JPS638427B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ラクタム化合物の抱合体の製造法に
関する。 薬剤の検出についての精確、急速かつ便利な方
法が絶えずかつ広く要求されている。特定の薬剤
を検定できることの必要性の理由は広く変化す
る。重要性が増加してきている１つの理由は、治
療上の投与量の評価にある。薬剤で処置される人
の薬剤への反応、新陳代謝の速度および薬剤によ
り生ずる副作用は変化するので、薬剤を治療的効
果を最大にすると同時に副作用を制限しかつ最小
にする投与量を知ることが重要になつてきた。 ５〜６員環にラクタム官能性をもつ薬剤の族は
てんかんの処置に使用される。これらの薬剤は比
較的水不溶性から比較的水溶性に変化する。これ
らの薬剤は構造において実質的に類似する。薬剤
の誘導体の製造において、合成上の問題にしばし
ば直面する。 これらの薬剤の誘導体は、特定の薬剤の検出に
対する免疫検定を発展させるとき、通常重要であ
る。興味ある薬剤に特異性を示す抗体を減少する
ため、免疫学的応答を開始する抗原たんぱく質ま
たは他の物質に対して抱合できる薬剤の誘導体を
製造しなければならない。具体的には、抗体は特
定の薬剤および／またはその新陳代謝物質にに強
く結合すること、すなわち高い結合定数をもつこ
と、そして高い結合数をもつ抗体の高い濃度をも
つことが望まれる。さらに、抗体は類似するが無
関係の薬剤に対して弱い結合定数をもち、それに
より免疫検定において陽性の結果を興味ある薬剤
と関係づけることができるようにし、そして異な
る薬剤の存在の結果ではないようにすべきであ
る。 さらに、ある免疫検定には修飾された薬剤が検
出分子、たとえば安定な遊離基または酵素に抱合
することが必要である。使用する官能性は抗原物
質への抱合に使用される官能性と同一であるかま
たは異なることができる。しかし、生成される抗
体は薬剤に強く結合できるばかりでなく、かつま
た検出分子へ抱合するとき薬剤へ強く結合できな
くてはならない。 たんぱく質、たとえば抗原および酵素への抱合
において、抱合に用いられる条件はきびしく制限
される。変性を防ぎかつ酵素活性の損失を最小と
するとき、温和な水性系が重要である。中性から
離れすぎるPHで操作するのを避けなければならな
いので、強い酸性または強いアルカリ性の溶液を
避けなければならない。さらに抗原の動物への導
入または検出体の抱合体に使用する貯蔵および検
定の条件を維持するため、抱合に使用する共有結
合は強い結合であるべきである。 先行技術は、次のとおりである。 ジフエニルヒダントインについての放射線免疫
検定について記載するTigelaar、Clin.Chem.
Acta、43.、43、231〜241（1973）。 広い種類のスピン・ラベルド（spin labeled）
免疫検定を開示する米国特許第3690834号。 広い種類のハプテン薬剤の酵素免疫を開示する
米国特許第3817837号。 たんぱく質をたんぱく質へ結合する数多くの方
法を開示するAvrameas、″Immunoenzyme
Techniques、″International Review of
Rysiology、27、349（1970）。 興味ある文献は、MeansおよびFeeny、
Chemical Modification of Proteins、Holden
−Day、San Francisco、California、1971であ
る。 本発明によれば、ラクタム官能性とカルボニル
に対してα位置の炭素が置換されている修飾薬剤
が提供され、この薬剤は抗原もしくは酵素である
たんぱく質に、または免疫検定用の他の検出分子
に抱合する。この修飾は、二置換炭素原子または
ラクタムの窒素に結合する基を介して環原子以外
に結合するオキソまたは非オキソカルボニル（そ
の窒素および硫黄の類似体を含む）のカルボニ
ル）官能性を導入することからなる。抗原の使用
により生成される抗体は、興味ある薬剤および／
またはその新陳代謝物質に対して高い特異性を有
する。 本発明によれば、５〜６員環のラクタム官能性
を有しかつカルボニルに隣接する炭素原子が二置
換されている薬剤の免疫検定における試薬の製造
にまたは試薬として使用する新規な組成物が提供
される。これらの化合物は、二置換された炭素原
子にまたはラクタムの窒素に少くとも一つの炭素
原子からなる連鎖を介して結合するオキソまたは
非オキソカルボニル（その窒素および硫黄の類似
体を含む）のカルボニル官能性を有する。これら
のカルボニル官能性を有する化合物は、抗原との
抱合に使用され、ついでこの抱合体は興味ある薬
剤に対して特異性をもつ抗体の生成に動物に注入
できる。さらに、このカルボニル官能性をもつ薬
剤は、免疫検定における検出試薬である酵素また
は安定な遊離基へ抱合できる。したがつて、これ
らの抱合体は、含まれる特定のカルボニル官能性
に依存してアミド、アミジン、チオアミド、また
はアルキルアミンである。 本発明による化合物はラクタムから誘導され飽
和炭素、カルボニルもしくはイミノを経てアミノ
へ結合した抱合体である。上記ラクタムは結合基
を経て抗原へ抱合するカルボニル官能性を有す
る。これらの化合物は、ほとんどの部分に対し
て、式 で表わされ、 式中Ｘは酸素（Ｏ）またはイミノ（NH）であ
り、 Ｒはメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレ
ン、ペンチレン、エチレンオキシメチル、エチレ
ンオキシエチル、プロピレンオキシメチルまたは
炭素数７もしくは８のフエノキシアルキルであ
り、 Ｍはフエニルまたは炭素数１〜３の低級アルキ
ルであり、ここでαがイミノであるときＭはフエ
ニルであり、αがメチレンであるときＭは炭素数
１〜３の低級アルキルであり、 ＺはH₂または酸素であり、 αはイミノ、メチレンまたはカルバモイルであ
り、Ｚが酸素であるときαはイミノまたはメチレ
ンであり、そしてＺがH₂であるときαはカルバ
モイルであり、 Ｄはアミノ基を経て結合するポリ（アミノ酸）
血清たんぱく抗原またはデヒドロゲナーゼ酵素で
あり、 ＹおよびY⁰の一方は結合であり、結合以外で
あるときＹは水素であり、そしてαがイミノであ
るときY⁰はフエニルであり、αがメチレンであ
るときY⁰は炭素数１〜３の低級アルキルであり、
そしてαがカルバモイルであるときY⁰は炭素数
１〜３の低級アルキルまたはフエニルであり、そ
してｎは整数１ないし該抗原の分子量を1000、好
ましくは1200で割つて得られた数である。 抗 原 ほとんどの部分に対して、本発明の抗原は、式 で表わされ、式中 抗原はポリ（アミノ酸）血清たんぱく又はデヒ
ドロゲナーゼ酵素であり、 この抗原は分子量が通常少なくとも5000、一般
に１千萬、通常100萬を越えず、好ましくは約
15000〜500000、さらに好ましくは約30000〜
200000であり、 この抗原に結合するアミノ基は抗原の一部分で
ある（但し、上記式では結合の種類を示すために
その一部分を取り出して表示してある）、 Ｘは酸素またはイミノ（NH）であり、 ＺはH₂または酸素であり、 α′はイミノ、メチレン、またはカルバモイル
（NHCO）であり、窒素原子はＺへ結合する炭素
原子に結合しており、 α′はＺが酸素であるときイミノまたはメチレン
であり、ＺがH₂であるときカルバモイルであり、 Ｗはフエニルまたは炭素数１〜３の低級アルキ
ルであり、通常α′がイミノまたはカルバモイルで
あるときフエニルであり、α′がメチレンであると
き低級アルキルであり、 R′はメチレン、エチレン、プロピレン、ブチ
レン、ペンチレン、エチレンオキシメチル、エチ
レンオキシエチル、プロピレンオキシメチルまた
は炭素数７もしくは８のフエノキシアルキルであ
り、 Y′およびY⁰′の一方はR′への結合であり、 結合以外であるとき、Y⁰′はα′がイミノである
ときフエニルであり、α′がメチレンであるとき低
級アルキルであり、そしてα′がカルバモイルであ
るときフエニルまたは低級アルキルであり、この
低級アルキルの炭素数は１〜３であり、 結合以外であるとき、Y′は水素であり、 n′は少なくとも１、そして抗原の分子量を
35000、通常20000、好ましくは7000で割つて得ら
れた値から抗原の分子量を1000、通常1200で割つ
て得られた値までの範囲にある。分子量が約
15000〜500000、とくに15000〜200000である抗原
に対して、ｎに対する好ましい範囲は抗原の分子
量を1000〜12000、通常1200〜6000で割つて得ら
れた値の範囲である。抗原がアルブミンであると
き、抱合した基の数は通常約10〜55、好ましくは
20〜45である。 広い種類の抗原性ポリアミノ酸が知られてお
り、ほとんどの部分に対して、１つの種から取つ
たたんぱく質は異なる種において抗原性であろ
う。興味あるたんぱく質の例は、血清アルブミ
ン、血清グロブリン、酵素、ヘモシアニンなどで
ある。とくに興味あるものは分子量が約30000〜
200000である血清アルブミンおよび血清グロブリ
ンである。 いつたん抱合された抗原がつくられると、これ
を単離し、抗体の製造に使用できる。抗体の製造
に使用される技術はふつうのものであり、いろい
ろな文献に見出される。たとえば、Kabat、et
al.、Experimental Immunochemistry、Charles
C.Thomas、Springfield、Illinois、1967.および
Williams、et al.、Methods in Immuology and
Immunochemistry、Vol.I、Academic Press、
New York、1967。通常、完全なフレウンド
（Freund）の助剤を用いる初期注射を宿主動物、
通常家畜、たとえば羊、やぎ、うさぎ、馬、雌牛
などのいろいろな部位に行ない、いろいろな周期
を置いて注射を繰返す。通常、初期の力価および
特異性は低く、注射を続けることにより改良さ
れ、通常回数の注射で高平部に達する。 別法として、官能化されたラクタム薬剤をホス
フアチドへ抱合させ、生じた抱合体を使用してリ
ボサムをつくることである。ついでこのリボサム
を使用して宿主動物に注射して抗体を形成でき
る。Uemura.et al.、Biochemistry、13、1572
（1974）を参照、この開示をここに参考のため加
える。ホスフアチジルエタノールアミンは、抗原
性ポリペプチドへの抱合と実質的に同じ方法で変
性ラクタム薬剤へ抱合できる。 生じた抱合体は、ほとんどの部分に対して、式 をもち、式中ＸおよびR′は上に定義したとおり
であり、 A¹およびA²は炭素数12〜18の脂肪酸アシル基
であり、そして LDは であり、式中記号は上に定義したとおりである。 このホスフアチジル抱合体をスフインゴメリ
ン、コレステロールおよびりん酸ジセチルと結合
することによりリボソムがふつうの方法で生成
し、Uemura、et al.、前掲に記載される操作に
従つてこれを注射する。 興味ある薬剤がジフエニルヒダントインである
とき、この抗原は式 で表わされ、式中Y¹およびY²以外は、記号は上
に定義したとおりであり、Y¹およびY²の一方は
結合であり、結合以外であるときはY²はフエニ
ルでありY¹は水素であり、Y²が結合であるとき
R′は好ましくは炭素数７〜８のフエノキシアル
キルであり、Y¹が結合であるときR′は好ましく
は脂肪族、とくに飽和脂肪族である。 興味ある薬剤がエソスクシイミドであるとき、
ほとんどの部分に対して、抗原は式 で表わされ、式中Y³、Y⁴およびX¹を除いて記号
は上に定義したとおりであり、X¹はメチルまた
はエチルであり、Y³およびY⁴の一方は結合であ
り、結合以外であるときY⁴はメチルまたはエチ
ルでありY₃は水素であり、好ましくはR′は脂肪
族、好ましくは飽和脂肪族である。 興味ある薬剤がピリミドであるとき、抗原はほ
とんどの部分に対して式 で表わされ、式中Y⁵、Y⁶およびX²を除いて記号
は上に定義したとおりであり、Y⁵およびY⁶の一
方は結合であり、結合以外のときY⁵は水素であ
りY⁶はフエニルまたはエチルであり、X²はフエ
ニルまたはエチルであり、Ｒは好ましくは脂肪
族、とくに飽和脂肪族である。 前駆化合物 アミノ基と強い共有結合、アミド、アミジン、
チオアミドまたは飽和アルキルアミン結合を形成
できる官能性をもつ前駆化合物を使用することに
より、抱合体は製造される。 ほとんどの部分に対して、前駆化合物は、式 で表わされ、D′を除いてすべての記号は上に定
義したとおりであり、 D′は水素またはヒドロキシである。 抱合に対する特定の官能性および修飾薬剤が抱
合する特定の組成に依存して、いろいろな技術が
抱合に使用される。 興味ある第１の方法は媒体中に可溶なカーボジ
イミドとカルボン酸とを使用する方法である。こ
の方法は比較的水に可溶な修飾ハプテンに対して
有用である。この反応は通常−10〜25℃において
比較的希釈された濃度において行ない、たんぱく
質へ抱合すべきハプテンの数に関してすくなくと
も化学量論的量のハプテンを使用する。カーボジ
イミドは化学量論量またはやや過剰量で使用す
る。 次に、２つの技術、すなわち混合無水物または
イミデイドの使用は、条件が実質的に同じである
ので、一緒に考える。水溶性ハプテンとともに、
低級アルキルカーボネートおよび低級アルキルイ
ミデート（炭素数１〜６の低級アルキル）を通常
使用する。水性媒体を約−10〜40℃、通常約−５
〜30℃の温度において使用する。反応時間は望む
抱合度、使用する濃度、使用する温度、および反
応成分の種類に依存して変化する。 ハプテンが水に難溶性であるとき、抱合に使用
する水性媒体は他の極性溶媒を含有しなくてもよ
くただしハプテンを抱合に加えるとき少量の極性
溶媒を導入し、あるいは25容量％までの極性の有
機溶媒を含むことができる。使用できる極性溶媒
のうちでアルキレンオキシ溶媒を挙げることがで
き、これにはカルビトール、ジエチレングリコー
ルモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモ
ノブチルエーテルおよびジエチレングリコールが
含まれる。使用できる他の溶媒の例は、ジメチル
スルオキシド、ヘキサメチルホスホルアミドおよ
びジオキサンである。 興味のある溶媒は、不活性溶媒である。補助溶
媒を使用するとき、これは少なくとも５容量％、
通常10容量％であり、約25容量％を越えず、通常
約20容量％を越えない。 媒体中のたんぱく質の濃度は一般に約１×10^-3
〜約１×10^-12モル、通常約１×10^-4モル〜約１
×10^-10モルである。ハプテン対抱合すべき化合
物上のアミノ基のモル数のモル比は少なくとも１
であり、通常約500を越えず、通常ポリペプチド
またはたんぱく質は少なくとも約２であり、約
100を越えない。 通常、イミデート官能性が存在するとき、変性
ハプテンのモル比は混合無水物に比べて非常に高
いモル比を用いる。イミデートとの反応は遅いの
で、この反応を加速させるため高いモル比を用い
る。抱合すべき化合物１モル当り約２〜500モル
のイミデートを使用できるが、抱合すべき化合物
１モル当り約１〜５モルの混合無水物を使用す
る。イミデートの反応時間は１週間程度に長くあ
ることがあるが、混合無水物の反応時間は一般に
約１分ないし１時間である。 抱合間の溶液のPHは一般に６〜９またはこれよ
り低いが、特定の場合にこれより高いPHがよいこ
ともある。いろいろな緩衝剤、たとえば炭酸塩、
りん酸塩、トリス、ホウ酸塩などを使用できる。 可溶性に劣るハプテンを用いる反応を行なうと
き、ハプテンを極性の非水性媒体または部分的に
水性の媒体中に高濃度で溶かし、エステルの生成
にはアルコールを溶媒として使用すると便利であ
る。ついで、抱合すべき物質を含有する媒体にこ
のハプテン溶液をはげしくかきまぜながら急速に
加える。溶液の高い加熱または高い局部的濃度を
避けるように注意する。 最後に、固体の支持体に結合したハロゲン化ア
シルを使用できる。ケイソウ土、たとえばセライ
トを使用できる。不活性媒体中においてカルボン
酸を活性ハロゲン化アシル、たとえば塩化オキサ
リルで交換することによつて、ハロゲン化アシル
を生成できる。ついで生じたハロゲン化アシルを
支持体と結合し、溶媒を蒸発する。通常、支持体
の重量に基づいて約５〜20重量％のハロゲン化ア
シルを用いる。 ついで吸収されたハロゲン化アシルを、適切な
PHの水性媒体中の抱合すべき化合物へ加えること
ができる。一般に、抱合すべき化合物１モル当り
約１〜100モル、通常約１〜10モルのハロゲン化
アシルを使用する。適度に塩基性の、一般にPH約
８〜11の媒体を用いる。 アルキルアミンの結合を形成するためには、−
10〜25℃の温度において過剰の水素化シアノホウ
素ナトリウムの存在下に温和な水性条件でアルデ
ヒドをポリ（アミノ酸）に抱合させる。 反応完了後、通常の処理、たとえば透析、ろ
過、抽出、クロマトグラフイーなどを行なう。 実 験 （すべての百分率は特記しないかぎり重量によ
る。減圧は特記しないかぎりmmHgである。） 実施例の表 1.0 前駆物質の製造 1.1 ３−（Ｎ−カルボキシメチル）ジフエニルヒ
ダントイン 1.2 ニトリルの加水分解による３−（Ｎ−カルボ
キシメチル）ジフエニルヒダントイン 1.3 ３−（Ｎ−ジフエニルヒダントイニル）プロ
ピオン酸 1.4 ５−（N³′−ジフエニルヒダントイニル）ペ
ンタノン酸 1.5 （２−（Ｎ−ジフエニルヒダントイニル）エ
トキシ）酢酸 1.6 ５−（ｐ−カルボキシメトキシフエニル）−
５−フエニルヒダントイン 1.7 ２−デオキソ−１−バルビツリル酢酸 1.8 ５−（2′−デオキソ−5′−フエニルバルビツ
リル−5′）ペンタナールおよびペンタノ
ン酸 1.9 １−カルボキシメチルザロンチン 1.10 ２−カルボキシエチル−２−メチルスクシ
ンイミド 2.0 BSAへの抱合化 2.1 N³−カルボキシメチルジフエニルヒダント
イン 2.2 セライト上のハロゲン化アシルによるN³−
カルボキシメチルジフエニルヒダントイ
ン 2.3 カルビチル（N³−ジフエニルヒダントイ
ン）アセトイミデイト 2.4 N³−（4′−カルボニシ−ｎ−ブチル）ジフエ
ニルヒダントイン 2.5 メチル（２−（N³′−ジフエニルヒダントイ
ニル）エトキシ）アセトイミデイド 2.6 ５−（ｐ−カルボキシメトキシフエニル）−
５−フエニルヒダントイン 2.7 ５−（2′−デオキソ−5′−フエニルバルビツ
リル−5′）ペンタナール 3.0 Ｇ−６−PDHへの抱合化 3.1 混合アルデヒド 3.2 イミデート 4.0 ２・２・５・５−テトラメチル−３−アミ
ノ−１−オキシルピロリジンへの抱合 4.1 メチル（N′−ジフエニルヒダントイニル）
アセトイミデート 4.2 ５−（ｐ−カルボキシメトキシフエニル）−
５−フエニルヒダントイン 4.3 ２−（2′−カルボキシエチル）−２−メチル
スクシンイミド 実施例 1.1 ３−（Ｎ−カルボキシメチル）ジフエニルヒダ
ントイン 250mlの水中の10.0ｇ（36.5ミリモル）のナト
リウム ジフエニルヒダントインのかきまぜられ
たけん濁液に、50mlの水中の10.0ｇ（40ミリモ
ル）のクロロ酢酸および10.0ｇの炭酸水素ナトリ
ウムの溶液を加え、生じた混合物を４時間還流し
た。室温に冷却したのち、このけん濁液を二酸化
炭素で飽和し、ろ過して未反応のジフエニルヒダ
ントインを除いた（5.0ｇが回収された）。ろ液を
6N塩酸でPH１の酸性にした。生じた沈殿をろ過
し、20mlの水で洗い、100mlの沸とう無水アルコ
ールに溶かし、50mlの熱水を加えた。一夜冷却
後、白色の結晶を集め、繰返し再結晶すると3.2
ｇ、融点285〜291℃が得られた。上記母液を真空
中で400mlに濃縮し、加熱し、冷却すると、2.0
ｇ、融点286〜293℃が得られた。 実施例 1.2 （３−（Ｎ−カルボキシメチル）ジフエニルヒ
ダントイン DMSO中の12ｇのジフエニルヒダントインの
ナトリウム塩のかきまぜられたけん濁液に、3.4
mlのクロロアセトニトリルを窒素ふん囲気下に加
えた。このけん濁液は透明となり、かきまぜを
1.5時間続けた。DMSOを真空中で温和な高温で
留去し、残留物を約400mlの酢酸エチル中に溶か
し、ついで水で２回、水性飽和炭酸水素ナトリウ
ムで１回洗い、ついで硫酸ナトリウム上で乾燥し
た。溶媒を除去したのち、残留物を50mlの無水エ
タノールとともに微摩砕すると、9.77ｇの白色結
晶が生じた。125mlの無水エタノールから再結晶
すると、目的生成物、融点194〜６℃が得られた。 上で製造した２ｇのニトリルを75mlの1Nのエ
タノール性水酸化ナトリウムに溶かし、この混合
物を室温で一夜かきまぜ、水で希釈し、ついでエ
ーテルで抽出した。水層を分離し、ついで6Nの
HClでPH１の酸性にした。生じた沈殿をろ過し、
水性エタノールから再結晶すると、1.43ｇが得ら
れた。 実施例 1.3 ２−（Ｎ−ジフエニルヒダントイニル）プロピ
オン酸 反応フラスコへ825mgのソデイオ ジフエニル
ヒダントイン、543mgの２−ブロモプロピオン酸
エチルと10mlのDMFを入れ、この混合物を窒素
ふん囲気下に60℃に加熱し、40mgのヨウ化カリウ
ムをこのかきまぜられた溶液へ加えた。一夜加熱
したのち、この反応混合物を25mlの水へ注ぎ入
れ、水とエーテルでフラツシユ洗浄し、これらの
液体を一緒にし、全量100mlのエーテルで２回抽
出し、エーテル抽出液を全量75mlの水で３回、ブ
ラインで１回洗つた。エーテルを蒸発したのち、
この溶液をベンゼン、クロロホルムおよびエーテ
ルの混合物でフラツシングし、ついで四塩化炭素
でフラツシングすると油が得られた。この油をジ
エチルエーテルに溶かし、このエーテル溶液を全
量25mlの水で２回洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥
し、蒸発すると油が得られ、これを四塩化炭素、
クロロホルム、ついでベンゼンとエタノールとの
混合物でフラツシングした。残留物を熱エタノー
ルに溶かし、エタノールの一部分を蒸発し、水を
くもり点まで加えた。静置すると、油が形成し、
これを反復再加熱および冷却により繰返し再溶解
し、ついでエタノールを加え、このとき結晶が形
成し、これは急速に油となつた。ベンゼン−エタ
ノールを加え、この溶液を蒸発すると油が残つ
た。 約12mlのTHFおよび４mlの1N水酸化ナトリウ
ム水溶液に、上で製造した油を溶かした。この２
相の溶液を室温で約60時間かきまぜた。ついで
THFを真空中でストリツピングし、この溶液を
6NHClでPH１の酸性にし、この時形成した固体
をろ過し、乾燥した。 この固体を50mlのジエチルエーテル中に溶かし
てさらに精製し、このエーテル溶液を50mlの飽和
炭酸水素塩の層で洗い、酸性にして沈殿を形成
し、全量100mlのジエチルエーテルで３回洗い、
このジエチルエーテルを蒸発すると、673mgが生
ずる。この生成物をメタノール中に溶かし、クロ
ロホルムをくもり点まで加えることによつて再結
晶化できた。 実施例 1.4 ５−（N³′−ジフエニルヒダントイニル）ペン
タノン酸 20mlの乾燥DMF中の3.4ｇのソデイオジフエニ
ルヒダントインのかきまぜられたけん濁液に、
2.63ｇのｎ−５−ブロモペンタノン酸エチルとこ
ん跡量のヨウ化カリウムを加えた。この混合物を
60℃で一液かきまぜたのち、この溶液を水で希釈
し、ジエチルエーテルで抽出した。水洗後、この
エーテル溶液を乾燥し、ろ過し、ろ液を蒸発する
と油が得られ、これを固化し、水性エタノールか
ら再結晶化した。全収量は3.2ｇであつた。 上で製造したエステル（2.0ｇ）を80mlのジオ
キサン中に溶かし、40mlの10重量％の水酸化カリ
ウム水溶液を加えた。相が分離したが、激しいか
くはんを10分間続け、この時水を追加し、単一相
が形成した。この水溶液をエーテルで３回抽出
し、酸性化し、ろ過すると、1.5ｇの酸が得られ、
これをベンゼンから再結晶した。 実施例 1.5 （２−（Ｎ−ジフエニルヒダントイニル）エト
キシ）酢酸 反応フラスコに４ｇのソデイオジフエニルヒダ
ントイン、３mlの２−クロロエトキシアセトニト
リルと12mlのDMFを導入し、この混合物を窒素
ふん囲気下に35℃において15分間かきまぜ、つい
で温度を60℃に上げ、かくきぜをさらに24時間続
けた。蒸発乾燥したのち、残留物を水で２回、
0.05N水酸化ナトリウム水溶液で１回そして塩化
ナトリウム水溶液で１回洗い、ついで硫酸マグネ
シウムで乾燥した。ついでこの溶液を蒸発させ、
残留物を60mlのエタノール中に取り、この溶液を
加熱ふつとうして3.49ｇの白色結晶が生成した。
エタノールから再結晶化したのち、生成物は融点
125〜128℃を有した。 15mlのエタノール性1N水酸化ナトリウム中に
200mgの上記ニトリルを導入し、この混合物を一
夜かきまぜた。水を加え、エタノールを蒸発する
と透明溶液が生成し、これを6NのHClでPH１の
酸性にした。沈殿をろ過すると187mgの白色粉末、
融点160〜168℃が生じた。 実施例 1.6 ５−（ｐ−カルボキシメトキシフエニル）−５−
フエニルヒダントイン 50mlの無水エタノール中の4.47ｇ（16.7ミリモ
ル）の５−（ｐ−ヒドロキシフエニル）−５−フエ
ニルヒダントインおよび1.94ｇ（16.7ミリモル）
のクロロ酢酸ナトリウムの溶液を、33.4mlの無水
エタノール中の1N水酸化ナトリウム（２当量の
塩基に相当する）で処理し、窒素ふん囲気下に22
時間還流した。室温に冷却したのち、この溶液を
丸底フラスコ中の同容量の蒸留水に注ぎ入れ、こ
の反応フラスコを50mlの蒸留水で２回洗い、一緒
にした水性フラクシヨンを6NのHClでPH１の酸
性にした。エタノールをブチ（Buchi）装置によ
り除去したのち、水性フラクシヨンを分別ロート
に入れ、酢酸エチルで３回全容量200mlに抽出し
た。有機層を25mlの炭酸水素ナトリウム飽和水溶
液で２回抽出し、蒸留水とブラインで数回逆洗浄
し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾燥する
と、2.69ｇの固体の白色化合物が生じ、これは
NMRおよびTLCにより出発物質であることが示
された（回収率58％）。 炭酸水素酸塩抽出液を分別ロート中で一緒に
し、6NHClでPH１の酸性にした。生じた沈殿を
200mlの酢酸エチル中に抽出し、これを蒸留水と
ブラインで逆洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥
し、ブチ（Buchi）装置で蒸発すると白色発ぽう
体が得られた。フラスコから数容量のアセトンを
フラツシングしたのち、この発ぽう体を真空マニ
ホルドで4.40ｇの一定重量に乾燥した。いろいろ
な系（たとえば、５％のMeOH／CHCl₃、20％
のMeOH／エーテルなど）におけるTLC（シリ
カ）は３つの点を示し、最も速い走行点はフエノ
ールに対するローダミンで着色した。NMRは芳
香族のほかにほぼ等しい比で4.3ppmと4.8ppmの
２本の一重線を示した。 この白色発ぽう体を30mlの無水エタノール中に
溶かし、２mlの濃硫酸を加え、この溶液を2.5時
間還流させた。このアリコートを中和し、エーテ
ルで抽出し、シリカのプレート上にはん点をつ
け、33％の酢酸エチル／ベンゼン中で展開すると
３つの点を示し、出発物質は存在せず、第２番目
に速い走行点はローダミンで着色した。 この溶液を等容量の水と分別ロート中で一緒に
し、生じた沈殿をエーテルで全量200mlに３回抽
出し、10mlの飽和炭酸水素塩溶液、100mlの水、
そして100mlのブラインで洗つた。硫酸ナトリウ
ム上で乾燥したのち、このエーテル溶液をブチ
（Buchi）装置で蒸発すると4.173ｇの白色の発ぽ
う体が生じた。NMRは酸の混合物中で見出され
る２本の一重線と約3.8ppmに２本の重なる一重
線を示した。 溶媒中に溶かした発ぽう体を、33％の酢酸エチ
ル／ベンゼンを満たした120ｇのブリンクマン
（Brinkman）の実験質級のシリカゲルのカラム
上に置き、窒素圧下に同じ溶媒で0.75ml／分の速
度で溶離し、20mlのフラクシヨンを集めた。この
フラクシヨンをTLC（シリカ）で分析し、33％の
酢酸エチル／ベンゼン中で展開した。ビス−およ
びＮ−アルキル化物を含有する混合フラクシヨン
をまず溶離し、小さな番号のＮ−および０−アル
キル化生成物を含有する混合フラクシヨン、最後
に０−アルキル化生成物を白色の発ぽう体、837
mg、として単離した。 上で製造した837mgのエステルを20mlの25％水
性エタノール、0.25モルのNaOH中で２時間けん
化し、ついで酸性にし、酢酸エチルで抽出する
と、803mgの酸、融点221.5〜222.5℃を生じた。 実施例 1.7 ２−デオキソ−１−バルビツル酢酸 火炎乾燥した３口の250mlの丸底フラスコに、
４ｇのプリミドン（18.3ミリモル、80℃／0.1mm
で乾燥したもの）と0.88ｇの50％NaOH分散物
（18.3ミリモル）を入れ、フラスコを排気し、N₂
を３回充てんした。DMF（60ml、モレキユラシー
ブで乾燥した）を加え、初めの反応が止んだの
ち、この溶液を加熱して内部温度を70〜75℃と
し、N₂下に３時間加熱し、ついで室温で一夜か
きまぜ、その間沈殿が形成した。この混合物を75
℃に加熱し、N₂圧下に添加ロートへ移した。こ
れを加熱ガンで加温することにより沈殿を防ぎな
がら、60mlDMF中の8.0mlのブロモ酢酸エチル
（12ｇ、４当量）の溶液に室温においてN₂下に滴
下した。この添加に２時間を要した。さらに20時
間後、過剰のハロゲン化物と溶媒を回転蒸発器
（45℃／約１mm）で除去した。 この固体残留物を約600mlの酢酸エチル中に溶
かし、水で３回、飽和ブラインで１回洗い、
Na₂SO₄上で乾燥し、蒸発した。この固体残留物
を沸とうクロロホルムで３回抽出し、クロロホル
ムを蒸発した。クロロホルムに不溶性の固体を回
収し、出発物質は1.3ｇであつた。 クロロホルムに可溶性の生成物をアセトニトリ
ルに取り、石油エーテルで１回洗い無機油を除去
した。蒸発すると、アセトニトリル留分は約５ｇ
の半結晶性油が生じた。シリカゲルとエーテル溶
離液を用いるTLCは主に２つの点、すなわちジ
アルキル生成物（R_f＝0.60）とモノアルキル生成
物（R_f＝0.33）を示した。100ｇのシリカゲルPF
とエーテル（３ポンドの圧力）によるクロマトグ
ラフイーは油として2.0ｇのジアルキル生成物を
与えた。ついで酢酸エチルで溶離すると、1.45ｇ
のモノアルキル生成物を与えた。フラクシヨンを
TLCにより分析し、一緒にし、目的生成物を沸
とうベンゼン溶液からシクロヘキサンの添加によ
り結晶化すると、1.325ｇ（23.4％の収率）の白
色小板状結晶、融点138〜141℃が得られた。 エステル生成物、1.00ｇ（3.30ミリモル）を15
mlTHF（新らしく蒸留したもの）中に溶かし、
1.0mlの6NのNaOHをかきまぜないで加えた。30
分後、十分な水を加えて沈殿した塩を溶かした。
３時間後、THFは蒸発し、塩基性層をエーテル
で１回洗い、濃塩酸でPH１の酸性にし、引つかい
て結晶化を誘導させた。沈殿した固体を最少量の
沸とうエタノールに溶かし、水（約30ml）を加
え、この溶液を濃縮して約20mlにし、ゆつくり冷
却し、この酸を結晶化することによつて再結晶化
した。100℃においてP₂O₅上で真空乾燥すると、
0.686ｇの白色の円柱、融点189〜190℃が得られ
た。初めのろ液を酢酸エチルで抽出し、処理して
得られた残留物を結晶化して他の0.130ｇを得た。
全収量＝0.816ｇ（90％）。 実施例 1.8 ５−（2′−デオキソ−5′−フエニルバルビツリ
ル−5′）ペンタナールおよびペンタノン酸 Ａ 500mlの３口フラスコに5.0ｇの油中の50％
NaHを入れ、石油エーテルでN₂下に数回洗つ
て油を除去した。200mlのDMF中のフエニルジ
エチルマロネート（23.6ｇ、21.5ml、0.1モル）
をN₂下にかきまぜながら加え、この混合物を
55〜60℃に加熱して陰イオンの形成を完結し、
生じた溶液を20.0mlの６−ブロモ−１−ヘキサ
ン（1.5当量）に加えた。この混合物をN₂下に
一夜加熱し、そその時それはPH紙に対して中性
とした。このDMFを回転蒸発器（44℃／１mm）
で除去し、残留物を約１のエーテルに溶か
し、水で数回、ついでブラインで洗い、
Na₂SO₄上で乾燥し、蒸発した。残留油、約30
ｇを真空ジヤケツト付ビクロウ（vigreux）カ
ラムに通して蒸留し、118〜121℃／0.005mmで
沸とうする留分を集めた、281ｇ（88％の収
率）。 Ｂ 上で製造したオレフイン（36.88ｇ、0.17ミ
リモル）の約600mlの乾燥メタノール中のかく
はんされた溶液を窒素でパージし、この溶液中
にN₂を流しながら大きいデユワーびん中で−
78℃に冷却した。ウエスバツチ・オゾネイター
（Welsbach Ozonator）を、7psiオゾン圧力、
流れ＝2.0、115ボルト、10ポンドの酸素入口圧
力で使用した。約１時間後、流出ガスはオゾン
を含有した。流出ガスが湿つた紙のK1／でん
粉試験で陰性を与えるまで、冷却液をN₂で約
１時間パージした。 ジメチルサルフアイド（20ml、２当量）を加
え、冷却浴を除き、混合物を一夜N₂下にかき
まぜた。 この混合物から揮発性物質を真空除去した。
残留物を400mlのエーテルに取り、300mlの水で
１回洗つた。水をエーテルで逆洗浄し、ついで
一縮にしたエーテルフラクシヨンを水で３回、
ブラインで１回洗い、Na₂SO₄上で乾燥し、蒸
発した。このように製造したアルデヒドは不安
定であり、これを使用して直接アセタールとす
べきである。 Ｃ このアルデヒド（37.0ｇ、0.12モル）を約
400mlの無水エタノールに溶かし、0.5ｇのｐ−
トリエンスルホン酸−水和物を加えた。この混
合物を少なくとも12時間静置し、ついで濃縮
し、約300mlの５％のNa₂CO₃中に注ぎ入れ、
エーテルで３回抽出した。このエーテル溶液を
一縮にし、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発すると油、
43.3ｇ（95％）が得られた。 Ｄ 300mlの無水エタノール中のNa（7.7ｇ、0.33
モル、３当量）の溶液をN₂下に新らしく調製
した。室温に冷却後、上記生成物（43.2ｇ、
0.11モル）を200mlのアルコールに加え、つい
で乾燥チオ尿素（12.6ｇ、0.17モル、1.5当量）
を加えた。この混合物をN₂下に一夜還流し、
室温に冷却し、ろ過した。ろ液を蒸発し、残留
物を水に取り、水性フラクシヨンをエーテルで
４回洗つた。一緒にした水性フラクシヨンを
0.5NのNaOHで１回洗つた。一緒にした水性
フラクシヨンを塩で飽和し、氷中で冷却し、濃
HClで注意して酸性にした。油状生成物をエー
テルで３回抽出した。このフラクシヨンは生成
物とこれより極性の化合物を含有することが
TLC（シリカ、１：１エーテル：石油エーテ
ル）により明らかになつたので、このより極性
の化合物を飽和Na₂SO₄で洗つた。ついで、こ
のエーテルを水、ブラインで洗い、Na₂SO₄上
で乾燥し、蒸発すると14.4ｇの発ぽう体が生
じ、これをTLC（R_f＝0.55、１：１エーテル：
石油エーテル：シリカ）によりかなり清浄にし
た。この物質をせん付きフラスコ内で−10℃で
貯蔵した。 Ｅ 上のチオバルビツル酸（12.9ｇ）、500mlの無
水エタノールおよび約100mlのＷ−５ラネーニ
ツケル・ペースト（約１週間経過したもの）の
混合物を水素ふん囲気下に約１時間還流した。
エタノールを完全に除去したのちこの混合物の
TLCによるプレート（シリカゲル、10％のエ
タノール／クロロホルム）からの分析は、反応
が完結したことを示した。H₂SO₄で着色する
と、１種の主要生成物（R_f＝0.48）を示した。 この熱溶液を媒体フリツトを通してろ過し
（注意：発火性ニツケルを乾燥してはならな
い）、このニツケルを沸とうエタノールで５回
洗つた。このエタノール溶液を約100mlに濃縮
し、ついで加熱沸とうさせて生成物を再溶解し
た。一夜静置すると、この生成物は結晶化し
た。エーテルを加え、この生成物をろ過し、エ
ーテルで２回洗うと3.91ｇ、融点228〜230℃
（ガス）、TLCでは純粋が得られた。第２番目
の収量は1.38ｇであつた。第３番目の収量は固
体残留物を熱酢酸エチルとともに微摩砕し、酢
酸エチルを濃縮することにより母液から得ら
れ、0.54ｇ、融点225〜228℃であつた。全量
5.83ｇ（49％）。 Ｆ 上記アセタール生成物（5.0ｇ、14.3ミリモ
ル）を40mlの酢酸に溶かし、20mlの水を加え
た。この溶液を4.5時間かきまぜ、沈殿がゆつ
くり現われた。この溶媒を50℃で真空除去し、
白色結晶を一夜真空に保つた。 残留物を700mlの沸とう水に取り、ろ紙を通
してろ過し、500mlに濃縮した。冷却すると、
白色生成物が微結晶として沈積する。P₂O₅上
で乾燥すると、2.54ｇの第１番目の収量、融点
230℃（分解）が得られた。第２番目の収量は
母液を約150mlに濃縮することにより0.62ｇが
得られた。全量3.16ｇ（80％の収率）。 Ｇ 300mlの試薬級のアセトン中の500mg（1.34ミ
リモル）上記アルデヒドの急速にかきまぜたけ
ん濁液を０℃において0.73mlの1.84モルのジヨ
ーンズ（Jones）試薬（CrO₃−H₂SO₄）ととも
に微摩砕し、さらに2.5時間かきまぜた。イソ
プロパノールを加えて過剰の試薬を分解し、つ
いで過剰の固体の炭酸水素ナトリウムと氷を加
えた。低温濃縮したのち、この反応混合物を酢
酸エチルで抽出して出発物質（71mg）を除去し
た。酸性化し抽出すると311mg（回収されたア
ルデヒドに基づいて71％）の白色粉末、融点
224〜225℃（分解）が得られ、これを沸とう水
から再結晶すると融点は233〜236℃（分解）で
あつた。 実施例 1.9 １−カルボキシメチルザロンチン 窒素ふん囲気下に、10mlの乾燥DMF中の370mg
（2.62ミリモル）乾燥ザロンチンを252mg（２当
量）水素化ナトリウム−ヌジヨール（nujol）分
散液で処理し、溶液が透明になるまで周囲温度に
おいてかきままぜた。10mlの乾燥DMF中ヨウド
酢酸（480mg、2.62ミリモル）を10分間にわたつ
て滴下し、この反応混合物を60℃に一夜加熱し
た。 DMFを真空除去したのち、残留物を20mlの
0.1NのNaOHに溶かし、エーテルで抽出した。
水層をPH１の酸性にし、塩を加え、酢酸エチルで
約20時間連続的に抽出した。受器から酢酸エチル
を乾燥し、蒸発すると445mgの生成物と出発物質
との粗混合物が得られた。これをシリカのTLC
実験室用プレート上に付着させ、酢酸エチル−ベ
ンゼン−酢酸（１：１：0.1）で展開した。下側
の帯を抽出すると、固化できない174mgの酸が得
られた。連続抽出器の本体から酢酸エチル層を同
様に処理すると、250mgの油が得られ、これを同
様に精製すると約50mgの酸が得られた。 実施例 1.10 ２−カルボキシエチル−２−メチルスクシンイ
ミド Ａ 150mlの乾燥ベンゼン中の22.6ｇ（0.2モル）
のシアノ酢酸エチル、28.4ｇ（0.2モル）のレ
ブリン酸エチルおよび２mlのピペリジンおよび
氷酢酸の溶液を20時間還流させ、その間反応器
へ取り付けたデイーン・スターク・ヘツドによ
りベンゼン−水共沸物を連続的に除去した。こ
のベンゼンを回転蒸発器で除去し、残留物を真
空蒸留した。出発物質と白色結晶を65℃／0.5
トル留去すると、27.5ｇ（60％）の目的生成物
が得られた。静置すると、生成物は暗色化して
濃かつ色となつた。 Ｂ 100mlのメタノール（マグネシウムから蒸留
したもの）中の上記オレフイン（10.84ｇ、
0.045モル）を室温において３ｇ（0.045モル）
のシアン化カリウムで処理し、添加の間温度は
８℃上昇し、ついで室温に低下し、この溶液は
鮮明な黄色変わつた。１時間かきまぜたのち、
TLCは反応が完了したことを示した。 この反応器は乾燥管とガス入口とを有した。
この混合物を−20℃に冷却し、HClを反応フラ
スコへ温度が−10℃に維持されるような速度で
導入し、４時間の添加時間の終り近くに温度は
５℃近くに上昇した。（注：反応は非常に発熱
性である。）この溶液をHClで飽和し、これを
室温に温め、一夜かきまぜ、ついで3.5時間還
流した。 水を加えて反応混合物を冷却し、メタノール
を真空除去した。この溶液のPHを濃水酸化物で
５に調節し、さらに溶媒を除去した。ろ過後、
ろ液をエーテルで抽出し、ついで炭酸水素酸
塩、水とブラインで洗い、乾燥し、蒸発して
2.90ｇの粗ジエステルを得た。 水層と洗液を一緒にし、濃縮し、PHを強い水
性水酸化物で約９に調節し、全体を酢酸エチル
で連続的に20時間抽出した。乾燥剤を受器フラ
スコへ加えて沈殿を形成し、メタノールを加え
て沈殿を加えた。有機相を蒸発すると油が得ら
れ、油をクロロ・ホルム−シクロヘキサンから
再結晶し、これから約500mgの白色粉末が得ら
れ、これを酢酸エチルから再結晶化すると分析
試料、融点174〜178℃が得られた。 このイミドピロリドン生成物の結晶化からの
母液を蒸発すると油が得られ、これを15mlの20
％りん酸とともに30分還流させた。この反応混
合物を氷中に注ぎ、酢酸エチルで抽出すると
1.14ｇのかつ色油が得られ、これはTLCによる
とほとんどがモノ酸であつた。 連続的にに抽出したものとの水性層を濃縮
し、十分なりん酸と混合して20％の溶液をつく
り、全部で10時間還流した。イミドおよび酸で
はない未確認の成分はゆつくり転化して1.24ｇ
の粗モノ酸となつた。 このようにして得られたすべてのモノ酸を集
め（3.18ｇ）、120ｇの粗大シリカのクロマトグ
ラフイーを行ない酢酸エチル−ベンゼン−酸酸
（１：１：0.1）で抽出した。モノ酸を含む試験
管を集めると約３ｇの酸が得られた。酢酸エチ
ル−シクロヘキサンから１回再結晶すると1.56
ｇのTLCで純粋なモノ酸、融点90−101℃が得
られた。酢酸エチル−シクロヘキサンから分析
用試料、m.p.100.5〜102℃（R_f＝0.2；シリカ、
酢酸エチル−ベンゼン−酢酸〔１：１：0.1〕）
が得られた。 Ｃ 上でつくつたジエステル２−メチル−２−
（2′−カルボメトキシエチル）−３−カルボメト
キシスクシンイミドのメタノール溶液（３ml中
の170mg）を３mlの1NのNaOHと混合し、室温
で３時間かきまぜた。この溶液を酸性にし、塩
を加え、酢酸エチルで抽出すると、130mgの油
が得られ、これは静置すると固化した。この油
をメタノール−クロロホルムから１回再結晶す
ると、やや純粋な二酸が得られ分析試料をアセ
トン−クロロホルムからの２回の再結晶により
つくつた。融点147〜150℃（分解）。 30mgのこの二酸と２mlの氷酢酸と一夜還流
し、溶媒を除去すると、約20mgの油が得られ、
これはTLCとNMRとにより目的のモノ酸であ
ることが示された。 実施例 2.1 うしの血清アルブミンへのN³−カルボキシメ
チルジフエニルヒダントインの抱合体 40μのトリエチルアミンを含有する４mlの乾
燥DMF中の124mgのN³−カルボキシメチルジフ
エニルヒダントインの溶液へ約70μのカルビチ
ルクロロホルメートを０℃において加え、この混
合物を０℃で1.5時間かきまぜた。ついでこの溶
液を20mlの水中の160mgのうしの血清アルブミン
（BSA）に０℃において加え、その間1Nの水酸
化ナトリウムでPHを９〜10に維持した。添加完了
後、このPHを約9.5〜10に２時間維持し、ついで
４℃で一週間かきまぜた。 ついで生じた溶液を脱イオン水に対して４℃に
おいて透析した。脱イオン水を２回の置換したの
ち、沈殿と上澄み液とが形成し、沈殿を遠心分離
し、上澄み液を脱イオン水に対して再透析し、全
部で３回脱イオン水を取り替えた。透析溶液を
15000rpmで15分間遠心分離し、得られた透析溶
液を凍結真空乾燥すると145mgの抱合体が得られ、
これはVV分析によるとハプテン数が51であつ
た。 実施例 2.2 うしの血清アルブミンへのN³−カルボキシメ
チルジフエニルヒダントインの抱合体 N³−カルボキシメチルジフエニルヒダントイ
ン（62mg、0.2ミリモル）を３mlの塩化メチレン
に溶かし、０℃において１mlの塩化オキザリルを
加えた。約３滴のジメチルホルムアミド（DMF）
を加え、この溶液を０〜５℃で２時間かきまぜ、
周囲温度で蒸発させ、ついで２mlの乾燥塩化メチ
レンに再溶解した。ついで塩化メチレン溶液を
280mg乾燥セライトへ加え、溶媒を室温で真空蒸
発した。ついで高真空を15分間加えて溶媒を完全
に除去した。 濃炭酸水素ナトリウムでPH9.5にに調節した約
６mlの水中の65mg（1μモル）のうしの血清アル
ブミン（BSA）の溶液に、セライトに吸収させ
た上記塩化アシルを加えた。０℃においてかきま
ぜ、PHを監視しかつ塩基の添加によりPHを約9.5
〜10.5に維持しながら、上記セライトを少しづつ
加えた。添加完了後約10分経過してから、PHを一
定に保つた。この反応混合物を一夜かきまぜ、こ
の溶液をろ過し、0.1モルの炭酸カリウム−0.1モ
ルの炭酸水素カリウムに対して２回完全に透析
し、ついで蒸留水に対して２回透析した。 この生成物を紫外線分析すると、１分子の
BSA当りのハプテン数は約25であつた。 実施例 2.3 うしの血清アルブミンへのカルビチル（N³−
ジフエニルヒダントイニル）アセトイミデート
の抱合体 （Ｎ−ジフエニルヒダントイニル）アセトニト
リル（550mg）、20mlの再蒸留カルビトールと25mg
の50％水素化ナトリウムを反応フラスコへ入れ、
この混合物を窒素ふん囲気下に一夜かきまぜた。
このかきまぜた溶液に50mlの水中の660mgのうし
の血清アルブミンを加え、1Nの水酸化ナトリウ
ムでPHを７とした。反応中、必要に応じて1Nの
水酸化ナトリウムまたは1Nの塩酸によりPHを10
に調製した。2.5時間後、PHは9.5となり、混合物
を室温で64時間静置した。 反応混合物を２つのアリコートに分け、一方の
アリコートを脱イオン水を３回置換させて透析し
た。透析物を遠心分離し、紫外線スペクトル法に
より分析した。ハプテン数は31のハプテン／
BSAであつた。凍結真空乾燥した後、438mgの抱
合体が得られた。 実施例 2.4 うしの血清アルブミンへのN³−（4′−カルボキ
シ−ｎ−ブチル）ジフエニルヒダントインの抱
合体 N³−（4′−カルボキシ−ｎ−ブチル）ジフエニ
ルヒダントイン（0.7ｇ）を30mlの塩化メチレン
に溶かし、これに０℃において５mlの塩化オキサ
リルを加えた。３滴のDMFを触媒として加えた。
２時間かきまぜたのち、溶媒を蒸発させ、残留物
を25mlの塩化メチレンに溶かした。ついでこの溶
液を2.5ｇの乾燥セライトへ加え、溶媒を蒸発さ
せた。 50mlの水中の0.64ｇのBSAに上記セライトを少
りづつ加え、その間炭酸ナトリウム水溶液でPHを
9.5〜10.5に維持した。このセライトを洗浄する
ため少量の水をさらに加えることが必要であつ
た。反応を短時間進行させたのち、この混合物を
ろ過し、最終的容量の約100mlを２つの部分に分
け、そのおのおのを0.1モルの炭酸ナトリウム−
0.1モルの炭酸水素ナトリウムに対して４回透析
し、ついで蒸留水に対して３回透析した。凍結真
空乾燥後、500mgの抱合体が単離され、これは紫
外線分析によるとハプテン数は23であつた。 実施例 2.5 うしの血清アルブミンへのメチル（２−（N³−
ジフエニルヒダントイニル）エトキシ）アセト
イミデートの抱合体 窒素ふん囲気中で20mlのメタノールに335mgの
（２−（N³′−ジフエニルヒダントイニル）エトキ
シ）アセトニトリルと５mgの50％水素化ナトリウ
ムを溶かし、この溶液を室温で16時間かきまぜ
た。二酸化炭素のガスをこの混合物中にに20分間
あわ立てたのち、溶媒を真空蒸発させた。残留物
を８mlのカルビトールに溶かし、20mlの水中の
500mgのBSAのかきまぜた溶液に室温において加
え、その間1Nの水酸化ナトリウムによりPHを約
9.5〜10.0に維持した。このPH値を2.5時間維持し
たのち、この混合物を室温で一夜かきまぜた。つ
いでこの混合物を18.000rpmで20分間遠心分離
し、上澄み液を脱イオン水に対して透析した。水
を５回取りかえた後、綿状沈殿が形成し、これを
遠心分離し、上澄み液を単離し、凍結真空乾燥す
ると340mgが得られた。ハプテン数は紫外線分析
によると37であつた。 実施例 2.6 BSAへの５（ｐ−カルボキシメトキシフエニ
ル）−５−フエニルヒダントインの抱合 ４mlの塩化メチレン中の500mgの実施例1.6の酸
の溶液を０℃に冷却し、４滴の乾燥DMF、つい
で1.5mlの塩化オキサリルを加えると、激しい反
応が起こつた。この反応混合物を15分間冷却し、
さらに1.5mlの塩化オキサリル、ついでさらに２
mlの塩化オキサリルを加えた。１時間かきまぜ、
その間反応混合物は室温となり、ついで溶媒を吸
引器のフード内で除去した。フラスコをブチ
（Buchi）装置により50mlづつの塩化メチレンで
数回フラツシ乾燥した。真空乾燥したセライトの
2.5ｇを25mlの塩化メチレン中にけん濁させ、前
記酸塩化物に加え、0.5時間かきまぜ、ついでブ
チ装置により溶媒を除去して乾燥粉末にした。 ５mlの蒸留水中の500mgのBSAの溶液を０℃に
冷却し、濃炭酸ナトリウムでPHを9.5にしたのち、
PHメーターでPHを監視しながら前記セライト／酸
塩化物けん濁液を少しづつ加えた。炭酸ナトリウ
ム溶液を必要に応じて加えてPHを9.25〜9.50に維
持した。セライトの添加完了後、PHは安定化し
た。この溶液を０℃に１時間維持したのち、焼結
ガラスのロートによりろ過し、透析袋に移し、４
のおのおのの0.1モルの炭酸ナトリウム／0.1モ
ルの炭酸水素ナトリウム（２回取り替え）そして
蒸留水（２回の取り替え）に対して３日間にわた
つて透析した。透析した抱合体を凍結真空乾燥す
ると、480mgの粉末が得られた。 抱合度を標準の曲線技術により決定し、A₂₅₇／
A₂₉₀の比を使用してハプテン数を決定すると、17
であつた。 実施例 2.7 BSAへの５−（2′−デオキソ−5′−フエニルバ
ルビツリル−5′）ペンタナールの抱合 250mlの0.05モルのNa₂HPO₄中の200mgのBSA
のPH7.0の溶液に、１mlのDMF中の50mg実施例1.8
のアルデヒドの溶液を加え、ビーカーにふたを
し、冷室中で３日間かきまぜた。 この透明な混合物を水（４）に対して透析
し、透析液を２回取り替えると透析袋中に沈殿が
現れた。透析液をさらに２回取り替えると、沈殿
が形成し、上澄み液を使用してハプテン数を決定
した。Ｎ−カルボキシメチルプリミドンに対する
標準曲線を使用すると、55のハプテン数が得られ
た。この溶液を凍結真空乾燥すると、79mgのたん
ぱく質の抱合体が得られた。 実施例 2.8 BSAへの１−カルボキシメチルザロンチンの
抱合 ４mlの乾燥DMF中の実施例1.9の酸（70mg、
0.351ミリモル）を−30℃に冷却し、当量のトリ
エチルアミンで処理し、ついで当量のイソブチル
クロロホルメートで30分間処理した。45分間かき
まぜたのち、この混合無水物をPH8.5に調節した
20mlの水中の300mgのBSA溶液へゆつくり加え
た。希水酸化物水溶液を必要に応じて混合無水物
とともに加えてPHを8.5に保持した。30分後PHは
安定化し、ついでこの溶液で冷室内で水を連続的
に取り替えながら水に対して完全に透析した。得
られた溶液をミリポアー（millipore）し、凍結
真空乾燥すると、250mgの白色粉末が得られた。
平均値38.5のハプテン／BSAが得られた。 実施例 2.9 BSAとの２−カルボキシエチル−２−メチル
スクシンイミドの抱合 窒素ふん囲気中で、100.6mgの実施例1.10の酸
を２mlのモレキユラー・シーブで乾燥したDMF
に溶かし、−20℃に冷却し、１当量のトリエチル
アミンを加えた。30分間かきまぜたのち、71μ
のイソブチルクロロホルメートを加え、この混合
物をさらに30分間かきまぜた。この混合無水物を
PH8.5の20mlの水中の300mlのBSAにゆつくり加
え、これによりPH値は増加した。沈殿がゆつくり
形成し、PHは徐々に低下した。混合無水物の添加
を続け、PHを1.5時間監視した。溶液を冷室内で
一夜かきまぜた。 朝、この溶液は完全に透明であつた。これを透
析袋に入れ、４の炭酸水素酸塩の緩衝液に、つ
いで水の連続的置換に対して透析した。生じた透
明溶液をミリポアーし、凍結真空乾燥すると、
270mgの白色粉末が得られた。ハプテン数は
42.5／BSAであつた。 実施例 3.1 ハプテンカルボン酸の混合無水物とカルビチル
カーボネートとを用いていくつかの反応を行なつ
た。混合無水物の製造の一般操作を用いた。次の
操作を例示する。 0.5mlのジメチルホルムアミド（DMF）、0.055
ミリモルのハプテン酸と6.95μのトリエチルア
ミンを反応器へ入れ、−10℃に冷却した。ついで
この溶液に8.5μのカルビチルクロロホルメート
を加え、この混合物を０℃に加温し、45分間静置
すると、この溶液はそのまま使用できる状態であ
つた。 同様にして、実質的に同じ濃度の同じ溶液中で
等モル量を使用して、他の混合無水物を調製し
た。 一般操作を使用して、この混合無水物をグルコ
ース−ホスフエイトデヒドロゲナーゼへ抱合し
た。この操作は次のとおりである。 グルコース−６−ホスフエイトデヒドロゲナー
ゼ、グルコース−６−ホスフエイトおよび
NADHの緩衝溶液を反応器へ入れた。この混合
物にカルビトールを加え、上のようにして調製し
た無水物溶液のアリコートを注射器によりその針
を表面下にして加えた。塩基を必要に応じて加
え、PHを約９±0.5に維持した。反応の終りにお
いて、試料を遠心分離して沈殿やくもり物質を実
質的に除去した。次の実施例に記載した操作によ
り検定を行なつた。 次の表に使用した物質、不活性化百分率と禁止
を示す。

【表】
☆☆☆
−CH_２− 1.95 2.5 0.19
30 20 10 24 9
8.5
−CH_２CH_２CH_２CH_２− 0.955 0.595 0.38
4 9.9 5.25 24 116
9.5

☆
−CH_２CH_２OCH_２− 0.955 0.5 0.2
15^＋ 20 10 17 滴
9
−CH(CH_３)CH_２− 1.46 0.5 0.2
9.5 19.8 10.5 −−
9

【表】 実施例 3.2 次のような一般操作を用いた。市販のＧ−６−
PDH〔4.19mg／ml、ベツクマン、マイクロビツク
ス（Beckman Microbics）〕を0.055モルのトリ
ス−HCl緩衝液、PH7.9に対して透析した。得ら
れた酵素溶液を反応に使用した。小型磁気かきま
ぜ棒とPH電極を備えたガラスびんへ、この酵素溶
液のアリコートを入れた。この溶液にかきまぜな
がら固体のNADAとグルコース−６−ホスフエ
イトを加えた。ついでかきまぜながら注射器によ
りその針を液面下にしてこの溶液に十分な量のカ
ルビトールを加えて所望量の共溶媒を形成した。
ついで、カルビトールの場合と同じようにして、
注射器により、この溶液に修飾ハプテンをカルビ
トール中のカルビチルオキシカルボニルエステル
としてかきまぜながら加えた。ついで、この反応
混合物を接種し、アリコートを取り出し、希釈
し、過剰の抗体による不活性化および禁止に関す
る速度を決定した。 次の表は物質の使用量、温度および時間、なら
びに不活性化および禁止の百分率を示す。 不活性化および禁止の百分率の検定操作は、次
のようにして行なう。PH５〜６の0.1モルのNAD
溶液の２容量部とPH7.9の0.055モルのトリス−
HCl緩衝液中の0.11モルのグルコース−６−ホス
フエイトの容量部とを一緒にする。抱合反応混合
物からのアリコートを上に示した緩衝液で１：
1000に希釈した。50mlのＧ−６−Ｐ−NAD溶液、
750μの緩衝液、50μの緩衝液（不活性化また
は禁止の度合を決定するときは抗体を含む）およ
び酵素抱合体または酵素対照物から、検定溶液を
形成する。緩衝液を一部分づつ使用して定量的な
移動を確実に行なうようにする。この溶液を分光
器へ吸引し、NADH生成速度を340nｍおよび37
℃において追跡した。１分当りのODの変化を第
２分目ないし第３分目の間で測定する。 結果を次の表に示す。 （Ｒは非オキソカルボニルと環との間の結合基
である。）

【表】 ※ メチルエステル
※※ 透析せず、そうでない場合は0.0055モルのト
リス〓HCl、pH7.9を4回取り替えて生成物を透
析した。
実施例 4.1 メチル（N³−ジフエニルヒダントイニル）ア
セトイミドのスピン・ラベル（spin label） ２mlのクロロホルム中の90ml（0.28ミリモル）
の（）および44mg（0.28ミリモル）の２・２・
５・５−テトラメチル−３−アミノピロリジン−
１−オキシルの溶液に40mg（0.30ミリモル）のト
リエチルアミン塩酸塩を加え、生じた溶液を一夜
静置した。こ混合物を実験室用TLCプレートに
直接塗布し、１：50の濃NH₄OH：酢酸エチルで
溶離した。Rf0.7の黄色帯は目的生成物であり、
こすり取つたものを同じ溶離液（100ml）で溶離
した。真空ストリツピング後、残留物をジエチル
エーテルに取り、ろ過し、ろ液を真空ストリツピ
ングし、真空ポンプの作用下（0.05mm）に１時間
置くと、75mgのガラス状黄色残留物が得られた、
IR（CHCl₃）1690cm^-1（Ｃ＝Ｎ）、分子量448.5。 実施例 4.2 ５−（ｐ−カルボメトキシフエニル）−５−フエ
ニルヒダントインのスピン・ラベル １mlの乾燥DMFと32mg（0.1ミリモル）の５−
（ｐ−カルボキシメトキシフエニル）−５−フエニ
ルヒダントインを混合し、窒素ふん囲気中で−８
℃に冷却した。17μのトリエチルアミンを加え
ると沈殿が形成した。30分間かきまぜたのち、
13μのイソブチルクロロホルメートを加え、溶
液を−８℃でさらに30分間かきまぜた。１mlの乾
燥DMF中の２・２・５・５−テトラメチル−３
−アミノ−１−オキシピロリジン（１当量）をこ
の冷溶液にかきまぜながら加え、この溶液を室温
に一夜温めた。 この反応混合物を水に注ぎ入れ、100mlのエー
テルで抽出した。有機相を飽和ブラインで逆洗浄
し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。エーテル層を
蒸発すると油が得られ、これをクロロホルム中に
溶かし、実験室用プレート（シリカ）上に塗り、
５％のメタノール／クロロホルム中で展開した。
約Rf0.30における帯をアセトンで抽出し、これを
蒸発すると、24mgの油が得られた。ヘキサンで微
摩砕し、蒸発するとかつ色のワツクス状固体が形
成し、これは結晶化しなかつた。この固体は３本
の線のESRスペクトル、スピン・ラベル・アミ
ンと異なるRf値、ならびにスピン・ラベル・ア
ミンと酸とのアミドの生成に一致するIRスペク
トルを有した。 実施例 4.3 ２−（2′−カルボキシエチル）−２−メチルスク
シンイミドのスピン・ラベル ３mlのモレキユラー・シーブ乾燥DMF中の92
mgの乾燥酸の溶液を−20℃に冷却し、１当量のア
ミンで処理し、ついで１当量のイソブチルクロロ
ホルメートで30分間処理した。この混合物を45分
間かきまぜたのち、500μのDMF中の78mgのス
ピン・ラベル・アミンを加えた。この反応混合物
を−20℃に２時間保持し、ついで室温で一夜かき
まぜた。 DMFを真空回転蒸発により除去し、残留物を
４mlの水中に溶かした。酢酸エチルの抽出により
得られた油を実験室用TLC（シリカ、15％のメタ
ノールクロロホルム）により精製すると約50mgの
黄色発ぽう体が得られた。15eVの質量スペクト
ルは324のM⁺値（計算分子量324、18）を示した。 抗体を次のようにして調製した。１mlの塩溶液
中に溶けた約10mgの抗原を３mlの完全なフレウン
ド（Freund）助剤と一緒にし、異なる動物を用
い４個所の異なる部位に注射した。約３週間後、
１mlの塩溶液中の約10mgの抗原を３mlの不完全な
フレウンド助剤と一緒にし、同様にして注射し
た。ついでほぼ１月を基準にして注射を繰返し、
各注射後約１週間以内に血を採取した。いくつか
の場合において抗体の力価ならびに結合定数を決
定した。次の表は、ジフエニルヒダントインに対
して、使用した特定の抗原、特定の採血前の注射
の回数および生成した抗体について決定した値を
示す。

【表】

【表】 米国特許第3690834号に記載されるスピン・ラ
ベルド免疫検定技術に従い、スピン・ラベルとし
てＮ−２・２・５・５−テトラメチル−１−オキ
シルピロリジニル−3N³−ジフエニルヒダントイ
ニルアセトアミジンを使用して決定した。 実施例２、３の抗原を使用して生成した抗体を
用いると、ジフエニルヒダントインの構造に似た
構造をもつある数の薬剤との相互反応はほとんど
起らなかつた。 検定は次のようにして行なつた。試薬溶液を一
緒にして1.15：１のスピン・ラベル：抗ジフニル
ヒダントイン（結合部位）の比を、0.18モルのホ
ウ酸塩緩衝液、PH8.0中のスピン・ラベル濃度
2.64×10⁶モルで、得た。ついでこの評価溶液を
ESRキヤビテイへ入れ、ピーク高さを測定した。
いろいろな濃度の種々の薬剤を加えて特定の薬剤
に対する当量濃度を決定した。これは1μｇ／ml
濃度においてジフエニルヒダントインと同程度の
スピン・ラベルの変性度を与えたであろう。結果
は次のとおりであつた。 ジフエニルヒダントイン 1μｇ／ml ｐ−OH−ジフエニルヒダントイン 14 セコバルビタール 100 フエノバルビタール ＞100 グルテチミド ＞100 次の検定はプリミドンに関するものであつた。
常法により実施例2.7の抗原を使用して抗体をつ
くつた。検定を次のようにして行なう。0.5％の
NaClと0.01V／Ｖ％のトリメンＸ−100を含有す
る250μの緩衝液（PH8.1、25℃；0.55モルのト
リス−HCl；0.05W／Ｖ％のNaN₃；0.005％Ｗ／
Ｖチメロサール（Thimerosal））（塩を含む緩衝
液）と50μの試料を調合して１mlのカツプに入
れた。60秒間平衡状態にしたのち、50μの上記
試料の溶液を第２のカツプに分配し、これに
1W／Ｖ％のうさぎの血清アルブミン、0.066モル
のグルコース−６−ホスフエートおよび0.4モル
のNAD（モノナトリウム塩）を含有する緩衝液中
の抗体溶液50μを加え、ついで250μの塩溶液
を加えた。最後に、0.9W／Ｖ％のNaClおよび
1W／Ｖ％のうさぎの血清アルブミンを含有する
緩衝液中の酵素抱合体50μを加え、ついで250μ
の緩衝液を加えた。この検定混合物をスペクト
ル測定器のセルに吸引し、15秒の遅延後第１回の
吸収の読みを行ない、80秒後に第２回の吸収の読
みを行なつた。読みの差をOD単位として記載す
る。既知の濃度の試料を使用し、標準曲線をつく
ることができる。 上記検定操作を用い、2.5μｇ／ml以下のプリミ
ドン濃度を血清中で容易に検出できた。相互反応
性についての研究において、試験薬剤および2.5μ
ｇ／mlのプリミドンの同等の応答を与えるに必要
な濃度を記載する。 フエノバルビタール ＞700μｇ／ml セコバルビタール ＞1000μｇ／ml メフバルビタール ＞1000μｇ／ml ジフエニルヒダントイン ＞1000μｇ／ml これらの結果から明らかなように、生理学的流
体に見出される濃度において、これらの密接に関
係する薬剤のいずれが存在しても誤つた正符号が
存在しないであろう。 本発明の新規な前駆化合物は安定でありかつ高
いハプテン数で生成されうる抗原への抱合体を生
成する。抗原を動物へ注射すると、興味ある化合
物に対して高い特異性をもつて抗体が高い力価で
生成する。さらに、本発明の化合物は検出分子、
たとえば安定な遊離基および酵素と抱合して、抗
体と一緒になつて高い感度および信頼性をもつ免
疫検定をなす試薬を生成できる。酵素抱合体およ
び遊離基抱合体は検定すべき薬剤と競争できるの
で、興味ある薬剤に対して高い特異性をもつ抗体
の興味ある化合物以外の化合物への結合に原因す
る誤まつた結果を与えない検定を行なうことがで
きる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中Ｘは酸素またはイミノであり； Ｒはメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレ
   ン、ペンチレン、エチレンオキシメチル、エチレ
   ンオキシエチル、プロピレンオキシメチルまたは
   炭素数７もしくは８のフエノキシアルキルであ
   り； Ｍはフエニルまたは炭素数１〜３の低級アルキ
   ルであり、ここでαがイミノであるときＭはフエ
   ニルであり、αがメチレンであるときＭは炭素数
   １〜３の低級アルキルであり； ＺはH₂または酸素であり； αはイミノ、メチレンまたはカルバモイルであ
   り、ここでＺがH₂であるときαはカルバモイル
   であり、そしてＺが酸素であるときはαはイミノ
   またはメチレンであり； Ｄはアミノ基を経て結合した、ポリ（アミノ
   酸）血清たんぱく抗原またはデヒドロゲナーゼ酵
   素であり； ＹおよびY⁰の一方はＲへの結合であり、結合
   以外であるときＹは水素であり、そしてαがイミ
   ノであるときY⁰はフエニルであり、αがメチレ
   ンであるときY⁰は炭素数１〜３の低級アルキル
   であり、そしてαがカルバモイルであるときY⁰
   は炭素数１〜３の低級アルキルまたはフエニルで
   あり； ｎは整数１ないし該抗原の分子量を1000で割つ
   て得られた数である。） の抱合体の製造法において； ポリ（アミノ酸）血清たんぱく抗原又はデヒド
   ロゲナーゼ酵素を、式： （式中、D′は水素またはヒドロキシであり、他
   は前記定義の通りである。） の前駆体と結合させる工程からなる前記製造法。