ES2948293T3 - Acido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrolidina-2-carboxamida)ciclopropil)-benzoico como antagonista del receptor EP4 - Google Patents
Acido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrolidina-2-carboxamida)ciclopropil)-benzoico como antagonista del receptor EP4 Download PDFInfo
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Abstract
La siguiente invención se refiere al ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrodilin-2-carboxamida)ciclopropilbenzoico (Compuesto 1) o una sal del mismo. Métodos ventajosos para obtener el Compuesto 1 También se describen, así como composiciones farmacéuticas que contienen ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrodilin-2-carboxamida)ciclopropilbenzoico (Compuesto 1) o una sal farmacéuticamente aceptable. del mismo se describe para su uso como antagonista del receptor EP4 en el tratamiento de una patología que involucra las actividades de la prostaglandina E2 (PGE2) en su patogénesis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrolidina-2-carboxamida)cidopropil)-benzoico como antagonista del receptor EP4
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención describe un nuevo derivado de la D-prolina, como un antagonista potente y selectivo del receptor EP4, el compuesto ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrolidina-2-carboxamida) ciclopropil benzoico (compuesto 1) según la fórmula
y sus sales farmacéuticamente aceptables, procesos para su preparación, las composiciones farmacéuticas que lo comprenden y su uso como medicamento para el tratamiento de enfermedades, en cuya patogénesis desempeña un papel fundamental la prostaglandina E2 (PGE2), a través de su interacción el subtipo de receptor EP4.
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
[0002] El receptor EP4 es de tipo receptor 7-transmembrana, cuya activación está asociada normalmente con un aumento de los niveles intracelulares de adenosín monofosfato cíclico (AMPc).
[0003] La prostaglandina E2 (PGE2) actúa a través del receptor EP4 activado, como sistema amplificador de citocinas, por ejemplo, interleucina-6 (IL-6), e induce la diferenciación y expansión de linfocitos T auxiliares proinflamatorios (Th) (Yokoyama et al., Pharmacol. Rev. 2013; 65:1010-52).
[0004] En el documento WO 2013/004290 se describen derivados aminocíclicos como antagonistas del receptor EP4. En concreto, en el Ejemplo 7, se describe el ácido 4-(1-(6-(4-(trifluorometil) bencil)-6-azaspiro[2.5] octan-5-carboxamida)ciclopropil)benzoico (denominado E7). E7, como enantiómero R al que se hace referencia brevemente como CR6086, mostró alta afinidad y selectividad por el receptor EP4 humano (K i 16,6 nM), funcionando como antagonista puro en la producción de PGE2 de AMPc estimulado. En modelos experimentales de cultivos de células E7, inhibió los efectos de citocinas importantes como mediadores de la artritis reumatoide: por ejemplo, redujo la expresión de IL-6 y del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en macrófagos, la liberación de IL-23 en células dendríticas, la liberación de IL-17 en linfocitos Th-17. Además, en modelos de artritis por colágeno (CIA) en ratas y ratones, se ha demostrado que CR6086 mejora todos los parámetros de artritis inducida: histopatología, inflamación, dolor (Caselli et al., Arthritis Research & Therapy (2018)20:39).
[0005] Sin embargo, CR6086 se obtiene a través de una síntesis química compleja que se muestra abajo como Esquema 1:
[0006] Al analizar esta síntesis descrita en los documentos WO2013/004290 y WO2011/006960, se muestra claramente la complejidad de la preparación del intermedio de síntesis CR6086, es decir, el siguiente ácido (R)-6-(terc-butoxicarbonil)-6-azaspiro [2.5] octano-5-carboxílico:
[0007] Como se indica en el esquema 1 anterior, esta síntesis consiste en la secuencia de 8 etapas: Después de empezar por la piperidin-4-ona comercialmente disponible, el grupo amino se protege con cloroformiato de bencilo. La reacción de Wittig tiene lugar para convertir la cetona en doble enlace en condiciones normales. El doble enlace se convierte en ciclopropilo usando dietil zinc y el grupo protector en la amina se elimina por hidrogenólisis. La amina se vuelve a proteger con anhídrido de carbonato de terc-butilo y el intermedio obtenido para proporcionar el ácido como mezcla de racemato se carbonata. La resolución del racemato se produce mediante la precipitación selectiva del enantiómero individual como sal, usando (R)-N-bencil-1-feniletano-1-amina. Por último, mediante la acidificación de la solución salina de racemato con HCl, se obtiene el intermedio ácido (R)-6-(terc-butoxicarbonil)-6-azaspiro[2.5]octano-5-carboxílico.
[0008] Por lo tanto, se advierte la necesidad de disponer de nuevos inhibidores análogos del receptor EP4, pero cuya síntesis sea menos complicada.
[0009] Por lo tanto, un primer objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo fármaco antagonista selectivo del receptor EP4 para el tratamiento farmacológico de enfermedades que requieran un antagonista del receptor mencionado, al menos igual a CR6086, pero que al mismo tiempo se pueda obtener con rutas sintéticas mucho menos complejas. SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0010] Los objetos indicados anteriormente se consiguieron por medio de un derivado original de D-prolina, esto es, ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrolidina-2-carboxamida)ciclopropil benzoico (Compuesto 1) que presenta la siguiente estructura:
0 una sal del mismo.
[0011] Por lo tanto, la presente invención se refiere al Compuesto 1, que es un potente antagonista del receptor EP4.
[0012] Asimismo, como resultará evidente a partir de la siguiente descripción, los inventores han preparado el Compuesto 1 a través de dos procesos de síntesis que solventan los inconvenientes de los procesos anteriores para preparar CR6086.
[0013] Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un proceso para la preparación de ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil) pirrolidina-2-carboxamida)ciclopropil benzoico (Compuesto 1) o una sal del mismo que comprende las etapas:
a) formar la amida (intermedio P1) haciendo reaccionar (terc-butoxicarbonil)-D-prolina (N-Boc-D-prolina) con metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato en presencia de un agente de acoplamiento
b) desproteger el grupo Boc del intermedio P1 con al menos un ácido para obtener el intermedio P2
c) alquilar el intermedio P2 con bromuro de 4-(trifluorometil) bencilo en presencia de una base para obtener el derivado de éster metílico (intermedio P3)
y
d) hidrolizar el éster metílico derivado (intermedio P3) en presencia de una base fuerte para obtener el compuesto 1
[0014] El proceso de la invención representado anteriormente resultó ser extremadamente ventajoso tanto por la simplicidad de sus etapas operativas, como también por el uso en la etapa a) de N-Boc-D-prolina, cuyo coste comercial es al menos 20 veces menor que el del intermedio de la técnica anterior, es decir, ácido (R)-6-(terc-butoxicarbonil)-6-azaspiro [2.5] octano-5-carboxílico usado en la síntesis de CR6086.
[0015] En otro aspecto, la invención se refiere a otro proceso para la preparación de ácido (R)-4-(1-(1 -(4-(trifluorometil)bencil) pirrolidina-2-carboxamida)ciclopropil benzoico (Compuesto 1) o una sal del mismo, que comprende las etapas de:
a) alquilar D-Prolina con bromuro de 4-trifluorometilbencilo en presencia de una base fuerte empleando un alcohol como disolvente para obtener el intermedio P4
b) formar la amida (intermedio P3) haciendo reaccionar el intermedio P4 con metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato en presencia de un agente de acoplamiento
; y
c) hidrolizar el intermedio P3 en presencia de una base fuerte para obtener el compuesto 1
[0016] Este proceso de preparación del compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que contempla la reducción adicional de una etapa para su síntesis, partiendo en este caso de la alquilación directa de D-prolina con bromuro de 4-(trifluorometil) bencilo, evitando de este modo el uso de la protección y la posterior desprotección de N-Boc-D-prolina, demostró ser más ventajoso desde el punto de vista de la síntesis.
[0017] En otro aspecto, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como medicamento y a composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0018] En otro aspecto más, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades, en cuya patogénesis desempeña un papel fundamental la prostaglandina E2 (PGE2) a través de su interacción con el subtipo de receptor EP4.
[0019] Por lo tanto, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como fármaco antagonista selectivo de EP4 para el tratamiento de enfermedades en cuya patogénesis desempeña un papel fundamental la prostaglandina E2 (PGE2).
[0020] El compuesto 1 de la invención ha demostrado, por lo tanto, ser capaz de inhibir las actividades de la prostaglandina E2 (PGE2) mediadas por el receptor EP4.
[0021] Por lo tanto, según la presente invención, el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es un fármaco antagonista selectivo del receptor EP4 para el tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, espondiloartritis (tal como, por ejemplo, artritis psoriásica y espondilitis anquilosante), artrosis y dolor, agudo y crónico, debido a inflamación, tal como dolor por osteoartritis, o dolor por artritis con una etiología inmunológica tal como artritis reumatoide. En otro aspecto, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como fármaco antagonista de EP4 en enfermedades tumorales. En este caso, los inventores suponen que el compuesto 1 puede actuar de dos modos distintos, alternativos y concomitantes: 1) la restauración de la respuesta inmunológica contra las células cancerosas, y 2) la inhibición de la angiogénesis que nutre el tejido tumoral. En otro aspecto adicional, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como fármaco antagonista del receptor EP4 en el tratamiento de enfermedades oculares. Entre estos, es posible mencionar la retinopatía de la prematuridad (ROP), la retinopatía diabética proliferativa y la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), que presentan neovascularización ocular como base patológica
común, vinculada en gran medida a la activación del receptor EP4, y que son la principal causa de ceguera en el mundo desarrollado.
[0022] En otro aspecto adicional, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como fármaco antagonista del receptor EP4 en el tratamiento de la endometriosis. En este caso, el compuesto resulta extremadamente ventajoso, ya que la endometriosis es una enfermedad crónica grave que provoca infertilidad y dolor pélvico crónico en el 10 %-20 % de mujeres en edad reproductiva.
[0023] Ahora se describirá la invención en relación con la descripción detallada que se indica a continuación y con las figuras anexas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0024] Las características y ventajas de la presente invención quedarán claras a partir de la siguiente descripción detallada, a partir de las formas de realización proporcionadas a modo de ejemplos ilustrativos y no limitativos, y mediante las figuras adjuntas, en las cuales:
- la figura 1 representa la reversión del efecto de la PGE2 en la liberación de TNF alfa inducida por LPS (muestreo 1 hora después del tratamiento) del ejemplo 9;
- la figura 2 muestra la evaluación de la CIA del edema del ejemplo 10; y
- la figura 3 muestra la evaluación clínica de la CIA del ejemplo 10.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0025] Por lo tanto, la invención se refiere al ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrolidina-2-carboxamida)ciclopropil benzoico (compuesto 1) que presenta la siguiente estructura:
o una sal del mismo.
[0026] Por lo tanto, la presente invención se refiere al Compuesto 1, que es un potente antagonista del receptor EP4.
[0027] En otro aspecto, la invención se refiere a un proceso para la preparación de ácido (R)-4-(1-(1 -(4-(trifluorometil)bencil) pirrolidina-2-carboxamida)ciclopropil benzoico (Compuesto 1) o una sal del mismo, que comprende las etapas de:
a) formar la amida (intermedio P1) haciendo reaccionar (terc-butoxicarbonil)-D-prolina (N-Boc-D-prolina) con metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato en presencia de un agente de acoplamiento
b) desproteger el grupo Boc del intermedio P1 con al menos un ácido para obtener el intermedio P2
c) alquilar el intermedio P2 con bromuro de 4-(trifluorometil) bencilo en presencia de una base para obtener el derivado de éster metílico (intermedio P3)
; y
d) hidrolizar el éster metílico derivado (intermedio P3) en presencia de una base fuerte para obtener el compuesto 1
[0028] Preferiblemente, en la etapa a), el metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato se prepara según lo descrito en el documento WO 2013/004290 y el agente de acoplamiento es preferiblemente 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida.
[0029] En concreto, la etapa a) contempla la formación de la amida entre D-N-Boc prolina, y metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato, en presencia de HOBt, EDCI y TEA durante 24 horas; el lavado de la fase orgánica en secuencia con una solución saturada de NaHCOs, una de NH4O y, por último, con agua; la anhidrificación y evaporación del disolvente, la purificación del producto mediante cromatografía en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de ciclohexano/acetato de etilo (100:0; 25/75).
[0030] En la etapa b), el al menos un ácido es preferiblemente ácido 2,2,2-trifluoroacético.
[0031] En concreto, la etapa b) contempla la desprotección del grupo Boc con ácido trifluoroacético y la posterior liberación de la sal en la resina de intercambio iónico.
[0032] En la etapa c), la base es preferiblemente carbonato de cesio.
[0033] En concreto, la etapa c) implica la alquilación con bromuro de 4-(trifluorometil) bencilo en presencia de Cs2CO3 durante 24 horas; el posterior lavado con una solución de NaCl al 4,5 %, la anhidrificación con disolvente y evaporación; purificación del residuo, disuelto en DCM, por medio de precipitación usando n-heptano como codisolvente; purificación posterior del filtrado mediante cromatografía flash en gel de sílice eluyendo con un gradiente de DCM/acetato de etilo (de 100/0 a 85/15).
[0034] En la etapa d), la base fuerte es preferiblemente hidróxido de sodio. La etapa d) tiene lugar preferiblemente en una mezcla de disolventes orgánicos miscible en agua, más preferiblemente el disolvente orgánico miscible en agua es
tetrahidrofurano (THF). En concreto, la etapa d) contempla la hidrólisis del éster metílico en presencia de NaOH con la posterior purificación mediante cromatografía de fase inversa eluyendo solo con agua y después metanol para proporcionar el Compuesto 1 en forma de sal de sodio.
[0035] Como se ha indicado, el proceso de la invención anteriormente ilustrado resultó ser extremadamente ventajoso, no solo por la simplicidad de sus etapas operativas, sino también por los reactivos utilizados, que son ciertamente de bajo coste.
[0036] En otro aspecto, la invención se refiere a otro proceso para la preparación de ácido (R)-4-(1-(1 -(4-(trifluorometil)bencil) pirrolidina-2-carboxamida)ciclopropil benzoico (Compuesto 1) o una sal del mismo, que comprende las etapas de:
a) alquilar D-Prolina con bromuro de 4-trifluorometilbencilo en presencia de una base fuerte empleando un alcohol como disolvente para obtener el intermedio P4
Intermedio P4
b) formar la amida (intermedio P3) haciendo reaccionar el intermedio P4 con metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato en presencia de un agente de acoplamiento
; y
c) hidrolizar el intermedio P3 en presencia de una base fuerte para obtener el compuesto 1
[0037] En la etapa a), la base es preferiblemente hidróxido de potasio y el alcohol es 2-propanol. En concreto, la etapa a) consiste en una alquilación de D-prolina con bromuro de 4-trifluorometilbencilo en presencia de una base fuerte usando un alcohol, preferiblemente 2-propanol, como disolvente; la recuperación del producto por tratamiento con HCl acuoso y la posterior filtración y purificación mediante tratamiento con acetona y ferc-butil-éter como codisolvente.
[0038] En la etapa b), el metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato se prepara preferiblemente según lo descrito en el documento WO 2013/004290 y el agente de acoplamiento es preferiblemente 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida.
[0039] En concreto, la etapa b) contempla la formación de la amida entre 4-(trifluorometil)bencil)-D-prolina preparada de acuerdo con la etapa a) anterior e hidrocloruro de metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato, en presencia de hidrato de hidroxibenzotriazol, TEA, EDCI disuelto en una solución de DCM; el lavado de la fase orgánica con una solución saturada de NaHCOs y, finalmente, con agua, la anhidrificación y evaporación del disolvente, purificación y recuperación del compuesto metil (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida)ciclopropil) benzoato, formado de este modo por el tratamiento y precipitación con éter metil-terbutílico.
[0040] En la etapa c), la base fuerte es preferiblemente hidróxido de sodio. La etapa c) tiene lugar preferiblemente en una mezcla de disolventes orgánicos miscible en agua, más preferiblemente el disolvente orgánico miscible en agua es tetrahidrofurano (THF).
[0041] En la etapa c) en particular, la hidrólisis del éster metílico obtenido de este modo conforme a lo descrito en el punto b) anterior y la recuperación del Compuesto 1 tiene lugar sucesivamente de acuerdo con lo descrito en el punto d) del primer proceso. Tal y como se ha indicado anteriormente, este proceso de preparación del compuesto que contempla la reducción adicional de una etapa para su síntesis, partiendo en este caso de la alquilación directa de D-prolina con bromuro de 4-(trifluorometil) bencilo, evitando de este modo el uso de la protección y la posterior desprotección de N-Boc-D-prolina, demostró ser más ventajoso desde el punto de vista de la síntesis.
[0042] En un aspecto ventajoso, el compuesto 1 se encuentra en forma de sal, preferiblemente una sal farmacéuticamente aceptable, más preferiblemente como sal de clorhidrato o sal de litio o sal de sodio.
[0043] En otro aspecto ventajoso, el compuesto 1 se encuentra en forma de zwitterión.
[0044] En otro aspecto, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como medicamento y a composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0045] En otro aspecto más, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades, en cuya patogénesis desempeña un papel fundamental la prostaglandina E2 (PGE2) a través de su interacción con el subtipo de receptor EP4.
[0046] Por lo tanto, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como fármaco antagonista selectivo de EP4 para el tratamiento de enfermedades en cuya patogénesis desempeña un papel fundamental la prostaglandina E2 (PGE2).
[0047] Por lo tanto, según la presente invención, el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es un fármaco antagonista selectivo del receptor EP4 para el tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, espondiloartritis (tal como, por ejemplo, artritis psoriásica y espondilitis anquilosante), artrosis y dolor, agudo y crónico, debido a inflamación, tal como dolor por osteoartritis, o dolor por artritis con una etiología inmunológica tal como artritis reumatoide. En otro aspecto, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como fármaco antagonista de EP4 en enfermedades tumorales. En este caso, los inventores suponen que el compuesto 1 puede actuar de dos modos distintos, alternativos y concomitantes: 1) la restauración de la respuesta inmunológica contra las células cancerosas, y 2) la inhibición de la angiogénesis que nutre el tejido tumoral. En otro aspecto adicional, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como fármaco antagonista del receptor EP4 en el tratamiento de enfermedades oculares. Entre estas, cabe mencionar la retinopatía de la prematuridad (ROP), la retinopatía diabética proliferativa y la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), que presentan neovascularización ocular como base patológica común, vinculada en gran medida a la activación del receptor EP4, y que son la principal causa de ceguera en el mundo desarrollado.
[0048] En otro aspecto adicional, la invención se refiere al compuesto 1 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como fármaco antagonista del receptor EP4 en el tratamiento de la endometriosis. En este caso, el compuesto resulta extremadamente ventajoso, ya que la endometriosis es una enfermedad crónica grave que provoca infertilidad y dolor pélvico crónico en el 10 %-20 % de mujeres en edad reproductiva.
EJEMPLOS
[0049] Los reactivos utilizados en los siguientes ejemplos se adquirieron de diversos proveedores y se usaron sin purificación adicional. Los disolventes se usaron en forma anhidra. Las reacciones en ambiente anhidro se llevaron a cabo con una presión positiva de N2.
[0050] Se registraron los espectros de resonancia magnética nuclear de protón (RMN t-H) en el instrumento Bruker Avance 400 MHz. Los desplazamientos químicos se indican en ppm (8) usando la línea de disolvente residual como patrón interno. La mutiplicidad de signos se indica como: s, singlete; d, doblete; t, triplete; q, cuartete; m, multiplete; br, signo ampliado.
[0051] Los espectros UPLC-Massa se realizaron en el instrumento Waters Acquity UPLC-SQD usando una columna C18 de Acquity UPLC-BEH (1,7|j M, 50*2,1 mm).
[0052] La cromatografía flash sobre gel de sílice se realizó en sistemas de cromatografía flash automáticos de Biotage (sistemas Sp1 e Isolera) usando cartuchos de sílice SNAP HP Biotage. La cromatografía de fase inversa se realizó en sistemas de cromatografía flash automáticos de Biotage (Isolera) usando cartuchos RediSep Gold C-18Aq.
[0053] Los cartuchos SPE-SCX son columnas de intercambio iónico para la extracción en fase sólida.
[0054] La potencia rotatoria se midió con un polarímetro Autopol V (Rudolph Sci.). En el presente documento, se emplean las siguientes abreviaturas:
NH4 4Cl: cloruro de amonio; NaHCOs: bicarbonato de sodio; Cs2CO3 : carbonato de cesio; NaOH: hidróxido de sodio; KOH: hidróxido de potasio; TEA: trietilamina; NH3: amoniaco; HCl: ácido clorhídrico; EDC: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida; Na2SO4: sulfato de sodio; DCM: diclorometano; EtOH: etanol; MeOH: metanol; IsOH: 2-propanol; t HF: tetrahidrofurano; t.a.: temperatura ambiente.
Ejemplo 1: Preparación del compuesto 1 a través del primer proceso de la invención
Preparación 1: Preparación de Terc-butil (R)-2-((1-(4-(metoxi carbonil) fenil) ciclopropil) carbamoil) pirrolidin-1-carboxilato (Intermedio P1).
[0055] Se añadieron hidrato de N-hidroxibenzotriazol (25,6 g, 167 mmol) y EDC (40,1 g, 209 mmol) a una solución de (ferc-butoxi carbonil)-D-prolina (30 g, 139 mmol) en DCM (550 ml) y la mezcla se agitó durante una hora a temperatura ambiente. Después de este tiempo, se añadieron clorhidrato de metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato (33,0 g, 145 mmol) y TEA (26,2 ml, 188 mmol). La reacción se agitó durante 24 horas. Cuando se completó la reacción, se añadió agua (350 ml) y las dos fases se agitaron durante aproximadamente 10 minutos. La fase orgánica se separó de la fase acuosa y se lavó secuencialmente con una solución saturada de NaHCO3 (300 ml), una de NH4Cl (300 ml) y finalmente con 300 ml de agua.
[0056] La fase orgánica se secó con Na2SO4 y se concentró para obtener un sólido de color amarillento claro cuya purificación mediante cromatografía flash sobre gel de sílice, con un gradiente de ciclohexano/acetato de etilo (100:0; 25/75), proporcionó el compuesto deseado (49,5 g; rendimiento del 88 %). (Intermedio P1).
[0057] MS: (ES/+) m/z: 389 [MH‘]
[0058] RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 8 ppm: 7,94 (2 H, d, J=8,31 Hz), 7,73 (1 H, br. s.), 7,23 (2 H, d, J=7,83 Hz), 4,29 (1 H, br. s.), 3,91 (3 H, s), 3,45 (2 H, br. s.), 1,77 - 2,53 (4 H, m), 1,47 (9 H, br. s), 1,29 - 1,42 (4 H, m).
Preparación 2: Preparación de Metil (R)-4-(1-(pirrol¡d¡n-2-carboxamida) ciclopropil) benzoato (Intermedio P2)
[0059] Se disolvió Terc-butil (R)-2-((1-(4-(metoxicarbonil) fenil) ciclopropil) carbamoil) pirrolidin-1-carboxilato (49,5 g, 122 mmol) en DCM (400 ml) y la mezcla se enfrió a 0 °C antes de añadir ácido 2,2,2-trifluoroacético (80 ml, 1038 mmol). Se dejó que la reacción alcanzara la temperatura ambiente y después se agitó durante 3 horas. Los disolventes se evaporaron y el residuo bruto se cargó en un cartucho SPE-SCX (150 g) eluyendo primero solo con MeOH y después con NH31M en MeOH. Las fracciones que contenían amoniaco se evaporaron para obtener el sólido residual deseado (30,9 g: rendimiento del 88 %). (Intermedio P2).
[0060] MS: (ES/+) m/z: 289
[0061] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 8,62 (1 H, s), 7,80 - 7,91 (2 H, m), 7,17 - 7,27 (2 H, m), 3,83 (3 H, s), 3,49 -3,58 (1 H, m), 2,77 - 2,92 (3 H, m), 1,91 - 2,03 (1 H, m), 1,56 - 1,74 (3 H, m), 1,17 - 1,34 (4 H, m).
Preparación 3: Preparación de metil (R)-4-(1-(1-(4-trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoato (Intermedio P3)
[0062] Se disolvió metil (R)-4-(1-(pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoato (29,6 g, 103 mmol) en THF (500 ml). Se añadieron Cs2CO3 (57,2 g, 176 mmol) y bromuro de 4-(trifluorometil) bencilo (16,82 ml, 109 mmol) en secuencia y la mezcla se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. El THF se evaporó y el residuo se dividió entre DCM (250 ml) y agua (250 ml) y la mezcla resultante se agitó vigorosamente durante aproximadamente 10 minutos. La fase orgánica se separó de la fase acuosa y se lavó dos veces con una solución de NaCl al 4,5 % (250 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró hasta obtener un sólido blanco (46,5 g), que se añadió con DCM (100 ml) y se calentó hasta aproximadamente 40 °C hasta su completa disolución. En este punto, se dejó que la solución alcanzara la temperatura ambiente antes de añadir n-heptano (500 ml) para obtener un precipitado blanco que después se filtró y se secó a 50 °C durante 24 horas para obtener el compuesto deseado (50 g; rendimiento: 89 %). (Intermedio P3).
[0063] MS: (ES/+) m/z: 447
[0064] RMN 1H (400 MHz, DMSO- d6) 8 ppm 8,47 (1 H, s), 7,77 - 7,85 (2 H, m), 7,66 - 7,71 (2 H, m), 7,58 - 7,65 (2 H, m), 7,14 (2 H, d, J=8,31 Hz), 3,78 - 3,90 (4 H, m), 3,66 (1 H, d, J=13,20 Hz), 3,11 (1 H, dd, J=9,05, 4,65 Hz), 2,98 -3,05 (1 H, m), 2,34 - 2,42 (1 H, m), 2,05 - 2,20 (1 H, m), 1,70 - 1,87 (3 H, m), 1,15 - 1,32 (2 H, m), 0,98 -1,15 (2H, m).
Preparación 4: Preparación de la sal de sodio de ácido (R)-4-(1-(1-(4-trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoico (Compuesto 1)
[0065] Se disolvió metil (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil)-benzoato (40,95 g, 92 mmol) (Intermedio P3) en una mezcla de THF (450 ml) y agua (250 ml) antes de añadir NaOH (4,40 g, 110 mmol). La suspensión blanquecina se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente orgánico se evaporó y el residuo se cargó en una columna RediSep Gold C-18Aq eluyendo primero solo con agua (2 volúmenes de columna) y finalmente con MeOH (3 volúmenes de columna). Las fracciones que contenían MeOH se concentraron y el residuo sólido resultante se secó a 60 °C al vacío para dar 35,5 g de la sal de sodio del Compuesto 1 (84 % de rendimiento).
C23H22FaN2NaO3
[0066] MS: (ES/+) m/z: 433 [MH-]
[0067] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 8,38 (1 H, s), 7,65 - 7,77 (4 H, m), 7,56 - 7,64 (2 H, m), 6,87 - 7,01 (2 H, m), 3.86 (1 H, d, J=13,20 Hz), 3,64 (1 H, d, J=13,69 Hz), 3,09 (1 H, dd, J=9,05, 4,65 Hz), 2,94 - 3,04 (1 H, m), 2,29 -2,41 (1 H, m), 2,03 - 2,19 (1 H, m), 1,69 - 1,86 (3 H, m).
[0068] Potencia rotatoria específica: (a)D20, 1 % en H2O = 30,2°.
Ejemplo 2:
Preparación del compuesto 1 a través del segundo proceso de la invención
Preparación 1: Preparación de (4-(trifluorometil) bencil)-D-prolina (Intermedio P4)
[0069] Se añadieron 50 g (0,43 moles) de D-prolina a una solución de 73 g (1,3 moles) de hidróxido de potasio disueltos en 500 ml de 2-propanol y, posteriormente, en porciones, 74 ml de bromuro de 4-(trifluorometil) bencilo (0,477 moles) disueltos en 300 ml de 2-propanol; se hizo reaccionar la solución con agitación a 50 °C durante 12 horas. Posteriormente, la solución se enfrió hasta 0 °C y se ajustó el pH hasta aproximadamente 4±1 con HCl acuoso al 32 %. El sólido precipitado formado se filtró, se lavó con un poco de 2-propanol, se disolvió en acetona, se filtró en caliente y se volvió a precipitar añadiendo metil-terc-butil éter para obtener el compuesto deseado (99 g; 83 % de rendimiento) tras la filtración y el secado. (Intermedio P4).
[0070] MS: (ES/+) m/z: 274
[0071] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 11,66 (vbs), 7,69 (2 H, d), 7,59 (2 H, d), 4,07 (1 H, d), 3,68 (1 H, d), 3,25 -3,32 (1 H, m), 2,93 (1 H, ddd), 2,39 - 2,48 (1 H, m), 2,10 (1 H, dq), 1,67 - 1,92 (3 H, m).
Preparación 2: Preparación de metil (R)-4-(1-(1-(4-trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoato (Intermedio P3)
[0072] A una solución de 26 g (95,4 mmol) de 4-(trifluorometil) bencil)-D-prolina y N-hidroxibenzotriazol hidrato (17,6 g, 114 mmol) disueltos en 600 ml de DCM, se le añadieron 80 ml de Te a (570 mmol) y 20 g (105 mmol) de e Dc I con corriente de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó en agitación durante aproximadamente 6 horas, después se añadieron 24 g (105 mmol) de clorhidrato de metil-4-(1-aminociclopropil) benzoato, y después se dejó reaccionar siempre en agitación durante 24 horas más a temperatura ambiente. Cuando se completó la reacción, se añadió agua (500 ml) y las dos fases se agitaron durante aproximadamente 10 minutos. La fase orgánica se separó de la fase acuosa y se lavó secuencialmente con una solución saturada de NaHCOs (400 ml), y finalmente con 400 ml de agua. La fase orgánica se secó con Na2SO4 y se concentró para obtener un sólido de color crema. Este sólido se suspendió en 1 litro de metil-tercbutil-éter, se calentó a ebullición, se filtró en caliente y la solución clara obtenida de este modo se concentró al vació hasta que se secó para obtener un sólido blanco que después se secó a 50 °C durante 24 horas para obtener el compuesto deseado (32,5 g; rendimiento: 75 %). (Intermedio P3).
[0073] MS: (ES/+) m/z: 447
[0074] RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 8 ppm 7,80 - 8,01 (3 H, m), 7,62 (2 H, d), 7,41 (2 H, d), 7,12 -7,24 (2 H, m), 3.86 (4 H, s), 3,66 (1 H, d), 3,27 (1 H, dd), 3,07 - 3,18 (1 H, m), 2,46 (1 H, td), 2,21 - 2,38 (1 H, m), 1,70 - 2,03 (3 H, m), 1,05 - 1,44 (4 H, m).
Preparación 3: Preparación de la sal de sodio de ácido (R)-4-(1-(1-(4-trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoico (Compuesto 1)
[0075] Se disolvió metil (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil)-benzoato (40,95 g, 92 mmol) (Intermedio P3) en una mezcla de THF (450 ml) y agua (250 ml) antes de añadir NaOH (4,40 g, 110 mmol). La suspensión blanquecina se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente orgánico se evaporó y el residuo se cargó en una columna RediSep Gold C-18Aq eluyendo primero solo con agua (2 volúmenes de columna) y finalmente con MeOH (3 volúmenes de columna). Las fracciones que contenían MeOH se concentraron y el residuo sólido resultante se secó a 60 °C al vacío para obtener 35,5 g de la sal de sodio del Compuesto 1 (84 % de rendimiento).
C23H22FaN2NaO3
[0076] MS: (ES/+) m/z: 433 [MH‘]
[0077] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 8,38 (1 H, s), 7,65 - 7,77 (4 H, m), 7,56 - 7,64 (2 H, m), 6,87 - 7,01 (2 H, m), 3,86 (1 H, d, J=13,20 Hz), 3,64 (1 H, d, J=13,69 Hz), 3,09 (1 H, dd, J=9,05, 4,65 Hz), 2,94 - 3,04 (1 H, m), 2,29 - 2,41 (1 H, m), 2,03 - 2,19 (1 H, m), 1,69 - 1,86 (3 H, m).
[0078] Potencia rotatoria específica: (a)D20, 1 % en H2O = 30,2°.
Ejemplo 3
Preparación de ácido (R)-4-(1-(1-(4-trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoico (zwitterión del Compuesto 1)
[0079] Se añadieron 1,7 ml (29,4 mmol) de ácido acético a una solución de 6,1 g (13,4 mmol) de la sal de sodio de ácido (R)-4-(1-(1 -(4-(trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoico disuelto en 80 ml de H2O y esta solución se extrajo dos veces con 80 ml de DCM. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H2O y después se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron al vacío para obtener un sólido de color crema pálido con un aspecto amorfo (5,7 g; rendimiento del 96 %).
C23H23F3N2O3.
[0080] MS: (ES/+) m/z: 433
[0081] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 12,68 (1 H, br. s.), 8,45 (1 H, s), 7,76 - 7,83 (2 H, m), 7,65 - 7,72 (2 H, m), 7,58 - 7,65 (2 H, m), 7,08 - 7,17 (2 H, m), 3,86 (1 H, d, J=13,69 Hz), 3,66 (1 H, d, J=13,20 Hz), 3,12 (1 H, dd, J=9,29, 4,40 Hz), 2,97 - 3,06 (1 H, m), 2,34 -2,43 (1 H, m), 2,05 -2,19 (1 H, m), 1,71 -1,86 (3 H, m), 1,15 -1,30 (2 H, m), 0,97 -1,14 (2 H, m).
[0082] Potencia rotatoria específica: (a)D20, 1 % en metanol = 28,9°.
Ejemplo 4
Preparación de ácido (R)-4-(1-(1-(4-trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoico (HCl del Compuesto 1)
[0083] Se añadió HCl 1 N (30 ml, 30 mmol) a una solución de 7 g (16,2 mmol) de ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoico («zwitterión» del Compuesto 1) disuelto en 300 ml de butan-2-ona. La mezcla de reacción se agitó durante 12 horas y el precipitado blanco formado en suspensión se filtró y se secó a 60 °C al vacío para obtener 5,8 g de clorhidrato del Compuesto 1 (rendimiento del 85 %).
C23H23F3N2O3 *HCl.
[0084] MS: (ES/+) m/z: 433
[0085] RMN 1H (400 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 7,89 - 7,97 (2 H, m), 7,70 - 7,83 (4 H, m), 7,18 (2 H, d, J=8,31 Hz), 4,45 - 4,60 (2 H, m), 4,28 (1 H, dd, J=9,05, 6,60 Hz), 3,68 - 3,79 (1 H, m), 3,39 - 3,49 (1 H, m), 2,61 - 2,75 (1 H,m), 2,22 - 2,35 (1 H, m), 2,01 -2,15 (2 H, m), 1,19 -1,38 (2 H, m), 1,13 (1 H, ddd, J=10,51,6,85, 5,14 Hz), 0,89 -1,00 (1 H, m).
[0086] Potencia rotatoria específica: (a)D20, 1 % en H2O = 18,3°.
Ejemplo 5
Preparación de la sal de litio de ácido (R)-4-(1-(1-(4-trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoico
[0087] Se añadieron 1,4 g (33,1 mmol) de hidróxido de litio monohidratado a una solución de 8 g (18 mmol) de metil (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoato disuelto en una mezcla de H2O-dioxano al 50 %. La solución se dejó en agitación durante 6 horas y después se evaporó el dioxano al vacío; el residuo se cargó en una columna Biotage C-18 eluyendo primero solo con agua (2 volúmenes de columna) y finalmente con MeOH (3 volúmenes). Las fracciones que contenían MeOH se concentraron y el sólido resultante se secó a 60 °C al vacío para obtener 6,9 g de la sal de litio del Compuesto 1 (88 % de rendimiento).
C23H22F3N2LO 3
[0088] MS: (ES/+) m/z: 433
[0089] RMN 1H (400MHz, METANOL-d4) 5 ppm 7,88 - 7,83 (m, 2H), 7,66 - 7,62 (m, 2H), 7,60 - 7,55 (m, 2H), 7,16 - 7,10 (m, 2H), 3,87 - 3,72 (m, 2H), 3,18 (dd, J=4,4, 9,8 Hz, 2H), 2,55 -2,44 (m, 1H), 2,32 -2,20 (m, 1H), 1,89 (br s, 3H), 1,35 -1,25 (m, 1H), 1,22 -1,15 (m, 1H), 1,11 -1,04 (m, 1H), 0,99 -0,90 (m, 1H).
Ejemplo 6: Preparación del compuesto de referencia, es decir, sal de sodio de ácido (S)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrolidin-2-carboxamida) ciclopropil) benzoico
(Compuesto 2)
[0090] El compuesto 2 se preparó de acuerdo con el primer proceso de la invención, por lo tanto, siguiendo todo el proceso descrito en el ejemplo 1 que comprende cantidades y reactivos, pero partiendo esta vez de (terc-butoxicarbonil)-L-prolina en lugar de (terc-butoxicarbonil)-D-Prolina.
C23H22FaN2NaO3.
[0091] MS: (ES/+) m/z: 433
[0092] RMN 1H (400MHz, DMSO-da) 8 = 8,38 (s, 1H), 7,75 -7,66 (m, 4H), 7,64 -7,56 (m, 2H), 6,96 (d, J=8,8 Hz, 2H), 3,86 (d, J=13,2 Hz, 1H), 3,63 (d, J=13,2 Hz, 1H), 3,13 - 3,07 (m, 1H), 3,03 - 2,96 (m, 1H), 2,40 - 2,31 (m, 1H), 2,19 - 2,05 (m, 1H), 1,87 - 1,69 (m, 3H), 1,21 -1,06 (m, 2H), 1,05 -0,91 (m, 2H).
[0093] Potencia rotatoria específica: (a)D20, 1 % en H2O = -28,5°.
Evaluación farmacológica
Ejemplo 7
Estudios de unión hacia el receptor EP4 humano.
[0094] Los experimentos se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito por Abramovitz et al (Biochemica and Biophysica Acta; 1483, 285-293, 2000).
Preparación del tejido:
[0095] Las membranas celulares que portan el receptor EP4 humano, expresado de manera estable por las células HEK293 (células embrionarias de riñón humano 293) se prepararon tal y como se describe a continuación. Tras eliminar el medio de cultivo (DMEM, suplementado con Glutamax I y que contenía 10 % de suero fetal bovino y blasticidina 10 |jg/ml), se realizó un lavado de la monocapa celular con 10 ml de tampón de lisis hipotónico (TRIS-Cl 5 mM EDTA 5 mM - pH 7,4). Las células, que crecieron en adherencia en el medio anteriormente mencionado a 37 °C con CO2 al 5 %, se separaron después del recipiente de cultivo (matraz de 150 cm2) y se lisaron por acción mecánica, añadiendo 20 ml de tampón de lisis fresco. Los lisados se agitaron durante 30 segundos y se centrifugaron a 40000 x g durante 22 minutos a 4 °C. El sedimento final se almacenó a -80 °C hasta su uso. En el momento del experimento de unión, las membranas se descongelaron y se resuspendieron en tampón de análisis (10 mM MES-KOH pH 6, que contenía 10 mM MgCh y 1 mM CaCh) para obtener una concentración de 1 mg de proteínas/ml. El contenido de proteínas de la suspensión de membrana se determinó utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
Ensayo de unión:
[0096] En los experimentos, se incubaron alícuotas de 10 j l de membranas con el radioligando [3H]-Prostaglandina E2 (PGE2) a la concentración de 1 nM, en ausencia o en presencia de diversas concentraciones de los compuestos que se van a analizar. La unión no específica se determinó en presencia de PGE21 jM . La incubación, en un volumen final de 0,1 ml, realizada en microplacas de 96 pocillos profundos, se llevó a cabo durante 90 minutos a 25 °C. La separación del radioligando libre del unido al receptor se produjo mediante filtración rápida al vacío, usando microplacas de filtración de fibra de vidrio Unifilter GFB, prehumedecidas con 0,3 % de polietilenimina disuelta en el tampón de análisis, y después se lavó 3 veces con tampón frío (50 mM HEPES, NaCl 500 mM, BSA 0,1 %, pH 7,4). Los discos de filtración se secaron después a 30 °C, a los que se añadió 0,05 ml de líquido de centelleo Microscint-20 (Perkin Elmer) a cada uno y, al final, se midió la radiactividad presente después de al menos una hora de estabilización.
[0097] Las curvas de competición compuesto/radioligando se analizaron utilizando el programa "Non linear curve fitting" (Graph Pad, versión 7 para Windows), que permitió calcular el valor IC50 (concentración capaz de inhibir el 50 % de la unión del radioligando al receptor en examen) para cada compuesto evaluado.
[0098] Resultados: Los resultados obtenidos de este modo se expresan como valores IC50, y se muestran en la siguiente Tabla 1.
Tabla 1: Unión al receptor EP4 humano recombinante.
[0099] A partir de los datos que se muestran en la tabla, se puede observar que tanto el Compuesto 1 como CR6086 mostraron una potente actividad en la inhibición de la unión al receptor EP4; el Compuesto 1 mostró una actividad inhibidora hacia la unión del ligando PGE2 prácticamente idéntica a la obtenida con el compuesto comparativo CR6086. Los inventores observaron y consideraron interesante que la actividad antagonista de EP4 del Compuesto 1 era estereoespecífica, ya que el Compuesto 2, que es el enantiómero de referencia "en forma S" del Compuesto 1, es decir,
ácido (S)-4-(1 -(1-(4-(trifluorometil) bencil) pirrolidin-2-carboxamida)cidopropil)benzoico, era aproximadamente 50 veces menos activo en la inhibición de la unión del ligando PGE2 al receptor EP4 humano.
Ejemplo 8:
Determinación de AMPc en células CHO transfectadas con receptor EP4 humano (prueba funcional).
[0100] Método: Evaluación de la actividad agonista y antagonista del Compuesto 1 en el receptor EP4 humano expresada en células CHO transfectadas con el receptor EP4 humano, determinada midiendo sus efectos en la producción de AMPc en ausencia y en presencia del agonista endógeno PGE2.
[0101] Las células CHO se suspendieron en tampón HBSS (Invitrogen) con la adición de HEPES 20 mM (pH 7,4) e IBMX 500 mM, después se distribuyeron en microplacas a una densidad de 20000 células por pocillo y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente en ausencia (control) o en presencia del compuesto objeto de examen. Como control de referencia de la actividad agonista, se añadió 1 μM de PGE2 a pocillos de dosificación independientes. En el caso de la evaluación del efecto antagonista, se añadió en cambio el agonista de referencia PGE2 hasta una concentración final de 30 nM. Tras 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, las células se lisaron y se añadieron el aceptor de fluorescencia (D2 marcado con AMPc) y el donador de fluorescencia (anticuerpo anti-AMPc marcado con criptato de europio). Tras 60 minutos a temperatura ambiente, se midió la transferencia de fluorescencia a una longitud de onda de 337 nm en excitación y a 620 y 665 nm en emisión usando un lector de microplacas (Envison, Perkin Elmer). La concentración de AMPc se determinó dividiendo la señal medida a 665 nm por la medida a 620 nm (ratio). Los resultados se expresaron, en el caso de la evaluación del efecto agonista, como porcentaje de la respuesta control a 1 μM de PGE2, mientras que, en el caso de la evaluación del efecto antagonista, como porcentaje de inhibición de la respuesta del agonista de control a 30 nM PGE2. Para la determinación de la actividad antagonista, se calculó la disociación aparente (Kb) aplicando la ecuación aplicando la ecuación de Cheng Prusoff modificada (Kb= IC50/(1+NEC50A)); donde A = concentración del agonista de referencia PGE2, y EC50A = valor de EC50 del agonista de referencia.
Resultados:
[0102] La prueba funcional de AMPc mostró que el Compuesto 1 era un antagonista puro de los receptores EP4 humanos (valores de Kb: 15 nM Compuesto 1 frente a 7,8 nM CR6086) sin actividad de tipo agonista.
Compuesto 1
[0103] Efecto agonista: inactivo hasta 10-6M
[0104] Efecto antagonista: IC50 = 1,6 *10-7 M; Kb = 1,5 * 10-8 M
CR6086
[0105] Efecto agonista: inactivo hasta 10-6M
[0106] Efecto antagonista: IC50 = 8,2*10-8M; Kb = 7,8*10-9M
Ejemplo 9:
Prueba funcional ex vivo: evaluación en la rata de la ocupación del receptor EP4 por el Compuesto 1 (30 mg/kg) en comparación con CR6086 (30 mg/kg)
[0107] Método: Se evaluó la liberación de la citocina TNF alfa inducida por la endotoxina lipopolisacárido (de E. coli) y modulada por concentraciones crecientes de PGE2, mediante las células presentes en la sangre entera de la rata y que expresan el receptor EP4. Como es bien sabido a partir de la bibliografía, PGE2 modula esta liberación inhibiéndola, y los compuestos analizados, selectivos para el receptor EP4, si están presentes en la sangre después de su captación, se unirán al receptor, impidiendo que PGE2 inhiba la liberación de citocinas. Este efecto inverso de la modulación de la liberación de TNF alfa puede considerarse un biomarcador del antagonismo hacia el receptor EP4.
[0108] Se usaron ratas macho Wistar (Charles River, Italia) que pesaban 250-275 g, tratadas oralmente con un vehículo o Compuesto 1 (30 mg/kg) o CR6086 (30 mg/kg). Cada grupo de tratamiento consistió en 6 animales.
Medición de los efectos ex vivo en sangre entera de la rata:
[0109] Los efectos de la ocupación del receptor por los compuestos objeto de examen se evaluaron una hora después de su administración, y se compararon con los medidos en presencia del vehículo solo. Tras la anestesia gaseosa con isofluorano, se extrajo sangre de la aorta abdominal y se transfirió a tubos que contenían heparina (0,1-0,2 U/ml). A continuación, se recogieron alícuotas de sangre de 0,4 ml y se dispensaron en una serie de tubos de ensayo que se precalentaron a 37 °C durante 10 minutos. Se añadió LPS (0,1 μg/ml de concentración final) a las muestras, que representaban el control de ensayo, o una mezcla de LPS (0,1 μg/ml de concentración final) PGE2 a diversas concentraciones. En las muestras que representan la liberación basal de citocina, LPS se sustituyó por tampón fosfato estéril (PBS). Las muestras se incubaron durante 4 horas a 37°C, después se añadieron 40 μl de 10 mM EDTA y las muestras se transfirieron a hielo. A continuación, las muestras se centrifugaron a 1500 x g durante 10 minutos a 4 °C y el plasma obtenido de este modo se retiró y se almacenó a -80 °C hasta el momento de la dosificación. El contenido de TNF alfa en el plasma se midió por medio de un kit comercial específico.
[0110] Las concentraciones finales de TNF alfa se calcularon para cada animal tratado y para cada condición experimental, a partir de las cuales se obtuvo el porcentaje de inhibición debido a las concentraciones crecientes de PGE2 en comparación con la muestra que contenía solo LPS. Los valores de referencia de liberación de citocinas resultaron estar por debajo del límite de sensibilidad del ensayo ELISA, indicado por el fabricante. Por lo tanto, el valor IC50 se calculó a partir de esta curva de inhibición. Para cada grupo de tratamiento, se construyeron curvas de inhibición de PGE2 (media ± SD de la inhibición frente a concentración de PGE2), como se muestra en la figura 1. Se analizaron los valores medios de TNF alfa de las muestras en presencia de solo LPS, en los diferentes grupos de tratamiento, para verificar el posible efecto intrínseco del compuesto objeto de examen. Los resultados obtenidos de este modo se ilustran en la figura 1.
[0111] Como se puede observar en la figura 1, tal y como se esperaba, las concentraciones crecientes de PGE2 (intervalo 10-1000 nM) inhibieron la liberación de TNF alfa, de manera dependiente de la concentración. Tras el tratamiento con CR6086 o el Compuesto 1, se observó una reversión estadísticamente significativa del efecto de PGE2 (**p<0,01 frente al grupo vehículo; ANOVA de dos factores), debido a la presencia del antagonista del receptor selectivo. El valor IC50 de PGE2 calculado para cada grupo de tratamiento con los compuestos es significativamente mayor que el calculado tras el tratamiento con el vehículo, lo que sugiere el mismo cambio de potencia de PGE2 debido a la presencia de los antagonistas. No se observaron diferencias entre los efectos debidos a los dos compuestos, y ninguno de los dos muestra efectos significativos per se en la liberación de TNF alfa (en ausencia de PGE2).
Ejemplo 10:
Artritis por colágeno en el ratón (CIA): efecto del Compuesto 1 en comparación con CR6086 en un modelo de artritis reumatoide en el ratón
[0112] Método: Se indujo artritis en el ratón mediante inyección intradérmica de colágeno heterólogo emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA). La artritis que se desarrolló se caracterizó por una marcada destrucción del cartílago articular con el depósito de complejos inmunes, sinovitis e inflamación periarticular. El colágeno actuó como antígeno e indujo una respuesta inmune que involucró a los linfocitos T y B, con la producción de anticuerpos anticolágeno. Los estudios realizados en el ratón con este modelo experimental permitieron identificar muchas de las citocinas y quimiocinas implicadas en la patogénesis de la artritis reumatoide humana. Después de la anestesia gaseosa con isoflurano/O2, los ratones machos adultos DBA/1 se inmunizaron mediante inyección intradérmica en la base de la cola con 100 |jl de una emulsión que contenía 200 |jg de colágeno bovino tipo II en CFA. El CFA estaba compuesto a su vez por 3 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis suspendidos en una mezcla de aceite de parafina y monooleato de manida. Un grupo de animales no inmunizados sirvió como grupo de control sano. Los ratones fueron inscritos para el estudio al inicio de los primeros síntomas clínicos de la patología, como edema y enrojecimiento de las patas traseras y delanteras. En distintos momentos desde la inducción de la patología, se evaluó el grado de patología asignando puntuaciones clínicas de acuerdo con la siguiente escala: 0 = normal, 1 = ligero enrojecimiento e hinchazón de los tobillos, 2 = edema pronunciado, 3 = edema grave y anquilosis; luego se añadieron los valores de puntuación clínica asignados a cada pata. El volumen de las 4 patas también se midió y se sumó usando un microcalibre. Al final del estudio, los animales se sacrificaron y se tomaron las 4 patas, se fijaron en formalina al 10 % y se procesaron para su análisis histológico. Las preparaciones se analizaron con un microscopio óptico para evaluar la degradación del cartílago y el hueso, la infiltración de células inflamatorias y la inflamación sinovial. Para tal fin, se asignaron puntuaciones para cuantificar la gravedad de los parámetros individuales evaluados. Los fármacos que se van a analizar se consideraron efectivos si eran capaces de contrarrestar la progresión de la enfermedad, reduciendo el edema, la puntuación clínica y el daño tisular a las articulaciones. El compuesto 1 (45-90 mg/kg) y CR6086 (30 mg/kg), disueltos en agua destilada, se administraron oralmente durante 16 días a lo largo de la progresión de la patología.
[0113] Análisis estadístico. Los valores se expresaron como media del grupo ± error estándar y se analizaron con el software GraphPad Prism, versión 6.0. El análisis estadístico se llevó a cabo con las distintas mediciones tomadas el día 16, 24 horas después del tratamiento final. Se realizó el análisis de varianza ANOVA de un factor y después la prueba de Dunnett para múltiples comparaciones para valores de edema. Para el análisis de los valores de puntuación clínica e histopatológica, se analizó la suma de las puntuaciones de las 4 patas por medio de la prueba no paramétrica ANOVA-Kruskall-Wallis, seguida de la prueba de Dunn para múltiples comparaciones. Para los análisis estadísticos realizados, se consideró como significativo un valor inferior a P = 0,05.
Resultados:
[0114] Se evaluó el efecto terapéutico del compuesto 1, administrado oralmente en dosis de 45 y 90 mg/kg, en la progresión de la artritis inducida por colágeno en ratones. El compuesto 1 redujo significativamente y de manera dependiente de la dosis la evolución de la patología durante los 16 días de tratamiento con el fármaco. Los resultados obtenidos de este modo se resumen gráficamente en la figura 2, que muestra la evaluación de la CIA del edema, y en la figura 3, que indica la evaluación clínica de la CIA.
[0115] Este efecto estuvo presente en todos los parámetros analizados, es decir, edema (***P<0,001 frente al vehículo; prueba de Dunnett), puntuación clínica e histopatológica (*P<0,05, ***P<0,001 frente al vehículo; prueba de Dunnett).
[0116] Al comparar los resultados relacionados con el edema (figura 2) y la puntuación clínica (figura 3) con los obtenidos para el antagonista de EP4 selectivo CR6086 a una dosis de 30 mg/kg en un estudio similar, se observó un mayor efecto en la reversión de los síntomas clínicos (hinchazón de las patas) por el compuesto 1 a una dosis de 45 mg/kg. Este
resultado permitió concluir que los dos compuestos, a la misma dosis, pueden manifestar la misma actividad terapéutica potente en la progresión de la artritis en el ratón.
EJEMPLO 11
Farmacocinética
[0117] El compuesto 1 administrado a ratas Wistar mostró una excelente biodisponibilidad oral. De hecho, cuando se administró a una dosis de 5 mg/kg, el Compuesto 1 mostró una CMAX de 4270 ng/ml y una AUC (0-24 h) de 5460 ngxh/ml. La concentración CMAX de 4270 ng/ml era equivalente a una concentración plasmática de aproximadamente 9000 nM, concentración que es aproximadamente 200 veces mayor que el valor IC50 que se puede obtener a partir de la Tabla 1. Este resultado justificó totalmente la actividad del Compuesto 1 en la inhibición de la inflamación (hinchazón de la pata) en el modelo CIA representado en la figura 2.
Claims (15)
1. Ácido (R)-4-(1-(1-(4-(tr¡fluoromet¡l)benc¡l)p¡rrol¡d¡na-2-carboxam¡da)c¡cloprop¡l benzoico (compuesto 1) que presenta la siguiente estructura:
o una sal del mismo.
2. Compuesto según la reivindicación 1, donde la sal es una sal de sodio.
3. Compuesto según la reivindicación 1, donde la sal es una sal de litio.
4. Compuesto según la reivindicación 1, donde la sal es una sal de clorhidrato.
5. Proceso para la preparación de ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil) p¡rrod¡lina-2-carboxam¡da)c¡cloprop¡l benzoico (compuesto 1) o una sal del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende las siguientes etapas: a) formar la amida (intermedio P1) haciendo reaccionar (terc-butoxicarbonil)-D-prolina (N-Boc-D-prolina) con metil 4-(1-aminociclopropil) en presencia de un agente de acoplamiento
b) desproteger el grupo Boc del intermedio P1 con al menos un ácido para obtener el intermedio P2
c) alquilar el intermedio P2 con bromuro de 4-(trifluorometil) bencilo en presencia de una base para obtener el derivado de éster metílico (intermedio P3)
y
d) hidrolizar el éster metílico derivado (intermedio P3) en presencia de una base fuerte para obtener el compuesto 1
6. Proceso según la reivindicación 5, donde el agente de acoplamiento de la etapa a) es 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
7. Proceso según la reivindicación 5 o 6, donde en la etapa b) el al menos un ácido es ácido 2,2,2-trifluoroacético.
8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde en la etapa c) la base es carbonato de cesio.
9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, donde en la etapa d) la base fuerte es hidróxido de sodio.
10. Proceso para la preparación de ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil) pirrodilina-2-carboxamida)ciclopropil benzoico (compuesto 1) o una sal del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende las siguientes etapas:
a) alquilar D-Prolina con bromuro de 4-trifluorometilbencilo en presencia de una base fuerte empleando un alcohol como disolvente para obtener el intermedio P4
b) formar la amida (intermedio P3) haciendo reaccionar el intermedio P4 con metil 4-(1-aminociclopropil) benzoato en presencia de un agente de acoplamiento
, y
c) hidrolizar el intermedio P3 en presencia de una base para obtener el compuesto 1
11. Proceso según la reivindicación 10, donde, en la etapa a), la base es hidróxido de potasio y el alcohol es 2-propanol.
12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 10-11, donde, en la etapa b), el agente de acoplamiento es preferiblemente 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida.
13. Composición farmacéutica que comprende el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y excipientes farmacéuticamente aceptables.
14. Ácido (R)-4-(1-(1 -(4-(trifluorometil)bencil) pirrodilina-2-carboxamida)ciclopropil benzoico (compuesto 1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso como medicamento.
15. Ácido (R)-4-(1-(1-(4-(trifluorometil)bencil)pirrodilina-2-carboxamida) ciclopropil benzoico (compuesto 1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso como antagonista del receptor EP4 en el tratamiento de una patología que implica las actividades de la prostaglandina E2 (PGE2) en su patogénesis, donde la patología se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, espondiloartritis, artritis psoriásica y espondilitis anquilosante, artritis y dolor agudo y crónico debido a inflamación, dolor por osteoartritis, dolor por artritis con etiología inmunológica, artritis reumatoide, una enfermedad tumoral, enfermedad ocular, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en retinopatía de la prematuridad (ROP), retinopatía diabética proliferativa y degeneración macular relacionada con la edad (AMD), y endometriosis.
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