CN112638871A - 作为ep4受体拮抗剂的(r)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸 - Google Patents

作为ep4受体拮抗剂的(r)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸 Download PDF

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Abstract

以下发明涉及(R)‑4‑(1‑(1‑(4‑(三氟甲基)苄基)吡咯烷‑2‑甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其盐。还描述了用于获得化合物1的有利方法以及包含化合物1的药物组合物。(R)‑4‑(1‑(1‑(4‑(三氟甲基)苄基)吡咯烷‑2‑甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其药学上可接受的盐被描述为用于作为EP4受体拮抗剂在治疗涉及前列腺素E2(PGE2)在其发病机理中的活性的病状的中使用。

Description

作为EP4受体拮抗剂的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡 咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸
描述
发明领域
本发明描述了作为EP4受体的有效且选择性的拮抗剂的D-脯氨酸的新衍生物，以下式的化合物(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)
Figure BDA0002958202590000011
和其药学上可接受的盐，用于其制备的工艺，包含其的药物组合物，以及其作为用于治疗疾病的药物的用途，在所述疾病的发病机理中前列腺素E2(PGE2)通过它与EP4受体亚型的相互作用发挥基本作用。
发明的技术领域
EP4受体为7跨膜受体类型，其激活通常与环磷酸腺苷(cAMP)的增加的细胞内水平有关。
前列腺素E2(PGE2)通过激活的EP4受体作为细胞因子扩增系统例如白介素-6(IL-6)起作用，并且诱导促炎性T辅助淋巴细胞(Th)的分化和扩增(Yokoyama等人，Pharmacol.Rev.2013；65：1010-52)。
WO 2013/004290描述了作为EP4受体拮抗剂的环状氨基衍生物。特别地，在实施例7中，描述了4-(1-(6-(4-(三氟甲基)苄基)-6-氮杂螺[2.5]辛-5-甲酰胺)环丙基)苯甲酸(被称为E7)。作为简称为CR6086的对映异构体R的E7对于人EP4受体示出高的亲和力和选择性(KI 16.6nM)，在经刺激的cAMP PGE2的产生中作为纯拮抗剂起作用。在E7细胞培养的实验模型中，E7抑制作为类风湿性关节炎的介导物的重要细胞因子的作用：例如，它减少巨噬细胞中IL-6和血管内皮生长因子(VEGF)的表达、减少树突细胞中IL-23的释放、减少Th-17淋巴细胞中IL-17的释放。此外，在大鼠和小鼠的胶原性关节炎(CIA)的模型中，CR6086已经示出改善所诱导的关节炎的所有参数：组织病理学、炎症、疼痛(Caselli等人，ArthritisResearch&Therapy(2018)20:39)。
然而，CR6086通过如下方案1所示的复杂化学合成获得：
Figure BDA0002958202590000021
分析WO2013/004290和WO2011/006960中描述的这种合成，合成中间体CR6086，即以下(R)-6-(叔丁氧基羰基)-6-氮杂螺[2.5]辛烷-5-甲酸的制备的复杂性被清楚地示出：
Figure BDA0002958202590000022
如上文方案1中所指示，该合成依次由8个步骤组成：在从市售的哌啶-4-酮开始之后，将氨基基团用氯甲酸苄酯保护。在标准条件下，发生维蒂希反应以将酮转化为双键。使用二乙基锌将双键转化为环丙基，并且通过氢解除去胺上的保护基团。用碳酸叔丁酯酸酐对胺进行再保护，并且将所获得的中间体碳酸化以给出作为外消旋混合物的酸。外消旋体的拆分通过使用(R)-N-苄基-1-苯基乙烷-1-胺选择性沉淀作为盐的单一对映异构体来发生。最后，通过用HCl酸化外消旋体盐溶液，获得中间体(R)-6-(叔丁氧基羰基)-6-氮杂螺[2.5]辛烷-5-甲酸。
因此感到需要新的类似的EP4受体抑制剂，但其合成不太复杂。
因此，本发明的第一个目的是提供一种新的EP4受体的选择性拮抗药物，用于需要上文提及的受体的拮抗剂的疾病的药理学治疗，该新的EP4受体的选择性拮抗药物至少等同于CR6086，但同时该药物利用复杂程度低得多的合成途径可获得。
发明概述
上文指示的目的借助于D-脯氨酸的原始衍生物获得，所述D-脯氨酸的原始衍生物即具有以下结构的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)：
Figure BDA0002958202590000031
或其盐。
因此，本发明涉及化合物1，所述化合物1是EP4受体的强的拮抗剂。
此外，如从下文的描述中将明显的，本发明人已经通过两种合成程序制备化合物1，这两种合成程序克服用于制备CR6086的现有工艺的缺点。
因此，在另外的方面中，本发明涉及一种用于制备(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其盐的工艺，该工艺包括以下步骤：
a)在偶联剂的存在下，通过使(叔丁氧基羰基)-D-脯氨酸(N-Boc-D-脯氨酸)与4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯反应来形成酰胺(中间体P1)
Figure BDA0002958202590000041
b)用至少一种酸将中间体P1的Boc基团脱保护，以便获得中间体P2
Figure BDA0002958202590000042
c)在碱的存在下，用4-三氟甲基苄基溴将中间体P2烷基化，以便获得甲酯衍生物(中间体P3)；
Figure BDA0002958202590000043
以及
d)在强碱的存在下水解衍生的甲酯(中间体P3)，以便获得化合物1
Figure BDA0002958202590000044
上文说明的本发明的工艺由于其操作步骤的简单性以及还由于在步骤a)中使用N-Boc-D-脯氨酸两者结果是极其有利的，N-Boc-D-脯氨酸的商业成本比现有技术的中间体，即用于合成CR6086的(R)-6-(叔丁氧基羰基)-6-氮杂螺[2.5]辛烷-5-甲酸的商业成本低至少20倍。
在另外的方面中，本发明涉及用于制备(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其盐的另一种工艺，该工艺包括以下步骤：
a)在强碱的存在下，采用醇作为溶剂，用4-三氟甲基苄基溴将D-脯氨酸烷基化，以便获得中间体P4
Figure BDA0002958202590000051
b)在偶联剂的存在下，通过使中间体P4与4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯反应来形成酰胺(中间体P3)
Figure BDA0002958202590000052
和
c)在强碱的存在下水解中间体P3，以便获得化合物1
Figure BDA0002958202590000053
从合成的角度来看，这种制备化合物1或其药学上可接受的盐的工艺被证明是更有利的，该工艺提供了其合成步骤的进一步减少，在这种情况下从用4-(三氟甲基)苄基溴将D-脯氨酸直接烷基化开始，从而避免使用N-Boc-D-脯氨酸的保护和随后的脱保护。
在另外的方面中，本发明涉及用于作为药物使用的化合物1或其药学上可接受的盐，以及包含本发明的化合物1或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在又一方面中，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐，用于在治疗疾病中使用，在所述疾病的发病机理中前列腺素E2(PGE2)通过它与EP4受体亚型的相互作用发挥基本作用。
因此，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐，用于作为选择性EP4拮抗药物用于治疗疾病，在所述疾病的发病机理中前列腺素E2(PGE2)发挥基本作用。
因此，本发明的化合物1已经被证明能够抑制由EP4受体介导的前列腺素E2(PGE2)的活性。
因此，根据本发明，化合物1或其药学上可接受的盐是EP4受体的选择性拮抗药物，用于治疗选自由类风湿性关节炎、脊椎关节炎(诸如，例如银屑病关节炎和强直性脊柱炎)、由炎症引起的关节病以及急性和慢性疼痛诸如骨关节炎疼痛或具有免疫学病因的关节炎疼痛诸如类风湿性关节炎组成的组的病状(pathology)。
在另一个方面中，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐，用作肿瘤疾病中EP4的拮抗药物。在这种情况下，发明人假设化合物1可以以两种不同的、可选择的且伴随的方式起作用：1)恢复针对癌细胞的免疫应答，和2)抑制滋养肿瘤组织的血管生成。
在又一个方面中，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐在眼病的治疗中作为EP4受体的拮抗药物。在这些眼病中，可以提及早产儿视网膜病变(ROP)、增生性糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性(AMD)，它们具有作为共同病理学基础的眼部新血管形成，这在很大程度上与EP4受体的激活有关，并且它们是发达国家中失明的主要原因。
在又一个方面中，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐在子宫内膜异位症的治疗中作为EP4受体的拮抗药物。在这种情况下，该化合物是极其有利的，因为子宫内膜异位症是严重的慢性疾病，其在10％-20％的育龄妇女中导致不孕和慢性骨盆疼痛。
现在将结合以下详细描述和附图来描述本发明。
附图简述
本发明的特性和优点将从以下详细描述、从通过说明性且非限制性的实施例提供的实施方案以及从附图变得明显，在附图中：
图1表示实施例9的PGE2对由LPS诱导的TNFα释放的作用的逆转(处理之后1小时取样)；
图2示出实施例10的CIA水肿评价；以及
图3示出实施例10的CIA临床评价。
发明详述
因此，本发明涉及具有以下结构的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)：
Figure BDA0002958202590000071
或其盐。
因此，本发明涉及化合物1，所述化合物1是EP4受体的强的拮抗剂。
在另外的方面中，本发明涉及用于制备(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其盐的工艺，该工艺包括以下步骤：
a)在偶联剂的存在下，通过使(叔丁氧基羰基)-D-脯氨酸(N-Boc-D-脯氨酸)与4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯反应来形成酰胺(中间体P1)
Figure BDA0002958202590000081
b)用至少一种酸将中间体P1的Boc基团脱保护，以便获得中间体P2
Figure BDA0002958202590000082
c)在碱的存在下，用4-三氟甲基苄基溴将中间体P2烷基化，以便获得甲酯衍生物(中间体P3)
Figure BDA0002958202590000083
和
d)在强碱的存在下水解衍生的甲酯(中间体P3)，以便获得化合物1
Figure BDA0002958202590000084
优选地，在步骤a)中，4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯如在WO 2013/004290中所描述的制备，并且偶联剂优选地为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
特别地，步骤a)提供在HOBt、EDCl和TEA的存在下，持续24小时，在D-N-Boc脯氨酸和4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯之间形成酰胺；依次用NaHCO3的饱和溶液、NH4Cl的饱和溶液并且最后用水洗涤有机相；脱水并蒸发溶剂，通过用环己烷/乙酸乙酯梯度(100:0；25/75)洗脱的硅胶色谱法纯化产物。
在步骤b)中，所述至少一种酸优选地为2,2,2-三氟乙酸。
特别地，步骤b)提供用三氟乙酸将Boc基团脱保护，并且随后在离子交换树脂上释放盐。
在步骤c)中，碱优选地是碳酸铯。
特别地，步骤c)包括在Cs2CO3的存在下用4-(三氟甲基)苄基溴烷基化持续24小时；随后用4.5％的NaCl溶液洗涤，脱水并蒸发溶剂；使用正庚烷作为共溶剂，借助于沉淀来纯化溶解在DCM中的残余物；随后通过用DCM/乙酸乙酯梯度(从100/0至85/15)洗脱的硅胶上的快速色谱法纯化滤液。
在步骤d)中，强碱优选地为氢氧化钠。在步骤d)中，强碱优选地为氢氧化钠。步骤d)优选地在水可混溶的有机溶剂混合物中发生，更优选地水可混溶的有机溶剂是四氢呋喃(THF)。特别地，步骤d)提供在NaOH的存在下水解甲酯，随后通过仅用水和然后用甲醇洗脱的反相色谱法纯化，以给出呈钠盐的形式的化合物1。
如所指示的，上文说明的本发明的工艺不仅由于其操作步骤的简单性并且还由于所使用的确实低成本的试剂而结果是极其有利的。
在另外的方面中，本发明涉及用于制备(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其盐的另一种工艺，该工艺包括以下步骤：
a)在强碱的存在下，采用醇作为溶剂，用4-三氟甲基苄基溴将D-脯氨酸烷基化，以便获得中间体P4
Figure BDA0002958202590000091
b)在偶联剂的存在下，通过使中间体P4与4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯反应来形成酰胺(中间体P3)
Figure BDA0002958202590000101
和
c)在强碱的存在下水解中间体P3，以便获得化合物1
Figure BDA0002958202590000102
在步骤a)中，碱优选地是氢氧化钾，并且醇是2-丙醇。
特别地，步骤a)由以下组成：在强碱的存在下，使用醇优选地2-丙醇作为溶剂，用4-三氟甲基苄基溴将D-脯氨酸烷基化；通过用含水HCl处理并且随后过滤来回收产物，并且通过用丙酮和叔丁基醚作为共溶剂处理进行纯化。
在步骤b)中，4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯优选地如在WO2013/004290中所描述的制备，并且偶联剂优选地为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
特别地，步骤b)提供在溶解于DCM溶液中的羟基苯并三唑水合物、TEA、EDCl的存在下，在根据先前步骤a)制备的4-(三氟甲基)苄基)-D-脯氨酸和4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯盐酸盐之间形成酰胺；用NaHCO3的饱和溶液洗涤有机相，并且最后用水洗涤有机相，脱水并蒸发溶剂，通过用甲基叔丁基醚处理和沉淀来纯化和回收由此形成的化合物(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸甲酯。
在步骤c)中，强碱优选地为氢氧化钠。步骤c)优选地在水可混溶的有机溶剂混合物中发生，更优选地水可混溶的有机溶剂是四氢呋喃(THF)。
在步骤c)中，特别地，根据先前点b)中描述的由此获得的甲酯的水解和化合物1的回收根据第一工艺的点d)中描述的连续地发生。
如上文指示的，从合成的角度来看，这种化合物的制备工艺被证明是更有利的，该工艺提供其合成通路(passage)的进一步减少，在这种情况下从用4-(三氟甲基)苄基溴将D-脯氨酸直接烷基化开始，从而避免使用N-Boc-D-脯氨酸的保护和随后的脱保护。
在一个有利的方面中，化合物1呈盐的形式，优选地呈药学上可接受的盐的形式，更优选地作为盐酸盐或锂盐或钠盐。
在另外的有利的方面中，化合物1呈两性离子的形式。
在另一个方面中，本发明涉及用于作为药物使用的化合物1或其药学上可接受的盐，以及包含本发明的化合物1或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在又一方面中，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐用于在治疗疾病中使用，在所述疾病的发病机理中前列腺素E2(PGE2)通过它与EP4受体亚型的相互作用发挥基本作用。
因此，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐用于作为选择性EP4拮抗药物用于治疗疾病，在所述疾病的发病机理中前列腺素E2(PGE2)发挥基本作用。
因此，根据本发明，化合物1或其药学上可接受的盐是EP4受体的选择性拮抗药物，用于治疗选自由类风湿性关节炎、脊椎关节炎(诸如，例如银屑病关节炎和强直性脊柱炎)、由炎症引起的关节病以及急性和慢性疼痛诸如骨关节炎疼痛或具有免疫学病因的关节炎疼痛诸如类风湿性关节炎组成的组的病状。
在另一个方面中，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐，用作肿瘤疾病中EP4的拮抗药物。在这种情况下，发明人假设化合物1可以以两种不同的、可选择的且伴随的方式起作用：1)恢复针对癌细胞的免疫应答，和2)抑制滋养肿瘤组织的血管生成。
在又一个方面中，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐在眼病的治疗中作为EP4受体的拮抗药物。在这些眼病中，可以提及早产儿视网膜病变(ROP)、增生性糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性(AMD)，它们具有作为共同病理学基础的眼部新血管形成，这在很大程度上与EP4受体的激活有关，并且它们是发达国家中失明的主要原因。
在又一个方面中，本发明涉及化合物1或其药学上可接受的盐在子宫内膜异位症的治疗中作为EP4受体的拮抗药物。在这种情况下，该化合物是极其有利的，因为子宫内膜异位症是严重的慢性疾病，其在10％-20％的育龄妇女中导致不孕和慢性骨盆疼痛。
下文通过非限制性实施例的方式给出本发明的实施方案的另外的实施例。
实施例
以下实施例中使用的试剂购自各个供应商，并且在不进一步纯化的情况下使用。溶剂以无水形式使用。无水环境中的反应在N2的正压下进行。
质子核磁共振光谱(1H NMR)在仪器Bruker Avance 400MHz上记录。使用残余溶剂线作为内标，以ppm(δ)报告化学位移。信号(sign)的多样性被指定为：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，扩展的信号。
使用Acquity UPLC-BEH的C18柱(1.7μM,50×2.1mm)，在仪器Waters AcquityUPLC-SQD上进行UPLC-Massa光谱。
硅胶上的快速色谱法使用SNAP HP Biotage二氧化硅柱体在Biotage自动快速色谱法系统(Sp1和Isolera系统)上进行。反相色谱法使用RediSep Gold C-18Aq柱体在Biotage(Isolera)自动快速色谱法系统上进行。
SPE-SCX柱体是用于固相提取的离子交换柱。
旋光率(rotatory power)用Autopol V旋光计(Rudolph Sci.)测量。
此处使用以下缩写：
NH4Cl：氯化铵；NaHCO3：碳酸氢钠；Cs2CO3：碳酸铯；NaOH：氢氧化钠；KOH：氢氧化钾；TEA：三乙胺；NH3：氨；HCl：盐酸；EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；Na2SO4：硫酸钠；DCM：二氯甲烷；EtOH：乙醇；MeOH：甲醇；IsOH：2-丙醇；THF：四氢呋喃；t.a.：室温。
实施例1:
通过本发明的第一工艺来制备化合物1
制备1：(R)-2-((1-(4-(甲氧基羰基)苯基)环丙基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-甲酸叔 丁酯(中间体P1)的制备。
将N-羟基苯并三唑水合物(25.6g,167mmol)和EDC(40.1g,209mmol)添加至(叔丁氧基羰基)-D-脯氨酸(30g,139mmol)在DCM(550ml)中的溶液，并且将混合物在室温搅拌持续1小时。此后，添加4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯盐酸盐(33.0g,145mmol)和TEA(26.2ml,188mmol)。将反应搅拌持续24小时。当反应完成时，添加水(350mL)，并且将两相搅拌持续约10分钟。将有机相从水相中分离，并且依次用NaHCO3的饱和溶液(300ml)、NH4Cl的饱和溶液(300ml)洗涤，并且最后用300mL的水洗涤。
有机相用Na2SO4干燥并浓缩，以获得淡黄色固体，其通过具有环己烷/乙酸乙酯梯度(100:0；25/75)的硅胶上的快速色谱法纯化，提供期望的化合物(49.5g；收率88％)。(中间体P1)。
MS:(ES/+)m/z:389[MH-]
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm:7.94(2H,d,J＝8.31Hz),7.73(1H,br.s.),7.23(2H,d,J＝7.83Hz),4.29(1H,br.s.),3.91(3H,s),3.45(2H,br.s.),1.77-2.53(4H,m),1.47(9H,br.s),1.29-1.42(4H,m)。
制备2：(R)-4-(1-(吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸甲酯(中间体P2)的制备
将(R)-2-((1-(4-(甲氧基羰基)苯基)环丙基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(49.5g,122mmol)溶解在DCM(400mL)中，并且将混合物冷却至0℃，然后添加2,2,2-三氟乙酸(80mL,1038mmol)。使反应达到室温并且然后搅拌持续3小时。蒸发溶剂，并且将粗制残余物装载到SPE-SCX柱体(150g)上，首先仅用MeOH洗脱，并且然后用在MeOH中的1M NH3洗脱。蒸发含有氨的级分，以获得期望的残余固体(30.9g，收率88％)。(中间体P2)。
MS:(ES/+)m/z:289
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm8.62(1H,s),7.80-7.91(2H,m),7.17-7.27(2H,m),3.83(3H,s),3.49-3.58(1H,m),2.77-2.92(3H,m),1.91-2.03(1H,m),1.56-1.74(3H,m),1.17-1.34(4H,m)。
制备3：(R)-4-(1-(1-(4-三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸甲酯 (中间体P3)的制备
将(R)-4-(1-(吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸甲酯(29.6g,103mmol)溶解在THF(500ml)中。依次添加Cs2CO3(57.2g,176mmol)和4-(三氟甲基)苄基溴(16.82ml,109mmol)，并且将混合物在室温搅拌持续24小时。蒸发THF，并且将残余物在DCM(250ml)和水(250ml)之间分配，并且将所得到的混合物剧烈搅拌持续约10分钟。将有机相从水相中分离，并且用4.5％的NaCl溶液(250ml)洗涤两次，经Na2SO4干燥并浓缩，以获得白色固体(46.5g)，向该白色固体添加DCM(100mL)，并且加热至约40℃，直到完全溶解。此时，使溶液达到室温，然后添加正庚烷(500mL)以获得白色沉淀物，然后该白色沉淀物被过滤并且在50℃干燥持续24小时，以获得期望的化合物(50g；收率：89％)。(中间体P3)。
MS:(ES/+)m/z:447
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.47(1H,s),7.77-7.85(2H,m),7.66-7.71(2H,m),7.58-7.65(2H,m),7.14(2H,d,J＝8.31Hz),3.78-3.90(4H,m),3.66(1H,d,J＝13.20Hz),3.11(1H,dd,J＝9.05,4.65Hz),2.98-3.05(1H,m),2.34-2.42(1H,m),2.05-2.20(1H,m),1.70-1.87(3H,m),1.15-1.32(2H,m),0.98-1.15(2H,m)。
制备4：(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸(化 合物1)的钠盐的制备。
将(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸甲酯(40.95g,92mmol)(中间体P3)溶解在THF(450ml)和水(250ml)的混合物中，然后添加NaOH(4.40g,110mmol)。将发白的悬浮液在室温搅拌持续24小时。蒸发有机溶剂，并且将残余物装载到RediSep Gold C-18Aq柱上，首先仅用水(2柱体积)洗脱，并且最后用MeOH(3柱体积)洗脱。浓缩含MeOH的级分，并且将所得到的残余固体在60℃在真空下干燥，以给出35.5g的化合物1的钠盐(84％收率)。
C23H22F3N2NaO3
MS:(ES/+)m/z:433[MH-]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.38(1H,s),7.65-7.77(4H,m),7.56-7.64(2H,m),6.87-7.01(2H,m),3.86(1H,d,J＝13.20Hz),3.64(1H,d,J＝13.69Hz),3.09(1H,dd,J＝9.05,4.65Hz),2.94-3.04(1H,m),2.29-2.41(1H,m),2.03-2.19(1H,m),1.69-1.86(3H,m)。
比旋光率(specific rotatory power)：(α)D20，在H2O中1％＝30.2°。
实施例2:
通过本发明的第二工艺来制备化合物1
制备1：(4-(三氟甲基)苄基)-D-脯氨酸(中间体P4)的制备
将50g(0.43摩尔)的D-脯氨酸添加至溶解于500ml的2-丙醇中的73g(1.3摩尔)的氢氧化钾的溶液，并且随后分批地添加溶解于300ml的2-丙醇中的74ml的4-(三氟甲基)苄基溴(0.477摩尔)；将溶液在50℃在搅拌下反应持续12小时。随后将溶液冷却至0℃，并且用含水的32％HCl将pH调节至约4±1。将所形成的沉淀的固体过滤，用少量2-丙醇洗涤，溶解在丙酮中，热过滤，并且通过添加甲基叔丁基醚再沉淀，以在过滤和干燥之后获得期望的化合物(99g；83％收率)。(中间体P4)。
MS:(ES/+)m/z:274
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 11.66(vbs),7.69(2H,d),7.59(2H,d),4.07(1H,d),3.68(1H,d),3.25-3.32(1H,m),2.93(1H,ddd),2.39-2.48(1H,m),2.10(1H,dq),1.67-1.92(3H,m)。
制备2：(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸甲酯 (中间体P3)的制备
在氮气流下，向溶解于600ml的DCM中的26g(95.4mmol)的4-(三氟甲基)苄基)-D-脯氨酸和N-羟基苯并三唑水合物(17.6g,114mmol)的溶液添加80ml的TEA(570mmol)和20g(105mmol)的EDCl。使反应混合物在搅拌下持续约6小时，然后添加24g(105mmol)的4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯盐酸盐，并且然后在室温始终在搅拌下反应持续另外24小时。当反应完成时，添加水(500mL)，并且将两相搅拌持续约10分钟。将有机相从水相中分离，并且依次用NaHCO3的饱和溶液(400ml)洗涤，并且最后用400mL的水洗涤。有机相用Na2SO4干燥并浓缩，以获得奶油色固体。将该固体悬浮在1升的甲基叔丁基醚中，加热至沸腾，热过滤，并且将由此获得的澄清溶液在真空下浓缩至干燥，以获得白色固体，然后将该白色固体在50℃干燥持续24小时，以获得期望的化合物(32.5g；收率：75％。(中间体P3)。
MS:(ES/+)m/z:447
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm7.80-8.01(3H,m),7.62(2H,d),7.41(2H,d),7.12-7.24(2H,m),3.86(4H,s),3.66(1H,d),3.27(1H,dd),3.07-3.18(1H,m),2.46(1H,td),2.21-2.38(1H,m),1.70-2.03(3H,m),1.05-1.44(4H,m)。
制备3：(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸(化 合物1)的钠盐的制备。
将(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸甲酯(40.95g,92mmol)(中间体P3)溶解在THF(450ml)和水(250ml)的混合物中，然后添加NaOH(4.40g,110mmol)。将发白的悬浮液在室温搅拌持续24小时。蒸发有机溶剂，并且将残余物装载到RediSep Gold C-18Aq柱上，首先仅用水(2柱体积)洗脱，并且最后用MeOH(3柱体积)洗脱。浓缩含MeOH的级分，并且将所得到的残余固体在60℃在真空下干燥，以获得35.5g的化合物1的钠盐(84％收率)。
C23H22F3N2NaO3
MS:(ES/+)m/z:433[MH-]
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.38(1H，s)，7.65-7.77(4H，m)，7.56-7.64(2H，m)，6.87-7.01(2H，m)，3.86(1H，d，J＝13.20Hz)，3.64(1H，d，J＝13.69Hz)，3.09(1H，dd，J＝9.05，4.65Hz)，2.94-3.04(1H，m)，2.29-2.41(1H，m)，2.03-2.19(1H，m)，1.69-1.86(3H，m)。
比旋光率：(α)D20，在H2O中1％＝30.2°。
实施例3
(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸(化合物1两性离子)的制备。
将1.7ml(29.4mmol)的乙酸添加至溶解于80ml的H2O中的6.1g(13.4mmol)的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸的钠盐的溶液，并且用80ml的DCM萃取该溶液两次。将合并的有机相用H2O洗涤，并且然后经Na2SO4干燥，并在真空下浓缩，以获得具有无定形外观的浅奶油色固体(5.7g；收率96％)。
C23H23F3N2O3。
MS：(ES/+)m/z：433
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.68(1H，br.s.)，8.45(1H，s)，7.76-7.83(2H，m)，7.65-7.72(2H，m)，7.58-7.65(2H，m)，7.08-7.17(2H，m)，3.86(1H，d，J＝13.69Hz)，3.66(1H，d，J＝13.20Hz)，3.12(1H，dd，J＝9.29，4.40Hz)，2.97-3.06(1H，m)，2.34-2.43(1H，m)，2.05-2.19(1H，m)，1.71-1.86(3H，m)，1.15-1.30(2H，m)，0.97-1.14(2H，m)
比旋光率：(α)D20，在甲醇中1％＝28.9°。
实施例4
(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸(化合物1HCl)的制备。
将HCl 1N(30mL，30mmol)添加至溶解于300ml的丁-2-酮中的7g(16.2mmol)的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸(化合物1“两性离子”)的溶液。将反应混合物搅拌持续12小时，并且将在悬浮液中形成的白色沉淀物过滤，并且在60℃在真空下干燥，以获得5.8g的化合物1的盐酸盐(收率85％)。
C23H23F3N2O3*HCl。
MS:(ES/+)m/z:433
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm7.89-7.97(2H,m),7.70-7.83(4H,m),7.18(2H,d,J＝8.31Hz),4.45-4.60(2H,m),4.28(1H,dd,J＝9.05,6.60Hz),3.68-3.79(1H,m),3.39-3.49(1H,m),2.61-2.75(1H,m),2.22-2.35(1H,m),2.01-2.15(2H,m),1.19-1.38(2H,m),1.13(1H,ddd,J＝10.51,6.85,5.14Hz),0.89-1.00(1H,m)
比旋光率：(α)D20，在H2O中1％＝18.3°。
实施例5
(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸的锂盐的制备。
将1.4g(33.1mmol)的氢氧化锂一水合物添加至溶解于50％H2O-二氧六环的混合物中的8g(18mmol)的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸甲酯的溶液。使溶液在搅拌下持续6小时，并且然后在真空下蒸发二氧六环；将残余物装载到Biotage C-18柱上，首先仅用水(2柱体积)洗脱，并且最后用MeOH(3柱体积)洗脱。浓缩含MeOH的级分，并且将所得到的固体在60℃在真空下干燥，以获得6.9g的化合物1的锂盐(收率88％)。
C23H22F3N2LiO3
MS:(ES/+)m/z:433
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 7.88-7.83(m,2H),7.66-7.62(m,2H),7.60-7.55(m,2H),7.16-7.10(m,2H),3.87-3.72(m,2H),3.18(dd,J＝4.4,9.8Hz,2H),2.55-2.44(m,1H),2.32-2.20(m,1H),1.89(br s,3H),1.35-1.25(m,1H),1.22-1.15(m,1H),1.11-1.04(m,1H),0.99-0.90(m,1H)。
实施例6参考化合物，即(S)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸(化合物2)的钠盐的制备。
化合物2根据本发明的第一工艺制备，因此遵循实施例1中描述的包括量和试剂的整个工艺，但是这次从(叔丁氧基羰基)-L-脯氨酸开始而不是从(叔丁氧基羰基)-D-脯氨酸开始。
C23H22F3N2NaO3。
MS:(ES/+)m/z:433
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.38(s,1H),7.75-7.66(m,4H),7.64-7.56(m,2H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),3.86(d,J＝13.2Hz,1H),3.63(d,J＝13.2Hz,1H),3.13-3.07(m,1H),3.03-2.96(m,1H),2.40-2.31(m,1H),2.19-2.05(m,1H),1.87-1.69(m,3H),1.21-1.06(m,2H),1.05-0.91(m,2H)
比旋光率：(α)D20，在H2O中1％＝-28.5°。
药理学评价
实施例7
与人EP4受体结合的研究。
实验根据由Abramovitz等人(Biochemica and Biophysica Acta；1483,285-293,2000)描述的程序进行。
组织准备：
由HEK293细胞(人胚胎肾293)稳定表达的携带人EP4受体的细胞膜被如下所描述的制备。在除去培养基(DMEM，补充有Glutamax I并含有10％的胎牛血清和10μg/ml的杀稻瘟菌素(blasticidin))之后，用10ml的低渗裂解缓冲液(TRIS-Cl 5mM+EDTA5mM-pH 7.4)进行细胞单层的洗涤。然后从生长容器(150cm2烧瓶)中分离在37℃以5％CO2在上文提及的培养基中粘附生长的细胞，并且通过添加20ml的新鲜裂解缓冲液的机械作用进行裂解。将裂解物搅拌持续30秒，并且在4℃以40000×g离心持续22分钟。将最终的球团(pellet)在-80℃储存直到使用。在结合实验时，将膜解冻并重新悬浮在分析缓冲液(10mM MES-KOH pH6，含有10mM的MgCl2和1mM的CaCl2)中，以获得1mg蛋白质/ml的浓度。使用牛血清白蛋白作为标准品来确定膜悬浮液的蛋白质含量。
结合测试：
在实验中，在不存在或存在不同浓度的待测试的化合物的情况下，将10μl等分试样的膜与1nM浓度的放射性配体[3H]-前列腺素E2(PGE2)一起孵育。非特异性结合在1μM的PGE2的存在下确定。在96深孔微孔板中进行的以0.1ml的最终体积的孵育在25℃进行持续90分钟。通过使用Unifilter GFB玻璃纤维过滤微孔板在真空下快速过滤进行游离的放射性配体与结合至受体的放射性配体的分离，该Unifilter GFB玻璃纤维过滤微孔板用溶解在分析缓冲液中的0.3％的聚乙烯-亚胺预润湿，随后用冷缓冲液(50mM HEPES，NaCl500mM，BSA0.1％，pH 7.4)洗涤3次。然后将过滤盘在30℃干燥，向各个过滤盘添加0.05ml的Microscint-20闪烁液(Perkin Elmer)，并且最后在稳定至少一小时之后测量存在的放射性。
使用“非线性曲线拟合”程序(Graph Pad，第7版，用于Windows)分析化合物/放射性配体竞争曲线，该程序允许计算每种评价的化合物的IC50值(在实验中(underexamination)能够抑制50％的放射性配体与受体结合的浓度)。
结果：由此获得的结果被表示为IC50值，并且在下表1中示出。
表1：与重组人EP4受体结合。
Figure BDA0002958202590000201
从表中示出的数据可以看出，化合物1和CR6086两者如何在抑制与EP4受体的结合方面展示出强的活性；化合物1示出对PGE2配体的结合的抑制活性，该抑制活性实际上与用比较化合物CR6086获得的抑制活性相同。发明人注意到并认为有趣的是，化合物1的EP4拮抗剂活性是立体特异性的，因为化合物2(其为化合物1的参考“S形式”对映异构体，即(S)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基)苯甲酸)在抑制PGE2配体与人EP4受体的结合方面活性低约50倍。
实施例8:
转染有人EP4受体的CHO细胞中cAMP的确定(功能性测试)。
方法：对化合物1在转染有人EP4受体的CHO细胞中表达的人EP4受体中的激动剂和拮抗剂活性的评价通过测量化合物1在不存在和存在内源性激动剂PGE2的情况下对cAMP产生的作用来确定。
将CHO细胞悬浮在添加有HEPES 20mM(pH 7.4)和IBMX 500mM的HBSS缓冲液(Invitrogen)中，然后以每孔20000个细胞的密度分布在微孔板中，并且在室温在不存在(对照)或存在所检查的化合物的情况下孵育持续10分钟。作为激动剂活性的参考对照，将1μM的PGE2添加至独立剂量孔中。在评价拮抗作用的情况下，将参考激动剂PGE2替代地添加到30nM的最终浓度。在室温孵育10分钟之后，将细胞裂解，并且添加荧光受体(cAMP标记的D2)和荧光供体(用铕穴状化合物标记的抗cAMP抗体)。在室温60分钟之后，使用微孔板读取器(Envison,Perkin Elmer)在337nm的激发波长以及在620nm和665nm的发射波长处测量荧光转移。通过将在665nm处测量的信号除以在620nm处测量的信号(比率)来确定cAMP浓度。在评价激动剂作用的情况下，结果被表示为以1μM的PGE2的对照响应的百分比，而在评价拮抗剂作用的情况下，结果被表示为以30nM的PGE2的对照激动剂的响应的抑制百分比。为了确定拮抗剂活性，表观解离常数(Kb)通过应用修改的Cheng Prusoff方程(Kb＝IC50/(1+A/EC50A))来计算；其中A＝参考激动剂PGE2的浓度，并且EC50A＝参考激动剂的EC50值。
结果：
功能性cAMP测试示出，化合物1是人EP4受体的纯拮抗剂(Kb值：15nM化合物1相对于7.8nM CR6086)，没有激动剂型活性。
化合物1
激动剂作用：无活性直至10-6M
拮抗剂作用：IC50＝1.6×10-7M；Kb＝1.5×10-8M
CR6086
激动剂作用：无活性直至10-6M
拮抗剂作用：IC50＝8.2×10-8M；Kb＝7.8×10-9M
实施例9:
离体功能性测试:在大鼠中评价与CR6086(30mg/kg)相比化合物1(30mg/kg)对EP4受体的占据
方法：通过在大鼠全血中存在的并表达EP4受体的细胞，来评价由内毒素脂多糖(来自大肠杆菌(E.coli))诱导并通过增加PGE2的浓度调节的细胞因子TNFα的释放。如从文献中已知的，PGE2通过抑制它来调节这种释放，并且对EP4受体具有选择性的所测试的化合物，如果在它们被摄取后存在于血液中，将与受体结合，防止PGE2抑制细胞因子的释放。调节TNFα释放的这种逆转作用可以被认为是对EP4受体的拮抗作用(antagonism)的生物标志(biomarker)。
使用称重250-275g的雄性Wistar大鼠(Charles River,意大利)，它们用媒介物或化合物1(30mg/kg)或CR6086(30mg/kg)进行口服处理。每个处理组由6只动物组成。
大鼠全血中离体作用的测量：
在所检查的化合物施用之后一小时评价该化合物的受体占据的作用，并且与在存在单独的媒介物的情况下测量的作用进行比较。在用异氟烷进行气体麻醉之后，从腹主动脉获取血液并转移到包含肝素(0.1-0.2U/ml)的管。然后取0.4ml血液等分试样，并且分配到一系列试管中，这些试管在37℃预热持续10分钟。向样品添加LPS(0.1μg/ml最终浓度)，其代表测试对照，或LPS混合物(0.1μg/ml最终浓度)+各种浓度的PGE2。在代表细胞因子的基础释放的样品中，由无菌磷酸盐缓冲液(PBS)替代LPS。将样品在37℃孵育持续4小时，然后添加40μl的10mM EDTA，并将样品转移到冰中。然后将样品在4℃以1500×g离心持续10分钟，并且移除由此获得的血浆，并且在-80℃储存，直到给药时。血浆中TNFα的含量借助于特定的商业试剂盒来测量。
针对每只经处理的动物和每种实验条件计算TNFα的最终浓度，从中获得与仅包含LPS的样品相比由于增加PGE2的浓度而导致的抑制百分比。细胞因子释放基线值结果低于由制造商所指示的ELISA测定灵敏度限值。因此，IC50值根据该抑制曲线计算。对于每个处理组，构建PGE2抑制曲线(抑制的平均值±SD相对于PGE2浓度)，如图1中所示。对不同处理组中仅存在LPS的样品的平均TNFα值进行分析，以验证所检查的化合物的可能的固有作用。由此获得的结果在图1中图示出。
如在图1中可以看到的，如所预期的，增加PGE2的浓度(范围10-1000nM)以浓度依赖性的方式抑制TNFα的释放。在用CR6086或化合物1处理之后，由于选择性受体拮抗剂的存在，观察到PGE2的作用的统计学上显著的逆转(**p<0.01相对于媒介物组；双向ANOVA)。针对每个具有化合物的处理组计算的PGE2的IC50值明显高于在用媒介物处理之后计算的值，这表明由于拮抗剂的存在的相同的PGE2效力变化(power shift)。在由这两种化合物引起的作用之间没有观察到差异，并且两者本身对TNFα的释放均没有示出显著的作用(在不存在PGE2的情况下)。
实施例10:
小鼠的胶原性关节炎(CIA):在小鼠的类风湿性关节炎的模型中与CR6086相比的 化合物1的作用
方法：通过皮内注射在弗氏完全佐剂(CFA)中乳化的异源胶原在小鼠中诱导关节炎。所发展的关节炎的特征为关节软骨的明显破坏，伴有免疫复合物沉积、滑膜炎和关节周围炎症。胶原充当抗原，并且诱导涉及T淋巴细胞和B淋巴细胞两者的免疫应答，其中产生抗胶原抗体。使用该实验模型在小鼠中进行的研究允许识别许多参与人类风湿性关节炎的发病机理的细胞因子和趋化因子。在用异氟烷/O2进行气体麻醉之后，成年雄性DBA/1小鼠通过在尾部的基部处皮内注射100μl的乳液进行免疫，所述乳液含有在CFA中的200μg的II型牛胶原。CFA又包含悬浮在石蜡油和二缩甘露醇一油酸(mono-oleate mannide)的混合物中的3mg/ml的结核分枝杆菌。一组未免疫的动物用作健康对照组。在病状的第一临床症状诸如后爪和前爪的水肿和发红开始时，将小鼠纳入研究。在自诱导病状起的不同时间，通过根据以下量表分配临床评分来评估病状的程度：0＝正常，1＝脚踝的轻微发红和肿胀，2＝明显的水肿，3＝严重的水肿和强直；然后添加分配给每只爪的临床评分值。还使用厚度计(micro-guage)测量4只爪的体积并对其求和。在研究结束时，处死动物，并且取4只爪，固定在10％福尔马林中，并且加工用于组织学分析。使用光学显微镜分析制品，以评估软骨和骨的降解、炎性细胞浸润和滑膜炎症。为此目的，分配评分以量化所评价的个体参数的严重程度。如果待测试的药物能够通过减少水肿、降低临床评分和减少对关节的组织损伤来对抗疾病的进展，则所述待测试的药物被认为有效。溶解在蒸馏水中的化合物1(45-90mg/kg)和CR6086(30mg/kg)在病状的进展期间口服施用持续16天。
统计学分析.值被表示为组平均值±标准误差，并且使用GraphPad Prism软件6.0版进行分析。采用在最终处理之后第16天，24小时获取的不同测量值进行统计学分析。进行ANOVA单向方差分析，随后进行Dunnett检验，用于水肿值的多重比较。为了分析临床评分值和组织病理学评分值，借助于ANOVA-Kruskall-Wallis非参数检验分析4只爪的评分总和，随后进行Dunn检验用于多重比较。对于所进行的统计学分析，低于P＝0.05的值被认为是显著的。
结果：
评价以45mg/kg和90mg/kg的剂量口服施用的化合物1对小鼠的胶原诱导的关节炎的进展的治疗作用。在16天的药物处理中，化合物1显著地且以剂量依赖性方式减少病状的演化(evolution)。由此获得的结果图示地总结在图2和图3中，图2示出了CIA水肿评价，图3报告了CIA临床评价。
这种作用存在于所有分析的参数中，即水肿(***P<0.001相对于媒介物；Dunnett检验)、临床和组织病理学评分(*P<0.05，***P<0.001相对于媒介物；Dunnett检验)。
将与水肿(图2)和临床评分(图3)相关的结果与在类似研究中针对以30mg/kg剂量的选择性EP4拮抗剂CR6086获得的结果进行比较，以45mg/kg剂量的化合物1对临床症状(爪的肿胀)的逆转存在更大的作用。该结果允许得出这样的结论：以相同剂量的两种化合物可以对小鼠的关节炎的进展表现出相同强的治疗活性。
实施例11
药代动力学
向Wistar大鼠施用的化合物1展示出优异的口服生物利用度。事实上，当以5mg/kg的剂量施用时，化合物1呈现出4270ng/ml的CMAX和5460ngxh/ml的AUC(0-24h)。4270ng/ml的CMAX浓度相当于约9000nM的血浆浓度，即比从表1中可获得的IC50值大约200倍的浓度。该结果充分证明化合物1在图2中所示的CIA模型中抑制炎症(爪的肿胀)方面的活性。

Claims (20)

1.(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)，具有以下结构：
Figure FDA0002958202580000011
或其盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述盐是钠盐。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述盐是锂盐。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述盐是盐酸盐。
5.一种用于制备根据权利要求1-4中任一项所述的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其盐的工艺，包括以下步骤：
a)在偶联剂的存在下，通过使(叔丁氧基羰基)-D-脯氨酸(N-Boc-D-脯氨酸)与4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯反应来形成酰胺(中间体P1)
Figure FDA0002958202580000012
b)用至少一种酸将所述中间体P1的Boc基团脱保护，以便获得中间体P2
Figure FDA0002958202580000021
c)在碱的存在下，用4-三氟甲基苄基溴将所述中间体P2烷基化，以便获得甲酯衍生物(中间体P3)
Figure FDA0002958202580000022
和
d)在强碱的存在下水解衍生的甲酯(中间体P3)，以便获得所述化合物1
Figure FDA0002958202580000023
6.根据权利要求5所述的工艺，其中步骤a)的所述偶联剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
7.根据权利要求5或6所述的工艺，其中在步骤b)中，所述至少一种酸是2,2,2-三氟乙酸。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的工艺，其中在步骤c)中，所述碱是碳酸铯。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的工艺，其中在步骤d)中，所述强碱是氢氧化钠。
10.一种用于制备根据权利要求1-4中任一项所述的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其盐的工艺，包括以下步骤：
a)在强碱的存在下，采用醇作为溶剂，用4-三氟甲基苄基溴将D-脯氨酸烷基化，以便获得中间体P4
Figure FDA0002958202580000031
b)在偶联剂的存在下，通过使所述中间体P4与4-(1-氨基环丙基)苯甲酸甲酯反应来形成酰胺(中间体P3)
Figure FDA0002958202580000032
和
c)在碱的存在下水解所述中间体P3，以便获得所述化合物1
Figure FDA0002958202580000033
11.根据权利要求10所述的工艺，其中在步骤a)中，所述碱是氢氧化钾，并且所述醇是2-丙醇。
12.根据权利要求10-11中任一项所述的工艺，其中在步骤b)中，所述偶联剂优选地为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的工艺，其中在步骤c)中，所述强碱是氢氧化钠。
14.一种药物组合物，包含根据权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。
15.根据权利要求1-4中任一项所述的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其药学上可接受的盐，用作药物。
16.根据权利要求1-4中任一项所述的(R)-4-(1-(1-(4-三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸(化合物1)或其药学上可接受的盐，用于作为EP4受体拮抗剂在治疗涉及前列腺素E2(PGE2)在其发病机理中的活性的病状中使用。
17.根据权利要求16所述的用于使用的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸或其药学上可接受的盐，其中所述病状选自由类风湿性关节炎、脊椎关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎、由炎症引起的关节病以及急性和慢性疼痛、骨关节炎疼痛、具有免疫学病因的关节炎疼痛和类风湿性关节炎组成的组。
18.根据权利要求16所述的用于使用的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸或其药学上可接受的盐，其中所述病状是肿瘤疾病。
19.根据权利要求16所述的用于使用的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸或其药学上可接受的盐，其中所述病状是眼病，所述眼病优选地选自由早产儿视网膜病变(ROP)、增生性糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性(AMD)组成的组。
20.根据权利要求16所述的用于使用的(R)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺)环丙基苯甲酸或其药学上可接受的盐，其中所述病状为子宫内膜异位症。
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