WO2006070737A1 - ベンゼン環上に二置換基を有するβ－ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体 - Google Patents

ベンゼン環上に二置換基を有するβ－ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体 Download PDF

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WO2006070737A1
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Keiko Shimamoto
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Suntory Limited
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    • C07C237/12—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups

Definitions

  • the present invention relates to a j3-benzyloxyspartic acid derivative having a disubstituent on a benzene ring having an L-glutamic acid uptake inhibitory action. More specifically, the compound of the formula (1) having an action of suppressing the gnoretamic acid uptake activity of the L-glutamate transporter (wherein R 1 is an aromatic group which may have a substituent) The substituent R 2 may have a substituent, and nitrogen or oxygen may be inserted into the chain.
  • Aromatic group which may have an aliphatic group or a substituent A group selected. Or a salt thereof, a production method for obtaining the compound, and a method for purifying or detecting an L-glutamate transporter using the compound.
  • L-glutamic acid is a transmitter of excitatory nerve stimulation in the central nervous system of mammals, and it is a memory process and memory that is a higher-order and complex physiological process that does not only cause rapid neurotransmission between synapses. Is also known to be involved.
  • Excitatory neurotransmission between synapses begins with the release of glutamate from the presynapse and ends with the rapid uptake of glutamate from the synaptic cleft by the high-affinity gnoretamic acid transporter present in nerve endings and Daria cells. (Attwell, D. and Nicholls, D., TIPS 6 8-74, 1991).
  • the / 3-positioned bulky compound acts as a blocker in all subtypes and found not only the uptake of gnoretamic acid, but also the inhibition of dartamic acid leakage and sodium ion influx by heteroexchange.
  • L_threo- ⁇ -benzyloxyspartic acid (L-TBOA) shown in formula (2) has a strong blocker action, and its affinity for glutamate receptors is lower than that of existing inhibitors. It has become a reference material for porter research.
  • protein purification is indispensable to elucidate the three-dimensional structure of glutamate transporter and to elucidate the substrate transport mechanism and substrate binding site.
  • Affinity column graphs are an effective means for protein purification. Attempts have already been made to purify proteins using antibodies. However, since the binding between the antibodies and the proteins was too strong, there was a disadvantage that the proteins lost their original functions during elution. If a blocker can be used as a column ligand, the blocker can be eluted under mild conditions. Therefore, a blocker having a substituent capable of binding to an affinity column while exhibiting strong L-glutamate uptake inhibition activity has been demanded.
  • the present invention provides a compound that has a high activity of inhibiting L-glutamic acid transporter gnoretamic acid uptake and further acts as an affinity column ligand.
  • the present invention also provides a production method for obtaining the compound, and a purification method and a detection method for an L-glutamate transporter using the compound.
  • the present inventors focused on the strong affinity of TFB-TBOA and its analogs, synthesized derivatives having further substituents on TFB-TBO ⁇ and its analogs, and used these derivatives as column carriers. It was considered to be used for retention and detection. As a result of intensive research, it was found that (2S, 3S) _3- (3,5-diaminobenzyloxy) aspartic acid derivative of formula (1) has strong activity and L-glutamate uptake inhibitory activity column. Can hold substituents that can be attached to As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a compound of the formula (1) capable of retaining a substituent capable of binding to an affinity column while exhibiting a strong L-gnoretamic acid uptake inhibitory activity (wherein R 1 represents Is an aromatic group which may have a substituent, and the substituent R 2 may have a substituent, and nitrogen or oxygen may be inserted into the chain. With group, substituent
  • FIG. 1 shows a method for synthesizing the compounds of the present invention (compounds 10 and 11).
  • FIG. 2 shows a method for synthesizing the compound of the present invention (Compound 14).
  • FIG. 3 shows a method for synthesizing the compound of the present invention (Compound 18).
  • the compound of the formula (1) is a compound that can retain a substituent capable of binding to an affinity column while exhibiting a strong L-gnoretamic acid uptake inhibitory activity, and in the formula, R 1 may have a substituent. Is a good aromatic group, and the substituent R 2 may have a substituent or may have a linear or branched C to C aliphatic group or a substituent in which nitrogen or oxygen may be inserted in the chain. Moyo Les, groups selected from aromatic groups.
  • the substituent R 1 is an aromatic group that may have a substituent.
  • the aromatic group represented by R 1 include a phenyl group, a naphthyl group, a pyridyl group, and the like, and the aromatic ring may have a substituent.
  • Substituents on the aromatic ring include linear or branched C 1 -C alkyl
  • 3- (trifluoromethyl) -3H-diazylin-3-yl) group and the like are exemplified.
  • the phenyl group substituted at the para position has a high L-glutamic acid inhibitory activity.
  • substituents include 4_ (trifluoromethyl) phenyl group, 4_ethylphenyl group, 4-methoxyphenyl group, and 4_azidophenyl group.
  • the substituent R 2 may have a substituent, and may have a linear or branched C to C aliphatic group or substituent in which nitrogen or oxygen may be inserted in the chain. Choose from good aromatic groups
  • Linear or branched c to c Aliphatic groups include methyl, ethyl
  • the aliphatic group may have an unsaturated bond or a substituent, and examples of the substituent at that time include an oxo group, a hydroxy group, a thiol group, an amino group, and a carboxyl group.
  • R 2 C 0 includes a group derived from an amino acid, a peptide, or polyethylene glycol.
  • Polyethylene glycol derivative represented by CO (n 2-6), which is condensed with amino acids and peptides.
  • Examples of the aromatic group of the substituent R 2 include a phenyl group, a naphthyl group, a pyridyl group, and the like, and the aromatic group may have a substituent on the aromatic ring.
  • Substituents on the aromatic ring include linear or branched C-c alkyl groups, c-c aryl groups, C-C alkoxyl groups, C-C acylamino groups. , Halogen, halogenated c-c alkyl group and the like.
  • linker one having an amino group as a substituent R 2 be the carboxylic acid of free Amino groups with commercially available force ram carriers or easily coupled to activated carboxylic acid ester or a halogenated alkyl group, it can.
  • linker one having an amino group as a substituent R 2 be the carboxylic acid of free Amino groups with commercially available force ram carriers or easily coupled to activated carboxylic acid ester or a halogenated alkyl group, it can.
  • piotin is bonded to the amino group, it can be held on a commercially available avidin column. Therefore, in the case of a compound having an amino group as R 2 , the compound can be fixed to a column carrier while maintaining high blocker activity.
  • fluorescent detection is possible by binding a fluorescent group or fluorescently labeled avidin instead of the column carrier.
  • linkers include amino acids such as ⁇ -alanine and 6-aminohexanoic acid, peptides obtained by condensing 2 to 5 of these, and polyethylene glycol derivatives having an amino group and a carboxylic acid at both ends. Or a compound obtained by condensing them. Furthermore, linear or branched C which may be substituted as substituent R 2
  • the compound of the present invention can be converted into a salt by an ordinary method.
  • such salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts, and ammonium salts, all of which are included in the present invention.
  • it can be converted into a salt with ordinary acids.
  • examples of such salts include salts of inorganic acids such as hydrochloride and sulfate, and salts of organic acids such as acetate, citrate, and trifluoroacetate. These are also included in the present invention.
  • the compound of the present invention can be synthesized by the method shown in FIG.
  • the Boc group represents a tert-butoxycarbonyl group
  • TBS represents a t_butyl-dimethylsilyl group
  • 3,5-Dinitrobenzyl chloride and sodium hydride are allowed to act on the hydroxyl group of a known compound 2 derived from an optically active epoxide (patent: Compound 6 of PCT / JP02 / 06286) to form dinitrobenzenoleether. .
  • the hydroxyl group is oxidized to a carboxylic acid.
  • the methyl ester is then removed to give the free carboxylic acid, and then both carboxylic acids are led to t_butyl ester.
  • the compound of the present invention is a glutamic acid cell labeled with 14 C in human EAAT2 and EAAT3, which is constitutively expressed in MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) cells or transiently expressed in COS-1 cells. Inhibits uptake. Therefore, the compound of the present invention is a useful molecular probe for elucidating the mechanism of the glutamate transporter, and has been shown to be a useful compound for the treatment of neurodegenerative diseases through studies such as structure-activity relationship and protein structure analysis. .
  • affinity column ligands for isolation and purification of glutamate transporter protein.
  • Known methods can be used to prepare affinity columns (for coupling reactions in general, see Affinity Chromatography Handbook published by Amersham Pharmacia Biotech: Principles and Methods). .
  • affinity columns for coupling reactions in general, see Affinity Chromatography Handbook published by Amersham Pharmacia Biotech: Principles and Methods). .
  • Affinity Chromatography Handbook published by Amersham Pharmacia Biotech: Principles and Methods.
  • Biotin labeling or fluorescent labeling can be performed by reacting with a thiotin derivative or fluorescent dye derivative having an active ester.
  • Some of the compounds of formula (1) are also useful as radioisotope labeling ligands for transporter protein identification.
  • FIG. 2 the ability to perform hydrogenation after introducing an unsaturated fatty acid acyl group (for example, an atalyloyl group) into R 2 CO.
  • an unsaturated fatty acid acyl group for example, an atalyloyl group
  • tritium isotopes Signs are possible.
  • FIG. 3 after introducing a halogenobenzoyl group as R 2 CO, it is led to a tin derivative by a known method and further substituted with [ 12 3 ⁇ 4NaI for radiosodo labeling.
  • the organic layer was dried over magnesium sulfate, the solvent was distilled off, and the resulting residue was dissolved in 5 mL of acetone, and Jones reagent was added until the brown color did not disappear.
  • the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, and 2-propanol was added to terminate the reaction, followed by extraction with ether, and the organic layer was washed with saturated brine.
  • the organic layer was dried over magnesium sulfate and the solvent was distilled off to obtain carboxylic acid (4) (268 mg, 2 steps 72%).
  • the obtained 4 was dissolved in 2 mL of methanol, and 2.5 mL of 1 N NaOH was added under ice cooling, followed by stirring at room temperature for 4 hours.
  • the reaction solution was adjusted to pH 1 with 2N hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate.
  • the residue obtained by distilling off the solvent was heated in 5 mL of ⁇ , ⁇ -dimethylformamide di-tert-butylacetal at 90 ° C for 15 minutes.
  • the reaction mixture was ice-cooled, water was added, and the mixture was stirred for 18 hours.
  • reaction solution was stirred at 40 ° C. for 2 hours, and ether and a 5% aqueous citrate solution were added to terminate the reaction.
  • the organic layer was washed with saturated brine, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine in that order, and dried over magnesium sulfate.
  • MDCK Mesh- [ 14C ] glutamate uptake in human EAAT2 or EAAT3 expressed in Darby Canin e Kidney
  • the inhibitory effect on penetration was measured.
  • Gnoretamic acid uptake activity was determined by adding ⁇ L- [C] glutamic acid and a sample of the specified concentration, incubating for 12 minutes, lysing the cells, and measuring the incorporated radioactivity with a liquid scintillator did. The amount of uptake was shown in Table 1 where the amount of uptake was shown as 100% when the test compound was not present (buffer only), and 0% when uptake in the sodium-free solution.
  • a predetermined amount of Affi-Gel 10 or Affi-Gel 15 (BioRad) is weighed on a glass filter, ice-cooled anhydrous 2-propanol, then the reaction solvent (alcohol, dimethenolesnoreflex (DMSO), Wash with dioxane or formamide, dissolve the ligand of the present invention in the reaction solvent, and add tertiary amine (triethylamine, diisopropylethylamine, etc.) to adjust the pH to 10-11. Mix the solution and allow to react for several hours at room temperature, wash away excess ligand and store the gel at 4 degrees.
  • the reaction solvent alcohol, dimethenolesnoreflex (DMSO)
  • DMSO dimethenolesnoreflex
  • tertiary amine triethylamine, diisopropylethylamine, etc.
  • CNBr-active Sepharose 4B (Amersham Bioscience) onto a glass filter. Repeat washing and swelling with 1 mM HC1.
  • the ligand of the present invention is dissolved in a coupling buffer (for example, 0.1 M NaHC03 containing 0.5 M NaCl, pH 8.3). This ligand is mixed with the gel dispersion at room temperature for 2 hours or overnight at 4 degrees. The gel is then introduced into blocking homogeneous IJ, eg 1 M ethanolamine or 0.2 M glycine, H 8.0. This gel was coupled with coupling buffer and acetate buffer (0.5 M NaCl, Wash with 0.1 M AcOH, pH 4.0) to remove excess ligand and blocking agent. Store the gel at 4 degrees.
  • a coupling buffer for example, 0.1 M NaHC03 containing 0.5 M NaCl, pH 8.3
  • This ligand is mixed with the gel dispersion at room temperature for 2 hours or overnight at 4 degrees.
  • the gel is then introduced into blocking homogeneous IJ
  • a derivative having two amino groups on the benzene ring of optically active ⁇ -benzyloxyspartic acid represented by the chemical formula (1) and a salt thereof are added to a ligand or a protein of an affinity column. It can serve as a ligand for detection.

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Description

明 細 書
ベンゼン環上に二置換基を有する 3 —べンジルォキシァスパラギン酸誘 導体
技術分野
[0001] 本発明は、 L-グルタミン酸取り込み阻害作用を有するベンゼン環上に二置換基を 有する j3—ベンジルォキシァスパラギン酸誘導体に関する。より詳細には、 L-グルタ ミン酸トランスポーターのグノレタミン酸取り込み活性の抑制作用を有する式（1)の化 合物 (ここで、式中 R1は置換基を有してもよい芳香族基であり、置換基 R2は置換基を 有してもよく鎖に窒素または酸素が挿入されていてもよい直鎖若しくは分岐 C〜C
1 30 脂肪族基、置換基を有してもよい芳香族基力 選択される基を示す。）、またはその 塩、及び前記化合物を得る製造方法、並びに前記化合物を用いた L-グルタミン酸ト ランスポーターの精製方法または検出方法に関する。
背景技術
[0002] L -グルタミン酸は、ほ乳動物の中枢神経系における興奮性神経刺激の伝達物質で あり、シナプス間での素早い神経伝達を引き起こすだけではなぐ高次で複雑な生理 的過程である記憶や学習にも関与していることが知られている。シナプス間での興奮 性の神経伝達は、プレシナプスからのグルタミン酸の放出に始まり、神経末端やダリ ァ細胞に存在する高親和性のグノレタミン酸トランスポーターによるシナプス間隙から の素早いグルタミン酸の取り込みにより終焉する (Attwell, D. and Nicholls, D., TIPS 6 8-74, 1991)。
[0003] レ、くつかの遺伝的な神経変性疾患においては、患者の脳の一部にナトリウム依存 性グルタミン酸取り込み活性の低下が報告されている (Rothstein, J. D. et al., N. Eng . J. Med 326, 1464-1468, 1992)。このため、グルタミン酸トランスポーターの機能の発 現と阻害がこれらの疾患との関連で注目されている。
[0004] したがって、グルタミン酸トランスポーター輸送機構の解明、およびてんかん 'ハン チントン氏病 ·筋萎縮性側索硬化症 (ALS) ·アルツハイマー病などの神経障害などの 神経変性疾患との関連の究明のためには、トランスポーター特異的に作用する阻害 剤、とりわけブロッカーとして作用する阻害剤の開発が要望されている。
[0005] 本発明者らは、 β位に置換基をもつ βーヒドロキシァスパラギン酸誘導体力 ΕΑΑΤ 1-5全てのサブタイプに対して、取り込み阻害作用を示すことを既に報告している (Le brun, B. et al , J. Biol. Chem. 272, 20336-20339, 1997; Shimamoto, K. et al., Mol. Pharmacol. 53, 195-201, 1998; Shigeri, Y. et al., J. Neurochem, 79, 1207-1216, 20 01)。中でも /3位の置換基が嵩高い化合物は、全てのサブタイプにおいてブロッカー として働き、グノレタミン酸の取り込みのみならず、ヘテロエクスチェンジによるダルタミ ン酸の漏出やナトリウムイオンの流入も阻害することを見いだしている (Chatton, J-Y. et al, Brain Res. 893, 46-52, 2001)。特に式（2)に示す L_スレオ- β -ベンジルォキ シァスパラギン酸 (L-TBOA)は強いブロッカー作用を有し、し力 グルタミン酸受容 体に対する親和性は既存の阻害剤より低いことから、グノレタミン酸トランスポーター研 究の標準物質となるに至っている。
[0006] [化 1]
Figure imgf000004_0001
式（2)
[0007] さらに L-TBOAのベンジル基メタ位にアミノ置換基を有する化合物が強い活性を示 すことを見出し、中でもパラ位に置換されたベンゾィルアミド型化合物が高親和性で あることを報告している（Shimamoto, K. et al" Mol. Pharmacol. 65， 1008-1015,2004) 。とりわけ式（3)に示すトリフルォロメチルベンゾィル基を有する化合物（TFB-TBOA) は取り込み阻害活性の IC 力 ¾Mオーダーであった。
[0008] [化 2]
Figure imgf000005_0001
[0009] 一方、グルタミン酸トランスポーターの 3次元構造を解明し、基質輸送機構や基質 結合部位を明らかにするためには、蛋白の精製が不可欠となる。ァフィ二ティカラムク 口マトグラフは蛋白精製に有効な手段である。既に抗体を用いた蛋白精製が試みら れているが、抗体と蛋白の結合が強すぎるために、溶出の際に蛋白が本来の機能を 失うという不都合があった。カラムリガンドにブロッカーを用いることができれば穏和な 条件で溶出できることから、強い L -グルタミン酸取り込み阻害活性を示しつつァフィ 二ティカラムに結合できるような置換基を有するブロッカーが求められていた。先に開 発した前述の置換 TBOA類の中でも、置換基としてアミノ酸やピオチンを有するもの はァフィ二ティカラムリガンドとして働くことが期待される力 S、その親和性は μ M程度と 十分なものではなかった。さらに、精製後の蛋白を検出するための手段も必要とされ ていた。
発明の開示
[0010] 本発明は、高い L-グルタミン酸トランスポーターのグノレタミン酸取り込み阻害活性を 有し更にァフィ二ティーカラムリガンドとして働く化合物を提供する。
[0011] 本発明は、前記化合物を得る製造方法、および前記化合物を用いた L-グルタミン 酸トランスポーターの精製方法および検出方法も提供する。
[0012] 本発明者らは、 TFB-TBOAおよびその類縁体の強い親和性に着目し、 TFB-TBO Αおよびその類縁体に更なる置換基を有する誘導体を合成し、それら誘導体をカラム 担体への保持や検出に用いることを考えた。鋭意研究したところ、式（1)の (2S，3S)_3 -(3，5 -ジァミノベンジルォキシ)ァスパラギン酸誘導体力 強レ、L -グルタミン酸取り込 み阻害活性を示しつつァフィ二ティカラムに結合できる置換基を保持させることがで きることを見出し、本発明を完成した。
[0013] [化 3]
Figure imgf000006_0001
[0014] 即ち、本発明は、強い L-グノレタミン酸取り込み阻害活性を示しつつァフィ二ティカラ ムに結合できる置換基を保持させることができる式（1)の化合物（ここで、式中 R1は置 換基を有してもよい芳香族基であり、置換基 R2は置換基を有してもよく鎖に窒素また は酸素が揷入されていてもよい直鎖若しくは分岐 C〜C 脂肪族基、置換基を有して
1 30
もよい芳香族基から選択される基を示す。）、またはその塩を提供する。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1は、本発明の化合物（化合物 10および 11)の合成方法を示す。
[図 2]図 2は、本発明の化合物 (化合物 14)の合成方法を示す。
[図 3]図 3は、本発明の化合物 (化合物 18)の合成方法を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 式（1)の化合物
式（1)の化合物は、強い L-グノレタミン酸取り込み阻害活性を示しつつァフィ二ティ カラムに結合できる置換基を保持させることができる化合物であり、式中 R1は置換基 を有してもよい芳香族基であり、置換基 R2は置換基を有してもよく鎖に窒素または酸 素が挿入されていてもよい直鎖若しくは分岐 C〜C 脂肪族基、置換基を有してもよ レ、芳香族基から選択される基を示す。
[0017] 置換基 R1は上述の通り、置換基を有してもよい芳香族基である。 R1で示される芳香 族基としては、フエ二ル基、ナフチル基、ピリジル基等が例示され、芳香環上に置換 基を有していてもよレ、。芳香環上の置換基としては、直鎖または分岐 C -Cアルキル
1 7 基、 C - C ァリール基、 C - Cアルコキシル基、ニトロ基、シァノ基、アミノ基、 C - Cァ
4 10 1 6 1 7 シノレアミノ基、カルボキシル基、ハロゲン、ハロゲン化 C -Cアルキル基、アジド基、 4 -
1 6
(3- (トリフルォロメチル) -3H-ジァジリン- 3-ィル)基等が例示される。中でもパラ位に置 換したフヱニル基が L -グルタミン酸阻害活性が高ぐそのような置換基としては 4_ (トリ フルォロメチル)フエニル基、 4_ェチルフエニル基、 4-メトキシフエ二ル基、 4_アジドフ ヱニル基、 4-(3_ (トリフルォロメチル) _3H_ジァジリン- 3-ィル)フエニル基などが挙げら れる。
[0018] 置換基 R2は上述の通り、置換基を有してもよく鎖に窒素または酸素が揷入されてい てもよい直鎖若しくは分岐 C〜C 脂肪族基、置換基を有してもよい芳香族基から選
1 30
択される基を示す。直鎖若しくは分岐 c〜c 脂肪族基としては、メチル基、ェチル
1 30
基、 n-プロピル基、イソプロピル基、 t ブチル基、ビエル基、プロぺニル基等が例示 される。直鎖若しくは分岐 C〜C 脂肪族基には、その鎖に窒素または酸素が挿入さ
1 30
れていてもよぐ窒素原子は 1〜3個挿入されるのが好ましぐ酸素原子は:!〜 8個挿 入されるのが好ましレ、。それら脂肪族基上には不飽和結合または置換基があっても よぐその際の置換基の例としては、ォキソ基、ヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、 カルボキシノレ基が含まれる。
[0019] また、 R2C〇としては、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール由来の基を含み、 例えばグリシル基、ァラニル基、 β—ァラニル基、システィニル基、 6-ァミノへキサノィ ル基、これらが 2— 5個縮合したペプチド類が例示される。また H N-(CH CH 0) _CH
2 2 2 η
CO (n = 2-6)で示されるポリエチレングリコール誘導体、これとアミノ酸 ·ペプチドを縮
2
合させた直鎖化合物も含まれる。
[0020] 置換基 R2の芳香族基としては、フエ二ル基、ナフチル基、ピリジル基等が例示され、 芳香環上に置換基を有していても良い。芳香環上の置換基としては、直鎖または分 岐 C -cアルキル基、 c -c ァリール基、 C -Cアルコキシル基、 C -Cァシルァミノ基 、ハロゲン、ハロゲン化 c -cアルキル基等が例示される。
1 6
[0021] 置換基 R2としてアミノ基を有するリンカ一を用いると、その遊離のァミノ基と市販の力 ラム担体のカルボン酸、もしくはカルボン酸活性エステルもしくはハロゲン化アルキル 基に簡単に結合させることができる。または、ァミノ基にピオチンを結合させると、市販 のアビジンカラムに保持させることができる。従って、 R2としてアミノ基を有する化合物 の場合は、高いブロッカー活性を保ったままカラム担体への固定が可能な化合物と なる。またカラム担体に代えて蛍光基または蛍光標識されたアビジンを結合させれば 蛍光による検出が可能である。このようなリンカ一としては、 β -ァラニン、 6 -ァミノへキ サン酸のようなアミノ酸類、これらを 2 _ 5個縮合させたペプチド類、ァミノ基とカルボ ン酸を両端に有するポリエチレングリコール誘導体、またはこれらを縮合させた化合 物が例示される。さらに、置換基 R2として置換されてもよい直鎖または分岐 C
1〜C 脂 30 肪族基、置換基を有してもよい芳香族基を持つものも高い活性を保持しており、その 一部に放射性同位体を導入することによりリガンドの検出が可能となる。
[0022] 本発明の化合物は、通常の方法によって塩とすることができる。このような塩として は、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金 属塩、アンモニゥム塩等があるが、これらはいずれも本発明に含まれる。一方、通常 の酸によっても塩とすること力 Sできる。このような塩としては、塩酸塩、硫酸塩等の無機 酸の塩、酢酸塩、クェン酸、トリフルォロ酢酸塩等の有機酸の塩等がある力 これらも 本発明に含まれる。
[0023] 化学式（1)の化合物の製造方法
本発明の化合物は、図 1に示す方法にて合成することができる。
[0024] 図 1中の Boc基は、 tert-ブトキシカルボニル基、 TBSは t_ブチル -ジメチルシリル基 を示す。
[0025] 光学活性エポキシドから導かれる既知化合物 2 (特許： PCT/JP02/06286の化合物 6)の水酸基に塩化 3，5-ジニトロベンジルと水素化ナトリウムを作用させて、ジニトロべ ンジノレエーテルとする。 TBS基を除去後水酸基を酸化しカルボン酸とする。次いでメ チルエステルを除去し遊離のカルボン酸とした後、両方のカルボン酸を t_ブチルエス テルに導く。ニトロ基を還元し、得られたァミノ基に R Oに相当するカルボン酸塩化 物を 1当量だけ加え、次レ、で R2COに相当するカルボン酸塩ィ匕物もしくはカルボン酸 と縮合剤を加えて二置換体とする。全ての保護基を強酸で除去して目的化合物を得 る。
[0026] 本^^月 )の ffl†牛
本発明化合物は、恒常的に MDCK (Madin-Darby Canine Kidney)細胞に発現させ た、または一過性に COS-1細胞に発現させた、ヒト EAAT2および EAAT3において、 14 Cでラベルしたグルタミン酸の細胞への取り込みを阻害する。従って、本発明の化合 物はグルタミン酸トランスポーターの機構解明に関する有用な分子プローブであり、 構造活性相関、蛋白構造解析などの研究を通して、神経変性疾患治療に結びつく 有用な化合物であることを示している。
[0027] 式（1)の化合物のうち、遊離のアミノ基をもつものは、グルタミン酸トランスポーター 蛋白の単離および精製のためのァフィ二ティカラムリガンドとして使用することができ る。ァフィ二ティカラム調製のためには、公知の方法を用いることができる（カップリン グ反応一般については、 Amersham Pharmacia Biotech社から出版されているァフィ二 ティクロマトグラフィーハンドブック:原理と方法、を参照。）。また、カラム担体に代えて
、活性エステルを有するピオチン誘導体や蛍光色素誘導体と反応させることにより、 ビォチン標識や蛍光標識を行うことが可能である。
[0028] 式（1)の化合物のレ、くつかは、トランスポーター蛋白同定のための放射性同位体標 識リガンドとしても有用である。例えば図 2おいて、 R2COに不飽和脂肪酸ァシル基（ 例えばアタリロイル基など）を導入した後、水素添カ卩を行うことができる力 この際にト リチウムガスを用いることにより、トリチウム同位体標識が可能である。また図 3のように R2COとしてハロゲンィ匕ベンゾィル基を導入した後、公知の方法でスズ誘導体へと導 き、さらに [12¾NaIで置換することで放射性ョード体標識が可能である。
[0029] 実施例
以下に本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例 に限定されるものではない。
[0030] 実施例 1
(2S,aS)-3- 3_し 6— ( -( _(2-ί2_〔2—アミ エトキシ^ ^ト_キシ) _ェヒキシ 1ェ！:キシ _)ァセ上 アミド)へキサンアミド) -へキサンアミド) -5-(4- (トリフルォロメチル)ベンズアミド)ベンジ ルォキシ)ァスパラギン酸（図 1の化合物 10)の合成
[0031] [ィ匕 4]
Figure imgf000010_0001
[0032] 実施例 1 1
図 1の化合物 2から化合物 3 ((2S,3R)_メチル 2-(3,5 -ジニトロべンジルォキシ )_3_(te rt-ブトキシカルボ二ル)- 4_(tert-ブチルジメチルシリルォキシ) -ブタノエート）の合成 化合物 2 (500 mg, 1.38 mmol)の DMF溶液 5mLに 0度で水素化ナトリウム（83 mg, 2. 07 mmol)とヨウ化テトラブチルアンモニゥム (152 mg, 0.41 mmol)を加え、更に塩化 3, 5 -ジニトロべンジル（450 mg, 2.07 mmol)を徐々に加えて、室温で 30分撹拌した。更に 水素化ナトリウムと塩化 3，5-ジニトロべンジル (150 mg,0.70 mmol)を加えて室温で 3 0分攪拌した。 5%クェン酸水溶液を加えて反応を終結させ、エーテルで抽出し、有 機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し得られた残查をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーにて精製し (エーテル Iへキサン = 1 / 3)、（クロ口ホルム Iメタノ ール = 300 I 1)標題化合物 455mg (61%)を得た。
[0033] 油状； [ α ] +0.85° (c 1.28, CHC1 ); 'H-NMR (CDCl , 400 MHz) δ 0.05 (s, 3H), 0
D 3 3
.08 (s, 3 H)， 0.86 (s, 9 H), 1.42 (s, 9 H)， 3.59 (t, 1 H, J = 9.5 Hz), 3.74 (dd， 1 H, J = 5.5, ).5 Hz), 3.79 (s, 3 H)， 4.23 (m， 1 H)， 4.44 (d, 1 H, J = 2.0 Hz), 4.61 (d, 1 H, J = 12.5 Hz), 4.84 (d, 1 H, J = 10.0 Hz), 4.97 (d, 1 H, J = 12.5 Hz), 8.57 (d, 2 H, J = 2.0 Hz), 8.99 (t, 1 H, J = 4.0 Hz).
Figure imgf000010_0002
図 1の化合物 3から化合物 5 ((2S,3S)-N-(tert-ブトキシカルボニル) -3-(3,5-ジニトロ ベンジルォキシ)ァスパラギン酸ジ -tert-ブチルエステル）の合成 化合物 3 (455 mg, 0.84mmol)のメタノール溶液 3 mLに触媒量の DL_カンファース ルホン酸を加えて室温で 18時間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をカ卩えて 反応を終結させ、エーテルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫 酸マグネシウムで乾燥させ溶媒を留去し得られた残查をアセトン 5 mLに溶力、して Jone s試薬を褐色が消えなくなるまで加えた。室温で 30分攪拌し、 2-プロパノールをカロえ て反応を終結させ、エーテルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を 硫酸マグネシウムで乾燥させ溶媒を留去しカルボン酸 (4)を得た (268 mg, 2段階 72%) 。得られた 4をメタノール 2 mLに溶解し、氷冷下で 1 N NaOH 2.5 mLを加えた後室温 で 4時間攪拌した。反応液を 2 N塩酸で pH 1に調整し、酢酸ェチルで抽出した。溶 媒を留去して得られた残渣を Ν,Ν -ジメチルホルムアミド ジ- tert -ブチルァセタール 5 mLに溶力 90度で 15分加熱した。反応液を氷冷し水をカ卩えて 18時間攪拌した。ェ 一テルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ溶媒 を留去し得られた残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し (エーテル/ へキサン = 1 / 3)、標題化合物 257 mg (2段階 77%)を得た。
[0034] 油状； [ α ] -4.2° (c 1.22, CHC1 ); 'H-NMR (CDCl , 400 MHz) δ 1.39 (s, 9 H), 1.
D 3 3
44 (s, 9 H)， 1.47 (s, 9 H), 4.51 (d, 1 H， J = 2.5 Hz), 4.58 (d, 1 H， J = 12.5 Hz), 4.81 (dd, 1 H, J = 2.0, 10.5 Hz), 5.03 (d, 1 H, J = 12.5 Hz), 5.19 (d, 1 H, J = 10.5 Hz), 8.50 (d, 2 H, J = 2.0 Hz), 8.93 (t, 1 H, J = 2.0 Hz).
Figure imgf000011_0001
図 1の化合物 5から化合物 6 ((2S,3S)-N-(tert-ブトキシカルボニル) -3-(3,5-ジァミノ ベンジルォキシ)ァスパラギン酸ジ -tert-ブチルエステル）の合成
化合物 5 (257 mg, 0.47 mmol)をエタノール 3 mLに溶解し、亜鉛末と 2%硫酸銅水溶 液から調製した活性亜鉛 3.0gを加えて 80度で 18時間攪拌した。放冷後濾過し、濾 液を濃縮した。得られた残渣を酢酸ェチルに溶かし飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグ ネシゥムで乾燥させた。溶媒を留去し得られた残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一にて精製し (エーテル Iへキサン = 2 / 1 - 3 /1)、標題化合物 178 mg (78%)を得 た。
[0035] 油状； [ひ] -12.5。 (c 1.02, CHC1 ); 'H-NMR (CDCl , 400 MHz) δ 1.41 (s， 9 H)， 1.44 (s, 9 H)， 1.48 (s, 9 H), 3.45 (bs, 2 H)， 4.22 (d, 1 H, J = 11.0 Hz), 4.40 (d, 1 H, J = 2.0 Hz), 4.59 (d, 1 H, J = 11.0 Hz), 4.71 (dd， 1 H, J = 2.0， 10.5 Hz), 5.28 (d, 1
H, J = 10.5 Hz), 5.95 (t, 1 H, J = 1.5 Hz), 6.06 (d, 2 H, J = 1.5 Hz). 図 1の化合物 6力 化合物 8 ((2S,3S)-N-tert_ブトキシカルボニル -3-(3-(6-(6- (2- (2 -(2-(2- (2- N_tert_ブトキシカルボニルアミノエトキシ)エトキシ) -エトキシ)エトキシ)ァセ トアミド)へキサンアミド)-へキサンアミド) -5_(4- (トリフルォロメチル)ベンズアミド)ベンジ ノレォキシ)-ァスパラギン酸ジ- tert-ブチルエステノレ）の合成
化合物 6 (120 mg, 0.25 mmol)とトリエチルァミン (104 μ L， 0.75 mmol)を塩化メチレ ン 5 mLに溶解し、氷冷下で塩化トリフルォロメチルベンゾィル 37 μ Lの塩化メチレン 溶液 (2 mL)をゆっくり加えた。氷冷下で 15分攪拌した後、リンカ一（図 1の 7) (288 mg ， 0.50 mmol), 1_ェチル _3_(3_ジメチルァミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（96 mg, 0.50 mmol), 4_N,N-ジメチルァミノピリジン (30 mg, 0.25 mmol)を加えた。反応液を 40 度で 2時間攪拌し、エーテルと 5%クェン酸水溶液を加えて反応を終結させた。有機層 を飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄し、硫酸マ グネシゥムで乾燥させた。溶媒を留去し得られた残查をシリカゲルカラムクロマトダラ フィ一にて精製し（メタノール Iクロ口ホルム = 3 / 97 ？ 5 /95)、標題化合物 184 mg (2段階 61%)と図 1の化合物 9 (40 mg, 19%)を得た。
化合物 8油状； [ α ] +4.0。 (c 0.93, CHC1 ); 'H-NMR (CDCl , 400 MHz) δ 1.25-
D 3 3
I.55 (m, 8 H), 1.42 (s, 27 H)， 1.48 (s, 9 H), 1.60 (tt, 2 H, J = 7.5 Hz), 1.71 (tt, 2 H ， J = 7.5 Hz), 2.15 (t, 2 H, J = 7.0 Hz), 2.36 (t, 2 H， J = 7.0 Hz), 3.25 (m， 6 H), 3.5 0 (m, 2 H), 3.55-3.70 (m, 14 H), 3.96 (d, 2 H, J = 5.0 Hz), 3.99 (d, 1 H, J = 11.5 H z)， 4.43 (s, 1 H), 4.76 (d, 2 H， J = 11.5 Hz), 5.10 (bs, 1 H)， 5.35 (d， 1 H, J = 10.5 H z)， 5.95 (bs, 1 H), 7.05 (bs, 1 H)， 7.31 (s, 1 H), 7.45 (s， 1 H)， 7.73 (d， 2 H, J = 8.0 Hz), 7.99 (s, 1 H), 8.01 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 8.24 (bs, 1 H)， 8.60 (bs, 1 H).
化合物 9油状； [ひ] +3.5° (c 1.34, CHC1 ); H-NMR (CDCl , 400 MHz) δ 1.41 (s，
D 3 3
18 H), 1,49 (s， 9 H)， 4.44 (d， 1 H, J = 12.0 Hz), 4.46 (d， 1 H， J = 2.5 Hz), 4.80 (dd， 1 H, J = 2.5, 10.5 Hz), 5.37 (d, 1 H， J = 10.5 Hz), 7.46 (d, 2 H, J = 1.5 Hz), 7.72 ( d， 4 H, J = 8.0 Hz), 7.95 (d, 4 H, J = 8.0 Hz), 8.19 (s, 1 H), 8.31 (s, 2 H).
Figure imgf000013_0001
図 1の化合物 8から化合物 10 ((2S,3S)-3-(3-(6-(6-(2-(2-(2-(2-(2-アミノエトキシ)ェ トキシ)エトキシ)エトキシ)ァセトアミド)へキサンアミド)-へキサンアミド) -5-(4- (トリフルォ ロメチル)ベンズアミド)ベンジルォキシ)ァスパラギン酸）の合成
化合物 8 (184 mg, 0.15 mmol)をクロロホノレム 1 mLに溶解し、トリフルォロ酢酸（TFA ) 1 mLをカ卩えて室温で 18時間攪拌した。溶媒を留去し得られた残查にクロ口ホルム をカロえて留去する操作を 3回繰り返した。残渣を水に溶かして凍結乾燥を 2回繰り返 し標題化合物を TFA塩として 104 mg (62%)得た。
[0037] アモルファス； [ひ] -19.1° (c 0.37, H 0); 'H-NMR (D 0, 400 MHz) δ 1.05 (m, 2
D 2 2
H), 1.15 (m, 2 H), 1.26 (m, 2 H), 1.32 (m, 4 H), 1.44 (m, 2 H), 1.98 (t， 2 H, J = 7.8 Hz), 2.16 (m, 2 H)， 2.96 (t, 4 H, J = 7.0 Hz), 3.05 (m， 2 H)， 3.46-3.64 (m, 16 H)， 3
.83 (s, 2 H)， 4.30 (d, 1 H， J = 12 Hz), 4.36 (d, 1 H, J = 2.5 Hz), 4.50 (d, 1 H， J = 2.
5 Hz), 4.54 (d, 1 H, J = 12 Hz), 7.00 (s, 1 H), 7.09 (s, 1 H)， 7.49 (d, 2 H, J = 8.5 H z)， 7.60 (s, 1 H), 7.68 (d, 2 H, J = 8.5 Hz). 図 1の化合物 9から化合物 l l ((2S,3S)-3-[3,5-ビス [4- (トリフルォロメチル)ベンズァ ミド]ベンジルォキシ]ァスパラギン酸）の合成
化合物 (9) (27 mg, 0.033 mmol)をクロロホノレム 1 mLに溶解し、トリフルォロ酢酸（TF A) 1 mLを加えて室温で 18時間攪拌した。溶媒を留去し得られた残查にクロ口ホルム をカ卩えて留去する操作を 3回繰り返した。残渣を水に溶かして凍結乾燥を 2回繰り返 し標題化合物を TFA塩として 20mg (84%)得た。
[0038] アモルファス；1 H-NMR (D 0， 400 MHz) δ 4.01 (d, 1 H, J = 5.0 Hz), 4.41 (d, 1 H,
2
J = 5.0 Hz), 4.49 (d， 1 H， J = 11.0 Hz), 4.74 (d， 1 H， J = 11.0 Hz), 7.48 (s， 2 H)， 7. 88 (d, 4 H, J = 8.0 Hz), 8.10 (d, 4 H, J = 8.0 Hz), 8.21 (d, 1 H， J = 1.5 Hz).
(2S.3S)-3-「3_プロピオニルアミド -5-「4_ (トリフルォロメチル)ベンズアミド 1ベンジルォ キシ 1ァスパラギン酸（図 2の化合物 14)の合成 [0039] [化 5]
Figure imgf000014_0001
[0040] 実施例 2— 1
図 1の化合物 6から図 2の化合物 12 ((2S，3S)-N-tert-ブトキシカルボニル -3-[3-ァク リルアミド -5-[4- (トリフルォロメチル)ベンズアミド]ベンジルォキシ]ァスパラギン酸ジ- tert-ブチルエステル）の合成
化合物 6 (20 mg, 0.042 mmol)とトリエチルァミン (17 μ L, 0.13 mmol)を塩化メチレン 5 mLに溶解し、氷冷下で塩化トリフルォロメチルベンゾィル (6.7 μ L， 0.042 mmol)の 塩化メチレン溶液 (2 mL)をゆっくり加えた。氷冷下で 15分攪拌した後、塩ィ匕アタリロイ ノレ (4.0 μ L, 0.050 mmol)を加えた。反応液をさらに 15分攪拌し、エーテルと飽和炭 酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を終結させた。有機層を飽和食塩水、 5%タエ ン酸水溶液、飽和食塩水の順に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留 去し得られた残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し (エーテル/へキサ ン = 1 / 3)、標題化合物 18.7 mg (2段階 63%)を得た。
[0041] 油状； 'H-NMR (CDC1 , 400 MHz) δ 1.41 (s, 18 H)， 1.49 (s, 9 H), 4.41 (d, 1 H, J
= 11.5 Hz), 4.45 (d, 1 H, J = 2.5 Hz), 4.79 (d, 2 H, J = 11.0 Hz), 5.38 (d, 1 H, J = 10.5 Hz), 5.76 (dd， 1 H, J = 1.0， 10.5 Hz), 6.25 (dd， 1 H, J = 10.5, 16.5 Hz), 6.40 ( dd， 1 H, J = 1.0, 16.5 Hz), 7.33 (s, 1 H)， 7.46 (s, 1 H)， 7.74 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 7. 75 (s, 1 H)， 7.96 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 8.03 (s, 1 H), 8.24 (s, 1 H). 実 例 2— 2
図 2の化合物 12から化合物 13 ((2S,3S)-N-tert-ブトキシカルボニル -3-[3-プロピオ ニルアミド -5-[4- (トリフルォロメチノレ)ベンズアミド]ベンジルォキシ] -ァスパラギン酸ジ -tert-ブチルエステノレ）の合成
化合物 12 (18 mg, 0.025 mmol)をメタノーノレ 2 mLに溶解し、 10%パラジウム炭素を 加えて、水素雰囲気下で 2時間攪拌した。触媒を濾去し、濾液を濃縮して標題化合 物 16.0 mg (89%)を得た。
[0042] 油状； 'H-NMR (CDC1 , 400 MHz) δ 1.23 (t， 3 H, J = 7.5 Hz), 1.42 (s, 9 H), 1.43
(s, 9 H)， 1.49 (s, 9 H), 2.37 (q, 2 H, J = 7.5 Hz), 4.40 (d, 1 H， J = 11.5 Hz), 4.45 ( d， 1 H, J = 2.5 Hz), 4.77 (d， 1 H, J = 10.0 Hz), 4.78 (dd， 1 H， J = 2.5, 10.0 Hz), 5.3 7 (d, 1 H， J = 10.0 Hz), 7.37 (s， 1 H)， 7.44 (s, 1 H), 7.66 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 7.90 (d， 2 H， J = 8.0 Hz), 7.81 (s 1 H), 8.13 (s, 1 H).
実 例 2— 3
図 2の化合物 13から化合物 14 ((2S,3S)-3-[3-プロピオニルアミド -5-[4- (トリフルォ ロメチル)ベンズアミド]ベンジルォキシ]ァスパラギン酸）の合成
ィ匕合物 13 (16.0 mg, 0.023 mmol)をクロ口ホルム 1 mLに溶解し、 TFA1 mLを加えて 室温で 18時間攪拌した。溶媒を留去し得られた残查にクロ口ホルムを加えて留去す る操作を 3回繰り返した。残渣を水に懸濁させて凍結乾燥を 2回繰り返し標題化合物 を TFA塩として 13.6 mg (98%)を得た。
[0043] アモルファス；1 H-NMR (D 0， 400 MHz) δ 1.05 (t, 3 H, J = 7.5 Hz), 2.29 (q, 2 H,
J = 7.5 Hz), 4.04 (d, 1 H, J = 3.0 Hz), 4.41 (d, 1 H, J = 3.0 Hz), 4.43 (d, 1 H, J = 1 1.5 Hz), 4.67 (d， 1 H， J = 11.5 Hz), 7.29 (s， 1 H)， 7.35 (s, 1 H), 7.85 (d, 2 H, J = 8. 0 Hz), 7.99 (s, 1 H), 8.06 (d, 2 H, J = 8.0 Hz).
?, 牛 牛の
グルタミン トランスポーター阴. '卜牛の洵
公知の方法 (Shimamoto, K. et al.， Mol. Pharmacol. 53, 195-201, 1998; Bioorg. Me d. Chem. Lett. 10, 2407-2410, 2000)に従い、恒常的に MDCK (Madin-Darby Canin e Kidney)細胞に発現させたヒト EAAT2または EAAT3において [14C]グルタミン酸の取 り込み阻害作用を測定した。グノレタミン酸取り込み活性は、 Ι μ Μの L-[ C]グルタミン 酸と所定の濃度の試料を加えて 12分間インキュベートした後細胞を溶解して、取り込 まれた放射活性を液体シンチレ一ターにより測定した。取り込み量は試験化合物が 存在しなレ、 (緩衝液のみ）場合を 100%とし、ナトリウムフリー溶液での取り込みの場合 を 0%とした％で表示し、 IC 値を求め表 1に示した。
[0044] [表 1] 表 1 二 よび対膨ヒ^ TOグルタミ 取り込み阻害
Figure imgf000016_0001
[0045] 実施例 4 カラムへの結合
調製例 1
所定量の Affi-Gel 10または Affi-Gel 15 (BioRad社)をグラスフィルター上に秤量し、 氷冷した無水 2-プロパノール、次いで反応溶媒（アルコール、ジメチノレスノレフイド（D MS〇)、ジォキサン、ホルムアミドで洗浄する。本発明品のリガンドを反応溶媒に溶解 し、 3級ァミン（トリエチルァミン、ジイソプロピルェチルァミンなど）を加えて pH 10-11 に調整する。膨潤したゲルとリガンド溶液を混合し、室温で数時間反応させる。過剰 のリガンドを洗浄して除去する。ゲルは 4度で保存する。
調製例 2
CNBr-活十生ィ匕セファロース (Sepharose)4B (Amersham Bioscience社)の所定量をグラ スフィルター上に秤量する。 1 mM HC1を用いて洗浄と膨潤を繰り返す。本発明のリガ ンドをカップリングバッファー（例えば 0.5 M NaClを含む 0.1 M NaHC03, pH 8.3)に 溶解する。このリガンドをゲル分散液と室温で 2時間または 4度で一夜混合する。次に ゲルをブロッキング斉 IJ、例えば 1 Mエタノールァミンまたは 0.2 Mグリシン、 H 8.0中 に導入する。このゲルをカップリング用バッファーおよび酢酸バッファー (0.5 M NaCl, 0.1 M AcOH, pH 4.0)にて洗浄し、過剰のリガンドおよびブロッキング剤を除去する。 ゲルは 4度で保存する。
産業上の利用可能性
本発明によれば、化学式 (1)で示される、光学活性 β -ベンジルォキシァスパラギン 酸のベンゼン環上に二つのアミノ基を有する誘導体およびその塩を、ァフィ二ティー カラムのリガンドもしくは蛋白検出用リガンドとして供することができる。

Claims

請求の範囲
式（1)の化合物、またはその塩：
Figure imgf000018_0001
ここで、式中 R1は置換基を有してもよい芳香族基であり；
置換基 R2は置換基を有してもよく鎖に窒素または酸素が挿入されていてもよい直鎖 若しくは分岐 C〜C 脂肪族基、置換基を有してもよい芳香族基から選択される基を
1 30
示す。
[2] 置換基 R2の末端がァミノ基で置換されている、請求項 1記載の化合物。
[3] 置換基 R2が脂肪族基であり、その鎖内に酸素原子と窒素原子を有している、請求 項 1または 2記載の化合物。
[4] 式（1)の化合物が (2S,3S)-3-(3-(6- (6- (2- (2-(2-(2- (2-アミノエトキシ)エトキシ)ェトキ シ)エトキシ)ァセトアミド)へキサンアミド) -へキサンアミド )_5_(4_ (トリフルォロメチル)ベ ンズアミド)ペンジノレオキシ)ァスパラギン酸である、請求項 1記載の化合物。
[5] 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の化合物からなる、ァフィ二ティーカラムリガン ド'。
[6] 請求項 4記載の化合物からなる、ァフィ二ティーカラムリガンド。
[7] 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の化合物からなる、蛍光検出用リガンド。
[8] 請求項 4記載の化合物からなる、蛍光検出用リガンド。
[9] 遊離のァミノ基と反応性であるカラム担体と、遊離のアミノ基を有するァフィ二ティー カラムリガンドとして請求項 1〜4のいずれか一項に記載の化合物とを結合させること によりァフィ二ティーカラムを調製し；
Lーグノレタミン酸トランスポーター蛋白を含む可能性がある生物学的サンプノレを、前 記ァフィ二ティーカラムに接触させ；
前記ァフィ二ティーカラムを洗浄し；そして
前記ァフィ二ティーカラムから L—グルタミン酸トランスポーター蛋白を溶出する； 工程からなる、生物学的試料中の L_グルタミン酸トランスポーター蛋白を精製する 方法。
[10] 請求項 4記載の化合物を前記ァフィ二ティーカラムリガンドとして用いる、請求項 9 記載の方法。
[11] 遊離のアミノ基を有する請求項 1〜4のいずれか一項に記載の化合物とピオチンを 結合させ、次に得られた結合物をアビジンカラムに保持させることによりカラムを調製 し；
Lーグノレタミン酸トランスポーター蛋白を含む可能性がある生物学的サンプノレを、前 記カラムに接触させ；
前記カラムを洗浄し;そして
前記カラムから L グルタミン酸トランスポーター蛋白を溶出する；
工程からなる、生物学的試料中の L グルタミン酸トランスポーター蛋白を精製する 方法。
[12] 請求項 4記載の化合物をカラムリガンドとして用いる、請求項 11記載の方法。
[13] 請求項:!〜 4のいずれか一項に記載の化合物とピオチンを結合させ、次に得られた 結合物を蛍光基または蛍光標識されたアビジンと結合させ；
L—グルタミン酸トランスポーター蛋白を含む可能性がある生物学的サンプルを、前 記結合物と接触させ;そして
前記サンプノレ中での前記ピオチンアビジン結合物との結合の有無を蛍光により検出 する；
工程からなる、 L—グノレタミン酸トランスポーター蛋白の蛍光による検出方法。
[14] 請求項 4記載の化合物を用いる、請求項 13記載の方法。
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