CN117866042A - 含有二硫化物的细胞穿透肽及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通用的可逆二环化策略，以增加肽基药物的所述蛋白水解稳定性和细胞渗透性两者。肽药物与短细胞穿透基序融合，并且通过一对二硫键的所述形成转化为构象受限的二环结构。所得的二环肽具有极大增强的蛋白水解稳定性以及细胞渗透性。一旦进入所述细胞内部，所述二硫键被还原以产生线性的生物活性肽。该策略用于生成针对所述NEMO‑IKK交互作用的细胞可渗透的二环肽基抑制剂。

Description

含有二硫化物的细胞穿透肽及其制备和使用方法

本申请是申请日为2017年11月09日，申请号为201780069098.8，发明名称为“含有二硫化物的细胞穿透肽及其制备和使用方法”的发明专利申请的分案申请。

关于联邦资助研究的声明

本发明为在政府支持下进行的，授权号GM062820、GM110208和GM122459，由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)提供资金。美国政府对该发明享有一定的权利。

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及细胞穿透肽及其制备和使用方法。

背景技术

与小分子药物相比，肽具有高选择性和有效性，同时相对安全且耐受性良好。肽的特别令人兴奋的应用为抑制蛋白质-蛋白质交互作用(PPI)，其仍然为小分子的挑战性靶标。因此，人们对肽的药物研究和研发兴趣增加，目前正处于临床试验评估的肽治疗剂约140种。然而，肽本身对蛋白水解的降解敏感。另外，肽通常对细胞膜不可渗透，这在很大程度上限制了它们对细胞外靶标的应用。尽管已显示肽主链的N-甲基化和分子内氢键的形成改善了某些环肽的蛋白水解稳定性和膜渗透性(T.Rezai等，J.Am.Chem.Soc.2006年，第128卷，第14073页)，但显然需要用于增加肽药物的代谢稳定性和细胞渗透性的另选策略。

NF-κB为一种转录因子，它控制参与免疫、应激、炎性反应、细胞增殖和凋亡的许多基因产物的表达(A.Oeckinghaus，S.Ghosh，Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2009年，第1卷，第a000034页)。NF-κB信号传导的异常活化与许多自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎)和癌症(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)等有关(V.Baud、M.Karin，Nat.Rev.DrugDiscov.2009年，第8卷，第33页；S.-C.Sun等人，Trends Immunol.2013年，第34卷，第282页；F.D.Herrington等人，J.Biomol.Screen.2016年，第21卷，第223页；G.Cildir等人，TrendsMol.Med.2016年，第22卷，第414页)。典型的NF-κB信号传导为在由κB(IκB)-激酶(IKK)络合物抑制剂与调节蛋白NF-κB必需改性剂(NEMO)之间的交互作用介导的(S.Yamaoka等人，Cell 1998年，第26卷，第1231页；D.M.Rothwarf等人，Nature 1998年，第395卷，第297卷)。与NEMO的结合激活了IKK，IKK继而又使IκB磷酸化，这促进了IκB的蛋白酶体降解和活性NF-κB的释放。已经报道了靶向NF-κB信号传导途径的各个步骤的调节剂，并且其中一些已经进入到临床中(V.Baud、M.Karin，Nat.Rev.Drug Discov.2009年，第8卷，第33页；S.-C.Sun等人，Trends Immunol.2013年，第34卷，第282页；F.D.Herrington等人，J.Biomol.Screen.2016年，第21卷，第223页；G.Cildir等人，Trends Mol.Med.2016年，第22卷，第414页；S.C.Gupta等人，Biochim.Biophys.Acta.2011年，第1799卷，第775页；T.M.Herndon等人，Clin.Cancer Res.2013年，第19卷，第4559页)。改善NF-κB活性的一个有吸引力的策略为选择性地破坏IKK-NEMO交互作用。先前的研究生成了一种弱的NEMO抑制剂(K_D～37μM)Antp-NBD(表6，肽1)，它含有与细胞穿透肽(CPP)Antp共价连接的IKKβ的11个残基NEMO结合结构域(NBD)(M.J.May等人，Science 2000年，第289卷，第1550页)。有趣的是，Antp-NBD阻断了不同促炎刺激对IKK活性的刺激，但不影响基础NF-κB的活性，从而为减少异常NF-κB的活性提供了一种潜在安全有效的机制(J.May等人，Science 2000年，第289卷，第1550页)。在若干临床前研究中，Antp-NBD在小鼠和犬模型中显示出治疗杜氏肌营养不良症和大B细胞淋巴瘤的体内疗效(E.Jimi等人，Nat.Med.2004年，第10卷，第617页；S.Dai等人，J.Biol.Chem.2004年，第279卷，第37219页；W.Shibata等人，J.Immunol.2007年，第179卷，第2681页；S.H.Dave等人，J.Immunol.2007年，第179卷，第7852页；A.Gaurnier-Hausser等人，Clin.Cancer Res.2011年，第17卷，第4661页；J.M.Peterson等人，Mol.Med.2011年，第17卷，第508页；D.A.Delfin等人，J.Transl.Med.2011年，第9卷，第68页；D.P.Reay等人，Neurobiol.Dis.2011年，第43卷，第598页；J.N.Kornegay等人，Skelet.Muscle 2014年，第4卷，第18页；G.Habineza Ndikuyeze等人，PLoS One，2014年，第9卷，第e95404页)。然而，为了实现临床效用，Antp-NBD将显著受益于其NEMO结合亲和力、代谢稳定性和细胞渗透性的改善。因此需要的为用于调节NF-κB信号传导的新组合物和方法。本文所公开的组合物和方法解决了这些和其他需要。

发明内容

本文公开了化合物、组合物，制备和使用这些化合物和组合物的方法。在本文所公开的各种实施方案中为二环肽、包含此类二环肽的组合物以及制备和使用它们的方法。

在一些实施方案中，本文所公开的二环肽包含：(a)第一环肽，该第一环肽包含细胞穿透肽序列(X_m)；(b)第二环肽，该第二环肽包含肽基配体(X_n)；以及(c)至少一个二硫键，该至少一个二硫键形成第一环肽或第二环肽中的至少一个，其中第一环肽与第二环肽缀合。

在各种实施方案中，X_m包含以下肽序列：

-AA¹-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-(AA⁶)_m-(AA⁷)_n-(AA⁸)_p-(AA⁹)_q-

其中：

AA¹、AA²、AA³、AA⁴、AA⁵、AA⁶、AA⁷、AA⁸和AA⁹各自独立地为氨基酸，可任选地被取代，并且其中至少三个氨基酸为精氨酸，并且至少两个氨基酸独立地包含疏水性侧链；并且

m、n、p和q独立地选自0和1。

在一些实施方案中，二环肽包含与X_m和X_n直接或间接缀合的连接结构部分。在一些实施方案中，X_m通过连接结构部分环化，X_n的C-或N-末端与连接结构部分缀合，并且X_n通过二硫键环化，从而形成二环肽。在其他实施方案中，连接结构部分与第一环肽中的氨基酸的侧链缀合，X_n的C-或N-末端与连接结构部分缀合，并且其中X_n通过二硫键环化，从而形成二环肽。

在一些实施方案中，本文所公开的二环肽包含第一二硫键和第二二硫键。在其他实施方案中，连接结构部分包含形成第一二硫键的第一取代基以及形成第二二硫键的第二取代基。在一些实施方案中，X_m通过第一二硫键环化，并且X_n通过第二二硫键环化，从而形成二环肽。在又一些实施方案中，连接结构部分与第一环肽的侧链缀合，并且X_n通过第一二硫键和第二二硫键环化，从而形成二环肽。在再一些实施方案中，X_m的C-或N-末端与连接结构部分缀合，并且X_m通过第一二硫键环化，并且其中X_n的C-或N-末端与连接结构部分缀合，并且X_n通过第二二硫键环化，从而形成二环肽。在更多实施方案中，X_n的C-或N-末端与连接结构部分缀合，并且其中X_m通过第一二硫键环化且X_n通过第二二硫键环化，从而形成二环肽。

在一些实施方案中，本文所公开的二环肽包含第三二硫键。在其他实施方案中，连接基结构部分包含形成第一二硫键的第一取代基、形成第二二硫键的第二取代基以及形成第三二硫键的第三取代基。在又一些实施方案中，X_m与X_n融合，从而形成融合的X_m-X_n肽，并且连接结构部分通过第三二硫键与所融合的X_m-X_n肽缀合，并且其中X_m通过第一二硫键环化且X_n通过第二二硫键环化，从而形成二环肽。

在一些实施方案中，本文所公开的二环肽包含第四二硫键。在一些实施方案中，连接基结构部分包含形成第一二硫键的第一取代基、形成第二二硫键的第二取代基、形成第三二硫键的第三取代基以及形成第四二硫键的第四取代基。在其他实施方案中，X_m通过第一二硫键和第二二硫键环化，并且X_n通过第三二硫键和第四二硫键环化，从而形成二环肽。

在各种实施方案中，本文所公开的二环肽具有根据式1至12中任一个的结构

其中：

AA^S在每次出现时独立地为与J形成二硫键的结构部分；

L-J为连接结构部分，其中：

J为不存在或者烷基、N-烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自独立地被至少两个取代基取代，该至少两个取代基在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键；并且

L为不存在或者将AA^S与X_m、X_n或其组合中的氨基酸连接的结构部分；并且

每个实例的SS表示二硫键。

在一些实施方案中，上述二环肽具有根据式I、II、V、VI、VII、VIII、IX、X和XII中任一个的结构，其中的每一个在下文更详细地描述。

在实施方案中，本文所公开的为包含式I或II的二环肽

其中X_m和X_n独立地包含1至20个氨基酸的序列，并且R¹为OH、OR²或NHR²，其中R²为C_1-20烷基、C_6-10芳基或杂芳基、氨基酸、2至20个氨基酸的肽序列、可检测到的结构部分或固体载体。

如本文所用，X_m指细胞穿透肽序列。在一些实施方案中，X_m的长度为5至10个氨基酸。在另一些实施方案中，X_m中的至少一个、至少两个或至少三个氨基酸具有疏水性侧链。在某些实施方案中，X_m包含一种或多种苯丙氨酸、萘丙氨酸、色氨酸或其类似物或衍生物。在一些实施方案中，X_m包含至少一种精氨酸或其类似物或衍生物。在其他实施方案中，X_m包含在表2中列出的序列(SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:146)。在某些实施方案中，X_m为或者包含RRRRΦF或FΦRRRR。

如本文所用，X_n指承载物序列。在一些实施方案中，X_n包含在表5中列出的序列(SEQID NO:147至SEQ ID NO:159)。在一些实施方案中，二环肽具有在表6中列出的序列(SEQ IDNO:160至SEQ ID NO:167)。

在本文所公开的另外的示例中为式III的肽

BMB-(AAⁿ)_u

III

其中n为5至20的整数，每个AAⁿ独立地为天然或非天然氨基酸残基，其中至少两个AAⁿ残基为半胱氨酸，并且BMB为3,5-双(巯基甲基)苯甲酸残基。在一些具体示例中，u为4至20、5至9、6至9、7至8或8至9。

在各种实施方案中，本文还公开了制备二环肽的方法，包括：

(a)使具有8至40个氨基酸的固体负载的肽与式IV的化合物接触，其中至少两个氨基酸独立地选自由以下构成的组：半胱氨酸、高半胱氨酸和具有硫醇基团的氨基酸类似物，该式IV的化合物：

其中Q¹和Q²彼此独立地选自CH或N；以及

(b)从固体载体裂解肽。

本公开的其他实施方案提供了包含式V、VI、VII、VIII、IX、X或XII的二环肽：

或其药学上可接受的盐，

其中：

AA¹、AA²、AA³、AA⁴、AA⁵、AA⁶、AA⁷、AA⁸和AA⁹各自独立地为氨基酸，可任选地被取代，其中至少三个氨基酸为精氨酸，并且至少两个氨基酸独立地包含疏水性侧链；

m、n、p和q独立地选自0和1；

AA¹⁰和AA¹¹各自独立地为氨基酸，可任选地被取代；

b和c独立地为0至20的整数；

AA^S在每次出现时独立地为与J形成二硫键的结构部分；

J为烷基、N-烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自独立地被至少两个取代基取代，该至少两个取代基在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键；

每个实例的ss表示二硫键；并且

L为将J与氨基酸、X_n或其组合连接的结构部分；并且

X_n为包含具有1至20个氨基酸的肽序列的承载物结构部分。

在一些实施方案中，J为N-烷基、芳基或杂芳基，它们各自独立地被至少两个取代基取代，该至少两个取代基在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键。在其他实施方案中，J为

在一些实施方案中，L为键、氨基酸、

其中a为0至10的整数。

在一些实施方案中，每个AA^S独立地为

其中AA^S'的C-末端形成酰胺键或者为R¹，其中R¹为OH、OR²、NHR²；并且其中R²为烷基、芳基、杂芳基、氨基酸、2至20个氨基酸的肽序列、可检测到的结构部分或固体载体。

在一些实施方案中，本文所公开的二环肽选自由以下构成的组：

/>

/>

或其药学上可接受的盐，

其中每个d独立地为1或2；并且

其中R¹为OH、OR²、NHR²；并且R²为烷基、芳基、杂芳基、氨基酸残基、2至20个氨基酸残基的肽序列、可检测到的结构部分或固体载体。

在一些实施方案中，独立地包含疏水性侧链的至少两个氨基酸选自由以下构成的组：甘氨酸、苯甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、萘丙氨酸、脯氨酸及其组合，其中苯甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或萘丙氨酸上的芳族侧链各自任选地被卤素取代。在其他实施方案中，独立地包含疏水性侧链的至少两个氨基酸独立地选自由以下构成的组：苯丙氨酸、萘丙氨酸及其组合。在又一些实施方案中，独立地包含疏水性残基的至少两个氨基酸为连续的氨基酸。

在一些实施方案中：

AA¹为L精氨酸；

AA²为L-精氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为L-苯丙氨酸；

AA⁵为L苯丙氨酸；并且

m、n、p和q各自为0。

或者

AA¹为L-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为L-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；

m为1，并且AA⁶为L-精氨酸；并且

n、p和q各自为0。

或者

AA¹为L-精氨酸；

AA²为L-精氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为L-精氨酸；

AA⁵为L-萘丙氨酸；

m为1，并且AA⁶为L-苯丙氨酸；并且

n、p和q各自为0。

在一些实施方案中，至少三个连续的氨基酸具有交替手性。在其他实施方案中，具有交替手性的至少三个连续的氨基酸为精氨酸。

在一些实施方案中：

AA¹为D-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为D-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；

m为1，并且AA⁶为D-精氨酸；并且

n、p和q各自为0。

或者

AA¹为D-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为D-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；

m和n各自为1，并且AA⁶为D-精氨酸并且AA⁷为L-精氨酸；并

且

p和q各自为0。

或者

AA¹为D-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为D-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；

m和n各自为1，并且AA⁶为D-精氨酸并且AA⁷为L-苯丙氨酸；

并且

p和q各自为0。

在其他实施方案中，AA¹、AA²、AA³、AA⁴、AA⁵、AA⁶、AA⁷、AA⁸和AA⁹选自SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:146。

在一些实施方案中，X_n中的肽序列抑制至少一种蛋白质-蛋白质交互作用。在其他实施方案中，蛋白质-蛋白质交互作用为在κB-激酶(IKK)络合物与调节蛋白NF-κB必需改性剂(NEMO)之间的交互作用。在又一些实施方案中，X_n中的肽序列为针对Ras、PTP1 B、Pin 1、Grb2 SH2、MDM2或其组合的抑制剂。在再一些实施方案中，X_n中的肽序列为野生型肽基配体或肽模拟物。

在一些实施方案中，本文提供了根据式V-A、VI-A、VII-A、VIII-A、IX-A、X-A或XII-A和XII-B的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

AA¹、AA²、AA³、AA⁴、AA⁵、AA⁶、AA⁷、AA⁸、AA⁹、AA¹⁰和AA¹¹独立地选自任选地被取代的氨基酸，其中至少三个氨基酸为精氨酸，并且至少两个氨基酸独立地包含疏水性侧链；

m、n、p或q独立地选自0和1；

b和c独立地为0至20的整数；

AA^S′在每次出现时独立地为包含硫醇的结构部分；

J为烷基、N-烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自独立地被至少两个硫醇取代基取代；并且

L为将AA^S′与氨基酸、X_n或其组合连接的任选的结构部分；并且

X_n为包含具有4至20个氨基酸的肽序列的承载物结构部分。

在一些实施方案中，J′为N-烷基、芳基或杂芳基。在另一些实施方案中，J′为

在一些实施方案中，L为不存在、氨基酸、

其中a为0至20的整数。

在一些实施方案中，每个AA^S′独立地为

其中AA^S′的C-末端形成酰胺键或者为R¹，其中R¹为OH、OR²、

NHR²；并且其中R²为烷基、芳基、杂芳基、氨基酸残基、2至20个氨基酸残基的肽序列、可检测到的结构部分或固体载体。

在一些实施方案中，化合物具有选自由以下构成的组的结构

/>

或其药学上可接受的盐，其中每个d独立地为1或0。

在上述化合物的实施方案中，独立地包含疏水性侧链的至少两个氨基酸选自由以下构成的组：甘氨酸、苯甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、萘丙氨酸、脯氨酸及其组合，其中苯甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、萘丙氨酸上的芳族残基任选地被取代。在其他实施方案中，独立地包含疏水性侧链的至少两个氨基酸选自由以下构成的组：苯丙氨酸、萘丙氨酸及其组合。在又一些实施方案中，独立地包含疏水性侧链的至少两个氨基酸为连续的氨基酸。

在一些实施方案中：

AA¹为L精氨酸；

AA²为L-精氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为L-苯丙氨酸；

AA⁵为L苯丙氨酸；并且

m、n、p和q各自为0。

或者

AA¹为L-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为L-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；

m为1，并且AA⁶为L-精氨酸；并且

n、p和q各自为0。

或者

AA¹为L-精氨酸；

AA²为L-精氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为L-精氨酸；

AA⁵为L-萘丙氨酸；

m为1，并且AA⁶为L-苯丙氨酸；并且

n、p和q各自为0。

在一些实施方案中，至少三个连续的氨基酸具有交替手性。在其他实施方案中，具有交替手性的至少三个连续的氨基酸为精氨酸。

在一些实施方案中：

AA¹为D-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为D-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；

m为1，并且AA⁶为D-精氨酸；并且

n、p和q各自为0。

或者

AA¹为D-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为D-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；

m和n各自为1，并且AA⁶为D-精氨酸并且AA⁷为L-精氨酸；并

且

p和q各自为0。

或者

AA¹为D-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为D-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；

m和n各自为1，并且AA⁶为D-精氨酸并且AA⁷为L-苯丙氨酸；

并且

p和q各自为0。

在其他实施方案中，AA¹、AA²、AA³、AA⁴、AA⁵、AA⁶、AA⁷、AA⁸和AA⁹选自SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:146。

在一些实施方案中，X_n中的肽序列抑制至少一种蛋白质-蛋白质交互作用。在另一些实施方案中，蛋白质-蛋白质交互作用为在κB-激酶(IKK)络合物与调节蛋白NF-κB必需改性剂(NEMO)之间的交互作用。在其他实施方案中，X_n中的肽序列为针对Ras、PTP1 B、Pin 1、Grb2 SH2、MDM2或其组合的抑制剂。在又一些实施方案中，X_n中的肽序列为肽基，为野生型肽配体或肽模拟物。

在各种实施方案中，公开了根据式XI的化合物：

其中：

每个实例的Y独立地为CH、N、O或S，条件是不超过四个Y为N、O、S或其组合；

Z为OR_a、氢、卤素、碳环基、杂环基或氨基酸；

每个实例的R独立地为烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基或氨基酸；并且

R_a独立地为H、C(O)烷基、烷基、烯基、炔基、碳环或杂环基。

在一些实施方案中，Y独立地为CH。在其他实施方案中，化合物具有根据式XI-A的结构：

在一些实施方案中，每个R独立地为芳基或杂芳基。在另一些实施方案中，化合物具有根据式XI-B的结构：

其中每个实例的Q独立地为CH或N。

在一些实施方案中，Z为OH。在其他实施方案中，化合物具有以下结构：

本文还公开了将治疗剂递送到细胞的细胞质的方法，包括施用权利要求18至38中任一项所述的化合物。

还公开了包含药物载体和本文所公开的二环肽的药物组合物。

本文还公开了治疗或预防受试者诸如人的障碍的方法，包括向受治疗者施用有效量的本文公开的化合物或其药学上可接受的盐。在一些示例中，受试者为动物，诸如人。在一些示例中，受试者被识别为具有治疗该障碍的需要。在一些示例中，该方法治疗障碍。在一些示例中，该障碍与异常的NF-κB信号传导相关联。在一些示例中，该障碍与不受控制的细胞增殖(诸如癌症)相关联。在一些示例中，该障碍为癌症。在一些示例中，该障碍为炎性障碍，诸如肠易激综合征。在一些示例中，该障碍为自身免疫障碍，诸如选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、牛皮癣、化脓性汗腺炎和难治性哮喘的障碍。在一些另外的示例中，本文公开了治疗杜氏肌营养不良症或大B细胞淋巴瘤的方法。

本文还公开了识别用于治疗障碍的候选药物的方法，该方法包括以下步骤：暴露本文所公开的化合物，通过本文所公开的方法制备的化合物，本文所公开的文库，通过公开与该障碍相关联的受体的方法制备的文库；b)检测在受体与化合物或文库之间的反应；以及c)确定化合物与受体反应的特性。

虽然本发明的各方面可以特定的法定类别(诸如系统法定类别)进行描述和受权利要求书保护，但这仅是为了方便并且本领域技术人员将理解本发明的每个方面可以任何法定类别进行描述和受权利要求书保护。除非另有明确说明，否则绝无意于将本文所陈述的任何方法或方面理解为要求其步骤以特定顺序执行。因此，在方法权利要求在权利要求或说明书中不具体地说明该步骤被限制为特定顺序的情况下，绝无意于在任何方面推断出一种顺序。这适用于任何可能的非明确的解读基础，包括：关于步骤或操作流程的安排的逻辑问题，从语法组织或标点符号推导的普通意义，或者在说明书中描述的各方面的数量或类型。

附图说明

并入并构成本说明书一部分的附图示出了若干方面，并且连同说明书一起用来解释本发明的原理。

图1A示出了用5μM FITC标记的肽cFΦR4(SEQ ID NO.:68)或1至5处理2小时之后HeLa细胞的MFI，如通过流式细胞术分析所确定的。空白，无肽。图1B示出了通过HTRF测定监测的肽1、4和5对NEMO-IKKγ交互作用的抑制。图1C示出了肽1、4和5对TNFα诱导的HEK293细胞中NF-κB信号传导的激活的剂量依赖性抑制。图1D示出了肽1、4和6的血清稳定性的比较。报告的数据为三次独立实验的平均值±SD。

图2为可逆肽二环化策略。GSH，谷胱甘肽。

图3示出了FITC标记的肽2和3的结构。

图4示出了肽4、5和6的结构。

图5A为制备性反相HPLC色谱图，示出了固相合成和用乙醚研磨后粗制肽4的纯化。图5B为在室温下用5mM谷胱甘肽在磷酸盐缓冲液(pH7.4)中温育2小时之前和之后纯化的肽4的分析反相HPLC和MALDI-TOF MS分析。

图6示出了通过HTRF测定监测的肽RRRRΦFCALDWSWLQC(IC₅₀＝1.4μM)(SEQ IDNO.:215)和RRRRΦFTALDWSWLQT(IC₅₀＝1.6μM)(SEQ ID NO.:216)对NEMO-IKKγ交互作用的抑制。

图7为分析反相HPLC，示出了该工作中使用的其他肽的纯度。通过MALDI-TOF MS分析证实肽的真实性。

图8为含有三-(二硫化物)的二环肽的示意图。

图9为含有二-(二硫化物)的二环肽的示意图，该二环肽在进入细胞的细胞溶质时从环状细胞穿透肽中释放承载物。

图10A示出了包含环状的二环肽的结构，该环状物包含与针对Keap1-Nrf2的肽基抑制剂缀合的CPP12(FfΦRrRr)，其具有荧光标记(NFL)。图10B示出了针对Keap1-Nrf2的线性肽基抑制剂的结构，其在不存在环状CPP的情况下具有荧光标记(NFL)。

图11示出了包含环状的二环肽的结构，该环状物包含与针对Pin1的肽基抑制剂缀合的环状CPP12(FfΦRrRr)，其具有荧光标记(NFL)。

图12A示出了包含环状的二环肽的结构，该环状物包含与针对CAL PDZ-CFTR交互作用的肽基抑制剂缀合的环状CPP12(FfΦRrRr)，其具有荧光标记(NFL)。图12B示出了针对CAL PDZ-CFTR交互作用的线性肽基抑制剂的结构，其在不存在环状CPP的情况下具有荧光标记(NFL)。

图13A示出了包含环状的二环肽的结构，该环状物包含与针对MDM2-p53交互作用(PMI)的肽基抑制剂缀合的环状CPP12(FfΦRrRr)，其具有荧光标记(NFL)。图13B示出了针对PMI的线性肽基抑制剂的结构，其在不存在环状CPP的情况下具有荧光标记(NFL)。

图14图解说明了与环状CPP-肽缀合物(即，本公开的二环肽)相比，未缀合的肽基抑制剂的细胞溶质摄取效率。

图15A示出了包含环状的二环肽的结构，该环状物包含与针对Keap1-Nrf2的肽基抑制剂缀合的环状CPP12(FfΦRrRr)。图15B示出了在不存在环状CPP的情况下针对Keap1-Nrf2的线性肽基抑制剂的结构。

图16示出了包含环状的二环肽的结构，该环状物包含与针对Pin1的肽基抑制剂缀合的环状CPP12(FfΦRrRr)。

图17图解说明了与针对PMI的线性肽基抑制剂相比，包含与针对MDM2-p53交互作用(PMI)的肽基抑制剂缀合的环状CPP12(FfΦRrRr)的二环肽的血清稳定性。

图18图解说明了与针对Keap1-Nrf2的线性肽基抑制剂相比，包含与针对Keap1-Nrf2的肽基抑制剂缀合的环状CPP12(FfΦRrRr)的二环肽的血清稳定性。

图19图解说明了与针对P1的线性肽基抑制剂相比，包含与针对Pin-1(P1)的肽基抑制剂缀合的CPP12(FfΦRrRr)的二环肽的血清稳定性。

具体实施方式

通过参考本发明的以下详细描述和其中包括的实施例和附图，可以更容易地理解本发明。

应当理解，在公开和描述本发明化合物、组合物、制品、系统、装置和/或方法之前，除非另有说明，否则它们不限于特定合成方法，或者除非另有说明，否则不限于特定试剂，因此当然可以改变。另外应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定方面的目的，并非旨在进行限制。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本发明，但是现在描述了示例方法和材料。

本文提及的所有出版物均通过引用方式并入本文，以公开和描述与所引用的出版物结合的方法和/或材料。本文所讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供的。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于先前的发明而无权提前提出此类出版物。此外，本文提供的出版物的日期可能与实际出版日期不同，这可能需要独立确认。

一般定义

如本文所用，化合物(包括有机化合物)的命名法可以使用通用名称、IUPAC、IUBMB或CAS命名法推荐给出。当存在一种或多种立体化学特征时，可以采用立体化学的Cahn-Ingold-Prelog规则来指定立体化学优先级、E/Z规格等。如果给出名称，本领域技术人员可以通过使用命名惯例通过系统地还原化合物结构，或通过商购获得的软件，诸如CHEMDRAW^TM(美国Cambridgesoft Corporation公司)，容易地确定化合物的结构。

如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”(“a”、“an”)和“所述”(“the”)包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“官能团”、“烷基”或“残基”包括两个或更多个此类官能团、烷基或残基的混合物等。

在本文中，范围可被表达为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，其他方面包括从一个特定值和/或到其他特定值。相似地，当采用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成了其他方面。还应当理解，每个范围的端值相对于另一个端值以及独立于另一个端值都为有意义的。还应当理解，本文公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应当理解，还公开了在两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

本说明书和结论权利要求中提及组合物中特定元素或成分的重量份表示在元素或成分与组合物或制品中表达重量份的任何其他元素或成分之间的重量关系。因此，在含有2重量份成分X和5重量份成分Y的化合物中，X和Y以2:5的重量比存在，并且无论化合物中是否含有另外的成分，都以此比率存在。

除非另有说明，否则成分的重量百分比(重量％)为基于包含该成分的制剂或组合物的总重量。

如本文所用，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以或可以不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例和其不发生的实例。

如本文所用，术语“受试者”是指施用目标，例如受试者。因此，本文所公开的方法的受试者可以为脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。另选地，本文所公开的方法的受试者可以为人、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠、鱼、鸟或啮齿动物。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在涵盖成人和新生儿受试者以及胎儿，无论是男性还是女性。在一些示例中，受试者为哺乳动物。患者是指患有疾病或障碍的受试者。术语“患者”包括人和兽医受试者。在所公开方法的一些示例中，在施用步骤之前已经诊断出受试者需要对癌症进行治疗。在所公开方法的一些示例中，在施用步骤之前受试者已被诊断患有癌症。术语受试者还包括细胞，诸如动物，例如人、细胞。

如本文所用，术语“治疗”是指对患者进行的意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍的医疗管理。该术语包括积极治疗，即治疗特别指向疾病、病理状况或障碍的改善，并且还包括病因治疗，即治疗指向去除相关联的疾病、病理状况或障碍的病因。此外，该术语包括姑息治疗，即，设计用于减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或障碍的治疗；预防性治疗，即涉及使相关联的疾病、病理状况或障碍的发展最小化或者部分或完全抑制的治疗；以及支持性治疗，即用于补充针对相关联的疾病、病理状况或障碍的改善的另一种特定疗法的治疗。在一些示例中，该术语涵盖受试者的任何治疗，包括哺乳动物(例如，人)，并且包括：(i)预防疾病发生在易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中；(ii)抑制疾病，即，阻止其发展；或(iii)缓解疾病，即，导致疾病消退。在一些示例中，受试者为哺乳动物，诸如灵长类动物，并且在一些示例中，受试者为人。术语“受试者”还包括驯养的动物(例如，猫、狗等)、牲畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊、鱼、鸟等)和实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、果蝇等)。

如本文所用，术语“预防”(“prevent”或“preventing”)是指排除、避免、消除、防止、阻止或阻碍某些事情的发生，尤其是通过提前行动。应当理解，除非另有明确指明，否则本文在使用减少、抑制或预防的情况下，也明确公开了其他两个词的使用。

如本文所用，术语“诊断的”意指已经由技术人员(例如，医生)进行身体检查，并且发现其具有可通过本文公开的化合物、组合物或方法诊断或治疗的病症。例如，“被诊断患有癌症”意指已经由技术人员(例如，医生)进行身体检查，并且发现其具有可通过可以治疗或预防癌症的化合物或组合物诊断或治疗的病症。作为另一个示例，“被诊断为需要对癌症进行治疗或预防”是指已经由技术人员(例如，医生)进行身体检查，并且发现其具有以癌症或其他疾病为特征的病症，其中对癌症进行治疗或预防对受试者有益。

如本文所用，短语“被识别为需要对障碍进行治疗”等是指基于治疗障碍的需要选择受试者。例如，基于本领域技术人员的早期诊断，然后对受试者进行障碍治疗，可以将受试者识别为需要对该障碍进行治疗(例如，与癌症相关的障碍)。在一些示例中，预期识别可以由与进行诊断的人不同的人执行。在一些示例中，还预期施用可由随后执行施用的人执行。

如本文所用，术语“施用”(“administering”和“administration”)是指向受试者提供药物制剂的任何方法。此类方法为本领域技术人员所熟知的，包括但不限于口服施用、透皮施用、吸入施用、鼻腔施用、局部施用、阴道施用、眼科施用、口内施用、脑内施用、直肠施用、舌下施用、口腔施用和肠胃外施用，包括注射，诸如静脉内施用、动脉内施用、肌内施用和皮下施用。施用可以为连续的或间歇的。在一些示例中，制剂可以治疗性施用；即，施用于治疗现有疾病或病症。在一些示例中，制剂可以预防性施用；即，施用于预防疾病或病症。

如本文所用，术语“接触”是指将所公开的化合物和细胞、靶受体或其他生物实体结合在一起，以这样的方式，该化合物可以直接影响靶标(例如受体、转录因子、细胞等)的活性；即，通过与目标本身交互作用，或间接地；即，通过与靶标活性所依赖的另一种分子、辅因子、因子或蛋白质交互作用。

如本文所用，术语“有效量”和“量有效”是指足以实现所需结果或对不希望的病症产生影响的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现所需治疗结果或对不希望的症状产生影响的量，但通常不足以引起不良副作用。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体成分；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；所采用特定化合物的排泄率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或重合使用的药物和医学领域熟知的相似因子。例如，开始剂量的化合物的水平低于达到所需治疗效果所需的水平并逐渐增加剂量直至达到所需效果完全在本领域技术范围内。如果需要，可以将有效日剂量分成多个剂量以用于施用目的。因此，单剂量组合物可含有此类量或其约数以构成日剂量。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可在一天或若干天内每天给予一次或多次剂量施用。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到关于适当剂量的指导。在一些示例中，制剂可以“预防有效量”施用；即，有效预防疾病或病症的量。

如本文所用，“EC₅₀”意指50％增强或活化生物过程或过程成分所需的物质(例如化合物或药物)的浓度或剂量，包括蛋白质、亚基、细胞器、核糖核蛋白等。EC₅₀还指体内50％增强或活化所需的物质的浓度或剂量，如本文其他地方进一步定义的。另选地，EC₅₀可以指在基线与最大响应之间的中部引起响应的化合物的浓度或剂量。可以在体外或体内系统中测量响应，这对于感兴趣的生物反应来说为方便且适当的。例如，可以使用培养的肌肉细胞或在具有分离的肌纤维的离体器官培养系统中体外测量响应。另选地，可以使用适当的研究模型(诸如啮齿动物，包括小鼠和大鼠)在体内测量响应。小鼠或大鼠可以为具有感兴趣的表型特征的近交品系，诸如肥胖症或糖尿病。适当时，可以在转基因或基因敲除的小鼠或大鼠中测量响应，其中已经酌情引入或敲除一个或多个基因以复制疾病过程。

如本文所用，“IC₅₀”意指50％抑制或缩减生物过程或过程成分所需的物质(例如化合物或药物)的浓度或剂量，包括蛋白质、亚基、细胞器、核糖核蛋白等。IC₅₀还指体内50％抑制或缩减所需的物质的浓度或剂量，如本文其他地方进一步定义的。另选地，IC₅₀也指物质的半数最大(50％)抑制浓度(IC)或抑制剂量。可以在体外或体内系统中测量响应，这对于感兴趣的生物反应来说为方便且适当的。例如，可以使用培养的肌肉细胞或在具有分离的肌纤维的离体器官培养系统中体外测量响应。另选地，可以使用适当的研究模型(诸如啮齿动物，包括小鼠和大鼠)在体内测量响应。小鼠或大鼠可以为具有感兴趣的表型特征的近交品系，诸如肥胖症或糖尿病。适当时，可以在转基因或基因敲除的小鼠或大鼠中测量响应，其中已经酌情引入或敲除一个或多个基因以复制疾病过程。

术语“药学上可接受的”描述了一种在生物学上或其它方面不合乎需要的材料，即，不会产生不可接受水平的不良生物学效应或以有害的方式交互作用。

如本文所用，术语“衍生物”是指具有衍生自母体化合物结构(例如，本文公开的化合物)的结构的化合物，并且它的结构与本文所公开的那些结构充分相似并且基于该相似性，本领域技术人员可以预期，本发明要求保护的化合物具有与要求保护的化合物相同或相似的活性和用途，或者作为前体诱导与要求保护的化合物相同或相似的活性和用途。示例性衍生物包括盐、酯、酰胺、酯或酰胺的盐以及母体化合物的N-氧化物。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液以及用于在使用前重建成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或载体的示例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。可例如通过使用包衣材料诸如卵磷脂、通过在分散体情况下维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。这些组合物还可含有辅佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸等可以确保预防微生物的作用。还可能需要包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。通过包含延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射药物形式的延长吸收。通过在可生物降解的聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中形成药物的微胶囊基质来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比率以及所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库可注射制剂。可注射制剂可以例如通过细菌截留过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂灭菌，这些灭菌剂可以在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载体可包括糖，诸如乳糖。有利地，至少95％重量的活性成分颗粒的有效粒径为0.01至10微米。

在本说明书和结论权利要求中使用的化学物类的残基是指在特定反应方案或后续制剂或化学产品中化学物类的所得的产物的结构部分，无论该结构部分是否实际上为从该化学物类中获得的。因此，聚酯中的乙二醇残基是指聚酯中的一个或多个-OCH₂CH₂O-单元，无论是否使用乙二醇来制备聚酯。相似地，聚酯中的癸二酸残基是指聚酯中的一个或多个-CO(CH₂)₈CO-结构部分，无论残基是否通过使癸二酸或其酯反应以获得聚酯而获得。又如，肽中的例如氨基酸残基是指一个或多个-AA-结构部分，并且此类残基在本文中可以互换地称为氨基酸或氨基酸残基。

化学定义

如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有允许取代基。在一些示例中，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、以及芳族和非芳族的取代基。示例性取代基包括例如下文所述的那些。适当有机化合物的允许的取代基可为一个或多个并且相同或不同。出于本公开的目的，杂原子(诸如氮)可具有满足杂原子化合价的氢取代基和/或本文所述有机化合物的任何允许取代基。本公开不旨在以任何方式受限于有机化合物的允许取代基。而且，术语“替代”或“替换为”包括隐含的前提条件，此类取代是根据取代原子和取代基的允许化合价，并且该取代产生稳定的化合物，例如不会自发地进行转化的化合物，诸如通过重排、环化、消除等。还预期，在某些示例中，除非明确相反地指出，否则各个取代基还可以任选地被取代(即，进一步取代或未取代)。

在定义各种术语时，“A¹”、“A²”、“A³”和“A⁴”在本文中用作表示各种特定取代基的通用符号。这些符号可为任何取代基，而不限于本文所公开的那些，并且当其在一个实例中被定义为某些取代基时，其可在另一个实例中被定义为某些其它取代基。

本文所用的术语“烷基”为1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基团，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基基团可以为环状或无环的。烷基基团可以为支链或非支链的。烷基基团也可以为取代或未取代的。例如，烷基基团可以被一个或多个基团取代，包括但不限于烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。“低级烷基”基团为含有1至6个(例如1至4个)碳原子的烷基基团。

在整个说明书中，“烷基”通常用于指未取代的烷基基团和取代的烷基基团两者；然而，还通过鉴定烷基基团上的特定取代基，在本文对取代的烷基基团特定地赋予名称。例如，术语“卤代烷基”(“halogenated alkyl”或“haloalkyl”)具体地指被一个或多个卤化物(例如，氟、氯、溴或碘)取代的烷基基团。术语“烷氧基烷基”具体地指被一个或多个烷氧基基团(如下所述)取代的烷基基团。术语“烷基氨基”具体地指被一个或多个烷氧基基团(如下所述)取代的氨基等。当“烷基”用于一个实例且特定术语如“烷基醇”用于另一个实例时，并不意味着暗示术语“烷基”也不指特定术语如“烷基醇”等。

该实践也用于本文所述的其它基团。换言之，当术语诸如“环烷基”指未取代和取代的环烷基部分两者时，取代的部分可在本文另外特别指明；例如，特定取代的环烷基可被称为例如“烷基环烷基”。类似地，取代的烷氧基可被具体地称为例如“卤代烷氧基”，特定取代的烯基可为例如“烯基醇”等。同样，使用一般术语如“环烷基”和特定术语如“烷基环烷基”的实践并不意味着暗示一般术语也不包括特定术语。

如本文所用，术语“环烷基”为由至少三个碳原子构成的非芳族碳基环。环烷基团的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基等。术语“杂环烷基”为如上定义的一类环烷基基团，并且包括在术语“环烷基”的含义之内，其中环中的至少一个碳原子被杂原子(诸如但不限于氮、氧、硫或磷)替代。环烷基基团和杂环烷基基团可为取代或未取代的。环烷基团和杂环烷基团可被一个或多个基团取代，这些基团包括但不限于烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、酰基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基氧基、磺酰基、砜、亚砜、或硫醇(如本文所述)。

如本文所用，术语“聚亚烷基基团”为具有两个或更多个彼此连接的CH₂基团的基团。聚亚烷基基团可由式—(CH₂)_a—表示，其中“a”为2至500的整数。

本文所用的术语“烷氧基”(“alkoxy”和“alkoxyl”)是指通过醚键键合的烷基或环烷基基团；也就是说，“烷氧基”基团可以定义为-OA¹，其中A^l为如上定义的烷基或环烷基。“烷氧基”还包括如上所述的烷氧基基团的聚合物；也就是说，烷氧基可以为聚醚，诸如—OA¹—OA²或—OA¹—(OA²)_a—OA³，其中“a”为1至200的整数，A¹、A²和A³为烷基和/或环烷基基团。

如本文所用，术语“烯基”为具有2至24个碳原子的烃基团，其结构式含有至少一个碳-碳双键。非对称结构诸如(A¹A²)C＝C(A³A⁴)旨在包括E和Z异构体两者。这可以在存在不对称烯烃的本文结构式中推断出，或者其可由键符号“＝”明确指示。烯基基团可以被一个或多个基团取代，包括但不限于，烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。

“碳环”(“Carbocyclyl”、“carbocyclic ring”或“carbocycle”)是指环结构，其中形成环的原子各自为碳。碳环可在环中包含3至20个碳原子。碳环包括如本文所定义的芳基和环烷基、环烯基和环炔基。碳环基团可以为取代的或未取代的。碳环基团可以被一个或多个基团取代，包括但不限于，烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。

如本文所用，术语“环烯基”为由至少三个碳原子组成并含有至少一个碳-碳双键的非芳族碳基环，即C＝C。环烯基基团的示例包括但不限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基、降冰片烯基等。术语“杂环烯基”为如上定义的一类环烯基基团，并且包括在术语“环烯基”的含义之内，其中环中的至少一个碳原子被杂原子(诸如但不限于氮、氧、硫或磷)替代。环烯基基团和杂环烯基基团可为取代或未取代的。环烯基基团和杂环烯基基团可以被一个或多个基团取代，包括但不限于，烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。

如本文所用，术语“炔基”为具有2至24个碳原子的烃基团，其结构式含有至少一个碳-碳三键。炔基基团可以被一个或多个基团未取代或取代，包括但不限于，烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。

如本文所用，术语“环炔基”为由至少七个碳原子组成并含有至少一个碳-碳三键的非芳族碳基环。环炔基基团的示例包括但不限于环庚基、环辛炔基、环壬炔基等。术语“杂环炔基”为如上定义的一类环烯基基团，并且包括在术语“环炔基”的含义之内，其中环中的至少一个碳原子被杂原子(诸如但不限于氮、氧、硫或磷)替代。环炔基基团和杂环炔基基团可为取代或未取代的。环炔基基团和杂环炔基基团可以被一个或多个基团取代，包括但不限于，烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。

如本文所用，术语“芳基”为含有任何碳基芳族基团的基团，包括但不限于苯、萘、苯基、联苯、苯氧基苯等。术语“芳基”也包括“杂芳基”，其被定义为含有具有至少一个引入芳族基团环内的杂原子的芳族基团的基团。杂原子的示例包括但不限于氮、氧、硫和磷。同样，术语“非杂芳基”也包括在术语“芳基”中，定义了含有不含杂原子的芳族基团的基团。芳基可为取代或未取代的。芳基基团可以被一个或多个基团取代，包括但不限于，烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。术语“联芳基”为一种特定类型的芳基基团并且包括在芳基的定义之中。联芳基是指经由稠环结构键合在一起的两个芳基基团，如萘，或者经由一个或多个碳-碳键连接的两个芳基基团，如联苯基。

如本文所用，术语“醛”由式—C(O)H表示。在整个说明书中，“C(O)”为羰基基团的简写符号，即，C＝O。

如本文所用，术语“胺”或“氨基”由式—NA¹A²表示，其中A¹和A²可独立地为氢或烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，如本文所述。

如本文所用，术语“烷基氨基”由式—NH(-烷基)表示，其中烷基为如本文所述。代表性示例包括但不限于甲氨基基团、乙氨基基团、丙氨基基团、异丙氨基基团、丁氨基基团、异丁氨基基团、(仲丁基)氨基基团、(叔丁基)氨基基团、戊基氨基基团、异戊基氨基基团、(叔戊基)氨基基团、己基氨基基团等。

如本文所用，术语“二烷基氨基”由式—N(-烷基)₂表示，其中烷基为如本文所述。代表性示例包括但不限于二甲氨基基团、二乙氨基基团、二丙氨基基团、二异丙基氨基基团、二丁基氨基基团、二异丁基氨基基团、二(仲丁基)氨基基团、二(叔丁基)氨基基团、二戊氨基基团、二异戊基氨基基团、二(叔戊基)氨基基团、二己氨基基团、N-乙基-N-甲氨基基团、N-甲基-N-丙氨基基团、N-乙基-N-丙氨基基团等。

如本文所用，术语“羧酸”由式—C(O)OH表示。

如本文所用，术语“酯”由式—OC(O)A¹或—C(O)OA¹表示，其中A^l可以为烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，如本文所述。如本文所用，术语“聚酯”由下式—(A¹O(O)C-A²-C(O)O)_a—或—(A¹O(O)C-A²-OC(O))_a—表示，其中A^l和A²可以独立地为本文所述的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，“a”为1至500的整数。“聚酯”为用于描述通过在具有至少两个羧酸基团的化合物与具有至少两个羟基基团的化合物之间的反应产生的基团的术语。

如本文所用，术语“醚”由式A¹OA²表示，其中A¹和A²可独立地为烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，如本文所述。如本文所用，术语“聚醚”由下式—(A¹O-A²O)_n—表示，其中A^l和A²可以独立地为本文所述的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，“a”为1至500的整数。聚醚基团的示例包括聚环氧乙烷、聚环氧丙烷和聚环氧丁烷。

如本文所用，术语“卤化物”是指卤素氟、氯、溴和碘。

如本文所用，术语“杂环”是指单环和多环芳族或非芳族环体系，其中至少一个环成员不为碳。杂环包括氮杂环丁烷、二恶烷、呋喃、咪唑、异噻唑、异恶唑、吗啉、恶唑(恶唑包括1,2,3-恶二唑、1,2,5-恶二唑和1,3,4-恶二唑)、哌嗪、哌啶、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯烷、四氢呋喃、四氢吡喃、四嗪(包括1,2,4,5-四嗪)、四唑(包括1,2,3,4-四唑和1,2,4,5-四唑)、噻二唑(包括1,2,3-噻二唑、1,2,5-噻二唑和1,3,4-噻二唑)、噻唑、噻吩、三嗪(包括1,3,5-三嗪和1,2,4-三嗪)、三唑(包括1,2,3-三唑、1,3,4-三唑)等。

“N-烷基”是指含有至少一个氮的如上定义的烷基，其中烷基与分子其余部分的附接点为通过N-烷基基团中的氮原子。除非在本说明书中另有说明，否则N-烷基基团可任选地被取代。

如本文所用，术语“羟基”由式—OH表示。

如本文所用，术语“酮”由式A¹C(O)A²表示，其中A¹和A²可独立地为烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，如本文所述。

如本文所用，术语“叠氮化物”由式—N₃表示。

如本文所用，术语“硝基”由式—NO₂表示。

如本文所用，术语“腈”由式—CN表示。

如本文所用，术语“甲硅烷基”由式—SiA¹A²A³表示，其中A¹、A²和A³可独立地为氢或烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，如本文所述。

如本文所用，术语“磺基氧基”由式—S(O)A¹、—S(O)₂A¹、—OS(O)₂A¹或—0S(O)₂OA¹表示，其中A^l可以为氢或烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，如本文所述。在整个说明书中，“S(O)”为S＝O的简写符号。如本文所用，术语“磺酰基”是指由式—S(O)₂A¹表示的磺基氧基基团，其中A^l可以为氢或烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，如本文所述。如本文所用，术语“砜”由式A¹ S(O)₂A²表示，其中A¹和A²可独立地为烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，如本文所述。如本文所用，术语“亚砜”由式A¹S(O)A²表示，其中A¹和A²可独立地为烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，如本文所述。

如本文所用，术语“硫醇”由式—SH表示。

如本文所用，“R¹”、“R²”、“R³”、“Rⁿ”(其中n为整数)可独立地具有一个或多个以上列出的基团。例如，如果R¹为直链烷基基团，则烷基基团中的一个氢原子可任选地被羟基基团、烷氧基基团、烷基基团、卤化物等取代。根据所选的基团，可将第一基团引入第二基团内，或者另选地，第一基团可侧挂(即连接)于第二基团。例如，关于短语“包含氨基基团的烷基基团”，可将氨基基团引入烷基基团的主链内。另选地，可将氨基连接到烷基基团的主链上。选定基团的性质将确定第一基团是否嵌入或连接到第二基团上。

如本文所述，化合物可含有“任选地取代的”结构部分。一般来讲，术语“取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，它是指指定结构部分的一个或多个氢被合适的取代基取代。除非另外指明，否则“任选地取代的”基团可在该基团的每个可取代位置具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的超过一个位置可以被选自特定基团的超过一个取代基取代时，该取代基在每个位置可以相同或不同。本文设想的取代基的组合优选为导致形成稳定或化学上可行的化合物的那些。还预期在一些示例中，除非明确地相反指出，否则各个取代基还可以任选地被取代(即，进一步取代或未取代)。

如本文所用，术语“稳定的”是指当经受允许其产生、检测的病症时基本上不改变的化合物，并且在一些示例中，它们的回收、纯化和用于本文公开的一个或多个目的。

“任选地取代的”基团的可取代碳原子上的合适的一价取代基独立地为卤素；—(CH₂)_0-4R^o；—O(CH₂)_0-4R^o、—O—(CH₂)_0-4C(O)OR^o；—(CH₂)_0-4CH(OR^o)₂；—(CH2)_0-4SR^o；—(CH₂)_0-4Ph，可以用R^o替代；—(CH₂)₀-₄O(CH₂)_0-1Ph，可以用R^o替代；—CH＝CHPh，可以用R^o替代；—(CH₂)_0-4O(CH₂)_0-1-吡啶基，可以用R^o替代；—NO₂；—CN；—N₃；—(CH₂)_0-4N(R^o)₂；—(CH₂)_0-4N(R^o)C(O)R^o；—N(R^o)C(S)R^o；—(CH₂)_0-4N(R^o)C(O)NR^o ₂；—N(R^o)C(S)NR^o ₂；—(CH₂)_{0- 4}N(R^o)C(O)OR^o；—N(R^o)N(R^o)C(O)R^o；—N(R^o)N(R^o)C(O)NR^o ₂；—N(R^o)N(R^o)C(O)OR^o；—(CH₂)_0-4C(O)R^o；—C(S)R^o；—(CH₂)_0-4C(O)0R^o；—(CH₂)_0-4C(O)SR^o；—(CH₂)_0-4C(O)OSiR^o ₃；—(CH₂)_0-4OC(O)R^o；—OC(O)(CH₂)_0-4SR—、SC(S)SR^o；—(CH₂)_0-4SC(O)R^o；—(CH₂)_0-4C(O)NR^o ₂；—C(S)NR^o ₂；—C(S)SR^o；—SC(S)SR^o、—(CH₂)_0-4OC(O)NR^o ₂；—C(O)N(OR^o)R^o；—C(O)C(O)R^o；—C(O)CH₂C(O)R^o；—C(NOR^o)R^o；—(CH₂)_0-4SSR^o；—(CH₂)_0-4S(O)₂R^o；—(CH₂)_0-4S(O)₂OR^o；—(CH₂)_0-4OS(O)₂R^o；—S(O)₂NR^o ₂；—(CH₂)_0-4S(O)R^o；—N(R^o)S(O)₂NR^o ₂；—N(R^o)S(O)₂R^o；—N(OR^o)R^o；—C(NH)NR^o ₂；—P(O)₂R^o；—P(O)R^o ₂；—OP(O)R^o ₂；—OP(O)(OR^o)₂；SiR^o ₃；—(C_1-4直链或支链亚烷基)O—N(R^o)₂；或者—(C_1-4直链或支链亚烷基)C(O)O—N(R^o)₂，其中每个R^o可以如下定义被取代并且独立地为氢、C_1-6脂族、—CH₂Ph、—O(CH₂)_0-1Ph、-CH₂(5元至6元杂芳基环)或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元至6元饱和、部分不饱和或芳基环，或者，尽管有上述定义，两个独立出现的R^o与它们的居间原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3元至12元饱和、部分不饱和或芳基单环或二环，其可以如下定义被取代。

R^o上合适的一价取代基(或通过两个独立出现的R^o与它们的居间原子一起形成的环)独立地为卤素，—(CH₂)_0-2R^●、—(卤R^●)、—(CH₂)_0-2OH、—(CH₂)O₂OR^●、—(CH₂)_0-2CH(OR^●)₂；—O(卤R^●)、—CN、—N₃、—(CH₂)_0-2C(O)R^●、—(CH₂)_0-2C(O)OH、—(CH₂)_0-2C(O)OR^●、—(CH₂)_0-2SR^●、—(CH₂)_0-2SH、—(CH₂)_0-2NH₂、—(CH₂)_0-2NHR^●、—(CH₂)_0-2NR^● ₂、—NO₂、—SiR^● ₃、—OSiR^● ₃、—C(O)SR、—(C_1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR或—SSR^●，其中每个R^●为未取代的或其前面的“卤素”仅被一个或多个卤素取代，并且独立地选自C_1-4脂族、—CH₂Ph、—O(CH₂)_0-1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元至6元饱和、部分不饱和或芳基环。R^o饱和碳原子上合适的二价取代基包括＝O和＝S。

“任选地取代的”基团的饱和碳原子上合适的二价取代基包括以下：＝O、＝S、＝NNR^* ₂、＝NNHC(O)R^*、＝NNHC(O)OR^*、＝NNHS(O)₂R^*、＝NR^*、＝NOR^*、—O(C(R^* ₂))_2-3O—或—S(C(R^* ₂))_2-3S—，其中R^*的每个独立出现选自氢、C_1-6脂族(其可以如下定义被取代)或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5元至6元饱和、部分不饱和或芳基环。与“任选地取代的”基团的邻位可取代的碳键合的合适的二价取代基包括：—O(CR^* ₂)_2-3O—，其中R^*的每个独立出现选自氢、C_1-6脂族(其可以如下定义被取代)或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5元至6元饱和、部分不饱和或芳基环。

R^*的脂族基团上合适的取代基包括卤素、—R^●、-(卤R^●)、-OH、—OR^●、—O(卤R^●)、—CN、—C(O)OH、—C(O)OR^●、—NH₂、—NHR^●、^—NR^● ₂或—NO₂，其中每个R^●为未取代的或其前面的“卤素”仅被一个或多个卤素取代，并且独立地为C_1-4脂族、—CH₂Ph、--O(CH₂)_0-1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元至6元饱和、部分不饱和或芳基环。

“任选地取代的”基团的可取代氮上的合适取代基包括 其中每个/>独立地为氢、C_1-6脂族(其可以如下定义取代)、未取代的-OPh或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5元至6元饱和、部分不饱和或芳基环，或者，尽管有上述定义，两个独立出现的/>与它们的居间原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3元至12元饱和、部分不饱和或芳基单环或二环。

R^*的脂族基团上合适的取代基独立地为卤素、—R^●、-(卤R^●)、-OH、—OR^●、—O(卤R^●)、—CN、—C(O)OH、—C(O)OR^●、—NH₂、—NHR^●、^—NR^● ₂或—NO₂，其中每个R^●为未取代的或其前面的“卤素”仅被一个或多个卤素取代，并且独立地为C_1-4脂族、—CH₂Ph、--O(CH₂)_0-1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元至6元饱和、部分不饱和或芳基环。

术语“离去基团”是指具有吸电子能力的原子(或一组原子)，其可作为稳定物质置换，与其一起带有键电子。合适的离去基团的示例包括卤化物和磺酸酯，包括但不限于三氟甲磺酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和溴苯磺酸酯。

术语“可水解基团”和“可水解结构部分”是指能够在例如碱性或酸性条件下进行水解的官能团。可水解残基的示例包括但不限于酰卤、活化羧酸和本领域已知的各种保护基团(参见，例如，“Protective Groups in Organic Synthesis”，T.W.Greene、P.G.M.Wuts，Wiley-Interscience，1999年)。

术语“有机残基”定义为含有碳的残基，即包含至少一个碳原子的残基，并且包括但不限于上文定义的含碳基团、残基或自由基。有机残基可含有各种杂原子，或通过杂原子与另一分子键合，包括氧、氮、硫、磷等。有机残基的示例包括但不限于烷基或取代的烷基、烷氧基或取代的烷氧基、单或二取代的氨基、酰胺基团等。有机残基可优选包含1至18个碳原子、1至15个碳原子、1至12个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子。在一些示例中，有机残基可包含2至18个碳原子、2至15个碳原子、2至12个碳原子、2至8个碳原子、2至4个碳原子或2至4个碳原子。

术语“残基”的非常接近的同义词为术语“自由基”，其在本说明书和结论权利要求中使用，是指本文所述分子的片段、基团或亚结构，而不管分子是如何制备的。例如，特定化合物中的2,4-噻唑烷二酮基具有以下结构

无论是否使用噻唑烷二酮来制备该化合物。在一些实施方案中，自由基(例如烷基)可以通过与一个或多个“取代基”键合而进一步改性(即，取代的烷基)。给定自由基中的原子数对本文所公开的化合物和组合物并不重要，除非本文其他地方指出相反的说明。

如本文定义和所用，术语“有机自由基”含有一个或多个碳原子。有机自由基可具有例如1至26个碳原子、1至18个碳原子、1至12个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子。在一些示例中，有机自由基可具有2至26个碳原子、2至18个碳原子、2至12个碳原子、2至8个碳原子、2至6个碳原子或2至4个碳原子。有机自由基通常具有与有机自由基的至少一些碳原子结合的氢。不含无机原子的有机自由基的一个示例为5,6,7,8-四氢-2-萘基。在一些实施方案中，有机自由基可含有1至10个与其结合的无机杂原子，包括卤素、氧、硫、氮、磷等。有机自由基的示例包括但不限于烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰氧基、氰基、羧基、烷氧羰基、烷基甲酰胺、取代的烷基甲酰胺、二烷基甲酰胺、取代的二烷基甲酰胺、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、硫代烷基、硫代卤代烷基、烷氧基、取代的烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、杂环基或取代的杂环基，其中这些术语在本文别处定义。包括杂原子的有机自由基的一些非限制性示例包括烷氧基、三氟代甲氧基、乙酰氧基、二甲氨基等。

如本文定义和所用，术语“无机自由基”不含碳原子，因此仅包含除碳以外的原子。无机自由基包括选自氢、氮、氧、硅、磷、硫、硒和卤素诸如氟、氯、溴和碘的原子的键合组合，它们可以单独存在或以其化学稳定的组合键合在一起。无机自由基具有10个或更少，或优选1至6个或1至4个如上列出的键合在一起的无机原子。无机自由基的示例包括但不限于氨基、羟基、卤素、硝基、硫醇、硫酸盐、磷酸盐等通常已知的无机自由基。无机自由基中没有键合周期表中的金属元素(诸如碱金属、碱土金属、过渡金属、镧系金属或锕系金属)，尽管此类金属离子有时可用作阴离子无机自由基的药学上可接受的阳离子，诸如硫酸盐、磷酸盐等阴离子无机自由基。除非本文其他地方另有具体说明，否则无机自由基不包括准金属元素诸如硼、铝、镓、锗、砷、锡、铅或碲，或惰性气体元素。

如本文所用，符号(下文中可称为“附接键的点”)表示作为在两个化学实体之间的附接点的键，其中一个被描述为附接到附接键的点，而另一个未被描绘为附接到附接点的键。例如，/>表示化学实体“XY”经由附接点的键结合到另一个化学实体。此外，可以通过推断来指定与未描绘的化学实体的特定附接点。例如，化合物CH₃-R³，其中R³为H或/>表示当R³为“XY”时，附接点的键为与R³被描述为键合到CH₃的键相同的键。

本文所述的化合物可含有一个或多个双键，因此可能产生顺式/反式(E/Z)异构体，以及其他构象异构体。除非另有说明，否则本文所公开的化合物和组合物包括所有此类可能的异构体，以及此类异构体的混合物。

除非另有说明，否则具有仅作为实线而不是作为楔形或虚线显示的化学键的式考虑了每种可能的异构体，例如每种对映体和非对映体，以及异构体的混合物，诸如外消旋或非手性混合物。本文所述的化合物可含有一个或多个不对称中心，因此可能产生非对映体和光学异构体。除非另有说明，否则本文所公开的化合物和组合物包括所有此类可能的非对映体及其外消旋混合物，它们的基本上纯的拆分对映体，所有可能的几何异构体及其药学上可接受的盐。还包括立体异构体的混合物，以及分离的特定立体异构体。在用于制备此类化合物的合成方法期间，或在使用本领域技术人员已知的外消旋化或差向异构化方法期间，此类方法的产物可以为立体异构体的混合物。

许多有机化合物以旋光性形式存在，具有旋转平面偏振光平面的能力。在描述旋光性化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和1或(+)和(-)用于表示化合物旋转平面偏振光的符号，(-)或l表示该化合物为左旋的。前缀为(+)或d的化合物为右旋的。对于给定的化学结构，这些称为立体异构体的化合物为相同的，除了它们为彼此不可重叠的镜像。特定的立体异构体也可称为对映体，此类异构体的混合物通常称为对映体的混合物。对映体的50:50混合物称为外消旋的混合物。本文所述的许多化合物可具有一个或多个手性中心，因此可以以不同的对映体形式存在。如果需要，可以用星号(*)表示手性碳。当手性碳的键用所公开的式中的直线描述时，应当理解，手性碳的(R)和(S)两者构型以及因此两种对映体及其混合物都包含在该式中。如本领域所用，当希望指定关于手性碳的绝对构型时，手性碳的键之一可以描绘为楔形(与平面上方的原子键合)，另一个可以描述为短平行线的一系列或楔形(与平面下方的原子键合)。Cahn-Ingold-Prelog体系可用于将(R)或(S)构型指定为手性碳。

本文所述的化合物包含其天然同位素丰度和非天然丰度的原子。所公开的化合物可以为同位素标记的或同位素取代的化合物，它们与所述的化合物相同，但是是对于一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界中通常存在的原子质量或质量数的原子取代的事实。可掺入本文所公开的化合物中的同位素的示例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，诸如分别为²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。化合物还包含其前药，并且含有上述同位素和/或其他原子的其他同位素的所述化合物或所述前药的药学上可接受的盐属于本发明的范围。某些同位素标记的化合物，例如掺入放射性同位素如³H和¹⁴C的化合物，可用于药物和/或底物组织分布测定。氚(即³H)和碳-14(即¹⁴C)同位素因其易于制备和可检测性而特别优选。此外，用较重的同位素诸如氘(即²H)取代可以提供某些治疗优势，这是因为代谢稳定性更高，例如体内半衰期延长或剂量需求减少，因此在某些情况下可能为优选的。同位素标记的化合物及其前药通常可以通过进行以下步骤，通过用容易获得的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂来制备。

本文描述的化合物可以作为溶剂化物存在。在一些情况下，用于制备溶剂化物的溶剂为水溶液，然后溶剂化物通常被称为水合物。化合物可以作为水合物存在，其可以例如通过从溶剂或从水溶液中结晶而获得。就这一点而言，一种、两种、三种或任何数量的溶剂化物或水分子可与本文所公开的化合物结合形成溶剂化物和水合物。除非另有说明，否则所有此类可能的溶剂化物都包括在本文的讨论中。

术语“共晶体”是指两个或更多个分子的物理缔合，其通过非共价交互作用而具有稳定性。该分子络合物的一种或多种成分在晶格中提供稳定的骨架。在某些实例下，客体分子作为无水物或溶剂化物掺入晶格中，参见例如“Crystal Engineering of theComposition of Pharmaceutical Phases.Do Pharmaceutical Co-crystals Representa New Path to Improved Medicines？”Almarasson,O.等人，The Royal Society ofChemistry，2004年，第1889-1896页。共晶体的示例包括对-甲苯磺酸和苯磺酸。

还应当理解，本文所述的某些化合物可以作为互变异构体的平衡存在。

例如，具有α-氢的酮可以以酮基形式和烯醇形式的平衡存在。

同样，具有N-氢的酰胺可以以酰胺形式和亚氨酸形式的平衡存在。除非另有说明，否则本文包括所有此类可能的互变异构体。

已知化学物质形成固体，其以不同的有序状态存在，称为多晶形式或改性。多晶型物质的不同修饰可以在它们的物理特性上有很大不同。化合物可以以不同的多晶形式存在，特定的修饰可以为亚稳的。除非另有说明，否则包括所有此类可能的多晶形式。

在一些示例中，化合物的结构可由下式表示：

这被理解为等同于下式：

其中n通常为整数。也就是说，Rⁿ应理解为表示五个独立的取代基R^n(a)、R^n(b)、R^n(c)、R^n(d)、R^n(e)。“独立的取代基”是指每个R取代基可以独立地定义。例如，如果在一个实例中R^{n (a)}为卤素，那么在该实例中R^n(b)不一定为卤素。

本文所公开的某些材料、化合物、组合物和成分可以商购获得或使用本领域技术人员通常已知的技术容易地合成。例如，用于制备所公开的化合物和组合物的起始物质和试剂可以从商业供应商(Aldrich Chemical Co.公司(美国威斯康星州，密尔沃基)、AcrosOrganics公司(新泽西州，莫里斯平原)、Fisher Scientific公司(宾夕法尼亚州，匹兹堡)或Sigma公司(密苏里州，圣路易斯))处获得，或者通过本领域技术人员已知的方法按照参考文献中所述的方法制备(诸如Fieser and Fieser's Reagents for OrganicSynthesis，第1-17卷(John Wiley and Sons，1991年))。Rodd的Chemistry of CarbonCompounds，第1-5卷及增刊(Elsevier Science Publishers，1989)；Organic Reactions，第1-40卷(John Wiley and Sons,1991)；March的Advanced Organic Chemistry(JohnWiley and Sons，第4版)；以及Larock的Comprehensive Organic Transformations(VCHPublishers Inc.，1989)。

除非另有明确说明，否则绝无意于将本文所陈述的任何方法理解为要求其步骤以特定顺序执行。因此，在方法权利要求实际上未叙述其步骤所遵循的顺序或者在权利要求或具体实施方式中没有另外具体说明步骤被限制为特定顺序的情况下，绝无意于在任何方面推断出一种顺序。这适用于任何可能的不明确的解释，其包括：关于步骤或操作流程的布置的逻辑问题；由语法组织或标点符号得出的普通含义；以及说明书中所述的实施方案的数量或类型。

本文公开了用于制备所公开的组合物的成分以及在本文所公开的方法内使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子组、交互作用、组等时，尽管可能没有明确公开对这些化合物的各种单独和集合组合和排列中每一者的特定引用，但本文对每一者都进行了具体地设想和描述。例如，如果公开和讨论了特定的化合物，并且讨论了可以对包括化合物的许多分子进行的许多修饰，则具体地设想化合物的每种组合和排列以及可能的修饰，除非明确地指出相反的情况。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并且公开了组合分子的一个示例A-D，则即使没有单独地列举每一个，每一个都是单独且全部地设想的意义组合，也认为公开了A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了这些的任何子组或组合。因此，例如，将考虑公开A-E、B-F和C-E的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本文所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可进行的各种另外的步骤，则应当理解，这些另外的步骤中的每一个步骤可利用本文所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来进行。

应当理解，本文所公开的组合物具有某些功能。本文公开了用于执行所公开的功能的某些结构要求，并且应当理解，存在可以执行与所公开的结构相关的相同功能的各种结构，并且这些结构通常将实现相同的结果。

本文使用的缩写如下：Cpa，L-4-氯苯丙氨酸；dap，D-2,3-二氨基丙酸；Dap，L-2,3-二氨基丙酸；FITC，异硫氰酸荧光素；Fpa，L-4-氟苯丙氨酸；F₂pa，L-3,4-二氟苯丙氨酸；fpa，D-2-氟苯丙氨酸；f₂pa，D-3,4-二氟苯丙氨酸；Nal，L-2-萘丙氨酸；Nle，正亮氨酸；Phg，L-α-苯甘氨酸；Sar，肌氨酸；TNFα，肿瘤坏死因子-α；TNFR，TNFα受体。

化合物

据先前报道，环状(FΦRRRRQ)(cFΦR₄，其中Φ为L-2-萘丙氨酸(SEQ ID NO.:72))为一类环状CPP的成员(Z.Qian等人，ACS Chem.Biol.2013年，第8卷，第423页；Z.Qian等人，Biochemistry 2014年，第53卷，第4034页)。这些CPP直接与膜磷脂结合，通过内吞作用进入细胞，并通过诱导小的不稳定囊泡的出芽而有效地从早期核内体逃逸到胞质溶胶中(同上；Z.Qian等人，Biochemistry 2016年，第55卷，第2601页)。由于细胞溶质递送效率(定义为细胞溶质与细胞外承载物浓度的比率)为20％，cFΦR₄(SEQ ID NO.:72)比Tat(一种最广泛使用的CPP)更活跃一个数量级(同上)。最重要的是，cFΦR₄(SEQ ID NO.:72)和其他环状CPP能够有效地将各种承载物分子(包括小分子、肽和蛋白质)递送到哺乳动物细胞的胞质溶胶中。例如，将短的肽基承载物直接掺入cFΦR₄(SEQ ID NO.:72)环(内环递送)中，所得的环肽为细胞可渗透的(同上；P.Upadhyaya等人，Angew.Chem.,Int.Ed.2015年，第54卷，第7602页；Angew.Chem.2015年，第127卷，第7712页)。还将cFΦR₄(SEQ ID NO.:72)与570万种不同的环肽融合，以产生细胞可渗透的二环肽文库(二环递送)(T.B.Trinh、P等人，ACSComb.Sci.2016年，第18卷，第75页)。然而，许多肽配体必须处于其延伸构象中才具有生物活性，并且与上述环化方法不相容。为此，通过将它们与FΦR₄(SEQ ID NO.:72)融合，并通过二硫键环化融合肽来研发用于细胞内递送线性肽基配体的可逆环化策略(Z.Qian等人，Angew.Chem.Int.Ed.2015年，第54卷，第5874页；Angew.Chem.2015年，第127卷，第5972页)。遗憾的是，先前的方法仅限于相对较短的肽，因为较长肽的环化导致大环，其构象灵活性限制了代谢稳定性和细胞渗透性的增加(Z.Qian等人，ACS Chem.Biol.2013年，第8卷，第423页；Z.Qian等人，Biochemistry 2014年，第53卷，第4034页)。经由含有内部硫醇的结构部分(例如，本文所公开的AA^S基团)的环化导致更小的环和更好的细胞摄取，但是留下一部分线性形式的肽基承载物，其仍然易于蛋白水解降解。为克服该限制，本文公开了可逆二环化策略，其允许通过形成一对二硫键将整个CPP-承载物融合物转化为二环结构(图2)。当在细胞外时，肽作为高度受限的二环存在，其具有增强的细胞渗透性和蛋白水解稳定性。进入胞质溶胶后，二硫键被细胞内谷胱甘肽(GSH)还原，产生线性生物活性肽。二环体系允许形成用于最佳细胞摄取的小CPP环和单独的承载物环，以适应不同长度的肽。

在各种实施方案中，本文所述的可逆二环肽包含第一环肽序列和第二环肽序列。在一些实施方案中，第一个二环肽序列包含细胞穿透序列(X_m)。在其他实施方案中，第二环肽序列包含承载物肽序列(X_n)。

在一些实施方案中，X_m和X_n为融合的。在一些实施方案中，融合发生在X_m的C-末端与X_n的N-末端之间。在其他实施方案中，融合发生在X_m的N-末端与X_n的C-末端之间。在另一些实施方案中，氨基酸或连接结构部分可用于融合X_m和X_n。在又一些实施方案中，用于融合X_m和X_n的氨基酸或连接结构部分形成至少一个分子内二硫键，从而形成二环肽序列。在另一些实施方案中，融合X_m和X_n的氨基酸由AA^S表示。在其他实施方案中，连接结构部分可以由本文所提供的式中的“L-J”表示。

在一些实施方案中，X_m可以直接或间接地与X_n缀合。例如，在一些实施方案中，X_m可以包含至少两个AA^S结构部分，并且X_n可以包含至少两个AA^S结构部分，并且X_m可以经由分别在X_m与X_n上的相对的AA^S残基之间形成的两个二硫键直接与X_n缀合。在其他实施方案中，连接结构部分与X_m中的氨基酸侧链共价结合，并且X_n包含至少两个AA^S结构部分，每个结构部分形成具有连接结构部分的二硫键。具有适于缀合连接结构部分的侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸。此外，可以适当地修饰氨基酸以与连接结构部分缀合。

如上所讨论，在一些实施方案中，本文所述的二环肽包含连接结构部分。在一些实施方案中，X_m通过连接结构部分环化。在其他实施方案中，X_n通过连接结构部分环化。在又一些实施方案中，X_m和X_n中的每一个通过连接结构部分独立地环化。在某些实施方案中，仅X_n通过连接结构部分环化，X_m为环肽序列，并且连接结构部分缀合X_n和X_m，从而形成本文所公开的二环肽。

在某些实施方案中，连接结构部分的前体包含至少两个硫醇基团，其形成至少两个分子内二硫键，从而形成本文所公开的二环肽。在这些实施方案中，二硫键可以通过细胞内GSH还原形成包含X_m和X_n的线性肽序列，以释放包含X_m的线性序列(在这种情况下X_n保持环状)，或包含X_n的线性序列(在这种情况下X_m保持环状)。在某些实施方案中，在进入细胞的胞质溶胶后，二硫键被细胞内GSH还原，从而释放包含X_n的线性序列。在其他实施方案中，细胞内GSH还原两个二硫键，从而释放包含X_m和X_n的线性序列。在又一些实施方案中，连接结构部分的前体包含三个硫醇基团，其在本文所公开的二环肽中形成三个分子内二硫键。在又一些实施方案中，连接结构部分的前体包含四个硫醇基团，其形成四个分子内二硫键。

因此，在各种实施方案中，本文公开了根据式1至12的二环肽。

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其中：

X_m和X_n独立地包含1至50个(例如，4至10)天然或非天然氨基酸的序列，其中X_m对应于如本文所定义的细胞穿透肽

(CPP)序列，并且X_n对应于如本文所定义的承载物肽序列；

AA^S在每次出现时独立地为与J形成二硫键的结构部分；

J为不存在或者烷基、N-烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自独立地被至少两个取代基取代，该至少两个取代基在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键；

每个实例的SS表示二硫键；以及

L为不存在或者将AA^S与X_m、X_n或其组合中的氨基酸连接的结构部分。

如上面式1至12所示，X_n可位于X_m的N-末端或C-末端。在一些实施方案中，L存在并且可以连接至X_m、X_n或AA^S的N-末端或C-末端。在其他实施方案中，L存在并且可以位于X_m和X_n、X_m和AA^S和/或X_n和AA^S中的每一个之间并且与其连接。在一些实施方案中，一个或多个AA^S可以位于X_n中。在此类实施方案中，AA^S可以为野生型肽序列的成分(即X_n)或AA^S可以引入肽序列(X_n)中。在一些实施方案中，承载物肽序列(X_n)具有两个AA^S(例如，式11)，其允许承载物肽序列在化合物进入胞质溶胶之后从CPP序列裂解。

如本文所用，“L”是指在J与X_m、X_n或其组合之间的连接。例如，在实施方案中，L可包含在J的前体上的官能团与氨基酸上的胺基团(例如，在X_m或X_n上)之间形成的结构部分。胺基团可以为N-末端，或者它可以为氨基酸侧链上的胺基团，例如X_m上。在此类实施方案中，J的前体可包括羧酸结构部分或其衍生物(例如，卤代酮)，其由此与氨基酸或承载物上的N-末端形成酰胺键。在其他实施方案中，L可包含在J的前体上的官能团与氨基酸上的羧酸基团(例如，在X_m或X_n上)之间形成的结构部分。羧基基团可以为C-末端，或者它可以为氨基酸侧链上的羧酸基团，例如X_m上。在此类实施方案中，J的前体包括胺，它由此与氨基酸或承载物的C-末端形成酰胺键。L的非限制性示例包括至少一个氨基酸、烷基、烯基、炔基、羰基、酰胺、亚胺、烯胺、烯烃、炔烃、二硫化物、硫酮、磺酰酮、氨基甲酰基、羰基氧基、二硫化物、硫醚和三唑。在实施方案中，L存在、为氨基酸、为

如上所定义，在各种实施方案中，J可以为烷基、N-烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自独立地被至少两个取代基取代，该至少两个取代基在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键。在一些实施方案中，J包含至少两个取代基，该至少两个取代基在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键。在其他实施方案中，J包含至少三个取代基，其在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键。在又一些实施方案中，J包含至少四个取代基，其在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键。

在一些实施方案中，L为不存在，并且J包含至少三个取代基，其在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键。此类二环肽的示例在式8和9中提供。

在其他实施方案中，L为不存在，并且J包含至少四个取代基，其在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键。式10中提供了此类二环肽的示例。

在一些实施方案中，J为不存在，并且L连接X_m和AA^s。

在一些实施方案中，J和L各自存在。在一些此类实施方案中，J和L可以位于X_n或X_m的N-末端，并且可以由以下中的至少一个表示(在形成二硫键之前)：

其中R表示氨基酸的一侧，其可以为包含X_m或X_n的肽序列的一部分，它可以为L的一部分。

在其他此类实施方案中，J和L可以位于X_n与X_m之间，在X_m与X_n之间，或X_n与X_m之一的C-末端，并且可以由以下之一(在形成二硫键之前)表示：

为了形成本公开的二环肽，上述结构的硫醇基团上的氢独立地被硫基团键合取代

在一些实施方案中，每个AA^s独立地为能够形成二硫键的氨基酸或其类似物或衍生物(例如，在形成二硫键之前具有硫醇基团的氨基酸)。此类氨基酸或其类似物或衍生物的非限制性示例包括：

其中AA^S的C-末端形成酰胺键或R¹，其中R¹为OH、OR²、NHR²；并且其中R²为烷基、芳基、杂芳基、氨基酸残基、2至20个氨基酸残基的肽序列、可检测到的结构部分或固体载体。

在一些实施方案中，式9的化合物具有下式：

图8示出了根据式9-A的含有三硫化二肽的二环肽的实施方案。

在一些实施方案中，式11的化合物具有下式：

在一些实施方案中，式12的化合物具有下式：

所附附录包括本公开的二环肽的另外的例示性配方。

在一个具体方面，本文公开了式I的二环肽。

其中R¹为OH、OR²、NHR²，其中R²为C_1-20烷基、C_6-10芳基或杂芳基、氨基酸残基、2至20个氨基酸残基的肽序列、可检测到的结构部分或固体载体；并且其中每个d独立地为1或2。两个肽序列X_m和X_n与中心3,5-(双巯基甲基)苯甲酰基结构部分偶接，形成二环结构，其具有序列X_m的细胞穿透肽环和序列X_n的承载物环(参见图2)。如上所述，X_m和X_n用于表示本文所述的二环肽中的肽序列，并且X_m和X_n的N-末端和C-末端可以包括在本文所提供的各种式中(例如，在上面的式I中)，以说明X_m和X_n在二环肽中的连接性。应当理解，当式中提供X_m和X_n的末端残基(例如-NH-，或-NH-C(O)-)时，此类残基不表示二环肽所需的另外的原子，而是这些残基为X_m和/或X_n中所含的氨基酸的成分。当式I化合物处于其未环化形式时，例如，在形成二硫键之前或在进入细胞之后并被GSH作用时，它们可以表示为式I-A。

在另一个方面，X_m和X_n可以以与式I中所示相反的方式与中心3,5-(双巯基甲基)苯甲酰基结构部分偶接。这些化合物也在本文中公开并由式II表示。

本文还公开了式III的肽序列。

BMB-(AAⁿ)_u

III

其中：

u为4至20的整数；

每个AAⁿ独立地为天然或非天然的氨基酸残基，具有至少两个AAⁿ残基，独立地选自由以下构成的组：半胱氨酸、高半胱氨酸、具有硫醇基团的氨基酸类似物；以及

BMB为3,5-双(巯基甲基)苯甲酸残基。

X_m和X_n

X_m和X_n可以独立地包含任何合适数量的可以环化的氨基酸。在一些实施方案中，X_m和X_n可以独立地包含1至50个氨基酸残基的序列(例如，1至20个氨基酸，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19和20，包括其间的所有范围)。在一些实施方案中，X_m和X_n中氨基酸的组合数目为至少8个残基。在一些示例中，X_m或X_n可独立地包含4个或更多个氨基酸(例如，5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个或9个或更多个)。在一些示例中，X_m或X_n可独立地包含20个或更少个氨基酸(例如，19个或更少个、18个或更少个、17个或更少个、16个或更少个或15个或更少个)。在特定实施方案中，X_m或X_n可独立地包含5至10个氨基酸。每种氨基酸可以为天然或非天然氨基酸、或其类似物或衍生物。因此，当在本文中使用时，术语氨基酸包括天然和非天然氨基酸及其类似物和衍生物。术语“非天然氨基酸”是指作为天然氨基酸的同类物的有机化合物，因为它具有与天然氨基酸类似的结构，使得它模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然氨基酸可以为修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，它不是20种常见的天然存在的氨基酸之一或稀有的天然氨基酸硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸。合适的氨基酸的示例包括但不限于丙氨酸、别异亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、萘丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、衍生物或其组合。表1列出了这些以及它们在本文所使用的缩写。

表1.氨基酸缩写

*单字母缩写：当在本文中以大写字母显示时，它表示L-氨基酸形式，当在本文的小写字母中显示时，它表示D-氨基酸形式

如上所讨论，本文可使用非天然氨基酸和D-氨基酸。本发明所公开的方法和组合物特别适合掺入非天然和D-氨基酸。氨基酸可以通过肽键偶接。每个氨基酸可以与氨基、羧酸根基团或侧链上的相邻氨基酸偶接。

X_m

氨基酸序列X_m可以为细胞穿透肽序列。在一些实施方案中，X_m的长度为4至20(例如，5至10)个氨基酸残基。在一些实施方案中，X_m中的至少一个、至少两个或至少三个氨基酸为精氨酸。在一些实施方案中，X_m中的至少一个、至少两个或至少三个氨基酸具有疏水性侧链。具有疏水性侧链的氨基酸的非限制性示例包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、萘丙氨酸、苯基甘氨酸、高苯丙氨酸、酪氨酸、环己基丙氨酸或正亮氨酸。在特定实施方案中，疏水性侧链为疏水性芳族酰胺链。在一些实施方案中，具有芳族疏水性侧链的氨基酸包括萘丙氨酸、苯甘氨酸、高苯丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在特定实施方案中，具有疏水性的氨基酸为苯丙氨酸、萘丙氨酸、色氨酸或其类似物或衍生物。在一些示例中，X_m中的至少一个氨基酸包含苯丙氨酸、苯甘氨酸或组氨酸，或其类似物或衍生物。在一些示例中，X_m包含至少一种精氨酸或其类似物或衍生物。

在式I或II的一些具体示例中，X_m可独立地选自表2中列出的任何序列。在一些示例中，细胞穿透肽可以与表2中列出的任何序列相反。

表2.X_m的示例序列。

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Φ＝L-萘丙氨酸；φ＝D-萘丙氨酸；Ω＝L-正亮氨酸；r＝D-精氨酸；F＝L-苯丙氨酸；f＝D-苯丙氨酸；q＝D-谷氨酰胺；X＝L-4-氟苯丙氨酸；Dap＝L-2,3-二氨基丙酸。

在一些示例中，X_m可以为SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:146中的任一个。在一些示例中，X_m可以为SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:146中任一个的变体。本文还公开了表2中肽的环状序列。序列64至146也可以通过在内部或在一端或两端(即在C-和/或N-末端)具有一个或多个半胱氨酸残基(或具有硫醇基团的其他氨基酸)来修饰，这允许通过与半胱氨酸(或具有硫醇基团的其他氨基酸)形成二硫键而环化肽。

肽变体为本领域技术人员熟知的，并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常属于取代变体、插入变体或缺失变体这三类中的一种或多种。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常为比氨基或羧基末端融合体的那些更小的插入，例如，大约1至3个残基。缺失的特征在于从肽序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常，在肽内的任何一个位点缺失不超过1至3个残基。氨基酸取代通常为单个残基，但可以同时发生在多个不同的位置；插入通常为约1至3个氨基酸残基；并且缺失将在约1至3个残基的范围内。缺失或插入优选在相邻对中进行，即缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或其任何组合可以组合以得到最终构型。取代变体为其中已去除至少一个残基并在其位置插入不同残基的变体。此类取代通常根据下表3进行，并称为保守取代。

表3.氨基酸取代

通过选择比表3中的取代更不保守的取代来进行功能的显著变化，即选择在维持(a)取代区域中肽骨架的结构(例如片状或螺旋构象)、(b)靶位点处分子的电荷或疏水性或(c)侧链的大部分等方面效果更显著不同的残基。通常预期会在蛋白质性质中产生最大变化的取代为其中(a)亲水性残基(例如丝氨酰或苏氨酰)被(或由)疏水性残基(例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰)取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸被(或由)任何其他残基取代；(c)具有带正电荷的侧链的残基(例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰)被(或由)带负电荷的残基(例如谷氨酰或天冬氨酰)取代；或者(d)具有庞大侧链的残基(例如苯丙氨酸)被(或由)不具有侧链的残基(例如甘氨酸)取代，在这种情况下，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化位点的数量的取代。

例如，用生物学上和/或化学上相似的一个氨基酸残基取代另一个氨基酸残基为本领域技术人员已知的保守取代。例如，保守取代将一个疏水性残基取代为另一个疏水残基，或将一个极性残基取代为另一个极性残基。取代包括组合，诸如例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe、Tyr。每种明确公开的序列的这种保守取代的变体包括在本文提供的肽中。

应当理解，定义X_m变体的一种方法为通过在特定已知序列的同源性/同一性方面定义变体。例如，SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:146各自列出特定序列。具体地讲，本发明公开了这些肽的变体，其与SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:146具有至少85％、90％、95％、97％或99％的同源性。本领域技术人员容易理解确定两种蛋白质的同源性的方法。例如，可以在比对两个序列后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。

除了SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:146的变体之外，这些肽的衍生物也在本发明所公开的方法和组合物中起作用。通过用经修饰的残基取代一个或多个残基来形成衍生物，其中残基的侧链已经被修饰。

在特定示例中，X_m包含至少一个、至少两个，或更具体地，至少三个相邻的精氨酸(R或r)残基。此外，在这些结构中，存在至少一个、至少两个或至少三个疏水性残基，例如苯丙氨酸、萘丙氨酸、色氨酸或其类似物或衍生物。例如，可以存在：1个精氨酸和5个疏水性残基，如苯丙氨酸、萘丙氨酸、色氨酸或其类似物或衍生物；2个精氨酸和4个疏水性残基，如苯丙氨酸、萘丙氨酸、色氨酸或其类似物或衍生物；3个精氨酸和3个疏水性残基，如苯丙氨酸、萘丙氨酸、色氨酸或其类似物或衍生物；4个精氨酸和2个疏水性残基，如苯丙氨酸，萘丙氨酸、色氨酸或其类似物或衍生物；或4个精氨酸和1个疏水性残基，如苯丙氨酸、萘丙氨酸、色氨酸或其类似物或衍生物。在具体示例中，本文所公开的环状化合物具有3个精氨基和3个疏水性残基，如苯丙氨酸、萘丙氨酸、色氨酸或其类似物或衍生物。此外，精氨酸残基可以群集，例如，精氨酸在另一个精氨酸残基的2个氨基酸内。同样，疏水性残基可以群集，例如，一个疏水性残基与另一个疏水性残基的2个氨基酸群集。

在优选的示例中，X_m为或包括RRRRΦF、FΦRRRR、FfΦRrRr、fΦRrRr、fΦRrRr、FφrRrR或FφrRrR。

在一些实施方案中，氨基酸序列X_m可以表示为或可以包含

AA¹-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-(AA⁶)_m-(AA⁷)_n-(AA⁸)_p-(AA⁹)_q

其中：

AA¹、AA²、AA³、AA⁴、AA⁵、AA⁶、AA⁷、AA⁸和AA⁹各自独立地为氨基酸；

至少三个氨基酸为精氨酸；

至少两个氨基酸包含疏水性侧链；

m、n、p或q独立地选自0和1。

在一些实施方案中，AA¹、AA²、AA³、AA⁴、AA⁵、AA⁶、AA⁷、AA⁸和AA⁹对应于SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:146的至少一个氨基酸序列。

本发明的某些实施方案包括氨基酸序列，其中至少四个连续的氨基酸具有交替手性。如本文所用，手性是指氨基酸的“D”和“L”异构体。在本发明的特定实施方案中，至少四个连续的氨基酸具有交替手性，剩余氨基酸为L-氨基酸。在其他实施方案中，本发明的肽包含具有D-L-D-L手性的四个氨基酸序列。在又一些实施方案中，本发明的肽包含具有L-D-L-D手性的四个氨基酸序列。

在实施方案中，本发明的肽包含两个连续的L-氨基酸。在另一些实施方案中，本发明的肽包含分开两个D-氨基酸的两个连续的L-氨基酸。在再一些实施方案中，本发明的肽包含分开两个D-氨基酸的两个连续的L-氨基酸和具有交替手性的至少四个连续的氨基酸，诸如但不限于具有D-L-L-D-L-D或L-D-L-L-D-L-D手性的肽序列。在甚至另一些实施方案中，本发明的肽包含分开两个D-氨基酸的两个连续的L-氨基酸和具有交替手性的至少五个连续的氨基酸，诸如但不限于具有D-L-L-D-L-D-L或L-D-L-L-D-L-D-L手性的肽序列。

在实施方案中，本发明的肽包含两个连续的D-氨基酸。在另一些实施方案中，本发明的肽包含分开两个L-氨基酸的两个连续的D-氨基酸。还在本发明的另一些实施方案中，本发明的肽包含分开两个L-氨基酸的两个连续的D-氨基酸和具有交替手性的至少四个连续的氨基酸，诸如但不限于具有L-D-D-L-D-L的肽序列。在本发明的甚至另一些实施方案中，本发明的肽包含分开两个L-氨基酸的两个连续的D-氨基酸和具有交替手性的至少五个连续的氨基酸，诸如但不限于具有L-D-D-L-D-L-D的肽序列。

在一些实施方案中，具有交替手性的氨基酸序列包含约至少约4个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸或至少约9个氨基酸。在实施方案中，具有交替手性的氨基酸序列包含约4个氨基酸至约9个氨基酸、或约5个氨基酸至约6个氨基酸、或约7个氨基酸至约9个氨基酸、或约8个氨基酸至约9个氨基酸、或约4个氨基酸至约8个氨基酸、或约4个氨基酸至约7个氨基酸、或约4个氨基酸至约6个氨基酸、或约4个氨基酸至约5个氨基酸。

在某些实施方案中，本发明的肽包含至少一个疏水性残基。在另一些实施方案中，本发明的肽包含两个疏水性残基。还在另一些实施方案中，本发明的肽包含至少两个疏水性残基。在某些实施方案中，至少一个疏水性残基为芳族疏水性残基。在特定实施方案中，至少一个疏水性残基选自由以下构成的组：萘丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在另一些实施方案中，至少一个疏水性残基选自由以下构成的组：萘丙氨酸和苯丙氨酸。在某些实施方案中，本发明的肽包含至少一个萘丙氨酸。在其他实施方案中，本发明的肽包含至少一个苯丙氨酸。还在其他实施方案中，本发明的肽包含至少一个苯丙氨酸和至少一个萘丙氨酸。在本发明的某些实施方案中，肽在AA¹、AA²或AA³位置处包含至少一个疏水性残基。在某些实施方案中，肽在AA¹、AA²或AA³位置处包含至少一个芳族疏水性残基。在本发明的另一些实施方案中，肽在AA¹、AA²或AA³位置处包含至少一个疏水性残基，其选自由以下构成的组：萘丙氨酸和苯丙氨酸。

在某些方面，本文公开了式V、VI、VII、VIII、IX、X和XII的二环肽：

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或其药学上可接受的盐，其中AA¹、AA²、AA³、AA⁴、AA⁵、AA⁶、AA⁷、AA⁸、AA⁹、AA¹⁰和AA¹¹各自独立地为氨基酸。

在一些实施方案中，至少三个氨基酸为精氨酸。在另一些实施方案中，至少两个氨基酸包含疏水性残基。在一些实施方案中，AA^S在每次出现独立地为与J形成二硫键的结构部分。

在一些实施方案中，J为N-烷基、芳基或杂芳基，它们各自独立地被至少两个取代基取代，该至少两个取代基在每次出现时独立地与AA^S形成二硫键。在一些实施方案中，J选自由以下构成的组：

在一些实施方案中，L选自由以下构成的组：

在一些实施方案中，化合物选自由以下构成的组：

/>

/>

或其药学上可接受的盐，其中每个d独立地为1或2。

当式V、VI、VII、VIII、IX或X的化合物处于其未环化形式时，例如，在形成二硫键之前或在进入细胞之后并被GSH作用时，它们可以表示为式I-A。还公开了根据式V-A、VI-A、VII-A、VIII-A、IX-A和X-A的化合物：

/>

或其药学上可接受的盐，

其中：

AA^S′在每次出现时独立地为包含硫醇的结构部分；

J为烷基、N-烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自独立地被至少两个硫醇取代基取代；以及

X_n和L在本文中定义。

在一些实施方案中，J为N-烷基或芳基。在一些实施方案中，J′为

在一些实施方案中，每个AA^S独立地为

其中AA^S′的C-末端形成酰胺键或者为R¹，其中R¹为OH、OR²、NHR²；并且其中R²为烷基、芳基、杂芳基、氨基酸、2至20个氨基酸的肽序列、可检测到的结构部分或固体载体。

在一些实施方案中，化合物具有选自由以下构成的组的结构：

/>

或其药学上可接受的盐。

X_n

氨基酸序列X_n为承载物肽序列。如上所述，对氨基酸X_n的数量没有限制。在一些实施方案中，X_n可具有1至50个氨基酸，例如1至20、1至10、4至20、4至10以及其中的所有值和子库。X_n的序列的示例为以上表2中概述的那些，包括其变体或衍生物。承载物肽序列的另外的示例可包括表4或表5中列出的任一种，或其衍生物或组合。

表4.示例承载物序列

/>

表5.示例承载物结构部分

/>

*pCAP，膦香豆氨基丙酸；Ω，正亮氨酸；U，2-氨基丁酸。

应当理解，当提及式I时，序列X_n在每个末端与半胱氨酸残基(C)偶接，并且由所述偶接形成的酰胺键包括在式I中。同样，当提及式II时，X_m在每个末端与半胱氨酸残基偶接，并且由所述偶接形成的酰胺键包括在式II中。例如，这些段可以表示为-C-X_n-C-或-C-X_m-C-，或有时表示为-C-(AA)_n-C-，其中AA＝如本文所定义的氨基酸残基，n为2至8的整数，例如，-C-AA¹-AA²-C-、-C-AA¹-AA²-AA³-C-、-C-AA¹-AA²-AA³-AA⁴-C-、-C-AA¹-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-C-、-C-AA¹-AA²-AA³-AA⁵-AA⁶-C-、-C-AA¹-AA²-AA³-AA⁵-AA⁶-AA⁷-C-和-C-AA¹-AA²-AA³-AA⁵-AA⁶-AA⁷-AA⁸-C-。当提及式I时，与序列X_n附接的两个末端半胱氨酸残基与式I的3,5-(双巯基甲基苯甲酰基)结构部分偶接，并且一个半胱氨酸残基也与序列X_m偶接(其也与式I的3,5-(双巯基甲基苯甲酰基)结构部分偶接)。当提及式II时，与序列X_m附接的两个末端半胱氨酸残基与式II的3,5-(双巯基甲基苯甲酰基)结构部分偶接，并且一个半胱氨酸残基也与序列X_n偶接(其也与式II的3,5-(双巯基甲基苯甲酰基)结构部分偶接)。

具体示例

本文所公开的二环肽的具体示例显示在表6中。

表6.本研究^a中的肽序列

/>

^aBMB，3,5-双(巯基甲基)苯甲酰基；Φ，L-2-萘丙氨酸；MP，3-巯基丙酰基。

^b仅下划线部分。

可检测到的结构部分

本发明所公开的化合物还可包含可检测到的结构部分，例如与X_m或X_n或R¹上的任何氨基酸的侧链连接。可检测到的结构部分可包含任何可检测到的标记。合适的可检测到的标记的实例包括但不限于UV-Vis标记、近红外标记、发光基团、磷光基团、磁自旋共振标记、光敏剂、光可裂解结构部分、螯合中心、重原子、放射性同位素、同位素可检测到的自旋共振标记、顺磁部分、发色团或其任何组合。在一些实施方案中，该标记为可检测到的，而无需添加其他试剂。

在一些实施方案中，可检测到的结构部分为生物相容的可检测到的结构部分，使得这些化合物可适用于多种生物学应用。如本文所用，“生物相容性”和“生物相容的”通常是指与其任何代谢物或降解产物一起对细胞和组织无毒的化合物，并且当细胞和组织在它们的存在下温育(例如，培养)时，它们不会对细胞和组织造成任何显著的不利影响。

可检测到的结构部分可含有发光体，诸如荧光标记或近红外标记。合适的发光体的示例包括但不限于金属卟啉；苯并卟啉；氮杂苯并卟啉；Napthoporphyrin；酞菁；多环芳族烃，诸如二萘嵌苯、二萘嵌苯二亚胺、芘；偶氮染料；呫吨染料；硼二亚甲基硼、aza-borondipyoromethene、花青染料、金属配体络合物诸如二吡啶、联吡啶、菲咯啉、香豆素以及钌和铱的乙酰丙酮化物；吖啶、恶嗪衍生物诸如二苯嗪；氮杂轮烯、squaraine；8-羟基喹啉、聚甲炔、发光产生纳米颗粒，诸如量子点、纳米晶体；喹诺酮；铽络合物；无机磷光体；离子载体诸如冠醚附属或衍生染料；或其组合。合适的发光体的具体示例包括但不限于Pd(II)八乙基卟啉；Pt(II)-八乙基卟啉；Pd(II)四苯基卟啉；Pt(II)四苯基卟啉；Pd(II)内消旋-四苯基卟啉四苯并卟啉；Pt(II)内消旋-四苯甲基苯并卟啉；Pd(II)八乙基卟啉酮；Pt(II)八乙基卟啉酮；Pd(II)内消旋-四(五氟苯基)卟啉；Pt(II)内消旋-四(五氟苯基)卟啉；Ru(II)三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)(Ru(dpp)₃)；Ru(II)三(1,10-邻菲咯啉)(Ru(phen)₃),六水合三(2,2’-二吡啶)氯化钌(II)(Ru(bpy)₃)；食用樱桃红B；荧光素；异硫氰酸荧光素(FITC)；伊红；铱(III)((N-甲基-苯并咪唑-2-基)-7-(二乙氨基)-香豆素))；铟(III)((苯并噻唑-2-基)-7-(二乙氨基)-香豆素))-2-(乙酰丙酮)；Lumogen染料；Macroflex荧光红；Macrolex荧光黄；德克萨斯红；罗丹明B；罗丹明6G；硫磺罗丹明；间甲酚；百里酚蓝；二甲酚蓝；甲酚红；氯酚蓝；溴甲酚绿；溴甲酚红；溴百里酚蓝；Cy2；Cy3；Cy5；Cy5.5；Cy7；4-硝基苯酚；茜素；酚酞；邻甲酚酞；氯酚红；钙镁试剂；溴二甲酚；酚红；中性红；硝嗪；3,4,5,6-四溴酚酞；刚果红；荧光素；伊红；2',7'--二氯荧光素；5(6)—羧基荧光素；羧基萘并荧光素；8-羟基芘-1,3,6-三磺酸；半-萘酚罗丹荧；半-萘并荧光素；三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)二氯化钌(II)；(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)钌(II)四苯硼；铂(II)八乙基卟啉；二烷基碳菁类染料；二十八烷基氧代羰花青(Dioctadecylcycloxacarbocyanine)；芴基甲氧基羰基氯；7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)；绿荧光蛋白(GFP)；及其衍生物或组合。

在一些示例中，可检测到的结构部分可包含罗丹明B(Rho)、异硫氰酸荧光素(FITC)、7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)、绿荧光蛋白(GFP)或其衍生物或组合。

可检测结构部分可以在细胞穿透肽结构部分或承载物结构部分的任何氨基酸的氨基、羧酸根基团或侧链上与细胞穿透肽部分附接(例如，在氨基、羧酸根基团或侧链或X_m或X_n或R¹中的任一个上)。

治疗结构部分

本发明所公开的化合物还可包含治疗结构部分。在一些示例中，承载物结构部分包含治疗结构部分。可检测到的结构部分可以与治疗结构部分连接，或者可检测到的结构部分也可以用作治疗结构部分。治疗结构部分是指当施用于受试者时将减轻疾病或障碍的一种或多种症状的组。

治疗结构部分可包含多种药物，包括拮抗剂，例如酶抑制剂和激动剂，例如导致所需基因产物表达增加的转录因子(尽管本领域技术人员将理解，也可使用拮抗性转录因子)，都包括在内。另外，治疗结构部分包括能够直接毒性和/或能够对体内健康和/或不健康细胞诱导毒性的那些药剂。而且，治疗结构部分能够诱导和/或引发免疫系统抵抗潜在的病原体。

治疗结构部分可以例如包括抗癌剂、抗病毒剂、抗微生物剂、抗炎剂、免疫抑制剂、麻醉剂或其任何组合。

治疗结构部分可包括抗癌剂。示例抗癌剂包括13-顺式-视黄素、2-氨基-6-巯基嘌呤、2-CDA、2-氯脱氧腺苷、5-氟尿嘧啶、6-硫基鸟嘌呤、6-巯嘌呤、Accutane、放线菌素-D、阿霉素、氟尿嘧啶、安归宁、氢化可的松、阿地白介素、阿来组单抗、阿利维生素A酸、Alkaban-AQ、马法兰、全反式视黄素、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲喋呤、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷、尼鲁米特、阿那曲唑、阿糖胞苷、阿糖胞嘧啶、阿可达、阿那曲唑、阿诺新、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、安维汀、BCG、BCNU、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、BiCNU、硫酸博来霉素、博来霉素、硼替佐米、白消安、白舒非、C225、甲酰四氢叶酸钙、Campath、伊立替康、喜树碱-11、卡培他滨、Carac、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀晶片、康士得、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、柠胶因子、克拉屈滨、可的松、更生霉素、CPT-11、环磷酰胺、氨鲁米特、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U、环磷酰胺、达卡巴嗪、放线菌素D、阿法达贝泊汀、道诺霉素、柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、DaunoXome、Decadron、强的松龙、去氢可的松、Denileukin diftitox、DepoCyt、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、Dexasone、Dexrazoxane、DHAD、DIC、Diodex、多西紫杉醇、Doxil、多柔比星、阿霉素脂质体、Droxia、DTIC、DTIC-Dome、Duralone、Efudex、Eligard、Ellence、乐沙定、Elspar、Emcyt、表柔比星、阿法依泊汀、爱必妥、Erwinia L-asparaginase、磷酸雌莫司汀钠、Ethyol、Etopophos、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐、Eulexin、Evista、依西美坦、法乐通、氟维司群、来曲唑、非格司亭、氟脲苷、Fludara、Fludarabine、Fluoroplex、Fluorouracil、Fluorouracil(霜剂)、Fluoxymesterone、氟他胺、亚叶酸、FUDR、氟维司群、G-CSF、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、健择、格列卫、Lupron、Lupron Depot、Matulane、Maxidex、氮芥、-Mechlorethamine Hydrochlorine、Medralone、美卓乐、Megace、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、Mesnex、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲基泼尼松龙、Mylocel、来曲唑、Neosar、Neulasta、Neumega、Neupogen、Nilandron、尼鲁米特、氮芥子气、Novaldex、Novantrone、奥曲肽、醋酸奥曲肽、Oncospar、长春新碱、Ontak、Onxal、Oprevelkin、Orapred、Orasone、奥沙利铂、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠、Panretin、Paraplatin、Pediapred、PEG干扰素、培门冬酶、培非格司亭、PEG-INTRON、PEG-L-天冬酰胺酶、苯丙氨酸氮芥、顺铂、顺氯氨铂、泼尼松龙、泼尼松、Prelone、丙卡巴肼、PROCRIT、阿地白介素、Prolifeprospan20含卡莫司汀植入物、Purinethol、Raloxifene，Rheumatrex，Rituxan，利妥昔单抗，Roveron-A(干扰素α-2a)、Rubex、盐酸红比霉素、Sandostatin、Sandostatin LAR、沙格司亭、Solu-Cortef、Solu-Medrol、STI-571、链脲霉素、他莫昔芬、贝沙罗汀、紫杉酚、紫杉特尔、Temodar、替莫唑胺、替尼泊苷、TESPA、反应停、Thalomid、TheraCys、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤药片、Thiophosphoamide、Thioplex、塞替派、TICE、Toposar、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、视黄酸、Trexall、Trisenox、TSPA、VCR、长春花碱、万珂、依托泊苷、Vesanoid、Viadur、长春碱、硫酸长春碱、Vincasar Pfs、长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VP-16、卫萌、希罗达、Zanosar、替伊莫单抗、Zinecard、诺雷得、唑来膦酸、择泰、格立得、基立克、GM-CSF、Goserelin、粒细胞集落刺激因子、Halotestin、赫赛汀、Hexadrol、Hexalen、六甲基三聚氰胺、HMM、Hycamtin、Hydrea、Hydrocort Acetate、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢化可的、羟基脲、替伊莫单抗、替伊莫单抗、Idamycin、伊达比星、Ifex、IFN-alpha、异环磷酰胺、IL 2、IL-11、甲磺酸伊马替尼、咪唑羧酰胺、干扰素α、干扰素Alfa-2b(PEG缀合物)、白细胞介素2、白细胞介素-11、内含子A(干扰素α-2b)、甲酰四氢叶酸、留可然、沙格司亭、亮丙瑞林、长春新碱、Leustatin、阿糖胞苷脂质体、Liquid Pred、洛莫司汀、L-PAM、L-Sarcolysin、Meticorten、丝裂霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、M-Prednisol、MTC、MTX、Mustargen、氮芥、Mutamycin、马利兰、易瑞沙、伊立替康、异维甲酸、Kidrolase、Lanacort、L-天门冬酰胺酶和LCR。治疗结构部分还可包含生物医药，诸如抗体。

在一些示例中，治疗结构部分可包含抗病毒剂，诸如更昔洛韦、叠氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)等。

在一些示例中，治疗结构部分可包含抗菌剂，诸如醋氨苯砜；磺胺苯砜钠；阿来霉素；阿来西定；美西林；amdinocillin pivoxil；阿米环素；氨氟沙星；氨氟沙星甲磺酸酯；阿米卡星；硫酸阿米卡星；氨基水杨酸；氨基水杨酸钠；阿莫西林；安福霉素；氨苄青霉素；氨苄西林钠；阿帕西林钠；阿泊拉霉素；天冬菌素；硫酸阿司米星；卑霉素；阿佛帕星；阿奇霉素；阿洛西林；阿洛西林钠；盐酸巴氨西林；杆菌肽；杆菌肽亚甲基双水杨酸酯；杆菌肽锌；巴波霉素；苯沙酸钙；红霉素B；硫酸倍他霉素；比阿培南；比尼拉霉素；盐酸苯柳胺酯；硫酸镁双巯氧吡啶；布替卡星；硫酸丁苷菌素；硫酸卷曲霉素；卡巴氧；羧苄青霉素二钠；羧苄青霉素钠茚满酯；羧苄苯青霉素钠；羧苄青霉素钾；卡芦莫南钠；头孢克洛；头孢羟氨苄；头孢孟多；头孢孟多酯钠；头孢孟多钠；头孢帕罗；羟胺唑头孢菌素；头孢唑仑钠；头孢唑林；头孢唑林钠；头孢拉宗；头孢地尼；头孢吡肟；盐酸头孢吡肟；头孢替考；头孢克肟；盐酸头孢甲肟；头孢美唑；头孢美唑钠；头孢尼西单钠；头孢尼西钠；头孢哌酮钠；头孢雷特；头孢噻肟钠；头孢替坦；头孢替坦二钠；盐酸头孢替安；头孢西丁；头孢西丁钠；头孢咪唑；头孢咪唑钠；头孢匹胺；头孢匹胺钠；硫酸头孢匹罗；头孢泊肟普昔塞酯；头孢丙烯；头孢沙定；头孢磺啶钠；头孢他啶；头孢布烯；头孢唑肟钠；头孢曲松钠；头孢呋辛；头孢呋辛乙酰氧乙酯；头孢呋辛匹赛酯；头孢呋辛钠；头孢乙腈钠；头孢氨苄；盐酸头孢氨苄；头孢；头孢噻啶；头孢噻吩钠；头孢匹林钠；头孢拉定；盐酸西托环素；乙酰霉素；氯霉素；氯霉素棕榈算酯；氯霉素泛酸盐络合物；氯霉素琥珀酸钠；磷酸氯己定；氯二甲苯酚；金霉素硫酸氢盐；盐酸金霉素；西诺沙星；环丙沙星；盐酸环丙沙星；西罗霉素；克拉霉素；盐酸克林沙星；克林霉素；盐酸克林霉素；盐酸克林霉素棕榈酸酯；磷酸克林霉素；氯法齐明；苄星邻氯青霉素；氯苯唑青霉素钠；氯羟喹；多粘菌素e甲磺酸钠；硫酸抗敌素；香豆霉素；香豆素钠；环青霉素；环丝氨酸；达福普汀；氨苯砜；达托霉素；地美环素；盐酸地美环素；去甲四环素；denofungin；二甲氧苄氨嘧啶；双氯青霉素；双氯青霉素钠；硫酸二氢链霉素；二硫氧吡啶；地红霉素；强力霉素；强力霉素钙；doxycycline fosfatex；海克强力霉素；droxacin sodium；依诺沙星；依匹西林；盐酸表四环素；红霉素；醋硬脂红霉素；依托红霉素；琥乙红霉素；葡庚糖酸红霉素；乳糖酸红霉素；丙酸红霉素；硬脂酸红霉素；盐酸乙胺丁醇；乙硫异烟胺；氟罗沙星；氟氯西林；氟氘丙氨酸；氟甲喹；磷霉素；磷霉素氨丁三醇；呋莫西林；呋唑氯铵；酒石酸呋唑氯铵；夫西地酸钠；梭链孢酸；硫酸庆大霉素；格洛莫南；短杆菌肽；卤普罗近；海他西林；海他西林钾；海克西定；依巴沙星；亚胺培南；异康唑；异帕米星；异烟肼；交沙霉素；硫酸卡那霉素；吉他霉素；左呋喃他酮；左普匹西林钾(levopropylcillin potassium)；来红霉素；林那霉素；盐酸林那霉素；洛美沙星；盐酸洛美沙星；洛美沙星甲磺酸；氯碳头孢；磺胺米隆；甲氯环素；甲氯环素磺基水杨酸；巨霉素磷酸钾；美喹多司；美罗培南；甲烯土霉素；盐酸甲烯土霉素；乌洛托品；乌洛托品马尿酸盐；乌洛托品扁桃酸盐；甲氧西林钠；美替普林；盐酸甲硝唑；磷酸甲硝唑；美洛西林；美洛西林钠；米诺环素；盐酸米诺环素；盐酸米林霉素；莫能菌素；莫能菌素钠；萘夫西林钠；萘啶酸钠；萘啶酸；natainycin；尼拉霉素；棕榈酸新霉素；硫酸新霉素；十一碳烯酸新霉素；硫酸奈替米星；中性霉素；nifuiradene；硝呋氨氧腙；硝呋太尔；nifuratrone；硝呋羟乙咪酮；硝呋甲咪酮；nifiupirinol；硝呋奎唑；硝基噻唑(nifurthiazole)；nitrocycline；呋喃妥因；nitromide；诺氟沙星；新生霉素钠；氧氟沙星；onnetoprim；苯唑西林；苯唑西林钠；肟莫南；肟莫南钠；噁喹酸；氧四环素；氧四环素钙；盐酸氧四环素；帕地霉素；对氯苯酚；paulomycin；培氟沙星；甲磺酸培氟沙星；培那西林；青霉素G苄星；青霉素G钾；普鲁卡因青霉素G；青霉素G钠；青霉素V；青霉素V苄星；青霉素V海巴明盐；青霉素V钾；戊胺唑酮钠；苯基氨基水杨酸盐；哌拉西林钠；吡苄西林钠；吡地西林钠；盐酸吡利霉素；盐酸匹氨青霉素；双羟萘酸匹氨青霉素；丙苯酸匹氨青霉素；硫酸多粘菌素B；紫菜霉素；普匹卡星；吡嗪酰胺；吡啶硫酮锌；醋酸喹癸胺(quindecamine acetate)；喹奴普丁；消旋甲砜霉素；雷莫拉宁；雷尼霉素；雷洛霉素；瑞普米星；利福布汀；利福美坦；利福克西；利福米特；利福平；利福喷丁；利福昔明；吡甲四环素；硝酸吡甲四环素；罗沙米星；丁酸罗沙米星；丙酸罗沙米星；罗沙米星磷酸钠；硬脂酸罗沙米星；罗索沙星；洛克沙胂；罗红霉素；山环素；山费培南钠；沙漠西林；沙匹西林；司可芬净；西索米星；硫酸西索米星；司帕沙星；盐酸奇放线菌素；螺旋霉素；盐酸司他霉素；司替霉素；硫酸链霉素；烟肼链霉素；磺胺苯；磺胺苯酰；磺胺醋酰；磺胺醋酰钠；黄安西汀；磺胺嘧啶；磺胺嘧啶钠；磺胺多辛；磺胺甲；磺胺甲基嘧啶；磺胺对甲氧嘧啶；磺胺二甲基嘧啶；磺胺甲二唑；磺胺甲恶唑；磺胺间甲氧嘧啶；磺胺恶唑；氨基苯磺酸锌；磺胺硝苯；柳氮磺吡啶；磺胺甲异噻唑；磺胺噻唑；磺胺甲苯吡唑；磺胺异恶唑；磺胺乙酰异恶唑；磺胺异唑二乙醇胺；磺粘菌素；硫培南；sultamricillin；磺氨苄青霉素钠；盐酸酞氨青霉素；替考拉宁；盐酸替马沙星；替莫西林；四环素；盐酸四环素；四环素磷酸复盐；四氧普林；甲砜霉素；thiphencillin potassium；羧噻酚青霉素甲苯酯钠；替卡西林二钠；替卡西林一钠；替克拉酮；氯化乔多；妥布霉素；硫酸妥布霉素；托氟沙星；甲氧苄氨嘧啶；硫酸甲氧苄啶；三重磺胺嘧啶；醋竹桃霉素；硫酸丙大观霉素；短杆菌素；万古霉素；盐酸万古霉素；维吉霉素；或拉米霉素。

在一些示例中，治疗结构部分可包含抗炎剂。

在一些示例中，治疗结构部分可包含地塞米松(Dex)。

在其他示例中，治疗结构部分包含治疗性蛋白质。例如，一些人在某些酶中存在缺陷(例如，溶酶体贮积病)。本文公开了通过将酶/蛋白质与所公开的细胞穿透肽之一连接而将此类酶/蛋白质递送至人细胞。已经用蛋白质(例如，GFP、PTP1B、肌动蛋白、钙调蛋白、肌钙蛋白C)测试了所公开的细胞穿透肽，并显示其起作用。

靶向结构部分

本发明所公开的化合物还可包含靶向结构部分。在一些示例中，承载物结构部分包含靶向结构部分。靶向结构部分可包含例如可靶向一个或多个酶结构域的氨基酸序列。在一些示例中，靶向结构部分可包含针对可在疾病中起作用的酶的抑制剂，诸如癌症、囊性纤维化、糖尿病、肥胖症或其组合。例如，靶向结构部分可包含表7中列出的任一序列。

表7.示例靶向结构部分

/>

/>

*Fpa，Σ＝L-4-氟苯丙氨酸；Pip，Θ＝L-高脯氨酸；Nle，Ω＝L-正亮氨酸；Phg，Ψ＝L-苯甘氨酸；F₂Pmp，Λ＝L-4-(膦酰基二氟甲基)苯丙氨酸；Dap＝L-2,3-二氨基丙酸；Nal，Φ’＝L-β-萘丙氨酸；Pp，θ＝L-哌啶酸；Sar,Ξ＝肌氨酸；Tm＝苯均三酸。

在一些示例中，靶向结构部分可以为SEQ ID NO:168至SEQ ID NO:214中的任一个。在一些示例中，靶向结构部分可以为SEQ ID NO:168至SEQ ID NO:214中任一个的变体。

靶向结构部分和细胞穿透肽结构部分可以重叠，即形成细胞穿透肽结构部分的残基也可以为形成靶向结构部分的序列的一部分，反之亦然。

治疗结构部分可以在细胞穿透肽结构部分或承载物结构部分的任何氨基酸的氨基、羧酸根基团或侧链上与细胞穿透肽部分附接(例如，在氨基、羧酸根基团或侧链或X_m、X_n或R¹中的任一个上)。在一些示例中，治疗结构部分可附接到可检测到的结构部分。

在一些示例中，治疗结构部分可包含靶向结构部分，其可充当针对Ras(例如，K-Ras)、PTP1B、Pin1、Grb2SH2、CAL PDZ等的抑制剂，或其组合。

Ras为人体内由RAS基因编码的蛋白质。正常Ras蛋白在正常组织信号传导中发挥重要作用，并且Ras基因的突变与许多癌症的发展有关。Ras可以充当分子开/关开关，一旦开启，Ras就会募集并激活生长因子和其他受体信号传导所必需的蛋白质。Ras的突变形式涉及各种癌症，包括肺癌、结肠癌、胰腺癌和各种白血病。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)为PTP超家族的原型成员，在真核细胞信号传导过程中发挥着多种作用。PTP1B为胰岛素信号传导途径的负调节剂，并且被认为是有希望的潜在治疗靶标，特别是用于治疗II型糖尿病。PIP1B也与乳腺癌的发展有关。

Pin1为一种与蛋白质子集结合的酶，在调节蛋白质功能中起到磷酸化后控制的作用。Pin1活性可调节脯氨酸定向激酶信号传导的结果，因此可调节细胞增殖和细胞存活。Pin1的失调可以在各种疾病中发挥作用。Pin1的上调可能与某些癌症有关，Pin1的下调可能与阿尔茨海默病有关。Pin1的抑制剂可以对癌症和免疫障碍具有治疗意义。

Grb2为参与信号转导和细胞通讯的衔接蛋白。Grb2蛋白含有一个SH2结构域，可以结合酪氨酸磷酸化序列。Grb2被广泛表达，并且对多种细胞功能至关重要。抑制Grb2的功能可损害发展过程并可阻断各种细胞类型的转化和增殖。

最近报道，囊性纤维化膜电导调节因子(CFTR)(一种在囊性纤维化(CF)患者中发生突变的氯离子通道蛋白)的活性受CFTR相关配体(CAL)通过其PDZ结构域(CAL-PDZ)的负调控(Wolde等人，J.Biol.Chem.2007年，第282卷，第8099页)。显示CFTR/CAL-PDZ交互作用的抑制通过减少其蛋白酶体介导的降解来改善ΔPhe508-CFTR(最常见的CFTR突变形式)的活性(Cheng,SH等人，Cell，1990年，第63卷，第827页；Kerem,BS等人Science 1989年，第245卷，第1073页)(Cushing,PR等人Angew.Chem.Int.Ed.2010年，第49卷，第9907页)。因此，本文公开了通过施用有效量的本文所公开的化合物或组合物治疗患有囊性纤维化的受试者的方法。施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗结构部分，其可包含可以作为针对CALPDZ的抑制剂的靶向结构部分。而且，本文所公开的化合物或组合物可以与校正CFTR功能的分子一起施用。

在一些示例中，靶向结构部分可包含E-T-G-E-F-L(SEQ ID NO:215)或LDPETGE(SEQ ID NO:216)。

连接结构部分

本公开内容提供了根据式IV′的化合物：

其中：

每个Y独立地为CH或N，条件是不超过四个Y为N；

Z为OR_a、氢、卤素、碳环基、杂环基或氨基酸；

每个R独立地为烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基或氨基酸；

以及

R_a独立地为H、C(O)烷基、烷基、烯基、炔基、碳环或杂环基。

在实施方案中，式IV的化合物具有根据式IV′a的结构：

在一些实施方案中，其中Z为OH。在一些实施方案中，R独立地为芳基或杂芳基。

在一些实施方案中，式IV的化合物具有根据式IV′b的结构

其中每个实例的Q独立地为CH或N。

在一些实施方案中，化合物具有以下结构

制备方法

如本领域技术人员所理解的，本文所述的化合物可使用有机合成领域技术人员已知的合成技术或其变体来制备。本文所述的化合物可由易得的原料制备。最佳反应条件可随着使用的特定反应物或溶剂而变化，但此类条件可由本领域的技术人员确定。

本文所述化合物的变体包括如对每种化合物所述的各种成分的添加、减去或移动。类似地，当分子中存在一个或多个手性中心时，分子的手性可以被改变。另外，化合物合成可涉及各种化学基团的保护和去保护。保护和去保护的使用以及适当保护基团的选择可由本领域的技术人员确定。保护基团的化学结构可见于例如Wuts and Greene,ProtectiveGroups in Organic Synthesis,第4版,Wiley&Sons,2006，其全文以引用方式并入本文。

用于制备所公开的化合物和组合物的起始物质和试剂可以从商业供应商处获得，诸如Aldrich Chemical Co.公司(威斯康星州，密尔沃基)、Acros Organics公司(新泽西州，莫里斯平原)、Fisher Scientific公司、(宾夕法尼亚州，匹兹堡)、Sigma公司(密苏里州，圣路易斯)、Pfizer公司(纽约州，纽约市)、GlaxoSmithKline公司(北卡罗来纳州，罗利)、默克公司(新泽西州，怀特豪斯站)、强生公司(新泽西州，新不伦瑞克)、Aventis公司(新泽西州，布里奇沃特)、阿斯利康公司(特拉华州，威尔明顿)、诺华公司(瑞士，巴塞尔)、惠氏公司(新泽西州，麦迪逊)、百时美施贵宝公司(纽约州，纽约)、罗氏公司(瑞士，巴塞尔)、礼来公司(印第安纳州，印第安纳波利斯)、雅培公司(伊利诺伊州，雅培公园)、Schering Plough公司(新泽西州，凯尼尔沃思)或勃林格殷格翰公司(德国，殷格翰)，或者通过本领域技术人员已知的方法按照参考文献中所述的方法制备，诸如Fieser andFieser’s Reagents for Organic Synthesis，第1至17卷(John Wiley and Sons，1991)；Rodd的Chemistry of Carbon Compounds，第1-5卷及增刊(Elsevier SciencePublishers，1989)；Organic Reactions，第1-40卷(John Wiley and Sons,1991)；March的Advanced Organic Chemistry(John Wiley and Sons,第4版)；以及Larock的Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.,1989)。其他材料如本文所公开的药物载体可购自商业来源。

制备本文所述的化合物的反应可在溶剂中进行，该溶剂可由有机合成领域的技术人员来选择。在实施反应的条件(即温度和压力)下，溶剂可能与原料(反应物)、中间体或产物基本上不反应。反应可在一种溶剂或超过一种溶剂的混合物中进行。产物或中间体形成可根据本领域已知的任何合适的方法来监测。例如，可通过光谱手段，诸如核磁共振光谱法(例如¹H或¹³C)、红外光谱法、分光光度法(例如紫外-可见)、或质谱法，或者通过色谱法例如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法来监测产物形成。

本发明所公开的化合物可以通过固相肽合成制备，其中氨基酸α-N-末端被酸或碱保护基团保护。此类保护基团应具有对肽键形成条件稳定的性质，同时易于去除而不破坏生长的肽链或其中所含的任何手性中心的外消旋化。合适的保护基团为9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Boc)、联苯基异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基，异冰片基氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、邻硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧基羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团特别优选用于合成所公开的化合物。其他优选的侧链保护基，对于侧链氨基如赖氨酸和精氨酸、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(pmc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯磺酰基、Cbz、Boc和金刚烷氧基羰基；对于酪氨酸、苄基、邻溴苄氧基-羰基、2,6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)；对于丝氨酸、叔丁基、苄基和四氢吡喃；用于组氨酸、三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰基和2,4-二硝基苯基；对于色氨酸、甲酰基；对于天冬氨酸和谷氨酸、苄基和叔丁基以及对于半胱氨酸、三苯甲基(三苯甲基)。在固相肽合成方法中，将α-C-末端氨基酸附接到合适的固体载体或树脂上。适用于上述合成的合适的固体载体为那些对逐步缩合-脱保护反应的试剂和反应条件呈惰性的物质，以及不溶于所用介质的物质。用于合成α-C-末端羧基肽的固体载体为4-羟甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)或4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基乙酰胺基乙基树脂，可从Applied Biosystems公司(加利福尼亚州，福斯特城)获得。通过N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或邻苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，含有或不含有4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)或双(2-氧代-3-恶唑烷基)氯化膦(BOPCl)的情况下，α-C-末端氨基酸与树脂偶接，在溶剂诸如二氯甲烷或DMF中，在10℃和50℃之间的温度下介导偶接约1至约24小时。当固体载体为4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂时，Fmoc基团在与α-C-末端氨基酸偶接之前用仲胺，优选哌啶裂解，如上所述。一种偶接脱保护的4(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂的方法为在DMF中为O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。连续受保护的氨基酸的偶接可以在自动多肽合成仪中进行。在一个示例中，生长肽链的氨基酸中的α-N-末端用Fmoc保护。从生长肽的α-N-末端侧去除Fmoc保护基团为通过用仲胺、优选哌啶处理完成的。然后以约3倍摩尔过量引入每种受保护的氨基酸，并且偶接优选在DMF中进行。偶联剂可以为O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。在固相合成结束时，从树脂中去除多肽并连续或在单次操作中脱保护。通过用包含茴香硫醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的裂解试剂处理树脂结合的多肽，可以在单次操作中完成多肽的去除和去保护。在多肽的α-C-末端为烷基酰胺的情况下，树脂通过用烷基胺的氨解而裂解。另选地，可以通过酯交换反应去除肽，例如用甲醇，然后氨解或通过直接转酰氨基作用。此时可以纯化受保护的肽或直接用于下一步骤。可以使用上述裂解混合物完成侧链保护基团的去除。完全去保护的肽可以通过采用以下任何或所有类型的一系列色谱步骤纯化：在弱碱性树脂上的离子交换(乙酸盐形式)；在未衍生的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如，Amberlite XAD)上的疏水性吸附色谱；硅胶吸附色谱；羧甲基纤维素离子交换色谱；分离色谱，例如在Sephadex G-25、LH-20或反流分布上；高效液相色谱(HPLC)，尤其是在辛基—或十八烷基甲硅烷基—二氧化硅键合相柱填料上的反相HPLC。

在本文所公开的具体方法中，制备二环肽的方法包括使式IV化合物与具有8至20个氨基酸残基的固体负载的肽接触：

其中Q¹和Q²彼此独立地选自CH或N；其中至少两个残基为半胱氨酸残基；以及从固体载体裂解肽。合适的固体载体的示例为聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇载体。Rink、Wang或Tentagel树脂为可以使用的固体载体的合适示例。从固体载体裂解肽通常可以用弱酸或碱完成。

使用方法

本文还提供了使用本文所述的化合物或组合物的方法。本文还提供了在对此有需要的受试者的疾病或病理进行治疗的方法，包括向受试者施用有效量的本文所述的任何化合物或组合物。

本文还提供了治疗、预防或改善受治疗者中癌症的方法。这些方法包括向受试者施用有效量的一种或多种本文所述的化合物或组合物或其药学上可接受的盐。本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐可用于治疗人类(如儿科和老年人群)和动物(例如兽医应用)中的癌症。所公开的方法可任选地包括鉴定患有癌症或者可能需要治疗癌症的患者。本文所述化合物和组合物可治疗的癌症类型的示例包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖道癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌和睾丸癌。另外的示例包括肛门、胆管、骨、骨髓、肠(包括结肠和直肠)、眼、胆囊、肾、口腔、喉、食道、胃、睾丸、子宫颈、间皮瘤、神经内分泌、阴茎、皮肤、脊髓、甲状腺、阴道、外阴、子宫、肝、肌肉、血液细胞(包括淋巴细胞和其它免疫系统细胞)的癌症和/或肿瘤。本文所述化合物和组合物可治疗的癌症的另外示例包括癌、卡波济氏肉瘤、黑素瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、胰腺癌、肺癌、白血病(急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓样白血病及其它)、以及淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤)和多发性骨髓瘤。可通过所公开的化合物治疗的癌症的其他示例为p53癌症，例如，通过使用其中承载物结构部分为SEQ ID NO:156的化合物，例如SEQ ID NO.:166和SEQ ID NO.:167。

本文所述的治疗或预防癌症的方法还可包括用一种或多种另外的试剂(例如抗癌剂或电离辐射)治疗。如本文所述的一种或多种另外的试剂以及化合物和组合物或其药学上可接受的盐可以任何次序施用，包括同时施用，以及以最多至相隔若干天的时间相间隔次序施用。该方法还可包括超过一次施用如本文所述的一种或多种另外的试剂和/或化合物和组合物或其药学上可接受的盐。如本文所述的一种或多种另外的试剂以及化合物和组合物或其药学上可接受的盐可通过相同或不同的途径施用。当用一种或多种另外的试剂治疗时，可将如本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐结合到包含一种或多种另外的试剂的药物组合物中。

例如，如本文所述的化合物或组合物或其药学上可接受的盐可以与另外的抗癌剂组合成药物组合物。

本文所公开的化合物也可单独使用或与诸如更昔洛韦、叠氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)等的抗癌剂或抗病毒剂联合使用，以治疗感染有可造成细胞转化的病毒的患者并且/或者治疗患有与细胞中存在的病毒基因组相关的肿瘤或癌症的患者。本文所公开的化合物还可与肿瘤疾病的基于病毒的治疗联合使用。

本文还描述了杀死受试者中的肿瘤细胞的方法。该方法包括使肿瘤细胞与有效量的如本文所述的化合物或组合物接触，并任选地包括用有效量的电离辐射照射肿瘤细胞的步骤。另外，本文提供了肿瘤放射疗法的方法。该方法包括使肿瘤细胞与有效量的如本文所述的化合物或组合物接触，并用有效量的电离辐射照射肿瘤。如本文所用，术语电离辐射是指包含如下粒子或光子的辐射：具有足够的能量，或者可经由核交互作用产生足够能量，从而产生电离。电离辐射的一个示例为x辐射。有效量的电离辐射是指在与本文所述的化合物联合施用时引起细胞损伤或死亡增加的电离辐射的剂量。电离辐射可根据如本领域已知的方法递送，包括施用放射性标记的抗体和放射性同位素。

如本文所述的方法和化合物可用于预防性和治疗性治疗两者。如本文所用，术语治疗或处理包括预防；延缓发作；发病后病征或症状恶化的消减、消除或延缓；以及预防复发。为了预防性应用，将如本文所述的治疗有效量的化合物和组合物或其药学上可接受的盐在发病前(例如，在癌症的明显迹象之前)、早期发作期间(例如，在癌症的初始迹象和症状之时)、或癌症发展确立后施用于受治疗者。预防性施用可在感染症状显现前若干天至数年发生。预防性施用可用于例如对呈现癌前病变的受试者、被诊断患有早期恶性肿瘤的受试者以及对特定癌症具有易感性(例如，家族、种族和/或职业)的亚组的化学预防性治疗。治疗性治疗包括在诊断出癌症之后，向受治疗者施用治疗有效量的如本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐。

在治疗、预防或改善受试者的癌症或肿瘤的方法的一些示例中，施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗结构部分，其可包含可作为针对Ras(例如K-Ras)、PTP1B、Pin1、Grb2 SH2或其组合的抑制剂的靶向结构部分。

本发明所公开的主旨还涉及用于治疗患有代谢障碍或病症的受试者的方法。在一个实施方案中，将有效量的一种或多种本文所公开的化合物或组合物施用于患有代谢障碍并且需要对其进行治疗的受试者。在一些示例中，代谢障碍可包括II型糖尿病。在治疗、预防或改善受试者的代谢障碍的方法的一些示例中，施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗结构部分，其可包含可作为针对PTP1B的抑制剂的靶向结构部分。在该方法的一个特定示例中，受试者肥胖，并且该方法包括通过施用如本文所公开的组合物治疗受试者的肥胖症。

本发明所公开的主旨还涉及用于治疗患有免疫障碍或病症的受试者的方法。在一个实施方案中，将有效量的一种或多种本文所公开的化合物或组合物施用于患有免疫障碍并且需要对其进行治疗的受试者。在治疗、预防或改善受试者的免疫障碍的方法的一些示例中，施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗结构部分，其可包含可作为针对Pin1的抑制剂的靶向结构部分。

本发明所公开的主旨还涉及用于治疗患有囊性纤维化的受试者的方法。在一个实施方案中，将有效量的一种或多种本文所公开的化合物或组合物施用于患有囊性纤维化并且需要对其进行治疗的受试者。在治疗受试者的囊性纤维化的方法的一些示例中，施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗结构部分，其可包含可作为针对CAL PDZ的抑制剂的靶向结构部分。

组合物、制剂和施用方法

所公开的化合物和含有它们的组合物的体内应用可以通过本领域技术人员目前或预期已知的任何合适的方法和技术来实现。例如，可将所公开的化合物以生理上或药学上可接受的形式进行配制，并且通过本领域已知的任何合适的途径施用，包括例如经口、经鼻、经直肠、局部和经肠胃外施用途径。如本文所用，术语肠胃外包括例如通过注射皮下、真皮内、静脉内、肌内、腹膜内和胸骨内施用。所公开的化合物或组合物的施用可为单次施用，或以如本领域的技术人员可容易确定的连续或不同的间隔施用。

本文所公开的化合物和包含其的组合物也可利用脂质体技术、缓释胶囊、植入泵和可生物降解的容器来施用。有利的是，这些递送方法可在延长的时段内提供一致的剂量。也可将化合物以其盐衍生物形式或晶体形式施用。

本文所公开的化合物可根据制备药学上可接受的组合物的已知方法进行配制。制剂在本领域技术人员公知且易得的大量资料中详细描述。例如，E.W.Martin的Remington’sPharmaceutical Science(1995)描述了可与所公开的方法结合使用的制剂。一般来讲，可以配制本文所公开的化合物，使得有效量的化合物与合适的载体组合，以促进化合物的有效施用。所用组合物也可呈多种形式。这些包括例如固体、半固体和液体剂型，例如片剂、丸剂、粉末、液体溶液或悬浮液、栓剂、注射和输注溶液、以及喷剂。优选的形式取决于预期施用模式和治疗应用。该组合物还优选包括本领域技术人员已知的常规药学上可接受的载体和稀释剂。与化合物一起使用的载体或稀释剂的示例包括乙醇、二甲基亚砜、甘油、氧化铝、淀粉、盐水、以及等同形式的载体和稀释剂。为了给期望的治疗性治疗提供此类剂量的施用，本文所公开的组合物可有利地包含按包括载体或稀释剂的总组合物的重量计在约0.1重量％至100重量％之间的一种或多种受试化合物的总和。

适于施用的制剂包括例如含水无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使该制剂与预期受体的血液等渗的溶质；以及含水和非水无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以单位剂量或多剂量容器存在，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在使用前仅需要无菌液体载体的条件，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒剂、片剂等制备。应当理解，除了上文具体提及的组分之外，本文所公开的组合物还可包括关系到所考虑制剂类型的本领域常规的其他试剂。

本文所公开的化合物和包含其的组合物可通过与细胞直接接触或经由载体方式递送到细胞中。用于向细胞递送化合物和组合物的载体方式为本领域已知的，并且包括例如将组合物胶囊包封于脂质体部分中。将本文所公开的化合物和组合物递送至细胞的另一种方式包括将化合物附接至靶向递送至靶细胞的蛋白质或核酸。美国专利号6,960,648和美国申请公开号20030032594和20020120100公开了可以与另一个组合物偶接并且允许组合物跨越生物膜易位的氨基酸序列。美国专利申请公布号20020035243还描述了用于跨细胞膜转运生物部分进行细胞内递送的组合物。也可将化合物引入聚合物中，其示例包括用于颅内肿瘤的聚(D-L丙交酯-共-乙交酯)聚合物；聚[双(对羧基苯氧基)丙烷：癸二酸]，摩尔比为20:80(如GLIADEL中所用)；软骨素；甲壳质；和脱乙酰壳多糖。

对于肿瘤障碍的治疗，本文所公开的化合物可以与其他抗肿瘤或抗癌物质组合和/或通过放射和/或光动力疗法和/或通过外科处理施用于需要治疗的患者以去除肿瘤。可将这些其它物质或治疗以与本文所公开的化合物相同或不同的时间给出。例如，可将本文所公开的化合物与有丝分裂抑制剂诸如紫杉酚或长春碱、烷基化剂诸如环磷酰胺或异环磷酰胺、抗代谢物诸如5-氟尿嘧啶或羟基脲、DNA嵌入剂诸如阿霉素或博莱霉素、拓扑异构酶抑制剂诸如依托泊苷或喜树碱、抗血管形成剂诸如血管抑素、抗雌激素诸如它莫西芬、和/或其它抗癌药或抗体分别诸如格列卫(Novartis Pharmaceuticals Corporation)和赫塞汀(Genentech,Inc.)、或免疫治疗剂诸如易普利姆玛和硼替佐米联合使用。

在某些示例中，可将本文所公开的化合物和组合物任选地与药学上可接受的载体如惰性稀释剂联合在一个或多个解剖位置如不希望的细胞生长部位(诸如肿瘤部位或良性皮肤生长物，例如注射或局部施用于肿瘤或皮肤生长物)进行局部施用。可将本文所公开的化合物和组合物任选地与药学上可接受的载体(诸如惰性稀释剂)或用于口服递送的可同化的食用载体例如经静脉内或经口联合全身性施用。其可被包封在硬或软壳明胶胶囊中，可被压制成片剂，或者可直接随患者饮食中的食物引入。对于口服治疗施用，活性化合物可与一种或多种赋形剂组合，并以可摄取的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂、气溶胶喷雾剂等形式使用。

所公开的组合物为生物可利用的并且可以口服递送。口服组合物可以为片剂、锭剂、丸剂、胶囊等，并且也可含有以下物质：粘合剂，诸如黄蓍胶、金合欢、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；以及甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或天冬甜素，或者可添加调味剂，诸如胡椒薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型为胶囊时，除了以上类型的材料之外，其还可含有液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可作为包衣存在或以其它方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、药丸或胶囊可涂覆有明胶、蜡、紫胶、或糖等。糖浆或酏剂可含有活性化合物、蔗糖或果糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、染料和调味剂，如樱桃或橙风味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应当在所用的量下为药学上可接受的并且基本上无毒。此外，可将活性化合物引入缓释制剂和装置中。

本文所公开的化合物和组合物(包括其药学上可接受的盐或前药)可通过输注或注射经静脉内、肌内、或腹膜内施用。可在任选地与无毒表面活性剂混合的水中制备活性剂或其盐的溶液。还可在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯和它们的混合物以及油中制备分散体。在常规储存和使用条件下，这些制剂可含有用于预防微生物生长的防腐剂。

适于注射或输注的药物剂型可包括含有活性成分的无菌水溶液或分散体或无菌粉末，其适用于临时制备任选地胶囊包封于脂质体中的无菌可注射或可输注溶液或分散体。最终剂型应当为无菌流体并且在制造和储存条件下很稳定。液体载体或媒介物可为溶剂或液体分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯、及其适宜混合物。适当的流动性可例如通过形成脂质体，通过在分散体情况下维持所需粒度，或通过使用表面活性剂来维持。任选地，微生物作用的预防可由各种其它抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等达到。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的长效吸收可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶达到。

无菌可注射溶液如下制备：根据需要将本文所公开的化合物和/或试剂以所需量与各种其它以上列举的成分一起引入适当溶剂中，然后进行过滤灭菌。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分与先前无菌过滤的溶液中存在的任何另外的期望成分的粉末。

对于局部施用，可将本文所公开的化合物和试剂作为液体或固体施用。然而，通常期望将它们与皮肤病学可接受的载体(可为固体或液体)作为组合物来联合局部施用到皮肤上。可将本文所公开的化合物和试剂和组合物局部施用到受治疗者的皮肤上，以减小恶性或良性生长物的尺寸(并且可包括完全去除)，或者治疗感染部位。可将本文所公开的化合物和试剂直接施用于生长或感染部位。优选地，将化合物和试剂以诸如膏剂、霜剂、洗剂、溶液、酊剂等的制剂施用到生长或感染部位。

可用的固体载体包括微细粉碎的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。可用的液体载体包括水、醇或二醇或水-醇/二醇共混物，其中化合物可任选地借助于无毒表面活性剂以有效的水平溶解或分散。可添加辅剂诸如芳香剂和另外的抗微生物剂，以针对给定用途最优化性质。所得的液体组合物可例如从用于浸渍绷带和其它敷料的吸收垫施用，或者使用泵型或气溶胶喷涂器喷涂到受感染的区域上。

也可将增稠剂如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料与液体载体一起使用，以形成直接施用到使用者皮肤上的可涂敷糊剂、凝胶、软膏剂、皂等。

本文所公开的化合物和试剂和药物组合物的可用剂量可通过在动物模型中比较其体外活性与体内活性来确定。用于将小鼠和其它动物的有效剂量外推至人的方法为本领域已知的。

组合物施用的剂量范围大到足以产生症状或障碍受到影响的期望效应。剂量不应大到引起不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。一般来讲，剂量将随患者的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，并且可由本领域的技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可在一天或若干天内每天给予一次或多次剂量施用。

本发明还公开了药物组合物，包含与药学上可接受的载体组合的本文所公开的化合物。包含一定量化合物的适于口服、局部或非肠道施用的药物组合物构成优选的方面。施用于患者，尤其是人的剂量应当足以在合理的时间帧内在患者体内实现疗效而无致死毒性，并且优选地导致不超过可接受水平的副作用或发病率。本领域的技术人员将认识到，剂量将取决于多各因素，包括受治疗者的状况(健康状态)、受治疗者的体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗比率、治疗比、以及病理状态的严重程度和阶段。

还公开了在一个或多个容器中包含本文所公开的化合物的试剂盒。所公开的试剂盒可任选地包括药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一个实施方案中，试剂盒包括如本文所述的一种或多种其它组分、助剂或辅剂。在另一个实施方案中，试剂盒包括一种或多种抗癌剂，诸如本文所述的那些试剂。在一个实施方案中，试剂盒包括说明如何施用试剂盒中化合物或组合物的说明书或包装材料。试剂盒的容器可为任何合适的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并为任何合适的尺寸、形状或构造。在一个实施方案中，本文所公开的化合物和/或试剂在试剂盒中提供为固体，例如片剂、丸剂或粉末形式。在另一个实施方案中，本文所公开的化合物和/或试剂在试剂盒中提供为液体或溶液。在一个实施方案中，试剂盒包括安瓿或注射器，所述安瓿或注射器含有液体或溶液形式的本文所公开的化合物和/或试剂。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以作出各种修改。相应地，其他实施方案在以下权利要求书的范围内。

实施例

提出以下实施例以向本领域的普通技术人员提供如何制备和评价本文要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开内容和描述，并且预期仅仅是本发明的示例，并非旨在限制发明人认为是其发明的范围。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一定的误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，温度为℃或为环境温度，压力为大气压或接近大气压。

实施例1：二环化支架的合成。

用于肽合成的试剂购自Chem-Impex公司(伊利诺伊州，伍德代尔)、NovaBiochem公司(加利福尼亚州，拉霍亚)或Anaspec公司(加利福尼亚州，圣何塞)。Rink酰胺树脂LS(100-200目，0.2mmol/g)购自Advanced ChemTech公司。细胞培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、0.25％胰蛋白酶-EDTA和DPBS购自Invitrogen公司(加利福尼亚州，卡尔斯巴德)。3,5-二甲基苯甲酸甲酯、N-溴代琥珀酰亚胺、亚磷酸二乙酯、2,2'-联吡啶二硫化物和其他有机试剂/溶剂购自Sigma-Aldrich公司(密苏里州，圣路易斯)。抗GST-Tb和链霉抗生物素蛋白-d2购自Cisbio公司(马萨诸塞州，贝德福德)。NF-κB报道基因(Luc)-HEK293细胞系和One-Step^TM荧光素酶分析系统购自BPS Bioscience公司(加利福尼亚州，圣地亚哥)。

方案2.二环化支架的合成。

3,5-双(溴甲基)苯甲酸甲酯的合成。方案2中示出了二环化支架的总体合成计划。向装有3,5-二甲基苯甲酸甲酯(2.0g，12.2mmol)的四氯化碳(20mL，用氮气喷射)的50mL圆底烧瓶中添加N-溴代琥珀酰亚胺(4.25g，23.9mmol)和过氧化苯甲酰(～60mg)作为引发剂。将反应在氮气氛下回流3小时。冷却反应混合物并过滤。将滤液用水(20mL)洗涤，用MgSO₄干燥，并真空浓缩。将粗制产物在石油醚中重结晶，得到为30％收率的标题化合物(1.2g，3.8mmol)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)：δ7.99(s,2H),7.62(s,1H),4.50(s,4H),3.94(s,3H).

3,5-双((乙酰硫代)甲基)苯甲酸甲酯的合成。向装有上述粗制的3,5-双(溴甲基)苯甲酸甲酯(1.0g，3.1mmol)的50mL圆底烧瓶中添加丙酮(20mL)和硫代乙酸钾(0.86g，7.52mmol)。将反应在氮气氛下回流3小时并使其冷却。添加20mL水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取混合物。将合并的有机层用MgSO₄干燥、浓缩，并通过硅胶色谱法纯化，得到0.72g的橙棕色固体(74.2％收率)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)：δ7.83(s,2H)，7.41(s,1H)，4.12(s,4H),3.90(s,3H),2.36(s,6H)。

3,5-双((吡啶-2-基二硫烷基)甲基)苯甲酸的合成。在氮气氛下向50mL圆底烧瓶中加入溶解在MeOH(15mL)中的3,5-双((乙酰硫代)甲基)苯甲酸甲酯(0.5g，1.6mmol)。添加NaOH(832mg，20.8mmol)的H₂O(3mL)溶液，使反应在室温下反应过夜。将反应溶液用AcOH(2.38mL，41.6mmol)酸化，并添加2,2'-联吡啶二硫化物(1.41g，6.4mmol)。过滤反应混合物以去除形成的橙色沉淀，并在室温下搅拌1小时。反应完成后，通过真空蒸发去除甲醇，并且将残余物快速装载到硅胶柱上。首先用20％至50％的EtOAc的己烷溶液洗脱柱以去除任何低极性物质，然后用含有1％ AcOH的己烷中的1:1(v/v)EtOAc洗脱所需产物。蒸发溶剂，得到棕色固体(222mg，两步收率为32％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ8.43(m,2H)，7.83(s,2H)，7.53-7.43(m,5H)，7.04(m,2H)，3.97(s,4H)。HRMS(ESI+)：C₁₉H₁₇N₂O₂S₄(M+H⁺)的计算值：433.0173；实测值：433.0176。

实施例2.二环肽的合成

肽的制备和表征。使用标准Fmoc化学在Rink酰胺树脂LS(0.2mmol/g)上合成肽。典型的偶合反应含有5当量的Fmoc氨基酸、5当量的2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)和10当量的二异丙基乙胺(DIPEA)，并且在温和混合下进行45分钟。通过用90:2.5:2.5:2.5:2.5(v/v)TFA/1,2-乙二硫醇/水/苯酚/三异丙基硅烷(TIPS)处理2小时，将肽去保护并从树脂中释放。将肽用冷乙醚(3×)研磨，并通过配备有C₁₈柱的反相HPLC纯化。通过将纯化的肽(每种～1mg)溶解在300μL的1:1:1DMSO/DMF/150mM的碳酸氢钠(pH8.5)中并与10μL的FITC在DMSO(100mg/mL)混合来进行用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的肽。在室温下20分钟之后，通过反相HPLC再次纯化反应混合物以分离FITC标记的肽。

为了合成二硫化物介导的二环肽，首先使用标准Fmoc/HATU化学制备含有两个Acm-保护的Cys残基的对应线性肽。通过用DMF中的2M乙酸汞(II)处理树脂过夜以去除Acm基团。然后将树脂在20％β-巯基乙醇的DMF中温育2小时(两次)以释放游离巯基。用DMF彻底清洗后去除所有还原剂，将树脂与1当量的3,5-双((吡啶-2-基二硫烷基)甲基)苯甲酸在含有1％(v/v)乙酸的甲醇中温育过夜。通过去除一小部分树脂并通过MALDI-TOF MS分析去保护/释放的肽产物来监测反应进程。通过用85:10:2.5:2.5(v/v)TFA/DCM//水/TIPS处理树脂2小时，然后如上所述进行醚研磨和HPLC纯化，实现肽的去保护和释放(图5A)。通过分析型HPLC判断，该工作中使用的所有最终肽具有≥95％的纯度(图5B和图7)。通过MALDI-TOFMS分析证实肽的真实性。为了进一步表征生物活性肽4，将该肽溶解在H₂O/D₂O(9:1、500μL；最终样品浓度2mM)。在Bruker Ascend 700MHz光谱仪上在298K下记录NMR光谱。

实施例3.基于细胞的测定

细胞培养。将HeLa细胞维持在由DMEM、10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素组成的培养基中。将NF-κB报告基因(Luc)-HEK293细胞维持在由DMEM、10％ FBS、1％青霉素/链霉素和100μg/ml潮霉素B组成的培养基中。将细胞在37℃、5％ CO₂存在下，在潮湿的培养箱中培养。

蛋白质表达和纯化。用pGEX4T3-GST-NEMO(1-196)质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并在37℃下在补充有0.05mg/mL氨苄青霉素的Luria液体培养基中生长至OD₆₀₀为0.4。通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(150μM终浓度)诱导表达。在30℃下5小时之后，通过离心收获细胞。将细胞团块悬浮于40mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.5mMMgCl₂、5mMβ-巯基乙醇、0.1％ Triton-X-100，pH8.0)、100μg/mL溶菌酶、100μl的DNA酶I(New England BioLabs公司)和100μl止咳蛋白酶抑制剂混合物(不含EDTA)(ThermoScientific公司)中。将该混合物在4℃下搅拌30分钟并短暂超声处理(2×10s脉冲)。离心粗制裂解物，产生澄清的上清液，将其直接上样到谷胱甘肽-琼脂糖4B柱(GE Healthcare公司)上。用10mM谷胱甘肽在50mM Tris-HCl(pH 8.0)(40mL)中从柱上洗脱结合的蛋白质，使用Amicon Ultra-15离心过滤装置(MWCO 10kDa)浓缩至0.5mL，并用PBS透析(2.67mM氯化钾、1.47mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠和8.06mM磷酸氢二钠)。为了在没有GST标签的情况下产生NEMO，在浓缩之前将蛋白质用凝血酶(GE Healthcare公司)在4℃处理16小时。使用Bradford测定以牛血清白蛋白作为标准物确定蛋白质浓度。将蛋白质快速冷冻并储存在-80℃。

工程化的原核表达质粒pJCC04a,1编码含有N-末端六组氨酸标签、硫氧还蛋白、TEV蛋白酶裂解位点和IKKβC-末端片段的K703R/K704R突变形式的融合蛋白(氨基酸701-745)[His-thx-IKKβ_KK/RR(701-745)]，由Maria Pellegrini博士友情提供(达特茅斯学院)。His-thx-IKKβ_KK/RR(701-745)在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中类似地表达，并使用HisTrap FF柱(GE Healthcare公司)通过亲和层析纯化。用50mM Tris-HCl(pH8.0)、300mM NaCl、250mMImadizole，2mMβ-巯基乙醇洗脱融合蛋白，并用TEV蛋白酶(150单位，1mg融合蛋白)在4℃下处理16h，以去除硫氧还蛋白(thx)。将所得的蛋白酶消化混合物重新装载到HisTrap柱上。收集流出级分并使用Amicon Ultra-15离心过滤装置(MWCO 10kDa)浓缩至～2mg/mL。通过用10倍摩尔过量的生物素-NHS在4℃下处理过夜，使IKKβ_KK/RR(701-745)蛋白生物素酰化。通过配备有C₁₈柱的反相HPLC纯化生物素酰化的IKKβ_KK/RR(701-745)，并在-80℃下冷冻保存。

流式细胞术。将HeLa细胞在六孔板(每孔5×10⁵个细胞)中培养24小时。在实验当天，将细胞与5μM FITC标记的肽在含有1％ FBS的透明DMEM中于37℃温育2小时。用DPBS洗涤细胞，用0.25％的胰蛋白酶从平板上分离，稀释到含有10％ FBS的透明DMEM中，以250g沉淀5分钟，用DPBS洗涤一次并重悬于含有1％牛血清白蛋白的DPBS中，并在BD LSR II流式细胞仪上分析。用Flowjo软件(Tree Star)分析数据。

血清稳定性测试。通过修改先前报道的程序进行稳定性测试。²将稀释的人血清(25％)以15,000rpm离心10分钟，收集上清液。将肽储备溶液稀释到上清液中至终浓度为5μM，并在37℃下温育。在不同时间点(0至20小时)，取出200-μL等分试样并与50μL的15％三氯乙酸和200μL乙腈混合，并将混合物在4℃温育过夜。将最终混合物在微量离心机中以15,000rpm离心10分钟，并通过配备有分析型C₁₈柱(Waters公司)的反相HPLC分析上清液。通过整合肽峰下面积(在214nm处监测)确定剩余肽的量(相对于零时间对照的％)。

HTRF测定。将重组GST-NEMO(30nM)、生物素-IKKβ_KK/RR(701-745)(50nM)、用d2受体标记的链霉抗生物素蛋白(2.5μg/mL)、用Tb供体标记的抗GST单克隆抗体(2.5μg/mL)和不同浓度的肽(0-100μM)在含有5mM TCEP和0.01％ Triton X-100(总体积20μL)的PBS中在384孔板中混合。将板在室温下温育2小时。在Tecan infinite M1000 Pro酶标仪上测量HTRF信号，并绘制为肽浓度的函数。使用GraphPad Prism 6.0分析数据，并通过将数据拟合至剂量-反应抑制曲线获得IC₅₀值。

NF-κB荧光霉素测定。将NF-κB报告基因(Luc)-HEK293细胞接种于96孔微量培养板中的45μL测定培养基(DMEM，10％ FBS和1％青霉素/链霉素，每孔～1500个细胞)中并培养过夜。将5μL测定培养基中的NEMO抑制剂添加细胞中，并将细胞温育2小时。将5μL测定培养基中的重组TNFα³以5ng/mL的终浓度添加到孔中。温育4小时后，向每个孔中添加55μL一步荧光素酶测定试剂。使用Tecan Infinite M1000 Pro酶标仪在温育10分钟后测量发光。将TNFα未刺激和刺激的细胞的荧光素酶活性分别记录为AU^-和AU⁺。用不同浓度的NEMO抑制剂温育后TNFα刺激细胞的荧光素酶活性记录为AU^pep。通过基于以下公式的荧光素酶活性诱导百分比来计算NF-κB信号传导激活的抑制：

抑制TNFα活化(％)＝(AU^pep-AU^-)/(AU⁺-AU^-)×100％

结果。为了测试可逆双环化策略的有效性，设计了包含CPP基序RRRRΦF(SEQ IDNO.:68))或FΦRRRR(SEQ ID NO.:69)的两种模型肽和与其N-或C-末端融合的模拟承载物基序(SASAS(SEQ ID NO.:156))(表6，肽2和3，图3为详细结构)。还将两个半胱氨酸残基掺入序列中用于后来的环化，一个在CPP与承载物基序之间的连接处，一个在C-末端。通过在Rink酰胺树脂上的标准Fmoc固相肽合成(SPPS)化学合成线性肽(方案1)。通过用Hg(OAc)₂处理选择性去除两个半胱氨酸侧链上的乙酰氨基甲基(Acm)基团，然后使暴露的游离硫醇在树脂上与3,5-双((吡啶-2-基二硫烷基)甲基)苯甲酸反应，其易于从可商购获得的起始物质制备(方案2)。在半胱氨酸侧链与3,5-双(巯基甲基)苯甲酸(BMB)支架之间形成两个二硫键导致了肽的环化。接下来，通过1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)去除N-末端Fmoc基团，并通过在BMB的羧基与N-末端胺之间形成内酰胺来使肽二环化(方案1)。BMB非常适合作为支架，因为它的结构对称性确保在二硫化物交换反应后形成单个二环产物。另外，支架的刚性预防形成任何分子内二硫键，这简化了支架的合成及其与含半胱氨酸的肽的反应。

为了监测它们的细胞摄取，在C-末端赖氨酸的侧链上用异硫氰酸荧光素(FITC)标记肽2和3。用5μM肽cFΦR₄(SEQ ID NO.:72)、2和3处理2小时的HeLa细胞的流式细胞术分析显示平均荧光强度(MFI)值分别为3020、5180和4100(图1A)。因此，二环肽2和3分别以比cFΦR₄(SEQ ID NO.:72)高72％和36％的效率进入HeLa细胞。

应用可逆二环化策略以产生针对NEMO-IKK交互作用的细胞可渗透、生物学活性的肽基抑制剂。尽管其具有体内功效，但线性Antp-NBD肽由于血清中的快速蛋白水解降解(t_1/2～15分钟)而具有差的药代动力学。设想将Antp-NBD转化为构象受限的二环结构以显著增加其蛋白水解稳定性。CPP基序RRRRΦF(SEQ ID NO.:68)与NBD的N-末端融合，并且N-和C-末端苏氨酸残基被两个半胱氨酸取代(表6，肽4，图4的详细结构(SEQ ID NO.:216))。肽融合物经由如上所述的两个二硫键在BMB支架周围二环化，得到作为主要产物的二环肽4(图5A)。作为对照，还制备了肽5(图4的详细结构)，其在结构上类似于肽4，但含有两个Ala残基代替两个Trp残基。先前已示出用丙氨酸取代Trp残基大大消除了NEMO结合(M.J.May等人，Science 2000年，第289卷，第1550页)。

方案1.二硫化物介导的二环肽的固相合成

肽4和5在添加到其C-末端的赖氨酸的侧链用FITC标记，并且通过流式细胞术评估它们的细胞进入。两种肽均有效地进入HeLa细胞，显示MFI值分别比cFΦR₄高3倍和2倍(图1A)。使用均相时间分辨荧光(HTRF)测定确定肽4和5的NEMO结合亲和力(M.Rushe等人，Structure2008年，第16卷，第798页；Y.Gotoh等人，Anal.Biochem.2010年，第405卷，第19页)。简而言之，在存在用荧光供体(Tb)标记的抗谷胱甘肽-S-转移酶(GST)抗体和用荧光受体(d2)标记的链霉抗生物素蛋白的情况下，GST-NEMO与生物素酰化的IKKβ片段(氨基酸701至745)(B.Gao等人，Biochemistry 2014年，第53卷，第677页)的结合导致共振能量转移。添加NEMO抑制剂可阻断NEMO-IKKβ交互作用并降低HTRF信号。在5mM三(羧乙基)膦(TCEP)存在下，预计它会完全还原肽4和5中的二硫键，肽4以浓度依赖性方式抑制NEMO-IKKβ交互作用，半数最大抑制浓度(IC₅₀)值为3.5±0.2μM(图1B)。在相同条件下，Antp-NBD示出IC₅₀值为～50μM，与先前报道的结合亲和力一致(M.Rushe等人，Structure 2008年，第16卷，第798页；Y.Gotoh等人，Anal.Biochem.2010年，第405卷，第19页)。可以预知，高达100μM的肽5仅引起对交互作用的轻微抑制。由于两个半胱氨酸残基取代苏氨酸并未显著改变NEMO结合亲和力(图6)，所以肽4相对于Antp-NBD的增强的NEMO结合可能是由在CPP基序的苯丙氨酸(RRRRΦF(SEQ ID NO.:68))与NEMO蛋白表面之间的另外的交互作用引起的。IKKβ在相同位置含有苯丙氨酸(Phe-734)。NEMO-IKKβ络合物的晶体结构示出Phe-734的侧链插入NEMO表面上的疏水袋(同上)。因此，肽4中的苯丙氨酸可能发挥细胞进入和NEMO结合的双重作用。

通过监测TNFα-诱导的NF-κB活化来评估二环肽调节细胞内部NEMO-IKK交互作用的能力。在NF-κB控制下，用荧光素酶报告基因转染的HEK293细胞首先用不同浓度的肽处理2小时，然后用TNFα处理M.J.May等人，Science 2000年，第289卷，第1550页；A.Gaurnier-Hausser等人，Clin.Cancer Res.2011年，第17卷，第4661页)。在不存在任何抑制肽的情况下，用5ng/mL TNFα处理使荧光素酶活性从177任意单位(AU)的基础水平增加至715AU。肽4以剂量依赖性方式降低TNFα-诱导的荧光素酶活性，IC₅₀值为～20μM(图1C)。相比之下，对照肽5在20μM时对NF-κB信号传导没有显著影响，并且在测试的最高浓度(40μM)下导致约10％的抑制。与先前的报道(M.J.May等人，Science 2000年，第289卷，第1550页)一致，Antp-NBD(肽1)也引起浓度依赖性抑制，但显示IC₅₀值为140μM。在细胞测定中二环肽4相对于Antp-NBD的更高效力可能是改善的细胞进入效率(图1A)和更高的NEMO结合亲和力(图1B)两者的结果。用5mM谷胱甘肽对二环肽4进行体外处理2小时，完全降低了二硫键(图5B)，表明肽2-5在细胞溶质进入时应经历完全还原。

最后，通过将肽在人血清中温育不同的时间长度来测试肽4和Antp-NBD的蛋白水解稳定性，并通过分析型HPLC定量剩余量的完整肽。为了比较，合成了对照肽(表6，肽6)，其具有与肽4相同的序列，但仅其CPP基序被环化。与先前的报告一致(E.Jimi等人，Nat.Med.2004年，第10卷，第617页；S.Dai等人，J.Biol.Chem.2004年，第279卷，第37219页；W.Shibata等人，J.Immunol.2007年，第179卷，第2681页；S.H.Dave等人，J.Immunol.2007年，第179卷，第7852页；A.Gaurnier-Hausser等人，Clin.Cancer Res.2011年，第17卷，第4661页；J.M.Peterson等人，Mol.Med.2011年，第17卷，第508页；D.A.Delfin等人，J.Transl.Med.2011年，第9卷，第68页；D.P.Reay等人，Neurobiol.Dis.2011年，第43卷，第598页；J.N.Kornegay等人，Skelet.Muscle 2014年，第4卷，第18页；G.Habineza Ndikuyeze等人，PLoS One，2014年，第9卷，第e95404页)，Antp-NBD被人血清快速降解，半衰期为～15分钟(图1D)。相比之下，二环肽4示出约10小时的半衰期，并且在37℃温育20小时后23％的肽保持完整。单环对照肽6也快速降解(半衰期为～30分钟)，可能是由于线性NBD序列的蛋白水解。先前已经证明，附着在cFΦR₄的Gln侧链上的线性肽基承载物在人血清中迅速降解(Z.Qian等人，Angew.Chem.Int.Ed.2 015年，第54卷，第5874页；Angew.Chem.2015年，第127卷，第5972页)。

总之，已经开发了一种简单的方法，通过将肽与短的CPP基序融合并通过二硫键可逆地环化融合肽，将肽基配体有效地递送到哺乳动物细胞中。所得的二环肽具有极大增强的细胞摄取以及蛋白水解稳定性。该策略应适用于递送任何线性肽。

实施例4.从胞质溶胶中的环状细胞穿透肽中释放肽基承载物的二环肽的合成

如下面方案2中所示，首先通过使用Fmoc/HATU化学的标准固相肽合成合成所需的环状CPP，并通过Lys(Mtt)连接基锚定到载体上。仍然在树脂上时，用2％的TFA去除Mtt基团，并通过使用HATU将暴露的Lys侧链偶接到双(巯基甲基)苯甲酸支架上。然后将环状CPP从树脂上裂解并用TFA脱保护。通过使肽在溶液(pH5)中与二硫代二吡啶反应来保护/活化游离硫醇，以产生CPP-支架。最后，通过简单地将CPP-支架和含硫醇的肽在pH8的水性缓冲液中混合来制备所需的CPP-肽承载物缀合物。

方案2.二硫化物介导的二环肽的固相合成

根据方案2合成的各种二环肽。具体地讲，将环状CPP12(FfΦRrRr)与针对Keap1-Nrf2的肽基抑制剂缀合(图10A)，与针对Pin1的肽基抑制剂缀合(图11)，与针对CAL PDZ-CFTR(PDZ)交互作用的肽基抑制剂缀合(图12A)，以及与针对MDM2-p53交互作用(PMI)的肽基抑制剂缀合(图13A)。使用本领域已知的方法附接荧光标记，以在必要时量化细胞摄取效率。

细胞摄取测定。使用流式细胞术测定根据方案2合成的各种二环肽(环状CPP+肽基承载物)的细胞摄取效率，并与线性肽基承载物(不含环状CPP)的细胞摄取效率进行比较。

所有测量一式三份并在10％的胎牛血清(FBS)存在下进行。承载物肽(例如，带负电荷的肽，诸如Keap1肽)的附着包括细胞摄取(相对于CPP12)。

血清稳定性。测定根据方案2合成的二环肽(环状CPP+肽基承载物)的血清稳定性，并与线性肽基承载物(不含环状CPP)的细胞摄取效率进行比较。将未缀合的肽和CPP12-肽缀合物在25％人血清中温育不同的时间段(分钟)，并通过分析型HPLC定量剩余完整肽。具体地，包含与针对MDM2-p53交互作用(PMI)的肽基抑制剂缀合(图17)或者与针对Keap1-Nrf2交互作用的肽基抑制剂缀合(图18)、或者与针对Pin-1(P1)的肽基抑制剂缀合(图19)的环状CPP12(FfΦRrRr)的二环肽的血清稳定性，比较了各个线性肽基抑制剂的血清稳定性。

与CPP12的缀合(经由环化)极大地增加了所有肽的血清稳定性。

本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来探知本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求书涵盖。

Claims (18)

1.一种二环肽，所述二环肽包含第一环肽和第二环肽，所述二环肽具有以下结构之一：

或其药学上可接受的盐，其中：所述第一环肽包含各自独立地为氨基酸的AA¹、AA²、AA³、AA⁴、AA⁵、AA⁶、AA⁷、AA⁸和AA⁹，其中至少两个氨基酸为精氨酸，并且至少两个氨基酸独立地包含疏水性侧链；

m、n、p和q各自独立地选自0和1；

每个d独立地为1或2；

所述第二环肽包含肽基配体(X_n)；

R¹为OH、OR²或NHR²；并且

R²为烷基、芳基、杂芳基、氨基酸、2至20个氨基酸的肽序列、可检测到的结构部分或固体载体。

2.根据权利要求1所述的二环肽，其中独立地包含疏水性侧链的至少两个氨基酸是甘氨酸、苯甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、萘丙氨酸、脯氨酸或其组合，其中苯甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或萘丙氨酸上的芳族侧链各自任选地被卤素取代。

3.根据权利要求2所述的二环肽，其中独立地包含疏水性侧链的至少两个氨基酸是苯丙氨酸、萘丙氨酸或其组合。

4.根据权利要求1所述的二环肽，其中独立地包含疏水性残基的所述至少两个氨基酸为连续的氨基酸。

5.根据权利要求1所述的二环肽，其中：

AA¹为L-精氨酸；

AA²为L-精氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为L-萘丙氨酸；并且

AA⁵为L苯丙氨酸。

6.根据权利要求1所述的二环肽，其中：

AA¹为L-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为L-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；并且

m为1，并且AA⁶为L-精氨酸。

7.根据权利要求1所述的二环肽，其中：

AA¹为L-精氨酸；

AA²为L-精氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为L-精氨酸；

AA⁵为L-萘丙氨酸；

m为1，并且AA⁶为L-苯丙氨酸。

8.根据权利要求1所述的二环肽，其中至少三个连续的氨基酸具有交替手性。

9.根据权利要求8所述的二环肽，其中具有交替手性的所述至少三个连续的氨基酸为精氨酸。

10.根据权利要求9所述的二环肽，其中：

AA¹为D-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为D-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；并且

m为1，并且AA⁶为D-精氨酸。

11.根据权利要求9所述的二环肽，其中：

AA¹为D-苯丙氨酸；

AA²为L-萘丙氨酸；

AA³为L-精氨酸；

AA⁴为D-精氨酸；

AA⁵为L-精氨酸；

m和n各自为1，并且AA⁶为D-精氨酸并且AA⁷为L-精氨酸。

12.根据权利要求9所述的二环肽，其中：

AA¹为L-苯丙氨酸；

AA²为D-苯丙氨酸；

AA³为L-萘丙氨酸；

AA⁴为L-精氨酸；

AA⁵为D-精氨酸；并且

m和n各自为1，并且AA⁶为L-精氨酸并且AA⁷为D-精氨酸。

13.根据权利要求1所述的化合物，其中X_n抑制至少一种蛋白质-蛋白质交互作用。

14.根据权利要求13所述的二环肽，其中所述蛋白质-蛋白质交互作用为在IκB-激酶(IKK)络合物与调节蛋白NF-κB必需改性剂(NEMO)之间的交互作用。

15.根据权利要求13所述的二环肽，其中X_n为针对Ras、PTP1 B、Pin1、Grb2 SH2或MDM2的抑制剂。

16.根据权利要求1所述的二环肽，其中X_n为野生型肽基配体或肽模拟物。

17.根据权利要求1所述的二环肽，其中AA¹-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-(AA⁶)_m-(AA⁷)_n-(AA⁸)_p-(AA⁹)_q选自SEQ ID NO：64-99、102-118和120-146。

18.一种将治疗剂递送到细胞的细胞质的方法，包括施用包含根据权利要求1所述的二环肽的化合物。