenyl-, o- Nitrophenoxyacetyl- und α-Chlorbutyrylgruppen, (2) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, beispielsweise Benzyloxycarbonyl- und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen, beispielsweise p-Chlorbenzyloxycarbonyl-, Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 1-(p-Biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl-, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl- und Benzhydryloxycarbonylgruppen, (3) aliphatische Schutzgruppen vom Urethantyp, beispielsweise tert-Butyloxycarbonyl- (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl- und Allyloxycarbonylgruppen, (4) Cycloalkyl- Schutzgruppen vom Urethantyp, beispielsweise Cyclopentyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und Cyclohexyloxycarbonylgruppen, (5) Schutzgruppen vom Thiourethantyp, beispielsweise Phenylthiocarbonylgruppen, und (6) Schutzgruppen vom Alkyltyp, beispielsweise Triphenylmethyl- (Trityl-) und Benzylgruppen. Die bevorzugte α-Aminoschutzgruppe ist die tert-Butyloxycarbonylgruppe.
  • Wie auf dem Fachgebiet der Festphasen-Peptidsynthese bekannt ist, tragen viele Aminosäuren Funktionen, die während der Herstellung der Kette geschützt werden müssen. Die Verwendung und die Wahl der geeigneten Schutzgruppe liegt im Ermessen des Fachmannes und hängt von der zu schützenden Aminosäure und der Gegenwart von anderen geschützten Aminosäureresten in dem Peptid ab. Die Wahl einer solchen Seitenkettenschutzgruppe ist kritisch, da sie während der Abspaltung der Schutzgruppe der α-Aminoeinheit nicht ebenfalls durch Abspaltung entfernt werden darf. Geeignete Seitenkettenschutzgruppen für Lysin sind beispielsweise die Benzyloxycarbonyl- und substituierten Benzyloxycarbonylgruppen, wobei der Substituent aus Halogenatomen (z. B. Chlor-, Brom- und Fluoratom) und Nitrogruppen (z. B. 2-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl- und 3,4-Dichlorbenzyloxycarbonylgruppen), Tosyl-, t- Amyloxycarbonyl-, t-Butyloxycarbonyl- und Diisopropylmethoxycarbonylgruppen ausgewählt wird. Die alkoholischen Hydroxylgruppen von Threonin und Serin können mit einer Acetyl-, Benzoyl-, tert-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt werden. Die bevorzugte Schutzgruppe ist die Benzylgruppe.
  • Ein geeignetes Kupplungsreagens kann gemäß dem Stand der Technik gewählt werden. Besonders geeignete Kupplungsreagenzien bei der Anknüpfung der Aminosäuren Gln, Asn oder Arg sind N,N'-Diisopropylcarbodiimid und 1- Hydroxybenzotriazol. Die Verwendung dieser Reagenzien verhindert die Nitril- oder Lactambildung. Weitere Kupplungsreagenzien sind (1) Carbodiimide (z. B. N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(τ-dimethylaminopropylcarbodiimid), (2) Cyanamide (z. B. N,N-Dibenzylcyanamid), (3) Ketenimine, (4) Isoxazoliumsalze (z. B. N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat, (5) monocyclische Stickstoff enthaltende heterocyclische Amide von aromatischem Charakter, die ein bis vier Stickstoffe im Ring enthalten, beispielsweise Imidazolide, Pyrazolide und 1,2,4-Triazolide. Spezifische heterocyclische verwendbare Amide schließen ein N,N'-Carbonyldümidazol und N,N- Carbonyl-di-1,2,4-triazol, (6) alkoxyliertes Acetylen (z. B. Ethoxyacetylen), (7) Reagenzien, die ein gemischtes Anhydrid mit der Carboxyleinheit der Aminosäure (z. B. Ethylchlorformiat und Isobutylchlorformiat) oder das symmetrische Anhydrid der zu koppelnden Aminosäure bilden (z. B. Boc-Ala-O-Ala-Boc), (8) Stickstoff enthaltende heterocyclische Verbindungen, die eine Hydroxylgruppe an einem Ringstickstoff aufweisen (z. B. N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol) und (9) Castros-Reagenz (BOP). Weitere aktivierende Reagenzien und deren Verwendung in der Peptidkupplung werden von Kapoor, J. Pharm. Sci. 59 (1970), 1- 27, beschrieben. Die Anmelder bevorzugen die Verwendung des symmetrischen Anhydrids als Kupplungsreagens für alle Aminosäuren mit der Ausnahme von Arg, Asn und Gln.
  • Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in einem etwa vierfachen Überschuß in den Festphasenreaktor eingeführt und die Kupplung in einem Medium aus Dimethylformamid: Methylenchlorid (1 : 1) oder in Dimethylformamid allein oder vorzugsweise in Methylenchlorid allein durchgeführt. Bei einer unvollständigen Kupplung wird das Kupplungsverfahren vor dem Entfernen der α- Aminoschutzgruppe vor der Kupplung der nächsten Aminosäure im Festphasenreaktor wiederholt. Der Erfolg der Kupplungsreaktion in jedem Stadium der Synthese wird durch die Ninhydrinreaktion, wie von Kaiser, E. et al., Analyt. Biochem. 34 (1970), 595, beschrieben, überwacht.
  • Nach der Kupplung der an der α-Aminogruppe geschützten Aminosäure an das Harz wird die Schutzgruppe unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens, beispielsweise unter Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan, entfernt. Die Entfernung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen 0ºC und Raumtemperatur durchgeführt. Andere übliche Reagenzien und andere Bedingungen zur Entfernung von spezifi schen α-Aminoschutzgruppen können verwendet werden. Nachdem die α- Aminoschutzgruppe entfernt worden ist, werden die anderen Aminosäuren mit einer geschützten Aminogruppe schrittweise in der gewünschten Reihenfolge daran gekoppelt. Mehrere Aminosäurereste können alternativ vor der Kupplung an die vom Harz getragene Aminosäuresequenz durch das Lösungsverfahren aneinander gekoppelt werden.
  • Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz erhalten worden ist, wird das Peptid vom Harz entfernt und die Schutzgruppe abgespalten. Dies kann durch Hydrolyse durchgeführt werden, beispielsweise durch Behandlung des an das Harz gebundenen Polypeptids mit wasserfreiem flüssigem HF in Gegenwart von Radikalfängern (z. B. Amisol). Üblicherweise wird die Entfernung der Schutzgruppe nach der vollständigen Synthese der Peptidkette durchgeführt, die Schutzgruppen können jedoch auch zu jedem anderen geeigneten Zeitpunkt entfernt werden.
  • Die Reinigung und Analyse des Peptids, dessen Schutzgruppen entfernt wurden, wird durch einige Standardverfahren durchgeführt. Die Wahl der geeigneten Reinigungs- und Analyseverfahren ist dem Fachmann bekannt. Ein geeignetes Reinigungsverfahren ist die präparative HPLC. Die Analyse der gereinigten Peptide kann durch eine analytische HPLC, Aminosäureanalyse, Massenspektrometrie mit schnellem Atombeschuß und jedes andere geeignete Analyseverfahren durchgeführt werden.
  • Therapeutische Verwendung:
  • Die antikoagulierend-wirksame Dosis eines erfindungsgemäßen Peptidderivats liegt zwischen 0,2 mg/kg und 250 mg/kg Körpergewicht des Patienten pro Tag je nach Patient, der Schwere des zu behandelnden thrombotischen Zustands und des gewählten Peptidderivats. Die für einen bestimmten Patienten geeignete Dosis kann leicht bestimmt werden. Vorzugsweise werden üblicherweise 1 bis 4 tägliche Dosen mit 5 bis 100 mg Wirkstoff pro Dosis verabreicht. Die Menge eines erfindungsgemäßen Peptids, die zur Inhibition oder Verhinderung der Blutkoagulation in einem extrakorporalen Medium wie gelagertes Gesamtblut erforderlich ist, kann vom Fachmann leicht ermittelt werden.
  • Eine Antikoagulanstherapie ist zur Behandlung und Prävention mehrerer thrombotischer Zustände, besonders bei einer Erkrankung der Koronararterien und Hirngefäße, indiziert. Fachleute erkennen leicht Zustände, die eine Antikoagulanstherapie erfordern. Es wird angenommen, daß der hier verwendete Begriff "Patient" Säuger, beispielsweise Primaten wie Mensch, Schaf, Pferd, Vieh, Schwein, Hund, Katze, Ratte und Maus bezeichnet. Eine Inhibition der Blutkoagulation ist nicht nur für die Antikoagulanstherapie von Individuen mit thrombotischen Zuständen nützlich, sondern auch, wenn eine Inhibition der Blutkoagulation gewünscht wird, bei spielsweise zur Prävention der Koagulation in gelagertem Gesamtblut und zur Prävention der Koagulation in anderen biologischen Proben für Tests oder zur Aufbewahrung.
  • Obwohl einige Peptidderivate nach der oralen Verabreichung die Darmpassage überleben können, bevorzugen die Anmelder eine nichtorale, beispielsweise eine subcutane, intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale Verabreichung, eine Verabreichung durch Depotinjektion, durch Herstellung eines Implantats oder durch Applikation auf die Schleimhäute, wie die der Nase, des Halses und der Bronchien, beispielsweise mittels einer Aerosolflasche, die ein erfindungsgemäßes Peptidderivat als Spray oder trockenes Pulver enthält.
  • Zur parenteralen Verabreichung können die Verbindungen als injizierbare Dosierungen einer Lösung oder Suspension der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht werden, das eine sterile Flüssigkeit, beispielsweise Wasser und Öle, mit oder ohne Zusatz eines grenzflächenaktiven Mittels und weiterer pharmazeutisch verträglicher Adjuvanzien sein kann. Beispiele von in diesen Präparaten verwendbaren Ölen sind Petroleum, Öle tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, beispielsweise Erdnußöl, Sojabohnenöl und Mineralöl. Üblicherweise sind Wasser, Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose und Lösungen verwandter Zucker, Ethanol und Glycole, beispielsweise Propylenglycol oder Polyethylenglycol, bevorzugte flüssige Träger, besonders für injizierbare Lösungen.
  • Die Verbindungen können als Depotinjektion oder Implantatpräparat verabreicht werden, die (das) so formuliert werden kann, daß eine Langzeit-Freisetzung des Wirkstoffes erfolgt. Der Wirkstoff kann in Pellets oder kleine Zylinder gepreßt und als Depotinjektion oder Implantat subkutan oder intramuskulär implantiert werden. Für Implantate können inerte Materialien, beispielsweise biologisch abbaubare Polymere oder synthetische Silicone, beispielsweise Silastic, ein von der Dow-Corning Corporation hergestellter Gummi aus Silicon, verwendet werden.
  • Beispiele
  • Diese Erfindung wird durch die nachstehend beschriebenen, nicht-einschränkenden Beispiele erläutert.
  • Beispiel 1 Herstellung von antikoagulierenden Peptiden
  • Das Peptid wurde durch Festphasenverfahren unter Verwendung von 8,3 mmol 0,56 mmol/g Bod D-Glu(Bzl)-Merrifieldharz auf einem halbautomatischen Vega- Peptidsynthesegerät synthetisiert. Einzelne symmetrische Anhydridkupplungen wurden mit 18,3 mmol Nα-Boc-Aminosäure (Peptides International) durchgeführt, ausgenommen bei Boc-Cha, das zwei Kupplungsreaktionen erforderte, um einen negativen Kaisertest zu erhalten. Teile des Peptidharzes (0,7 bis 1,5 g) wurden nach Zyklus 3 bis 8 entfernt und beiseite gelegt; bei des-Glu&sup5;&sup7; wurden 1,36 g (0,50 mmol) Boc-Pro-Ile- Pro-Glu(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-D-Glu(Bzl)-Merrifieldharz nach Zyklus 8 aufbewahrt. Das Harz mit dem geschützten Peptidfragment wurde in ein Applied Biosystems- Reaktionsgefäß transferiert, wo Boc-Tyr(2-BrZ) unter Verwendung einer zweifachen symmetrischen Anhydridkupplung mit 2,0 mmol Aminosäure angefügt wurde. Die Nα-Boc- Schutzgruppe wurde mit 50% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt, durch dreimaliges Waschen mit 10% Diisopropylethylamin in Methylenchlorid neutralisiert, dreimal mit Methylenchlorid gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Das Peptid wurde mit einer zweifachen Bernsteinsäureanhydrid-Kupplung in Dimethylformamid am Nα mit Bernsteinsäure versehen, dreimal mit Dimethylformamid gewaschen, durch zweimaliges Waschen mit 10% Diisopropylethylamin in Methylenchlorid neutralisiert, dreimal mit Methylenchlorid gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Schutzgruppe des Peptids wurde entfernt und das Peptid vom Harz mit 5% Anisol enthaltender wasserfreier HF 60 min bei 0ºC abgespalten. Die HF wurde bei 0ºC im Vakuum entfernt; das Peptid wurde mit wäßrigem 25% Acetonitril aus dem Harz extrahiert, eingefroren und gefriergetrocknet.
  • Eine präparative HPLC wurde auf einer 50,8 · 150 mm-C¹&sup8;-Beckmann-Säule mit einem linearen Gradienten von 29,6 bis 31,6% Acetonitril in 0,1% wäßriger Trifluoressigsäure bei 80 ml/min 15 min durchgeführt. Der Hauptpeak (bei 280 nm kontrolliert) wurde gesammelt und gefriergetrocknet, wobei 281 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden. Die Homogenität wurde mittels HPLC auf einer (4,6 · 250 mm)-Vydac 218TP54 C¹&sup8;-Säule, 2,0 ml/min. to = 1,5 min. Elutionszeit mit einem linearen Gradienten von 15 bis 40% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure über 25 min war 17,1 min. ermittelt.
  • Eine Analyse der gereinigten markierten Peptide durch FAB-MS zeigte den gewünschten Molekülionenpeak und ergab eine Aminosäureanalyse, die dem gewünsch ten Peptid entsprach. So haben die folgenden Peptide die nachstehend genauer beschriebenen festgestellten physikalischen Eigenschaften.
  • Die Proben wurden in einem Thrombin-induzierten Fibringerinnsel- Inhibitionstest getestet. Alle Lösungen des Tests wurden mit einem 0,12 M Natriumchlorid, 0,01 M Natriumphosphat, 0,01% Natriumazid und 1% Rinderserumalbumin, pH 7,4, enthaltenden Testpuffer durchgeführt. Rinderthrombin wurde bis zu einer Konzentration titriert, bei der die Fibringerinnselbildung mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (Bio-Tek EL 309) bei 405 nm über einen Zeitraum von 60 min überwacht werden konnte. Diese Thrombinlösung (50 ul; 0,2 umol) wurde zu Mikrotiterplattenvertiefungen, die 50 ul einer Lösung des zu testenden synthetischen Peptids enthielten, zugesetzt. Nachdem 1 min geschüttelt und weitere 10 min bei 20ºC inkubiert worden war, wurden 100 ul verdünntes Plasma (1 : 10) in 0,1% EDTA zugesetzt, und der Ansatz wurde 20 sec mit dem Vortexgerät gemischt. Die Trübung der Lösung wurde mit einem automatischen Lesegerät in Abständen von 5 min überwacht.
  • Der IC&sub5;&sub0; wird aus den Ergebnissen berechnet und ist als die Peptidkonzentration definiert, die zur Hälfte der relativ zu einer Kontrolle ohne Inhibitor beobachteten Trübung führt. Dies entspricht einer zweifachen Verlängerung der Fibringerinnselbildungszeit. Für Tests mit menschlichem Thrombin wurden menschliches Thrombin und Rinderthrombin bis zu Konzentrationen titriert, bei denen das Fibringerinnsel mit der gleichen Geschwindigkeit über einen Zeitraum von 30 min erhalten wurde. So haben die folgenden Peptide die angegebenen biologischen Eigenschaften für die nachstehend beschriebenen Beispiele, wobei + einen IC&sub5;&sub0; > 25 uM und < 200 uM und + + einen IC&sub5;&sub0; < 25 uM bedeuten. 1)
  • In vitro-Wirksamkeit: + 2)
  • In vitro-Wirksamkeit: + 3)
  • In vitro-Wirksamkeit: ++ 4)
  • In vitro-Wirksamkeit: + + 5)
  • In vitro-Wirksamkeit: ++ 6)
  • In vitro-Wirksamkeit: + 7)
  • In vitro-Wirksamkeit: + + 8)
  • In vitro-Wirksamkeit: + 9)
  • In vitro-Wirksamkeit: + 10)
  • In vitro-Wirksamkeit: ++ 11)
  • In vitro-Wirksamkeit: ++ 12)
  • In vitro-Wirksamkeit: + + 13)
  • In vitro-Wirksamkeit: + 14)
  • In vitro-Wirksamkeit: +

Claims (10)

1. Peptidderivat, ausgewählt aus
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
2. Verfahren zur Herstellung eines Peptidderivats oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte
a) Verwendung eines Harzes mit einer geeignet gebundenen, C-terminal geschützten Aminosäure;
b) aufeinanderfolgendes Verknüpfen der anderen &alpha;-Aminogeschützten Aminosäuren, um die beanspruchte geschützte Aminosäuresequenz herzustellen; und
c) Entfernen der Schutzgruppen und Reinigen des gewünschten Peptids.
3. Peptidderivat oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon gemäß Anspruch 1 oder ein Gemisch davon zur Verwendung als pharmazeutischer Wirkstoff.
4. Peptidderivat oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon gemäß Anspruch 1 oder ein Gemisch davon zur Verwendung als Antikoagulans.
5. Verwendung der Peptidderivate von Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels.
6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Arzneimittel als Antikoagulans verwendbar ist.
7. Arzneimittel, enthaltend ein wie in Anspruch 1 definiertes Peptidderivat und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein Verdünnungsmittel und/oder ein Exzipiens.
8. Arzneimittel von Anspruch 7 zur Verminderung der Blutkoagulation.
9. Verfahren zur Verminderung der Blutkoagulation in einem extrakorporalen Medium, das das Inkontaktbringen des Mediums mit einer blutantikoagulierend wirkenden Menge eines Peptids von Anspruch 1 umfaßt.
10. Verfahren zur Hemmung der Blutkoagulation in einem extrakorporalen Medium durch Inkontaktbringen eines Peptids von Anspruch 1 mit dem extrakorporalen Medium.
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