KR0154528B1 - 항응고성 펩티드 - Google Patents

항응고성 펩티드

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KR0154528B1
KR0154528B1 KR1019900015868A KR900015868A KR0154528B1 KR 0154528 B1 KR0154528 B1 KR 0154528B1 KR 1019900015868 A KR1019900015868 A KR 1019900015868A KR 900015868 A KR900015868 A KR 900015868A KR 0154528 B1 KR0154528 B1 KR 0154528B1
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레오나드 크르스테난스키 존
Original Assignee
게리 디. 스트리트
메렐 다우 파마슈티칼스 인크
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

내용 없음.

Description

항응고성 펩티드
본 발명은 신규 항응고성 펩티드에 관한 것이며, 이와 같은 펩티드는 또한 항응고제 개발에 있어서 유용한 시약이다.
항응고제는 약리학적 치료, 예를 들면 급성 심부 정맥 혈전증, 폐동맥 색전중, 사지의 급성 동맥 색전중화, 심근 경색, 및 전염된 맥관내 응고화에 유용한 치료제이다. 항응고제를 예방 투여하면 류마티스성 질환 또는 동맥 경화성 심장 질환 환자에 있어서, 색전중의 재발을 방지하며, 수술의 특정 혈전 색전증 합병증을 방지 하는 것으로 생각된다. 항응고제는 또한 관상 동맥 질환 및 뇌 혈관성 질환의 치료시에도 투여되어 왔다. 동맥 혈전증, 특히 심장 근육 및 뇌의 동맥에 있어서의 혈전증은 사망을 초래하는 주된 요인이다.
히루딘은 거머리 타액선으로부터 분리한 65개 아미노산 잔기의 폴리펩티드 이다. 이 펩티드는 트롬빈 특이성 억제제이며, 따라서 항응고제로서 사용될 수 있다. 이 펩티드가 상당한 효능을 가지고 있을 지라도, 거머리 추출물로부터 분리한 히루딘의 임상용도는 바람직하지 못한데, 그 이유는 이들의 제한된 양, 높은가격, 및 이러한 크기의 외인성 단백질을 투여함으로써 통상적으로 수반되는 알레르기성 반응 때문이다.
본 발명자들은 최초로, 적어도 일부가 항응고성 활성을 갖는 히루딘의 특이성 영역을 발견하였다. 이 펩티드 영역(히루딘의 제55 내지 65 아미노산 잔기)을 화학적으로 합성하였으며, 이 영역은 트롬빈의 인식 부위에 결합하는 것을 밝혀졌으며, 그 인식 부위는 효소 절단 부위와 공간적으로 구별된다. 합성 펩티드의 결합은 피브린 생성 및 웅괴 형성에 있어서 중요한 예비 필요 조건인, 트롬빈의 인식 부위에 대한 피브리노겐의 결합을 경쟁적으로 방지하므로, 항응고제로서 중요한 의학적 가치가 있다.
본 출원자들은 기본적인 서열 중에서 1개의 아미노산이 결실된 이러한 펩티드의 유도체를 제조하였다. 특이적으로, 전체적으로 일어난 이러한 일련의 아미노산 결실은 위치 및 조성에 있어서 펩티드의 서열 의존성의 정도를 정의하고, 광범위한 이론적인 의약 설계에 대한 근거를 제공한다. 이러한 유형의 많은 펩티드 동족체는 모 펩티드의 특성을 가지므로 항 웅고성 치료에 과학적으로 관심 있고, 치료적으로 중요한 부가제로서 역할을 한다. 또한, 아미노산 유사체는 그 자체에 효력 증진 및 활성 지속 기간 연장 활성을 갖는다.
다음 일반식 (I)의 펩티드 유도체는 유용한 항응고제이고, A3내지 A8위치의 적어도 하나는 하나의 결합을 이룬다.
X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y (I)
상기 식에서,
X는 수소, 탄소 원자수 1 내지 10의 알킬기 1 또는 2개, 탄소 원자수 2 내지 10의 아실기 1 또는 2개, 카르보벤질옥시 또는 t-부틸옥시카르보닐로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노 말단 잔기이고,
A1은 하나의 결합이거나, 또는 히루딘 또는 그의 천연 변이체 또는 그의 일부의 서열이거나, 또는 임의 아미노산의 잔기 1 내지 11개를 함유하는 펩티드이며,
A2는 Phe, SubPhe, pChloroPhe, Pgl, Tha, His, Nap, β-(-2 및 3-티에닐)알라닌, β-(-2 및 3-푸라닐)알라닌, β-(-2, 3- 및 4-피리딜)알라닌, β-(벤조티에닐-2- 및 3-)알라닌, β-(1- 및 2-나프틸)알라닌, Tyr, I-Tyr 또는 Trp이며,
A3는 하나의 결합이거나 또는 Glu, Asp 또는 Ala이며,
A4는 하나의 결합이거나 또는 임의 아미노산이며,
A5는 하나의 결합이거나 또는 Ile, Val, Leu, Nle, Phe 또는 Ala이며, 또는 Ala이며,
A6은 하나의 결합이거나 또는 Pro, Hyp, 3,4-디히드로 Pro, 티아졸리딘-4-카르복실레이트, Sar, NMePgl, Azt, Pip 또는 D-Ala이며,
A7은 하나의 결합이거나 또는 임의 L-아미노산이며,
A8은 하나의 결합이거나 또는 임의 L-아미노산이며,
A9는 Tyr, 1-Tyr, D-Tyr, His, Ala, Met, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha 또는 Pro이거나 또는 이러한 아미노산 또는 임의 친지성 아미노산을 적어도 1개 함유하는 디펩티드이며,
A10은 하나의 결합이거나, 또는 히루딘 또는 그의 천연 변이체 또는 그의 일부의 서열이거나 또는 임의 아미노산 잔기 1 내지 11개를 함유하는 펩티드이고,
Y는 OH, (C1-C8)알콕시, 아미노, 또는 모노 또는 디(C1-C4)알킬 치환된 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택된 카르복시 말단 잔기이다.
다음의 통상적인 약자, 즉 (1) 아미노산 및 이들의 3문자 코드,(2) 변형된 특이한 아미노산 및 (3) 말단 아미노 및 카르복시 치환체를 본 명세서 중에서 사용 하였다.
(1) : 아미노산 및 이들의 3문자 코드
(2) : 변형된 특이한 아미노산
(3) 아미노 및 카르복시 말단 산 치환체
다음은 히루딘의 공지된 천연 발생 아미노산 서열 변이체를 나타낸 것이다.
히루딘의 아미노산 서열 변이
글리신을 제외한 천연 발생 아미노산은 키랄성 탄소 원자를 함유한다. 특별한 언급이 없는한, 본 명세서에 사용된 광학적으로 활성인 아미노산은 L-배위를 갖는다. 예를들면, A1또는 A10기의 임의 아미노산은 D-또는 L-배위를 가질 수 있다. 통상적인 방법에서와 같이, 본 명세서에 기재된 펩티드의 구조는 아미노 말단의 사슬의 왼쪽에 놓이고, 카르복시 말단이 사슬의 오른쪽에 놓이는 방법으로 기재한다.
알킬기 및 알콕시기의 알킬 부분은 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 알킬기, 예를들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸, 시클로펜틸, 헥실, 이소헥실, 시클로헥실 및 시클로펜틸메틸, 헵틸, 옥틸(Oct), 8-아미노옥탄산(Oac)를 포함한다. 탄소수 2 내지 10의 아실기는 1개의 기에 1 또는 2개의 직쇄, 분지쇄, 시클릭, 카르보닐 부분을 갖는 포화 및 불포화된 아실기, 예를들면, 아세틸(Ac), 아제티딘-2-카르복실레이트(Azt), 벤조일 숙시닐, 신나모일(Cin), 3,4-디히드로신나모일(3,4-디히드로Cin), 말레일(Mal) 및 글루타릴(Glt)을 함유한다. 알킬 및 아실 치환체 모두는 할로겐 치환체를 갖는 기들을 함유하며, 할로겐기는 플루오로,클로로,브로모 또는 요오도이며, 예를들면 트리플루오로아세틸(Tfa)이 있다.
본 명세서에서 사용된 임의 아미노산은 아미노산 치환체를 갖는 임의 카르복실산을 포함하는 것이 아니라, 폴리펩티드 유도체 업계의 숙련된 사람들이 통상적으로 사용하는 바와같이 것으로서 천연 발생 아미노산 뿐만 아니라 천연 발생 펩티드의 합성 유사체를 제조할 때
펩티드 화학 업계의 숙련된 사람이 통상적으로 사용하는 다른 비 단백질 α-아미노산을 포함한다. 천연 발생 아미노산, 즉 L-아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 세린, 메티오닌, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 프롤린, 히스티딘, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아르기닌, 오르니틴 및 리신이다. 또한 임의 아미노산은 천연 발생 L-아미노산의 D-이성질체(D-아미노산), 즉 D-알라닌, D-발린, D-로이신, D-이소로이신, D-세린, D-메티오닌, D-트레오닌, D-페닐알라닌, D-티로신, D-트립토판, D-시스테인, D-프롤린, D-히스티딘, 아스파라긴산, D-아스파라긴, D-글루탐산, D-글루타민, D-아르기닌이 있다. 또한 비 단백질 α-아미노산은, 예를들면 노르로이신, 노르발린, 알로이소로이신, 호모아르기닌, 티아프롤린, 디히드로프롤린, 히드록시프롤린(Hyp), 호모세린, 시클로헥실글리신(Chg), α-아미로-n-부티르산(Aba), 시클로헥실 알라닌(Cha), 아미노페닐부티르산(Pba), 오르토, 메타 또는 파라 위치에서 일 또는 이치환된 페닐알라닌[예, 파라 치환된 페닐알라닌(pSubPhe)및 파라-클로로-페닐알라닌 및 파라-니트로페닐알라닌(pNO2Phe)] 또는 다음, 즉 (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로겐 또는 니트로기의 1 또는 2 개를 갖는 페닐 부분의 위치에 일 또는 이치환된 페닐알라닌, 또는 메틸렌디옥시기, β-2- 및 3-티에닐-알라닌, β-2- 및 3-푸라닐알라닌, β-2-, β-3- 및 β-4-피리딜알라딘, β-(벤조티에닐-2- 및 3-일)알라닌, β-(1- 및 2-나프틸)알라닌(Npa), 세린, 트레오닌, 티로신의 0-알킬화된 유도체, 글루탐산 및 아스파라긴산의 메틸 에스테르, S-알킬화된 시스테인, 티로신의 0-설페이트 에스테르, 및 할로겐화된 티로신(예, 3-요오도티로신, 5-요오도티로신, 3,5-디요오도티로신)으로 치환된 페닐알라닌이 있다.
발생자들은, 히루딘 또는 그의 천연 변이체의 서열은 히루딘에 대해서 발견되는 아미노산 서열을 실질적으로 사용하는 것을 의미한다.
히루딘 및 그의 변이체에 대해 사용된 그의 부분는 히루딘 또는 그의 변이체의 서열로부터 유도된 적어도 4개의 아미노산의 연속 영역을 포함하는 것을 의미한다.
친지성 아미노산은 Tyr, Phe, Leu, Met, Nle, Ile, Val 및 Pro를 포함한다. 또한, 아미노산은 모든 N-알킬 아미노산을 포함하는 것을 의미한다. 아미노산의 예로는 N-메틸 페닐알라닌(NMePhe), N-메틸 페닐글리신(NMePgl), 2,4-디히드로프롤린(3,4-디히드로Pro), P-아미노페닐 부티르산(Pba), 사르코신(Sar) 및 프롤린(Pro), 피페콜레이트(Prp)가 있을 수 있다.
임의 아미노산 1 내지 11개의 잔기를 함유하는 펩티드는 독특한 활성을 갖는 코어(core)구조를 둘러싸고 있는 코어 아미노산(A2-A9)의 아미노 또는 카르복실말단에 아미노산을 첨가한 것을 의미한다.
일반식(I)의 폴리펩티드는 임의 비독성, 유기 또는 무기산과 함께 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 적합한 염을 형성하는 무기산의 예로서는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산, 산 금속염, 예를들면 오르토 인산 일수소나트륨 및 황산 수소칼륨이 있다. 적합한 염을 형성하는 유기산의 예로서는 모노-, 디- 및 트리카르복실산이 있다. 이와 같은 산의 예로서는, 아세트산, 글루콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 히드록시말레산, 벤조산, 히드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 2-페녹시벤조산 및 술폰산(예, 메탄 술폰산 및 2-히드록시에탄 술폰산)이 있다. 카르복시 말단 아미노산 부분의 염의 예로서는 어느 적합한 무기 염기 또는 유기 염기와 함께 형성된 비독성 카르복실산의 염이 있다. 이러한 염의 예로서는 알칼리 금속, 예를들면, 나트륨 및 칼륨; 알칼리 토금속, 예를들면 칼슘 및 마그네슘; 알루미늄을 포함한 IIIA족의 경금속; 및 1급, 2급 및 3급 유기아민, 예를들면, 트리알킬아민 (예, 트리에틸아민), 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N,N-디벤질에틸렌디아민, 디히드로아비에틸아민, N-(저급)알킬피페리딘 및 임의 다른 적합한 아민의 염이 있다.
화합물의 일반기에서와 같이 특정기가 바람직하다. 바람직한 일반식(I)의 펩티드 유도체는,
X는 수소, 아세틸 또는 숙시닐기이며,
A1은 하나의 결합이거나, 또는 히루딘 또는 아미노산 1 내지 54개 또는 이들의 영역을 함유하는 그의 천연 변이체의 서열이며,
A2은 하나의 결합이거나 또는 Tyr, Trp, Glu, His, Leu, Phe, D-Phe, SubPhe, pChloroPhe, NMePhe, Tha, 3,4-디히드로(Cin, Cin, Nap β-(2- 및 3-티에닐)알라닌, β-(2- 및 3-푸라닐)알라닌, β-(2, 3- 및 4-피리딜)알라닌, β-(벤조티에닐-2- 및 3-일)알라닌 또는 β-(1- 및 2-나프틸)알라닌이며,
A3는 하나의 결합이거나, 또는 Glu 또는 Ala이며,
A4는 하나의 결합이거나, 또는 Glu, Asp, Pro, Ala, Azt, Pip, 아미노산 또는 D-아미노산이며,
A5은 하나의 결합이거나, 또는 Ile 또는 Leu이며,
A6은 하나의 결합이거나, 또는 Pro, Sar, D-Ala, Hyp 또는 NMePgl이며,
A7은 하나의 결합이거나, 또는 Glu, Gln, Asp 또는 Ala이며,
A8은 하나의 결합이거나, 또는 Glu, Asp 또는 Ala이며,
A9은 하나의 결합이거나, 또는 Ala, Pro, Cha 또는 디펩티드, 예를들면 Ala-Tyr, Tyr-Leu, Ala-Phe, Tyr-Tyr, Ala-Leu, Tyr-Ala, Glu-Leu, D-Tyr-Leu, Leu-Phe, Sar-Cha, Pro-Cha, Cha-Leu, Ala-Cha 또는 Tyr-Cha이며,
A10은 하나의 결합이거나 또는 γMeGlu, Glu, D-Glu, Asn, D-Asn, Asn-ol, Pro, Glu, Ala, Lys, D-Lys, Asp, Orn 또는 Ala이며,
Y는 OH, (C1-C8)알콕시, 아미노, 모노 또는 디(C1-C4)알킬 치환된 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 카르복시 말단 잔기, 또는 알콜 말단 잔기인 것이다.
특히 바람직한 일반식(I)의 펩티드 유도체는,
X는 Suc, Mal이며,
A1은 하나의 결합이거며,
A2는 Tyr, Phe, Nap이며,
A3는 Glu 또는 하나의 결합이며,
A4는 Glu, Pro, Tiq 또는 하나의 결합이며,
A5은 Ile 또는 하나의 결합이며,
A6은 Pro 또는 하나의 결합이며,
A7은 Glu 또는 하나의 결합이며,
A8은 Glu 또는 하나의 결합이며,
A9은 Ala-Cha, Tyr-Leu, Ala, Cha이며,
A10은 Gln, D-Glu, Asn이고,
Y는 OH, NH2인 것이다.
[합성]
본 발명의 단백질은 당 업계의 숙련된 사람들에서 공지된 여러 방법으로 쉽게 제조할 수 있다. 이와 같은 방법으로서는 용액상 펩티드 합성법, 고상 서열화 및 블럭 합성법 및 유전자 클로닝법 및 이들 기술의 조합 등이 있다. 고상 서열화 및 블록 합성법 및 유전자 클로닝법 및 이들 기술의 조합 등이 있다. 고상 서열화 방법은 자동화된 펩티드 합성기를 사용하는 것과 같은 정립된 자동화 방법을 사용하여 행할 수 있다. 이 방법에 있어서, 펩티드는 C-말단 보호된 아미노산으로 시작하여 수지 상에서 구성된다. 사용된 수지 지지체는 폴리펩티드의 고상 제조를 위해 당 업계에 사용되었던 종래의 적합한 모든 수지, 바람직하기로는 약 0.5 내지 약 3%의 디비닐 벤젠과 가교된 폴리스티렌일 수 있으며, 이것은 클로로메틸화 또는 히드록시메틸화되어, 초기에 도입되는 α-아미노 보호된 아미노산과 함께 에스테르 형성을 위한 자리를 제공하였다. C-말단 아미드를 위해 피메틸벤즈히드릴아민 수지를 사용할 수 있다. 서열의 커플링을 완결한 후, Boc 보호기를 제자리에 남겨 두거나 또는 제거시키고, N-말단 아미노기는 아실화시킨다. 수지로부터 보호된 단편을 적절한 아미노 알콜을 사용하여 제거시켰다.
히드록시메틸 수지의 예는 문헌[보단스즈끼(Bodanszky)등의 Chem. Ind. (London)제38호, 제1597-1598페이지 (1966년)]에 기재되어 있다. 클로로메틸화된 수지는 바이오 래드 라보라토리스사(Bio Rad Laboratories; California주 Richmond 소재)로부터 시판되고, 이와 같은 수지의 제조 방법은 문헌[스트워트 등 (Stewart, et al.)의 Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman Co. 사. San Francisco, 1969년), 제1장, 제1-6페이지]에 기재되어 있다. 보호된 아미노산은 문헌[기신(Gisin)의 Helv. Chem. Acta. 제56호, 제1476페이지(1973년)]에 기재된 방법으로 수지에 결합시킬 수 있다. 수지에 결합되고 보호된 많은 아미노산은 시판된다.한 예로서 카르복시 말단이 D-Glu 잔기인 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위해, 벤질화되고 히드록시메틸화된 페닐아세트아미도메틸(PAM)수지에 결합되고 tert-부틸옥시카르보닐(Boc)보호된 D-Glu를 사용할 수 있다.
수지 지지체에 α-아미노 보호된 아미노산을 커플링시킨 다음에 보호기를 임의 적합한 방법, 예를들면 염화메틸렌 중의 트리플루오로아세트산, 트리플루오로오세트산 단독, 또는 디옥산 중의 HCl 을 사용하여 제거한다. 탈보호는 0℃ 내지 실온에서 행한다. 특정 α-아미노 보호기의 제거를 위한 조건 및 다른 표준 절단 시약을 사용할 수 있다. α-아미노 보호기를 제거한 후에, 다른 아미노 보호 아미노산을 바람직한 순서대로 단계적으로 커플링시킨다. 다른 방법으로서는, 다중 아미노산기는 수지로 지지된 아미노산 서열로 커플링시키기 전에 용액 방법으로 커플링시킬 수 있다.
각각의 아미노산을 사용하여 폴리펩티드 서열 중에 도입시키는 α-아미노 보호기는 당 업계에 공지된 임의 보호기일 수 있다. α-아미노 보호기의 군 중에는 (1)아실형 보호기, 예를들면 포르밀, 트리플루오로 아세틸, 프탈일, 톨루엔술포닐(tosyl), 벤젠술포닐, 니트로페닐술페닐, 트리틸술페닐, O-니트로페녹시아세틸 및 α-클로로부티릴; (2) 방향족 우레탄형 보호기, 예를들면 벤질옥시카르복닐 및 치환된 벤질옥시 카르복닐, 예를들면 p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질-카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, p-메톡시벤질옥시카르보닐, 1-(p-비페닐일)-1-메틸에톡시카르보닐, α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐 및 벤즈히드릴옥시카르코닐: (3) 지방족 우레탄 보호기, 예를들면 tert-부틸옥시카르보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐 및 알릴옥시카르보닐 : (4)시클로알킬 우레탄형 보호기, 예를들면 시클로펜틸옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐 및 시클로헥실옥시카르보닐 : (5) 티오우레탄형 보호기, 예를들면 페닐오카르보닐 ; 및 (6) 알킬형 보호기, 예를들면 트리페닐메틸(트리틸)및 벤질 등이 있다. 바람직한 α-아미노 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐이다.
고상 펩티드 합성 업계에 공지된 바와같이, 많은 아미노산은 사슬을 형성하는 동안에 보호를 필요로 하는 관능성을 함유한다. 적절한 보호기의 사용 및 선택은 당 업계의 숙련된 사람의 능력에 속하는 일이며, 보호되는 아미노산 및 펩티드상의 다른 보호된 아미노산 잔기의 존재에 의존하게 된다. 이와 같은 측쇄 보호기의 선택은 α-아미노 부분 보호기를 절단하는 동안에 절단에 의해 제거되지 않는 것으로서 선택해야 하는 중요한 문제이다. 예를들면, 리신에 대한 적합한 측쇄 보호기는 벤질옥시 카르보닐 및 치환된 벤질옥시카르보닐이며, 상기 치환체는 할로(예, 클로로, 브로모, 플루오로) 및 니트로(예, 2-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, 3,4-디클로로벤질옥시카르보닐), 토실, t-아밀옥시카르보닐, t-부틸옥시카르보닐 및 디이소프로필메톡시카르보닐로부터 선택된다. 트레오닌 및 세린의 알콜성 히드록실기는 아세틸, 벤조일, tert-부틸, 트리틸, 벤질, 2,6-디클로로벤질 또는 벤질옥시카르보닐기로 보호시킬 수 있다. 바람직한 보호기는 벤질이다.
적절한 커플링제의 선택은 당 업계의 기술에 속한다. 첨가되는 아미노산이 Gln, Asn 또는 Arg 인 경우, 특히 적합한 커플링제는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸이다. 이러한 시약을 사용함으로써 니트릴 및 락탐 형성을 방지한다. 다른 커플링제로서는 (1) 카르보디이미드(예, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 및 N-에틸-N'-(Y-디메틸아미노프로필카르보디이미드); (2) 시아나미드(예, N,N-디벤질시아나미드); (3) 케텐이민 ; (4) 이족사졸륨염(예, N-에틸-5-페닐-이족사졸륨-3'-술포네이트); (5) 1 내지 4개의 질소를 함유하는 방향족 특성의 모노시클릭 질소 함유 헤테로시클릭 아미드, 예를들면 이미다졸리드, 피라졸리드, 및 1,2,4-트리아졸리드(유용한 특정 헤테로 시클릭아미드로는 N,N'-카르보닐디이미다졸 및 N,N'-카르보닐-디-1,2,4-트리아졸을 들 수 있음); (6) 알콕시화된 아세틸렌(예, 에톡시아세틸렌); (7) 아미노산의 카르복실 부분과 함께 혼합된 무수물을 형성하는 시약(예, 에틸클로로포르메이트 및 이소부틸클로로포르메이트), 또는 커플링되는 아미노산의 대칭성 무수물(예, Boc-Ala-O-Ala-Boc); (8) 하나의 고리 질소 상에 히드록시기를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 화합물 (예, N-히드록시프탈이미드, N-히드록시숙신이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸); 및 (9) 카스트로스 시약(BOP) (Castro's reagent)이 있다. 다른 활성화제 및 펩티드 커플링 중의 이들의 용도는 카푸어(Kapoor)의 문헌[J. Pharm. Sci., 제59호, 제1-27페이지(1970)]에 기재되어 있다. Arg, Asn 및 Glu을 제외한 모든 아미노산을 위한 커플링제로서 대칭성 무수물을 사용하는 것이 바람직하다.
각각의 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열은 고상 반응기 중에 약 4배의 과량으로 도입시키며, 커플링은 디메틸포름아미드 ; 염화메틸렌 (1:1)의 매질 또는 디메틸포름아미드 단독 매질 중에서 행하며, 염화메틸렌 단독 매질이 바람직하다. 불완전 커플링이 발생하는 경우에, 고상 반응기 중에서 다음 아미노산을 커플링하기 전에, α-아미노 보호기를 제거시키기 전에 커플링 방법을 반복한다. 각 합성 단계에서 커플링 반응의 성공은 문헌[이. 카이저(E. Kaiser, et al)등의 Analyt, Biochem. 제34호, 제595페이지(1970)]에 기재된 바와 같이 닌히드린 반응에 의해 검사한다.
α-아미노 보호딘 아미노산을 수지 지지체에 커플링시킨 다음, 보호기는 임의 적합한 방법, 예를들면 염화메틸렌 중의 트리플루오로 아세트산, 트리플루오로아세트산 단독 또는 디옥산 중의 HCl을 사용하여 제거한다. 탈보호는 0℃내지 실온에서 행한다. 특정 α-아미노 보호기 제거를 위한 조건 및 다른 표준 절단 시약을 사용할 수 있다. α-아미노 보호기를 제거한 후, 다른 아미노 보호된 아미노산은 바람직한 순서로 단계적으로 커플링시킨다. 다른 방법으로서는, 다중 아미노산기를 수지로 지지된 아미노산 서열로 커플링시키기 전에 용액 방법으로 커플링시킬 수 있다.
바람직한 아미노산 서열을 얻은 후에, 이 펩티드는 수지로부터 제거시키며, 탈보호시킨다. 이것은 스케빈저(예, 아니솔)의 존재 중에서 무수 HF용액으로 수지에 결합된 폴리펩티드를 처리하는 바와같은 가수분해로써 행할 수 있다. 전형적으로는, 보호기의 제거는 펩티드 사슬 합성이 종결된 후에 행하지만 보호기는 적합한 임의 적절한 시간에 제거시킬 수 있다.
탈보호된 펩티드의 정제 및 분석은 다수의 표준 방법으로서 성취된다. 적절한 정제 및 분석 방법의 선택은 당 업계의 기술에 속한다. 적합한 정제 방법은 예비 HPLC이다. 정제된 펩티드의 분석은 분석 HPLC, 아미노산 분석, 고속 원자 충격 질량 분광분석계 및 다른 임의 적합한 분석 수단으로써 행할 수 있다.
본 발명의 펩티드 유도체의 항응고제는 환자, 치료할 혈전중의 심도 및 선택된 펩티드 유도체에 따라서 1일 당 0.2mg/kg 내지 250mg/kg(환자 체중)의 양으로 투여한다. 특정 환자에 대한 적합한 투여량은 쉽게 결정할 수 있다. 바람직하기로는, 투여량 당 유효 성분 5mg 내지 100mg 으로 1일에 1 내지 4회 분할 투여할 수 있다. 저장된 전혈과 같은 체외 매질 중의 혈액 응고를 억제하거나 방지하는데 필요한 본 발명의 펩티드 양은 당 업계의 숙련된 사람에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
항응고성 치료는 각종 혈전성 질병, 구체적으로 관상 동맥 및 뇌혈관 질환의 치료 및 예방을 의미한다. 이 분야에 경험이 많은 사람은 항응고성 치료를 필요로 하는 상황을 쉽게 알 수 있다. 본 명세서에 사용된 환자는 사람, 양, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐 및 생쥐를 포함한 영장류와 같은 포유류를 의미한다. 혈액 응고화 억제는 혈전성 질병을 갖는 개체의 항응고성 치료에서 유용할 뿐만 아니라 혈액 응고의 억제가 바람직할때는 언제나, 예를들면 저장된 전혈 중의 응고를 방지하고, 시험용 또는 저장용 다른 생물학적 시료 중에서 응고를 방지하는데 유용하다.
펩티드 유도체의 일부가 경구 투여 후에 소화되지 않고 장을 통과할 수 있기 때문에, 비경구 투여, 예를들면, 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내 투여가 바람직하며 ; 축적질 주에 의한 투여; 이식 제제에 의한 투여; 또는 스프레이 또는 건조 분말 형태로 본 발명의 펩티드 유도체를 함유하는 에어로졸 깡통으로 코, 인후, 및 기관지 관의 점막에 적용시키는 방법이 바람직하다.
비경구 투여를 위해서 화합물은 계면 활성제 및 다른 제약상 허용되는 보조제의 첨가 또는 첨가없이 물 및 오일과 같은 멸균액일 수 있는 제약상 허용되는 담체와 함께 생리학상 허용되는 희석제 중의 화합물의 용액 또는 현탁액의 주사 투여제로서 투여할 수 있다. 이러한 제제 중에 사용될 수 있는 오일의 예로서는 석유, 동물유, 식물유, 또는 합성 원료, 예를들면 땅콩유, 대두유 및 광유가 있다. 일반적으로 물, 염수, 수용성 덱스트로오스 및 관련 당 용액, 에탄올 및 글리콜, 예를들면 프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜이 바람직한 액체 담체이며, 이들 담체는 특히 주사 용액용으로 적합하다.
상기 화합물은 유효 성분을 서방형으로 제거될 수 있는 축적질 주사제 또는 이식 제제 형태로 투여할 수 있다. 유효 성분은 펠릿 또는 소형 원통형으로 압착시킬 수 있고 또는 축적질 주사제 또는 이식제로서 피하적으로 또는 근육내적으로 이식시킬 수 있다. 이식제는 생분해성 중합체 또는 합성 실리콘과 같은 불활성 물질, 예를들면 실리콘 고무인 실라스틱(Silastic; Dow-Corning Corporation사 제품)을 사용할 수 있다.
[실시예]
본 발명은 다음 실시예로서 예시되지만, 이 실시예가 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
항응고성 펩티드의 제조
펩티드를 베가(Vega) 반자동 펩티드 합성기 상에서 0.56 mmol/g Bod D-Glu(Bzl) 메리필드 수지 8.3 mmol을 사용하여 고상법으로 합성하였다. 음성 카이저(Kaiser) 시험을 하기 위해 2개의 커플링 반응을 필요로 하는 Boc-Cha의 경우를 제외하고는 Nα-Boc-아미노산(Peptides International사 제품) 18.3 mmol을 사용하여 단일 대칭형 무수물 커플링을 수행하였다. 펩티드 수지(0.7-1.,5g)의 일부를 제거하고, 3-8회의 사이클 후에 고정시켰다. des-Glu57을 위하여, Boc-Pro-Ile-Pro-Glu(Bzl)-Ala-Cha-Glu(Bzl) 메리필드 수지 1.36g(0.50 mmol)을 8회 후에 보존하였다. 보호된 펩티드 단편 수지를 2.0 mmol 아미노산과의 이중 대칭 무수물 커플링을 이용하여, Boc-Tyr(2-BrZ)이 함유되어 있는 어플라이드 바이오시스템스 반응 용기에 전달하였다. Nα-Boc 보호는 염화메틸렌 중에서 50% 트리플루오로 아세트산을 사용하여 제거시키고, 염화메틸렌 중의 10% 디오소프로필에틸아민으로 3회 세척하여 중화시키고, 염화메틸렌을 사용하여 3회 세척시키고, 질소 흐름 하에서 건조시켰다. 펩티드는 디메틸포름아미드 중에서의 이중 숙신산 무수물 커플링을 이용하여 Nα숙시닐화시키고, 디메틸포름아미드를 사용하여 3회 헹구고, 염화메틸렌 중의 10% 디이소프로필에틸아민으로 2회 세척하여 중화시키고, 염화메틸렌을 사용하여 3회 세척시키고 진공 중에서 건조시켰다. 펩티드를 탈보호시키고 0℃에서 60분 동안 5% 아니솔을 함유하는 무수 HF를 사용하여 수지로부터 분해시켰다. HF를 0℃에서 진공 중에서 져거시키고, 펩티드를 25% 아세토니트릴 수용액을 사용하여 수지로부터 추출하고, 동결 및 건조시켰다.
예비 HPLC를 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 중에서의 15분간에 걸친 29.6-31.6% 아세토니트릴 선형 농도 구배법을 사용하여 C18Beckman 50.8 x 150mm 컴럼 상에서 80ml/분의 속도로 수행하였다. 주요 피크(280nm에서 측정)를 수집하고 동결 건조시켜서 목적 생성물 280mg 을 얻었다. 균질성을 HPLC로 측정하였다. Vydac 218TP54 (4.6 x 250mm) C18컬럼, 2.0ml/분, to=1.5분, 0.1% 트리플루오로아세트산에 대한 25분에 걸친 15-40% 아세토니트릴 선형 농도 구배법을 사용한 용출 시간은 17.1분이었다.
정제시킨 표지화 펩티드를 분석하여 FAB-MS이 의하여 목적하는 분자 이온 피크를 얻고, 목적하는 펩티드에 따른 아미노산 분석을 하였다. 이러한 방법으로, 다음의 펩티드는 하기 명시한 물리적 성질을 갖는다.
시료를 트롬빈 유도된 피브린 응혈 억제 분석에 대해 시험하였다. 분석 용액은 모두 0.12M 염화나트륨, 0.01M 인산나트륨, 0.01% 아지드화나트륨 및 0.1% 소혈청 알부민을 함유하는 분석용 완충액(pH 7.4)으로 제조하였다. 소의 트롬빈은 적절한 농도로 적정하여 피브린 응혈 형성을 405nm에서 60분 이내에 마이크로 적정기판 기록기(Bio-Tek EL 309)로써 검출할 수 있게 하였다. 이 트롬빈 용액(50μl ; 0.2pmol)을 시험할 합성 펩티드 용액 50μl를 함유하는 마이크로 적정기 판의 웰에 첨가하였다. 1분간 교반시키고, 20℃에서 10분 동안 추가로 인큐베이션시킨 후, 0.1% EDTA 중의 희석된 혈장(1:10) 100μl 를 첨가하고 20초 동안 와동시켰다. 이 용액의 혼탁도는 5분 간격으로 자동 기록기로써 모니터하였다. 이 결과로부터 IC50을 계산하고, IC50억제제를 함유하지 않은 대조용에 비해 50% 혼탁도에 유도한국는 펩티드의 농도로서 정의하였다. 이것은 피브린 응혈 형성 시간에 있어서 2배 증가에 상당한다. 인간 트롬빈을 사용하는 분석을 위해서, 인간 및 소 트롬빈을 30분에 걸쳐 동일한 속도에서 피브린 응혈이 생기는 농도까지 적정하였다. 이 방법에 있어서, 다음의 펩티드는 다음의 특정 실시예에 대한 생물학적 특성을 가지며, +는 25μmIC50200 μM을 나타내며, ++는 IC5025 μM를 나타낸다.
시험관 내 효능 : +
시험관 내 효능 : ++
시험관 내 효능 : ++

Claims (17)

  1. 로 이루어진 군에서 선택된 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  2. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  4. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  5. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  6. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  7. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  8. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  9. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  10. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  11. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  12. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  13. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  14. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  15. 제1항에 있어서, 펩티드가
    인 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염.
  16. (a) C-말단 보호된 아미노산이 적합하게 결합된 수지를 사용하는 단계, (b) 다른 a 아미노 보호된 아미노산을 순차적으로 커플링시켜 보호된 아미노산 서열을 얻는 단계, (c) 상기 보호기를 제거시킨 후 펩티드 유도체를 정제하는 단계로 이루어지는, 제1항 내지 15항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩티드 유도체 또는 그의 제약학상 허용되는 염의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 15항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩티드 유도체를 체외 매질과 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 체외 매질 중의 혈액 응고의 억제 방법.
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