DE2521523A1

DE2521523A1 - Lactamverbindungen und konjugate

Info

Publication number: DE2521523A1
Application number: DE19752521523
Authority: DE
Inventors: Gunner Van Bolz; Richard K Leute; Prithipal Dr Singh; Michael J Soffer
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1974-06-28
Filing date: 1975-05-14
Publication date: 1976-01-15
Also published as: GB1511571A; CA1037475A; JPS511632A; FR2276317B1; JPS638427B2; FR2276317A1

Description

Patentanmeldung

Lactamverbindungen und !Conjugate

Es besteht ein fortgesetztes und steigendes Bedürfnis für genaue, schnelle und bequeme Verfahren zum Nachweis von Arzneimitteln bzw. Drogen. Die Gründe für das Bedürfnis, ein bestimmtes Arzneimittel zu analysieren, sind vielfältig. Ein Grund, der zunehmend an Bedeutung gewinnt, ist die Ermittlung der therapeutischen Dosis. Da Personen, die mit Arzneimitteln behandelt werden, unterschiedlich auf das Arzneimittel ansprechen, eine unterschiedliche Stoffwechselgeschwindigkeit haben und unterschiedlich auf die vom Arzneimittel verursachten Nebenwirkungen reagieren, ist es wichtig geworden, zu wissen, in welcher Dosis ein Arzneimittel verabreicht werden soll, um einen möglichst guten therapeutischen Effekt zu erzielen und gleichzeitig alle Nebenwirkungen auszuschließen oder zu vermindern.

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2S21523

Eine Gruppe von Arzneimitteln, die in einem fünf- oder sechsgliedrigen Ring die Lactamfunktion enthalten, werden zur Behandlung der Epilepsie verwendet· Diese Arzneimittel sind einerseits relativ wasserunlöslich, andererseits relativ wasserlöslich. Diese Arzneimittel sind strukturell weitgehend ähnlich. Bei der Herstellung von Arzneimittelderivaten treten häufig Syntheseprobleme auf.

Derivate dieser Arzneimittel sind gewöhnlich nötig, wenn man eine Immuno -Analyse zum Nachweis eines bestimmten Arzneimittels entwickelt. Es muß ein Derivat des Arzneimittels hergestellt werden, das dann mit einem antigenen Protein oder einem anderen Material konjugiert werden kann, das die Immunreaktion in Gang setzt, um die für das interessierende Arzneimittel spezifischen Antikörper zu vermindern. Unter "spezifisch" versteht man, daß sich die Antikörper stark an das spezifische Arzneimittel und/oder seine Stoff Wechselprodukte binden, d.h. eine hohe Bindungskonstante und eine hohe Konzentration an Antikörpern mit hohen Bindungskonstanten haben. Weiterhin soll der Antikörper schwache Bindungskonstanten zu ähnlichen, aber nicht verwandten Arzneimitteln haben, so daß ein positives Ergebnis bei der Immuno -Analyse mit dem interessierenden Arzneimittel in Beziehung gesetzt werden kann und nicht durch die Anwesenheit eines anderen Arzneimittels bedingt ist.

Weiterhin ist es bei einigen Immuno-Analysen erforderlich, daß das modifizierte Arzneimittel mit einem Detektormolekül, z.B. einem freien Radikal oder einem Enzym, konjugiert wird. Die verwendete !Funktionalität kann gleich oder verschieden von der Funktionalität sein, die für die Konjugation mit der antigenen Substanz verwendet wird. Die erzeugten

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Antikörper müssen sich aber nicht nur fest an das Arzneimittel binden, sondern auch in der Lage sein, sich fest an das mit dem Detektormolekül konjugierte Arzneimittel zu binden.

Bei der Konjugation an Proteine, wie Antigene und Enzyme, ist man weitgehend auf die für die Konjugation anwendbaren Bedingungen beschränkt. Es sind milde wäßrige Systeme wesentlich, wenn eine Denaturierung und ein Verlust der Enzymaktivität vermieden werden sollen. Stark saure und alkalische Lösungen müssen vermieden werden, so daß man zwangsläufig bei einem vom ifeutralwert nicht zu weit entfernten pH-Wert arbeiten muß. Weiterhin sollen die für die Konjugation angewendeten kbvalentenBindungen starke Bindungen sein, so daß sie die Einführung des Antigens in das Lebewesen oder die Lagerungs- und Analysenbedingungen für das Detektorkonjugat aushalten können.

Zum Stand der Technik wird auf folgende Druckschriften hingewiesen:

Von Tigelaar wurde in Olin.Chem. Acta, 43, 4^, 231-241 (1973) eine Radioimmuno-Analyse für Diphenylhydantoin beschrieben.

In der USA-Patentschrift 3 690 834 ist eine Eamuno-Analysemethode mit Spinmarkierungssubstanzen für eine Vielzahl von Arzneimitteln beschrieben.

In der USA-Patentschrift 3 817 837 ist eine Enzym-Immuno-Analyse für eine große Anzahl von haptenischen Arzneimitteln beschrieben.

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Ih der Arbeit von Avrameas mit der Bezeichnung "Immunoenzyme !Techniques" in der International Review of Physiology, 27« 34-9 (1970) ist eine Anzahl von Methoden zur Verknüpfung von Proteinen mit Proteinen beschrieben.

Weiterhin ist von Interesse das Lehrbuch von Means und Feeny, "Chemical Modification of Proteins", Holden-Day, San Irancisco, Calif.,

Die Erfindung betrifft modifizierte Arzneimittel mit einer Lactamfunktion, die am Kohlenstoffatom in cL-Stellung zur Carboxylgruppe disubstituiert sind und die zur Konjugation an Proteine, d.h. entweder Antigene oder Enzyme oder an andere Detektormoleküle zur Verwendung bei der Immuno-Analyse geeignet sind. Die Modifizierung umfaßt die Einführung einer Carbonylfunktion, d.h. entweder einer Qxo- oder einer Nicht-Qxo-Carbonylfunktion (einschließlich der Stickstoff- und Schwefel-Analogen), die, wenn sie nicht an ein Ringatom gebunden ist, über eine Gruppe verbunden ist, die mit dem disubstituierten Kohlenstoffatom oder dem Lactamstickstoffatom verbunden ist. Die unter Verwendung des Antigens erhaltenen Antikörper haben eine hohe Spezifität für das interessierende Arzneimittel und/oder seine StoffWechselprodukte.

Die neuen Verbindungen zur Herstellung von Reagenzien oder zur Verwendung als Reagenzien bei Immuno-Analysen von Arzneimitteln haben Lactamfunktionen mit 5 bis 6 Ringgliedern und sind an dem der Carbonylgruppe benachbarten Kohlenstoffatom disubstituiert. Die Verbindungen haben eine Carbonylf unktion, d.h. entweder eine Oxo- oder Mcht-Oxo-Carbonylfunktion (einschließlich der Stickstoff- und Schwefel-Analogen), die über eine Kette mit mindestens

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einem Kohlenstoffatom an das disubstituierte Kohlenstoffatom oder an das Lactam-Stickstoffatom gebunden ist. Die Verbindungen mit den funktionellen Oarbonylgruppen werden zur Konjugation mit Antigenen verwendet, die dann Tieren injiziert werden, um Antikörper zu erzeugen, die gegenüber dem interessierenden Arzneimittel spezifisch sind. Weiterhin kann das Arzneimittel mit der funktionellen Carbonylgruppe mit Enzymen oder stabilen freien Badikalen konjugiert werden, die als Detektorreagenzien bei Immuno-Analysen dienen. Die Konjugate sind also Amide, Amidine, ühioamide oder Alkylamine, was von der jeweils vorliegenden Oarbonylfunktion abhängt.

Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind Lactame, die eine Carbonyl-(Oxo- oder Nicht-Oxo)-!Funktion zur Konjugation mit Antigenen über eine verbindende Gruppe haben, bzw. die daraus abgeleiteten Konjugate, die über eine gesättigte Kohlenstoffbindung, eine Nicht-Qxo-Garbonyl oder eine Iminobindung mit der Aminogruppe verbunden sind. Diese Verbindungen haben größtenteils die nachstehend angegebene lOrmel:

X⁰

D-N- (O)- E -

worin die Symbole folgende Bedeutungen haben:

X ist Ghalcogen (0 oder S) oder Imino (NH);

R ist eine verbindende Gruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und 0 bis 2, gewöhnlich 0 bis 1 Heterοatomen in der Kette, Ghalcogen oder Stickstoff (tertiärer Aminstickstoff) und

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kann aliphatisch, alicyclisch, aromatisch oder heterocyclisch sein, sowie entweder aliphatisch gesättigt oder ungesättigt, wobei gewöhnlich 0 bis 1 Stelle mit einer äthylenischen Unsättigung vorliegt;

M ist eine Phenyl- oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen;
Z ist H₂ oder Sauerstoff;

.χ ist eine Imino-, Methylen- oder Carbamoylgruppe, mit der Maßgabe, daß eine Imino- oder Methylengruppe vorliegt, wenn Z Sauerstoff ist, und daß eine Garbamoylgruppe vorliegt, wenn Z gleich Hp ist;

D ist ein Poly-(Aminosäure)-Antigen (Protein oder Polypeptid) , das über Aminogruppen gebunden ist; oder bedeutet D¹ (COp). , worin ρ 0 oder 1 ist, mit der Maßgabe, daß ρ gleich 0 ist, wenn Z kein Sauerstoff ist; daß für ρ = 0 D¹ Wasserstoff, Halogen, insbesondere Chlor und Brom, Hydroxy oder ein gesättigter aliphatischer oder heterocyclischer organischer Rest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und 1 bis 6 Sauerstoffatomen ist (diese liegen in Form von Oxyatomen als die einzigen anderen Atome neben Wasserstoff vor), und der durch Sauerstoff mit der Carbonylgruppe (einschließlich der Stickstoff- und Schliefel-Analogen) verbunden ist, wobei die Sauerstoffatome normalerweise durch mindestens 2 Kohlenstoff atome voneinander getrennt sind; für ρ = 1 ist D' der genannte gesättigte aliphatische oder heterocyclische organische Rest; eines von J und X° ist eine Bindung, wobei Y, wenn es keine Bindung ist, Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen bedeutet ;und Y° ist eine Phenylgruppe, wenn^X.eine Iminogruppe ist, bzw. eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wenn'Xeine Methylengruppe ist, bzw. eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe, wenn<χ eine Carbamoylgruppe ist;

5 Π 9 8 B 3 / 1 f1 3 1

m ist O oder 1, wenn D ein Antigen ist, sonst nur 1; und η ist 1, wenn D kein Antigen ist, und 1 bis diejenige Zahl, die erhalten wird, wenn das Molekulargewicht des Antigens durch 1000 und vorzugsweise durch 1200 geteilt wird.

Antigene

Ih den meisten Fällen haben die Antigene gemäß der Erfindung die nachstehend angegebene Formel

Antigen

Σ Ii -HH-(O)₁₁₁₁.

worin die Symbole folgende Bedeutungen haben:

"Antigen" ist eine natürlich vorkommende oder synthetische Poly-(Aminosäure), d.h. gewöhnlich ein Polypeptid oder ein Protein, das als Antigen wirkt und das gegebenenfalls auch andere Bestandteile als Aminosäuren enthalten kann; das Antigen hat normalerweise ein Molekulargewicht von mindestens 5000 und üblicherweise von nicht mehr als 10 Millionen, gewöhnlich von nicht mehr als 1 Millionen und vorzugsweise von etwa 15.000 bis 500.000, insbesondere von etwa 30.000 bis 200.000;

die an das Antigen gebundene Aminogruppe ist Teil des Antigens, ist jedoch unabhängig angegeben, um die Art der Bindung zu veranschaulichen;

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X ist Sauerstoff, Imino (MH) oder Schwefel; Z ist H₂ oder Sauerstoff;

•X¹ ist Πϊηίηο, Methylen oder Carbamoyl (HEGO), wobei das mit dem Kohlenstoffatom verbundene Stickstoffatom auch mit Z verbunden ist;

wobei Oi.¹ Imino oder Methylen ist, wenn Z Sauerstoff ist, und Carbamoyl ist, wenn Z H~ ist;

V ist eine Ihenylgruppe oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, insbesondere eine Ihenylgruppe, wenn x¹ eine Imino- oder Carbamoylgruppe ist, und eine niedere Alkylgruppe, wenn «-<· eine Methylengruppe ist;

E¹ ist eine verbindende Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und O bis 1 Heteroatom (Chalcogen bzw. Stickstoff), gewöhnlich ein aliphatischer Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, üblicherweise mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und O bis 1 Heteroatom in der Kette, wobei das Heteroatom Sauerstoff oder Stickstoff, vorzugsweise Sauerstoff ist und der Sauerstoff in der Qxyform und der Stickstoff in der tertiären Aminform vorliegen, wobei sich mindestens 1, vorzugsweise 2 Kohlenstoffatome zwischen den Heteroatomen befinden;

R¹ kann geradkettig oder verzweigt, vorzugsweise geradkettig sein und hat O bis 1 Stelle mit aliphatischer Unsättigung, z.B. äthylenischer Unsättigung, ist jedoch normalerweise gesättigt; oder

R¹ ist ein monocyclischer Arylrest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, üblicherweise mit 6 bis 8 Kohlenstoffatomen und O bis 1 Heteroatom, das nicht im Ring ist und das entweder Sauerstoff oder Stickstoff, vorzugsweise Sauerstoff, ist, wobei der Sauerstoff in der Cbcyform und der Stickstoff in der tertiären Aminoform vorhanden sind und

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sich mindestens 1, vorzugsweise 2 Kohlenstoffatome zwischen den Heteroatomen befinden;
m¹ ist 0 oder 1;

eines von X¹ und X^ ist eine Bindung zu R¹; wenn es keine Bindung ist, ist ϊ° eine Phenylgruppe, wenn _yl' eine ünidogruppe ist, eine niedere Alkylgruppe, wenn Ot¹ eine Methylengruppe ist, und entweder eine Phenyl- oder niedere Alkylgruppe, wenn oc¹ eine Carbamoylgruppe ist, wobei die niedere Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoff atome enthält;

wenn es keine Bindung ist, ist X¹ Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen; n¹ ist mindestens 1 und reicht gewöhnlich vom Molekulargewicht des Antigens, geteilt durch 35*000, gewöhnlich geteilt durch 20.000, vorzugsweise geteilt durch 7000, bis zum Molekulargewicht des Antigens, geteilt durch 1000, gewöhnlich durch 1200. I¹Ur Antigene mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 15.ΟΟΟ bis 500.000, insbesondere von 15-000 bis 200.000, liegt der bevorzugte Bereich für n¹ zwischen dem Molekulargewicht des Antigens, gsteilt durch 1000 bis 12.000, gewöhnlich geteilt durch 1200 bis 5000. Ist das Antigen ein Albumin, so liegt die Anzahl der konjugierten Gruppen gewöhnlich im Bereich von etwa 10 bis 55* vorzugsweise von 20 bis 4-5.

Es ist eine große Anzahl von antigenen Polyaminosäuren bekannt, d.h. sowohl von natürlich vorkommenden, als auch von synthetischen. Meistens sind Proteine von einer Art von Lebewesen Antigene bei einer anderen Art. Es können aber auch Polymere von Aminosäuren hergestellt werden, z.B. Poly-L-Lysin. Geeignete Proteine sind Albumine, Globuline, Enzyme, Hämocyanine, Albuminoide, Gluteline, Proteine mit proteinfremden Bestandteilen,

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z.B. Glykoproteine und dgl. Von besonderem Interesse sind die Serumalbumine und -globuline mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 30.000 bis 200.000.

Beispiele für die Gruppen R sind Methylen, Äthylen, Propylen, Butylen, Pentylen, Äthylenoxymethyi, Ithylenoxyäthyl, N-Methyläthylenaminoäthyl und Propylenoxymethyl.

Sobald das konjugierte Antigen hergestellt worden ist, kann es isoliert und zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Die Methoden zur Herstellung der Antikörper sind die üblichen und können verschiedenen Lehrbüchern entnommen werden. Beispielsweise sei hingewiesen auf Kabat et al, Experimental Iiamuno chemistry, Charles C. OJhomas, Springfield, Illinois, 1967 und Williams et al, Methods in Immunology and Immuno chemistry, Bd. I, Academic Press, New York, 1967· Normalerweise wird zunächst eine Injektion unter Verwendung von vollständigem ireund'schem Adj'uvans an verschiedenen Stellen des Wirtstieres, gewöhnlich eines Haustieres, z.B. bei einem Schaf, einer Ziege, einem Kaninchen, einem Pferd, einer Kuh od.dgl. vorgenommen, worauf die Injektionen in verschiedenen Zeitabständen wiederholt werden. Normalerweise sind die Anfangstiter und die Spezifität geringer, und verbessern sich mit den weiteren Injektionen, wobei nach einigen Injektionen gewöhnlich ein Plateau erreicht wird.

Nach einer weiteren Alternative kann die funktionalisierte Lactamdroge mit einem Phosphatid konj'ugiert werden, und das erhaltene Konjugat kann zur Herstellung von Liposomen verwendet werden. Die Liposomen können dann einem Wirtstier inj'iziert werden, um Antikörper zu bilden. In diesem

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Zusammenhang sei auf Uemura et al, Biochemistry, 1j5, 1572 (1974), zur Unterstützung der Offenbarung der vorliegenden Erfindung hingewiesen. Das Phosphatidyläthanolamin kann mit der modifizierten Lactamdroge praktisch in der gleichen Weise konjugiert werden, wie die Konjugation mit dem antigenen Polypeptid erfolgt.

Das erhaltene Konjugat hat in den meisten Fällen die nachstehend angegebene Formel:

A¹ OCH₂OH(OA²) GH₂OP(O) (OH)OOH₂CH₂KHCR' (LD)

worin X und R¹ wie vorstehend definiert sind;

1 2
A und A Fett säur e-Acylgrupp en mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen;

LD die Formel

0 —I

bedeuten, worin die Symbole wie vorstehend definiert sind.

Die Liposomen werden in üblicher Weise durch Kombination des Phosphatidylkonjugats mit Sphingomyelin, Cholesterin und Dicetylphosphat gebildet und nach der von Uemura et al (a.a.O.) beschriebenen Arbeitsweise injiziert.

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Handelt es sich bei dem Arzneimittel um Diphenylhydantoin, so hat das Antigen die nachstellend angegebene Formel:

Antigen (-M-

worin, mit Ausnahme von Y und Il , die Symbole die vorstehend angegebene Bedeutung haben, ausgenommen, daß m vorzugsweise 1 ist; eines von T und Tr ist eine Bindung, wobei, wenn es sich nicht um Bindungen handelt, Tr eine Ehenylgruppe und Ϊ Wasserstoff bedeutet, und wenn Tr die Bindung ist, R¹ vorzugsweise eine aromatische Gruppe, insbesondere eine Phenoxyalkylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet, und wenn I die Bindung ist, R¹ vorzugsweise eine aliphatische, insbesondere eine gesättigte aliphatische Gruppe bedeutet.

Wenn das interessierende Arzneimittel Ä'thosuccimid ist, so hat das Antigen die nachstehend angegebene Formel:

Antigen \ -—ΜΗ-

^—R¹ —

worin die Symbole die vorstehend angegebene Bedeutung haben, ausgenommen hinsichtlich ΐ , IT und X , wobei, wenn X Methy oder Äthyl ist, eines von Ί? und X^ eine Bindung ist, und

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wenn es sich nicht um Bindungen handelt, X¹" die andere Methyl- bzw. Ithylgruppe und Y⁵ Wasserstoff ist; vorzugsweise ist R¹ eine aliphatische, insbesondere eine gesättigte aliphatische Gruppe.

Wenn das interessierende Arzneimittel Frimidon ist, so hat das Antigen üblicherweise folgende Formel:

\
Antigen J-M-

m'

n^l

worin die Symbole die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben, mit Ausnahme von Ί?, Γ³ und IT, worin eines von Ί? und Γ³ eine Bindung ist, wobei, wenn eines keine Bindung ist, I^ Wasserstoff und Y⁶ Hienyl oder Äthyl ist und X² die andere Phenyl- bzw. Ithylgruppe bedeutet; R¹ ist vorzugsweise eine aliphatische und insbesondere eine gesättigte aliphatische Gruppe.

Vorstufen

Die Konjugate werden unter "Verwendung von Vorstufenverbindungen hergestellt, welche Funktionen besitzen, die mit Aminogruppen, wie Amiden, Amidinen, Thioamiden oder gesättigten Alkylamin-Bindungen, starke kovalente Bindungen bilden.

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Üblicherweise haben die Vorstufen folgende Formel

D" (COV,—C-R¹-

worin alle Symbole die vorstehend angegebene Bedeutung haben, ausgenommen p¹ und D¹¹;

wobei p¹ 0 oder 1 ist, mit der Maßgabe, daß p¹ O ist, wenn X nicht Sauerstoff ist; und worin D¹ ' folgende Bedeutungen haben kann:

Wasserstoff, Hydroxy oder Halogen, mit der Maßgabe, daß p¹ 0 und X Sauerstoff ist; einen gesättigten aliphatischen Rest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich mit

2 bis 10 Kohlenstoffatomen und mit 1 bis 6 Sauerstoffatomen, die über Sauerstoff an die Carbonylgruppe gebunden sind, einschließlich Alkoxygruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Alkylenoxygruppen mit mindestens

3 Kohlenstoffatomen und mindestens 2 Qxy-Sauer stoff atomen, d.h. mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis Sauerstoffatomen, gewöhnlich mit 2 bis 4 Sauerstoffatomen und vorzugsweise mit 3 Sauerstoffatomen, wobei gewöhnlich nicht mehr als 2 Hydroxylgruppen vorliegen (normalerweise befinden sich 1 bis 4, gewöhnlich 2 bis 3 Kohlenstoffatome zwischen den Sauerstoffatomen) ; oder oxy-heterocyclische Gruppen mit 5 bis 6 Ringgliedern aus Kohlenstoff und Sauerstoff und mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Je nach der für die Konjugation in Frage kommenden Funktion und der Verbindung, mit der das modifizierte

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Arzneimittel konjugiert wird, können verschiedene Arbeitsweisen zur Konjugation angewendet werden.

Bei der ersten Arbeitsweise wird ein Carbodiimid verwendet, das zusammen mit der Garbonsäure im Medium löslich ist. Diese Arbeitsweise ist besonders brauchbar für relativ gut wasserlösliche modifizierte Haptene. Die Reaktion wird normalerweise bei einer Temperatur im Bereich von -10 bis 25°C bei verhältnismäßig niedrigen Konzentrationen durchgeführt, wobei mindestens die stöchiometrische Menge Hapten, bezogen auf die mit dem Protein zu konjugierende Haptenzahl verwendet wird. Das Carbodiimid wird in einer stöchiometrischen Menge oder in einem geringen Überschuß verwendet.

Als nächstes werden zwei Arbeitsweisen gemeinsam betrachtet, nämlich die Verwendung von gemischten Anhydriden oder Imidaten, da die Bedingungen weitgehend ähnlich sind. Bei wasserlöslichen Haptenen werden normalerweise niedere Alkylcarbonate und niedere Alkylimidate verwendet, wobei man unter niederen Alkylgruppen solche mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen versteht. Es wird ein wäßriges Medium mit Temperaturen im Bereich von etwa -10 bis 40⁰C, gewöhnlich von etwa -5 bis 30⁰C verwendet. Die Zeit hängt von dem gewünschten Konjugationsgrad, den verwendeten Konzentrationen und Temperaturen und von der Natur der Reaktionsteilnehmer ab.

Wenn das Hapten nur schwer wasserlöslich ist, kann das zur Konjugation verwendete wäßrige Medium frei von anderen polaren Lösungsmitteln sein, ausgenommen diejenige kleine Menge, die beim Zusatz des Haptens zur Konjugation eingeführt wird; das polare organische Lösungsmittel kann aber

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auch in Mengen von bis zu 25 Vol.-^ vorhanden sein. Brauchbare polare Lösungsmittel sind die Alkylenoxy-Lösungsmittel, z.B. Garbitol, Diäthylenglykolmonoäthyläther, Diäthylenglykolmonobutyläther und Diäthylenglykol. Die Alkylenoxy-Lösungsmittel erfüllen hinsichtlich ihrer Zusammensetzung die Definition von D¹¹, und es können die beiden .endständigen Qxygruppen veräthert sein. Andere brauchbare Lösungsmittel sind Dirnethylsulföxyd, Hexamethylphosphoramid und Dioxan.

Die interessierenden Lösungsmittel sind inerte Lösungsmittel. Venn ein Hilfslösungsmittel verwendet wird, so liegt es normalerweise in Mengen von mindestens 5 Vol.-%, gewöhnlich von 10 Vol.-%, und in Mengen von nicht mehr als etwa 25 Vol.-%, vorzugsweise von nicht mehr als 20 Vol.-%, vor.

Die Konzentration an Protein im Medium beträgt im allgemeinen etwa 1 χ 10 ^J bis etwa 1 χ 10 Mol, gewöhnlich ^{4 10}

etwa 1 χ 10~⁴ bis etwa 1 χ 10~¹⁰ Mol. Das Molverhältnis zwischen dem Hapten und der Molzahl der Aminogruppen an der zu konjugierenden Verbindung beträgt mindestens 1, im allgemeinen nichtnehr als etwa 500, bei Polypeptiden oder Proteinen gewöhnlich mindestens etwa 2 und nicht mehr als etwa 100.

Normalerweise werden sehr hohe Molverhältnisse hinsichtlich des modifizierten Haptens angewendet, wenn die Imidat-Funktion vorliegt, verglichen mit dem gemischten Anhydrid. Die Umsetzung mit dem Imidat verläuft langsam, so daß hohe Molverhältnisse zur Beschleunigung der

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Umsetzung verwendet werden, wahrend bei Verwendung von Imidaten etwa 2 bis 500 Mol Imidat auf ein zu konjugierendes Mol angewendet werden können, so können bei Verwendung von gemischten Anhydriden etwa 1 bis 5 Mol gemischtes Anhydrid auf ein zu konjugierendes Mol angewendet werden. Während die Reaktionszeiten für die Imidate bis eine Woche betragen können, betragen die Reaktionszeiten bei Verwendung von gemischten Anhydriden im allgemeinen etwa 1 Minute bis 1 Stunde.

Der pH-Wert der Lösung während der Konjugation liegt im allgemeinen im Bereich von 6 bis 9 oder darunter, obgleich in bestimmten Fällen auch höhere pH-Werte empfehlenswert sein können. Es können verschiedene Puffer verwendet werden, z.B. Carbonate, Phosphate, Tris, Borate usw.

Wird die Umsetzung mit weniger löslichen Haptenen durchgeführt, so wird das Hapten in einem polaren, nicht wäßrigen Medium oder in einem teilweise wäßrigen Medium bei einer hohen Konzentration gelöst, wobei zweckmäßig der zur Bildung des Esters verwendete Alkohol als Lösungsmittel verwendet wird. Die Haptenlösung wird dann schnell unter kräftigem Rühren dem Medium zugesetzt, das das zu konjugierende Material enthält. Es ist darauf zu achten, daß hohe Lösungswärmen oder hohe örtliche Konzentrationen vermieden werden.

Schließlich können Acylhalogenide, die an einen festen

Träger gebunden sind, verwendet werden. Zweckmäßig kann als Träger Diatomeenerde, wie "Celite" (Wz) verwendet werden.

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Das Acylhalogenid kann durch Austausch der Carbonsäure mit einem reaktionsfähigen Acylhalogenid, z.B. Gxalylchlorid, in einem inerten Medium, gebildet werden. Das gebildete Acylhalogenid wird dann mit dem Träger vereinigt, worauf das Lösungsmittel abgedampft wird. Normalerweise werden etwa 5 bis 20 % Acylhalogenid, bezogen auf das Gewicht des Trägers, verwendet.

Das adsorbierte Acylhalogenid kann dann in einem wäßrigen Medium bei einem geeigneten pH-Wert, der zu konjugierenden Verbindung zugesetzt werden. Um allgemeinen werden etwa 1 bis 100 Mol, gewöhnlich etwa 1 bis 10 Mol Acylhalogenid auf ein zu konjugierendes Mol verwendet. Es
wird ein schwach basisches Medium verwendet, das im
allgemeinen einen pH-Wert im Bereich von etwa 8 bis 11 hat.

Zur Ausbildung der Alkylamin-Bindung wird der Aldehyd unter milden wäßrigen Bedingungen in Gegenwart eines Überschusses an ITatriumcyanoborhydrid bei Temperaturen im Bereich von -10 bis 25⁰C mit der Poly-(Aminosäure) konjugiert.

Uach Beendigung der Umsetzung wird das Eeaktionsgemisch in üblicher Weise aufgearbeitet, z.B. durch Dialyse, Filtration, Extraktion, Chromatographie und dergleichen.

Experimenteller Teil

Alle Temperaturen sind in ⁰C angegeben, falls nichts anderes gesagt ist. Alle Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, falls nichts anderes gesagt ist. Die reduzierten Drucke sind in mmHg angegeben, falls nichts anderes gesagt ist.

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Tabelle der Beispiele

1.0 Herstellung der Vorstufen

1.1 3- (N-Carboxymethyl) -diphenylhydantoin

1.2 3-(N-Carbos^ethyl)-diphenylhydantoin durch Hydrolyse des Nitrils

1.3 2- (N-Diphenylhydantoinyl) -propionsäure

1.4 5~(ß -Mphenylhydantoinyl) pent ansäure

1.5 (2- (N- Diphenylnydantoinyl) -äthoxy) -e ssigsäure

1.6 5- (p_-Oarboxymethoxyp^Enyl) -5-phenylhydantoin

1.7 2-Deoxo-1-barbiturylessigsäure

1.8 5-(2^l-Deoxo-5^l-phenylbarbituryl-5^t)pentanal und -pentansäure

1.9 1-Garboxymethylzarontin

1.10 2-Oarboxyäthyl-2-methylsuccinimid

2.0 Konjugationen an ESA

2.1 N -Garboxymethyl-diphenylhydantodja

2.2 IT^-Oarboxyniethyl-diphenylhydantoin durch Acylhalogen an "Celite"

2.3 Oarbityl- (N^-diphenylhydantoin) -ace timidat

2.4 W- (4' -Oarboxy-n-butyl) -diphenylhydantoin

2.5 Methyl-(2-QP -diphenylhydantoinyl)-äthoxy)-acetimidat

2.6 5- (Carboxymethoxyphenyl)-5-phenylhydantoin

2.7 5-(2·-Deoxo-5'-phenylbarbituryl-5')pentanal

3.0 Konjugationen an G-6-PDH 3.1« Gemischte Anhydride
3.2. Imidat

4.0 Konjugate an 2,2,5,5-Tetramethyl-3-amino-1-oxylpyrrolidin

4.1 Methyl- (N^-diphenylhydantoinyl) -acetimidat

4.2 5- (pj-Oarboxyme thoxyphenyl) -5-phenylhydantoin

4.3 2- (2' -Garboxyäthyl) -2-methylsuccinimid

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Beispiel 1.1 3- (N-Carboxymethyl) -diphenylhydantoin

Zu einer gerührten Suspension von 10,0 g (36,5 mMol) Natrium-Diphenylhydantoin in 250 ml Wasser wurde eine Lösung von 10,0 g (40 mMol) Chloressigsäure und 10,0 g Natriumbicarbonat in 50 ml Wasser gegeben; das erhaltene Gemisch wurde 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Suspension mit Kohlendioxid gesättigt und filtriert, um nicht-umgesetztes Diphenylhydantoin zu entfernen (es wurden 5»0 g wiedergewonnen). Das Hltrat wurde mit 6-n Schwefelsäure bis auf einen pH-Wert von 1 angesäuert. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit 20 ml Wasser gewaschen, in 100 ml siedendem absolutem Äthanol gelöst und mit 50 ml heißem Wasser versetzt. Das Gemisch wurde über Nach abgekühlt, und die abgeschiedenen weißen Kristalle wurden gesammelt. Nach mehrmaligem Umkristallisieren wurden 3,2 g Produkt mit einem Schmelzpunkt von 285 bis 291° erhalten. Die Mutterlaugen wurden unter Vakuum auf 400 ml eingedampft, erhitzt und abgekühlt, wobei 2,0 g Produkt mit einem Schmelzpunkt von 286 bis 293° erhalten wurden.

Beispiel 1.2 3- (N-Carboxymethyl) -diphenylhydantoin

Zu einer gerührten Suspension von 12 g des Natriumsalzes von Diphenylhydantoin in Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden unter Stickstoff 33 ml Chloracetonitril gegeben. Nach dem Klären der Suspension wurde das Rühren noch 1,5 Stunden fortgesetzt. Das DMSO wurde im Vakuum bei einer etwas erhöhten Temperatur abdestilliert, und der Rückstand wurde in etwa 400 ml Äthylacetat gelöst; die Lösung wurde dann zweimal mit Wasser und einmal mit einer gesättigten wäßrigen NatriumJoarbonatlösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittel wurde der Rückstand mit 50 ml absolutem Äthanol verrieben, wobei 9»77 S weiße Kristalle erhalten wurden. Nach dem Umkristallisieren aus 125 ml absolutem

Äthanol fiel das erwünschte Produkt mit einem Schmelzpunkt

_TOn 194 bis 196° an.

252Ί523

2 g des so liergestellten Nitrils wurden in 75 ml 1-n-äthanolischem Natriumhydroxid gelöst, das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, mit Wasser verdünnt und mit Äther extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit 6-n-H01 bis auf einen pH-Wert von 1 angesäuert. Der erhaltene Niederschlag wurde filtriert und aus wäßrigem Äthanol umkristallisiert, wobei 1,43 S Produkt erhalten wurden.

Beispiel 1.3 2- (N-Diphenylhydantoinyl) -propionsäure

In einen Reaktionskolben wurden 825 nig Natrium- Diphenylhydantoin, 543 mg Äthyl-2-Brompropionat und 10 m\ DMF eingefüllt, worauf das Gemisch unter Stickstoff auf 60 erhitzt wurde und der gerührten Lösung 40 mg Kaliumiodid zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht erhitzt und dann in 25 ml Wasser gegossen, worauf der Kolben mit Wasser und Äther gewaschen und die vereinigten Flüssigkeiten zweimal mit insgesamt 100 ml Äther extrahiert wurden. Die Ätherextrakte wurden dreimal mit insgesamt Wasser und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Eindampfen des Äthers wurde die Lösung mit einem Gemisch aus Benzol, Chloroform und Äthanol einer Schnellverdampfung unterzogen, gefolgt von einer Schnellverdampfung mit Tetrachlorkohlenstoff, wobei ein öl erhalten wurde. Das Öl wurde in Diäthyläther gelöst, die Ätherlösung zweimal mit Wasser (Gesamtvolumen 25 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem öl eingedampft, das zunächst mit Tetrachlorkohlenstoff, dann mit Chloroform und schließlich mit einem Gemisch aus Benzol und Äthanol einer Schnellverdampfung unterzogen wurde. Der Rückstand wurde in heißem Äthanol gelöst, ein Teil des Äthanols abgedampft und Wasser bis zum Trübungspunkt zugesetzt. Beim Steten bildete sich ein Öl, das durch mehrmaliges Erhitzen und Abkühlen wieder aufgelöst wurde, worauf Äthanol zugesetzt wurde.

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Hierbei bildeten sich Kristalle, die sich rasch in ein Öl umwandelten. Dann wurde ein Benzol-Äthanol-Gemisch zugesetzt, und die Lösung wurde eingedampft, wobei ein öliger Kickstand hinterblieb.

Das so hergestellte Öl wurde in etwa12ml Tetrahydrofuran ((EES¹) und 4 ml 1-n-wäßriger Natriumhydroxidlösung gelöst. Die aus zwei Phasen bestehende Lösung wurde bei Raumtemperatur etwa 60 Stunden gerührt. Dann wurde das TEF unter Vakuum abgedampft, die Lösung mit 6-n-HCl bis auf einen pH-Wert von 1 angesäuert, wobei sich ein fester Körper bildete, der abfiltriert und getrocknet wurde.

Der feste Körper wurde durch Auflösen in 50 ml Diäthyläther weiter gereinigt, und die Ätherlösung wurde mit 50 ml einer gesättigten Bicarbonat-Lösungsschicht gewaschen, und angesäuert, wobei ein Niederschlag ausfiel, der abgetrennt und dreimal mit Diäthyläther (Gesamtvolumen 100 ml) extrahiert wurde. Die Diäthyläther-Lösung wurde zur Trockne eingedampft, wobei 673 mg Produkt erhalten wurden_o Das Produkt konnte durch Auflösen in Methanol und Zusatz von Chloroform bis zum Trübungspunkt umkristallisiert werden.

Beispiel 1.4 5- C^ -Diphenylhydantoinyl) -pentansäure

Zu einer gerührten Suspension von 3 »4 g Natrium-Diphenylhydantoin in 20 ml trockenem DMP wurden 2,63 g Äthyl-n-5-brompentanoat und eine Spur Kaliumiodid gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 60⁰C gerührt, worauf die Lösung mit Wasser verdünnt und mit Diäthyläther extrahiert wurde. Nach dem Waschen wurde die Ätherlösung getrocknet und filtriert, und das Filtrat wurde eingedampft, bis ein Öl hinterblieb, das erstarrte und aus wäßrigem Äthanol umkristallisiert wurde. Gesamtausbeute 3_}2 g.

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Der so hergestellte Ester (2,0 g) wurde in 80 ml Dioxan gelöst, worauf 40 ml einer 10-gewichtsprozentigen wäßrigen Ealiumhydroxidlösung zugesetzt wurden. Hierbei trennten sich die Blasen, wobei aber noch. 10 Minuten kräftig gerührt wurde, worauf weiteres wasser zugesetzt wurde, bis sich eine einzige !hase bildete. Die wäßrige Lösung wurde dreimal mit Äther extrahiert, angesäuert und filtriert, wobei 1,5 g Säure erhalten wurden, die aus Benzol umkristallisiert wurde.

Beispiel 1.5 (2-(N-Diphenylhydantoinyl)-äthoxy)-essigsäure

In einen Reaktionskolben wurden 4 g Natrium-Diphenylhydantoin, 3 ml 2-Chloräthoxyacetonitril und 120 ml DMP eingefüllt, und das Gemisch wurde unter Stickstoff 15 Minuten bei 35° gerührt, worauf die Temperatur auf 60° erhöht und das Rühren weitere 24 Stunden fortgesetzt wurde. Nach dem Eindampfen zur Trockne wurde der Rückstand in Diäthyläther aufgenommen, und die Ätherlösung wurde zweimal mit Wasser, einmal mit 0,05n-wäßriger Natriumhydroxid! δ sung und einmal mit wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, worauf sie mit Magnesiumsulfat getrocknet wurde. Dann wurde die Lösung eingedampft, der Rückstand in 60 ml Äthanol aufgenommen, und die Lösung zum Sieden erhitzt, wobei 3,49 g weiße Kristalle erhalten wurden. Nach dem Umkristallisieren aus Äthanol hatte das Produkt einen Schmelzpunkt von 125 bis 128°.

In 15 ml einer äthanolischen 1n-Natriuinhydroxidlösung wurden 200 mg des so hergestellten Nitrils gegeben, und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Dann wurde Wasser zugesetzt und der Äthanol verdampft, wobei eine klare Lösung erhalten wurde, die mit 6n-HCl bis auf einen pH-Wert von 1 angesäuert wurde. Der Niederschlag wurde abfiltriert, wobei 187 ^S eines weißen Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 160 bis 168° erhalten wurden.

Beispiel 1.6 5- (p-Oarboxymethoxyphenyl) -5-phenylhydantoin

Eine Lösung von 4,47 g (16,7 mMol) 5-^-Hydroxyphenyl)-5-phenylhydantoin und 1,94 g (16,7 mMol) Natrium-Chloracetat in 50 ml absolutem Äthanol wurde mit 33»4 ml 1n-Kaliumhydroxidlösung in absolutem Äthanol (2 Basenäquivalente) behandelt und 22 Stunden unter Stiökstoff unter Bückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Baumtemperatur wurde die Lösung in ein gleiches Volumen destilliertes Wasser in einem Bundkolben gegossen; der Beaktionskolben wurde zweimal mit 50 ml destilliertem Wasser gewaschen, und die vereinigten wäßrigen !Fraktionen wurden mit 6n-HCl bis auf einen pH-Wert von 1 angesäuert.

Nach dem Abdampfen des Äthanols wurde die wäßrige !Fraktion in einen Scheidetrichter gegossen und dreimal mit Äthylacetat (Gesamtvolumen 200 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde zweimal mit je 25 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert, mehrmals mit destilliertem Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, wobei 2,69 S einer festen weißen Verbindung erhalten wurden, die durch Kernresonanzspektroskopie und Dünnschichtchromatographie als Ausgangsmaterial nachgewiesen werden konnte (Wiedergewinnung 58 %).

Die Bicarbonatextrakte wurden in einem Scheidetrichter vereinigt und mit 6n-HCl bis auf einen pH-Wert von 1 angesäuert. Der erhaltene Niederschlag wurde mit 200 ml Äthylacetat extrahiert, das mit destilliertem Wasser und Kochsalz nachgewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem weißen Schaum eingedampft wurde. Nach schnellem Abdestillieren einiger Volumteile Aceton aus dem Kolben wurde der Schaum unter Vakuum bis zur Gewichtskonstanz (4,40 g) getrocknet. Die Dünnschichtchromatographie auf

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Kieselsäure zeigte bei Anwendung mehrerer Systeme (z.B. 5 % Methanol in CHGl₅, 20 % Methanol in Äther usw.) drei Flecken, wobei der am schnellsten laufende Fleck durch Anfärbung mit Rhodamin als ein Phenol nachgewiesen werden konnte. Durch Kernresonanzspektroskopie konnten neben den Aromaten zwei Singuletts bei 4,3 und 4,8 ppm in etwa dem gleichen Verhältnis nachgewiesen werden.

Der weiße Schaum wurde in 30 ml wasserfreiem Methanol gelöst, worauf 2 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt wurden und die Lösung 2,5 Stunden unter Kickfluß erhitzt wurde. Ein Aliquot wurde neutralisiert, mit Äther extrahiert und auf eine Kieselsäureplatte aufgetragen; die Entwicklung mit 33 % Äthylacetat in Benzol zeigte drei Flecken und kein Ausgangsmaterial, wobei der am zweitschnellsten laufende Fleck mit Bhodamin angefärbt werden konnte.

Die lösung wurde in ein gleiches Volumen Wasser in einem Scheidetrichter eingegossen, und der erhaltene Niederschlag wurde dreimal mit Äther (Gesamtvolumen 200 ml) extrahiert, mit 10 ml gesättigter Bicarbonatlösung, 100 ml Wasser und 100 ml Kochsalzlösung gewaschen. Mach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde die Ätherlösung eingedampft, wobei 4-j 173 g eines weißen Schaumes erhalten wurden. Die Kernresonantspektroskopie ergab zwei Singuletts im Säuregemisch sowie zwei überlappende Singuletts bei etwa 3,8 ppm.

Der im Lösungsmittel gelöste Schaum wurde auf eine Kolonne aus 120 g präparatives Kieselgel (Brinkman) aufgebracht, das mit 33 % Äthylacetat in Benzol angemacht war, und mit dem gleichen Lösungsmittelsystem mit einer Geschwindigkeit -von 0,75 ml/Min, unter Stickstoffdruck eluiert, wobei Fraktionen von 20 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden durch Dünn Schichtchromatographie (Kieselsäure) mit 33 % .«.thjtacetat in Benzol analysiert. Die Mischfraktionen, die bis- und N-alkylierte Verbindungen enthielten, wurden zuerst eluiert, gefolgt

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von einer kleinen Anzahl von Mischfraktionen, die N- und O-alkylierte !Produkte enthielten. Schließlich wurde das reine O-alkylierte Produkt als weißer Schaum mit einem Gewicht von 837 mg isoliert.

Die Verseifung von 837mg dieses so hergestellten Esters in 20 ml 25 %igem wäßrigem Äthanol und 0,25-molarer NaOH-Lösung über einen Zeitraum von 2 Stunden und anschließende Ansäuerung und Extraktion mit Äthylacetat ergab 803 mg der Säure mit einem Schmelzpunkt von 221,5 bis 222,5°.

Beispiel 1.7 2-Deoxo-1-barbituryle ssigsäure

In einen durch Ausflammen getrockneten Dreihals-Rundkolben von 250 ml wurden 4 g Primidon (18,3 mMol, bei 80°/0,1 mmHg getrocknet) und 0,88 g einer 50 %igen NaH-Dispersion (18,3 mMol) eingefüllt; der Kolben wurde evakuiert und dreimal mit M^ gefüllt. Dann wurden 60 ml Dimethylformamid (DMi¹), getrocknet über Molekularsieben, zugesetzt. Nach dem Aufhören der anfänglichen Reaktion wurde die Lösung auf eine Innentemperatur von 70 bis 75° erhitzt und 3 Stunden unter Stickstoff gerührt, dann bei Raumtemperatur über Nacht weitergerührt, wobei sich ein Niederschlag bildete. Das Gemisch wurde auf 75° erhitzt und mittels Stickstoffdruck in einen Zugabetrichter übergeführt. Die Bildung eines Niederschlages wurde durch Erwärmen mit einem Warmluftgebläse verhindert, während das Gemisch einer Lösung von 8,0 ml Äthylbromacetat (12 g, 4 Äquivalente) in 60 ml DMi¹ bei Raumtemperatur unter Stickstoff zugetropft wurde. Die Zugabedauer betrug 2 Stunden. Nach weiteren 20 Minuten wurden das überschüssige Halogenid und das Lösungsmittel auf einem Drehverdampfer (45°/etwa 1 mmHg) entfernt.

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Der feste Rückstand wurde in etwa 600 ml Äthylacetat gelöst und dreimal mit Wasser und einmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über I^SCL getrocknet und eingedampft. Der feste Rückstand wurde dreimal mit siedendem Chloroform extrahiert, und das Chloroform wurde verdampft. Der in Chloroform unlösliche feste Körper, d.h. das Ausgangsmaterial, wurde wiedergewonnen (1,3 g).

Die in Chloroform löslichen Produkte wurden in Acetonitril aufgenommen und einmal mit Petroläther gewaschen, um das Mineralöl zu entfernen. Beim Eindampfen gab die Acetonitrilfraktion ein halbkristallines öl mit einem Gewicht von etwa 5 g- Die Dünnschichtchromatographie auf Kieselsäuregel mit Äther als Eluierungsmittel ergab zwei Hauptflecken, nämlich für das Dialkylprodukt (R„=0,60) und für das Monoalkylprodukt (R„=0,33). Die Säulenchromatographie mit 100 g Kieselgel PP mit Äther unter einem Druck von etwa 2,2 atü ergab 2,01 g Dialkylprodukt in Form eines Öls. Die Eluierung mit Äthylacetat ergab dann 1,45 g Monoalkylprodukt. Die Sraktionen wurden durch DünnschichtChromatographie analysiert, vereinigt, und das erwünschte Produkt wurde zweimal aus siedender Benzollösung durch Zusatz von Cyclohexan umkristallisiert, wobei 1,325 g (Ausbeute 23,4%) Produkt in Form von weißen Plättchen mit einem Schmelzpunkt von 138 bis 141° erhalten wurden.

Das Esterprodukt (1,00 g » 3,30 mMol) wurde in 15 ml frisch destilliertem Tetrahydrofuran gelöst, worauf 1,0 ml Gn-MaOH ohne Rühren zugesetzt wurden. Nach 0,5 Stunden wurde gerade so viel Wasser zugesetzt, um das abgeschiedene Salz zu lösen. Nach 3 Stunden wurde das Tetrahydrofuran abgedampft, und die basische Schicht wurde einmal mit Äther gewaschen und dann mit kozentrierter HCl bis auf einen pH-Wert von 1 angesäuert. Dann wurde an der Gefäßwand gekratzt, um die Kristallisation in Gang zu setzen. Der ausgeschiedene feste Körper wurde durch Auflösen in der Mindestmenge siedendem Äthanol,

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Zusatz von Wasser (etwa 30 ml), Eindampfen der Lösung bis auf etwa 20 ml und langsames Abkühlen auskristallisiert, wobei die Säure ausfiel. Beim Trocknen im Vakuum bei 10O⁰C über P₅O₅ wurden 0,686 g weiße, längliche Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 189 bis 190° erhalten. Weitere 0,130 g wurden durch Extraktion des Ausgangsfiltrats mit Ithylacetat und Auskristallisieren des erhaltenen Rückstandes gewonnen. Gesamtausbeute 0,816 g (90 %).

Beispiel 1.8 5-(2'-Deoxo-5'-phenylbarbituryl-5^t)-pentanal und -pentansäure

A. Ih einen 5OO ml-Dreihalskolben wurden 5»0 g einer 50 %igen NaH-Suspension in öl, die zur Entfernung des Öls mehrmals mit Petrolather unter Stickstoff gewaschen war, eingefüllt. Dann wurden 23,6 g Phenyldiäthylmalonat (21,5 ml, 0,1 Mol) in 200 ml DMF unter Rühren in einer Stickstoffatmosphäre zugesetzt, und das Gemisch wurde auf 55 bis 60° erhitzt, um die Anionenbildung zu vervollständigen; die erhaltene Lösung wurde zu 20,0 ml 6-Brom-1 -hexen (1,5 Äquivalente) gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht unter Stickstoff erhitzt, wonach es gegenüber pH-Papier neutral reagierte. Das DMF wurde mit Hilfe eines Drehverdampfers (44-°/1 mmHg) abgedampft, und der Rückstand wurde in etwa 1 Liter Äther gelöst und mehrmals mit Wasser und dann mit Kochsalzlösung gewaschen, mit NapSO. getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene öl (etwa 30 g) wurde durch eine Vigreux-Kolonne mit Yakuummantel destilliert, wobei die bei 118 bis 121°/0,005 mm siedende Fraktion in einer Menge von 28,1 g (Ausbeute 88 %) gesammelt wurde.

B. Eine gerührte Lösung des wie oben hergestellten Olefins (36,88 g, 0,17 Mol) in etwa 600 ml trockenem Methanol wurde mit Stickstoff gespült und in einem großen Dewar-Gefäß unter Stickstoffspülung auf -78° abgekühlt. Es wurde ein Welsbach-Ozonisator bei einem Ozondruck von etwa 0,5 atm, einer Strömung von 2,0, einer Spannung von II5 Volt und einem Sauer stoff-Eingangsdruck von etwa 0,7 atm verwendet.

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Bach etwa 1 Stunde enthielt das abströmende Gas Ozon. Die kalte Lösung wurde etwa 1 Stunde mit Stickstoff gespült, bis das abströmende Gas auf feuchtem Papier einen negativen EJ-Stärketest ergab.

Dann wurden 20 ml (2 Äquivalente) Dimethylsulfid zugesetzt, worauf das Eühlbad entfernt und das Gemisch über Nacht unter Stickstoff gerührt wurde.

Das Gemisch wurde im Vakuum von flüchtigen Substanzen befreit. Der Rückstand wurde in 400 ml Äther aufgenommen und einmal mit 300 ml Wasser gewaschen. Das Wasser wurde mit Äther zurückgewaschen, und die vereinigten Ätherfraktionen wurden dann dreimal mit Wasser und einmal mit Kochsalzlosung gewaschen, über Na^SO^, getrocknet und eingedampft. Der so hergestellte Aldehyd ist instabil und sollte unmittelbar zur Herstellung des Acetals verwendet werden.

C 37,0 g (0,12 Mol) des Aldehyds wurden in etwa 400 ml absolutem. Äthanol gelöst, worauf 0,5 g p-Toluolsulfosäure-Monohydrat zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde mindestens 12 Stunden stehengelassen, anschließend konzentriert und in etwa 300 ml 5 %iger Na₂C0.,-Lösung eingegossen und dreimal mit Äther extrahiert. Die Ätherfraktionen wurden vereinigt, mit NaoSO. getrocknet und eingedampft, wobei 43,3 g (95 %) eines Öls hinterblieben.

D. Es wurde eine Lösung von 7j7 S (0,33 Mol, 3 Äquivalente) Wa in 300 ml absolutem Äthanol frisch unter Stickstoff hergestellt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 43,2 g (0,11 Mol) dieses Produktes zu 200 ml Alkohol gegeben, worauf 12,6 g (0,17 Mol, 1,5 Äquivalente) getrockneter {Thioharnstoff zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde über Nacht in einer Stickstoffatmosphäre unter Mickfluß erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Das JFiltrat wurde eingedampft, der

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Rückstand in Wasser aufgenommen, und die wäßrige fraktion wurde viermal mit Äther gewaschen. Die vereinigten Ätherfraktionen wurden einmal mit 0,5 n-NaOH-Lösung gewaschen. Die vereinigten wäßrigen iraktionen wurden mit Salz gesättigt, mit Eis abgekühlt und vorsichtig mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure abgesäuert. Das ölige Produkt wurde dreimal mit Äther extrahiert. Da sich aufgrund der Dünnschichtchromatographie (Äther/Petroläther 1:1 auf Kieselsäure) ergab, daß diese Iraktion das Produkt sowie eine stärker polare Verbindung enthielt, wurde die stärker polare Verbindung mit gesättigter NaHCO^-Lösung ausgewaschen. Die Ätherlösung wurde dann mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Na₂SCL getrocknet und eingedampft, wobei durch DünnschichtChromatographie (R_f=0 »55; Äther/ Petroläther 1:1, Kieselsäure) 14,4- g eines verhältnismäßig sauberen Schaumes erhalten wurden. Dieses Material wurde bei -10° in etem mit Stopfen versehenen Kolben aufbewahrt.

E. Ein Gemisch der wie vorstehend erhaltenen Thiobarbitursäure (12,9 g), 500 ml absolutem Äthanol und etwa 100 ml W-5 Raney-Nickel-Paste (etwa 1 Woche alt) wurde etwa 1 Stunde in einer Wasserstoffatmosphäre unter Rückfluß erhitzt. Die Analyse des Gemisches durch Dünnschichtchromatographie nach gründlicher Entfernung des Äthanols von der Platte (Kieselgel, 10 % Methanol in Chloroform) zeigte eine vollständige Umsetzung. Die farbreaktion mit H₂SCv zeigte eine Hauptverbindung bei R_f=0,48).

Die heiße Lösung wurde durch eine mittelfeine iritte filtriert (das pyrophore Nickel soll nicht austrocknen), und das Nickel wurde fünfmal mit siedendem Äthanol gewaschen. Die Äthanollösung wurde auf etwa 100 ml eingedampft und dann zum Sieden erhitzt, um das Produkt wieder aufzulösen. Das Produkt kristallisierte beim Stehen über Nacht aus. Es wurde Äther

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zugesetzt, und das Produkt wurde filtriert und zweimal mit Äther gewaschen, wobei 3,91 g mit einem Schmelzpunkt von 228 bis 230° (Gasbildung) erhalten wurden; das Produkt war dunnschichtchromatographisch rein. Eine zweite iraktion wog 1»38 g. Eine dritte iraktion wurde aus der Mutterlauge durch Verreiben des festen Rückstandes mit heißem Äthylacetat und Ei τι dampf en des Äthylacetats erhalten; diese !Fraktion wog 0,54 g (Schmelzpunkt 225 bis 228°). Die Gesamtausbeute betrug 5,83 g (49 %).

F. Das vorstehend angegebene Acetalprodukt (5>0 g, 14,3 mMol) wurde in 40 ml Essigsäure gelöst, worauf 20 ml Wasser zugesetzt wurden. Die Lösung wurde 4,5 Stunden gerührt, wobei allmählich ein Niederschlag auftrat. Das Lösungsmittel wurde bei 50° in Vakuum entfernt, und der weiße, kristalline Rückstand wurde über Nacht unter Vakuum gehalten.

Der Rückstand wurde in 700 ml siedendem Wasser aufgenommen, durch Filterpapier filtriert und auf 500 ml eingedampft. Beim Abkühlen schied sich das weiße Produkt in Form von feinen Kristallen aus. Nach dem !Erocknen über PoOc wurden 2,54 g als erste iraktion mit einem Schmelzpunkt von 230° (eers.) erhalten. Eine zweite Iraktion (0,62 g) wurde durch Eindampfen der Mutterlauge auf etwa I50 ml erhalten. Gesamtausbeute 3,16 g (80 %).

G. Eine schnell gerührte Suspension von 500 mg (1,34 mMol) dieses Aldehyds in 300 ml Aceton (Reagensqualität) von 0° wurde mit 0,73 ^l 1,84-molarem Jones-Reagens (OrO^-HpSO^) titriert und weitere 2,5 Stunden gerührt. Dann wurde Isopropanol zugesetzt, um das überschüssige Reagens zu zerstören, worauf überschüssiges festes Natriumbicarbonat und Eis zugesetzt wurden. Nach dem Eindampfen bei niedriger Temperatur wurde das Reaktionsgemisch mit Äthylacetat extrahiert, um das Ausgangsmaterial (71 mg) zu entfernen. Nach dem

B Π 9 β R 3 / 1 Π 31

Ansäuern und dem Extrahieren erhielt man 311 mg (71 %, bezogen auf den wiedergewonnenen Aldehyd) eines weißen Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 224 bis 225° (zers.); nach einmaligem Umkristallisieren aus siedendem wasser erhöhte sich der Schmelzpunkt auf 233 bis 236° (zers.).

Beispiel 1.9 1-Carboxymethylzarontin

Unter einer Stickstoffatmosphäre wurden 370 mg (2,62 mMol) getrocknetes Zarontin in 10 ml trockenem DMF mit 252 mg (2 Äquivalente) einer Matriumhydrid-Kugol-Dispersion behandelt und bei Raumtemperatur gerührt, bis sich die Lösung geklärt hatte. Dann wurden 480 mg (2,62 mMol) Jodessigsäure in 10 ml trockenem DMF über einen Zeitraum von 10 Minuten zugetropft, und das Reaktionsgemisch wurde bei 60° über Nacht erhitzt.

Das DMP wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 20 ml 0,In-KaOH gelöst und mit Äther extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde bis auf einen pH-Wert von 1 angesäuert, ausgesalzen und mit Äthylacetat kontinuierlich über einen Zeitraum von etwa 20 Stunden extrahiert. Das Äthylacetat aus dem Auffanggefäß wurde getrocknet und eingedampft, wobei 445 mg eines rohen Gemisches aus Produkt und Ausgangsmaterial erhalten wurden. Das Gemisch wurde auf Kieselsäureplatten für die präparative Dünnschichtchromatographie ausgebreitet und mit Äthylacetat-Benzol-Essigsäure (1:1:0,1) entwickelt. Die Extraktion der unteren Bande ergab 174 mg einer Säure, die nicht zur Erstarrung gebracht werden konnte. Eine ähnliche Behandlung der Äthylacetatschicht vom Boden der kontinuierlichen Extraktionsvorrichtung ergab 250 mg eines Öls, das in ähnlicher Weise gereinigt wurde und etwa 50 mg Säure ergab.

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Beispiel 1.10 2-Carbo:Q-äthyl-2-methylsuccinimid

A. Eine Lösung von 22,6 g (0,2 Mol) Cyanessigsäureäthylester, 28,4 g (0,2 Hol) Ithyllävulinat und 2 ml Piperidin und Eisessig in 150 ml trockenem Benzol wurden 20 Stunden unter Rückfluß erhitzt, wobei das Benzol-Wasser-Azeotrop mit einem Dean-Stark~Aufsatz, der mit dem Reaktionsgefäß verbunden war, kontinuierlich entfernt wurde. Das Benzol wurde mit Hilfe eines Drehverdampfers entfernt, und der Rückstand wurde unter Vakuum destilliert. Die Ausgangssubstanzen und eine weiße, kristalline Verbindung destillierten bei 65°/0,5 Torr, ab, wobei 27,5 (60 %) des erwarteten Eroduktes erhalten wurden. Beim Stehen verfärbte sich das Erodukt tiefbraun.

B. Das wie vorstehend erhaltene Olefin (10,84 g, 0,045 Mol) in 100 ml Methanol (aus Magnesium abdestilliert) wurde bei Raumtemperatur mit 3 g (0,045 Mol) Kaliumcyanid behandelt; während der Zugabe stieg die Temperatur um 8° und fiel dann wieder auf Raumtemperatur, und die Lösung verfärbte sich hellgelb. Nach einstündigem Rühren zeigte die Dünnschichtchromatographie, daß die Umsetzung vollständig war.

Das Reaktionsgefäß wurde mit einem Trockenrohr und einem Gaseinleitungsrohr versehen. Das Gemisch wurde auf -20° abgekühlt, und HCl wurde mit einer solchen Geschwindigkeit in den Reaktionskolben eingeleitet, daß die Temperatur unterhalb -10° blieb; gegen Ende der 4 Stunden dauernden Zugabe stieg die Temperatur auf 5° (Anmerkung: Die Umsetzung ist sehr exotherm). Nachdem die Lösung mit HGl gesättigt war, wurde sie auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt, sowie anschließend 3,5 Stunden unter Rückfluß erhitzt.

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Dem abgekühlten Reaktionsgemisch wurde dann Wasser zugesetzt, und die Hauptmenge des Methanols wurde unter Vakuum entfernt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit konzentriertem Hydroxid auf 5 eingestellt, worauf weiteres Lösungsmittel abgedampft wurde. Nach dem Filtrieren wurde das illtrat mit Äther extrahiert, dann mit Bicarbonat, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft, wobei 2,90 g des rohen Diesters erhalten wurden.

Die wäßrige Schicht und die Waschwässer wurden vereinigt und eingedampft, der pH-Wert wurde mit starkem wäßrigem Alkali auf etwa 9 eingestellt, und das Ganze wurde 20 Stunden kontinuierlich mit Äthylacetat extrahiert. Nach Zugabe eines Trocknungsmittels in das Aufnahmegefäß bildete sich ein Niederschlag, der durch Zusatz von Methanol wieder gelöst werden konnte. Die organische Schicht wurde zu einem öl eingedampft, und das Öl wurde aus Chloroform-Cyclohexan umkristallisiert, wobei 500 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden, das aus Äthylacetat umkristallisiert wurde, wobei eine Analysenprobe mit einem Schmelzpunkt von 174- bis 178° erhalten wurde.

Die Mutterlauge der Kristallisation des Imidopyrrolidon-Produktes wurde zu einem Öl eingedampft und 30 Minuten mit 15 ml 20 %iger Phosphorsäure unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eis gegossen und mit Äthylacetat extrahiert, wobei 1,14- g eines braunen Öls erhalten wurden, das nach der Dünnschichtchromatographie hauptsächlich aus der Monosäure bestand.

Die ursprüngliche wäßrige Schicht, die kontinuierlich extrahiert worden war, wurde eingedampft und mit ausreichend Phosphorsäure, um eine 20 %ige Lösung zu ergeben, vermischt, und insgesamt 10 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Eine nicht identifizierte Verbindung, die weder das Imid, noch die Säure war, wandelte sich langsam in die rohe Monosäure (1,24- g) um«·

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Die gesamte, so erhaltene Monosäure wurde vereinigt (3 »18 g) und auf 120 g roner Kieselsäure chromatographiert und mit Äthylacetat-Benzol-Essigsäure (1:1:0,1) eluiert. Der Inhalt der Röhrchen mit der Monosäure wurden vereinigt, wobei etwa 3 g Säure erhalten wurden. Nach einmaligem Umkristallisieren aus ÄthSfiacetat-Cyclohexan wurden 1,56 g reine (durch Dünnschichtchromatographie bestimmt) Monosäure mit einem Schmelzpunkt von 90 bis 100° erhalten. Die Analysenprobe wurde aus Äthylacetat-Cyclohexan erhalten und hatte einen Schmelzpunkt von 100,5 bis 102° (R_f=0,2; Kieselsäure, Äthylacetat-Benzol-Essigsäure /~1:1:0 ,_i7).

C. Eine methanolische Lösung des wie vorstehend erhaltenen Diesters 2-Methyl-2- (2' -carbmethoxyäthyl) -3-carbniethoxysuccinimid (170 mg in 3 ml) wurde mit 3 ml In-NaOH vermischt und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde angesäuert und ausgesalzen, dann mit Äthylacetat extrahiert, wobei 130 mg eines Öls erhalten wurden, das beim Stehen erstarrte. Das öl wurde einmal aus Methanol-Chloroform umkristallisiert, wobei eine halbwegs reine Disäure erhalten wurde, und die .Analysenprobe wurde durch zweimaliges Umkristallisieren aus Aceton-Chloroform hergestellt. J¹ » 147 bis 150° (zers.).

30 mg der Disäure wurden mit 2 ml Eisessig über Nacht

unter Rückfluß erhitzt, worauf das Lösungsmittel entfernt

wurde. Es wurden etwa 20 mg eines Öls erhalten, das nach

der Dünnschichtchromatographie' und der Kernresonanz spektroskopie

als die gewünschte Monosäure nachgewiesen werden konnte.

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Beispiel 2.1

N -Carbo^cymethyldiphenylhydantoin-Konnugat mit Rinderserumalbumin.

Zu einer Lösung von 124 mg N-Carboxymethyldiphenylhydantoin

in 4 ml trockenem DMF, das 40 yul Triäthylamin enthielt, wurden

etwa 72/ul Chlorameisensäure Carbitolester bei O zugesetzt,

und das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei 0° gerührt. Die Lösung wurde dann zu 160 mg Rinderserumalbumin (RSA) in 20 ml Wasser von 0° gegeben, wobei der pH-Wert durch Zusatz von In-Katriumhydroxidlösung im Bareich von 9 bis 10 gehalten wurde. Nach Beendigung der Zugabe wurde der pH-Wert 2 Stunden auf etwa 9*5 bis 10 gehalten, worauf bei 4° über das Wochenende gerührt wurde.

Die erhaltene Lösung wurde dann bei 4° gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Nach zwei Austauschoperationen trat ein Niederschlag auf, der abzentrifugiert wurde; die überstehende Flüssigkeit wurde nochmals gegen entionisiertes Wasser (insgesamt 3 Austauschstufen) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 15 Minuten bei 15.000 U/Min, zentiifugiert, und die erhaltene dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, wobei 125 mg eines Eonjugats erhalten wurden, das nach der UV-Analyse eine Haptenzahl von 51 hatte.

Beispiel 2.2 N-Carboxymethyldiphenylhydantoin-Konn'ugat an Rinderserumalbumin

N^-Carboxymethyldiphenylhydantoin (62 mg, 0,2 mMol) wurde in 3 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, worauf 1 ml Gxalylchlorid bei 0° zugesetzt wirde. Es wurden etwa 3 Tropfen Dimethylformamid (DMF) zugesetzt, und die Lösung wurde 2 Stunden bei 0 bis 5° gerührt, bei Raumtemperatur eingedampft und dann in 2 ml trockenem Methylenchlorid aufgelöst. Die Methylenchloridlösung wurde dann zu 280 mg trockenem Celite gegeben, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur eingedampft. Dann wurde 15 Minuten ein Hochvakuum angelegt, um die vollständige Entfernung des Lösungsmittels zu gewährleisten. 5098S3/1031

Zu einer Lösung von 65 mg (1/uMol) Rinderserumalbumin (RSA) in etwa 6 ml Wasser, dessen pH-Wert mit konzentrierter wäßriger Natriumcarbonatlösung auf 9»5 eingestellt worden war, wurde das vorstehend angegebene, an Gelite adsorbierte Acylchlorid zugegeben. Das Celite wurde anteilsweise unter Rühren bei 0° zugesetzt, wobei der pH-Wert überwacht wurde und Alkali zugesetzt wurde, um den pH-Wert im Bereich von etwa 9»5 bis 10,5 zu halten. Etwa 10 Minuten nach Beendigung der Zugabe blieb der pH-Wert konstant. Das Reaktionsgemisch wurde über Macht gerührt, die Lösung zweimal gegen 0,1m-Kaliumcarbonat-0,Im-Kaliumbicarbonat erschöpfend dialysiert, worauf sie zweimal gegen destilliertes Wasser dialysiert wurde.

Die OT-Analyse des Produktes ergab eine Haptenzah? von etwa 25 je Molekül RSA.

Beispiel 2.5

Oarbityl- Qüf -diphen_tTlh.ydantoinyl)-acetimidat-Eon,iug;at mit Rinderserumalbumin.

A. In einen Reaktionskolben wurden 550 mg (H-Diphenylhydantoinyl)· acetonitril, 20 ml umdestilliertes Carbitol und 25 mg 50 %iges Uatriumhydrid eingefüllt, und das Gemisch wurde unter Stickstoff über Macht gerührt. Der gerührten Lösung wurden 600 mg Rinderserumalbumin in 50 ml Wasser (auf einen pH-Wert von 7 eingestellt) in 1n-Ifatriumhydroxidlösung zugesetzt. Während der Umsetzung wurde der pH-Wert entweder mit 1n-Natriumhydroxid oder In-Chlorwasserstoffsäure je nach Bedarf auf 10 eingestellt. Nach 2,5 Stunden hatte sich der pH-Wert auf 9»5 verschoben, und das Gemisch wurde 64 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.

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Nach dem Aufteilen des Reaktionsgemisches in zwei Anteile wurde ein Anteil gegen entionisiertes Wasser dialysiert (dreimaliger Wechsel). Das Dialysat wurde zentrifugiert und UY-spektroskopisch analysiert. Es wurde eine Haptenzahl von 31 je Mol RSA gefunden. Nach dem Lyophilisieren wurden 438 mg Eonjugat erhalten.

Beispiel 2.4

N- (4' -Carboxy-n-butyl) -diphenylhydantoin-Kon.iugat an Rinders erumalbumin

0,7 g N -(4'-Carbo:xy-n-butyl)-diphenylhydantoin wurden in 30 ml Methylenchlorid, dem 5 ml Oxalyl chlor id zugesetzt waren, bei 0° gelöst. Es wurden 3 Tropfen DMi¹ als Katalysator zugesetzt. Nach zweistündigem Rühren wurde das Lösungsmittel abgedampft, und der Rückstand wurde in 25 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wurde dann zu 2,8 g trockenem Gelite gegeben, und das Lösungsmittel wurde abgedampft.

Zu 0,64 g RSA in 50 ml Wasser wurde der wie vorstehend behandelte Gelite anteilsweise zugegeben, wobei der pH-Wert mit wäßriger Natriumcarbonatlösung auf 9»5 bis 10,5 gehalten wurde. Eine kleine Menge zusätzliches Wasser war nötig, um den Gelite hineinzuwaschen. Nachdem die Umsetzung kurze Zeit durchgeführt worden war, wurde das Gemisch filtriert, und das Endvolumen von etwa 100 ml wurde in zwei Anteile geteilt, wobei jeder viermal gegen 0,1m-Natriumcarbonat und 0,1 m-Natriumbicarbonat und anschließend dreimal gegen destilliertes Wasser dialysiert wurde. Nach dem Lyophilisieren wurden 500 mg eines Eonjugats isoliert, das nach der UV-Analyse eine Haptenzahl von 23 hatte.

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Beispiel 2.5

Methyl- (2- (N^ - diphenylhydant ο inyl) -äthoxy) -acetimidat-Konn'ugat an Rinderserumalbumin

Es wurden unter Stickstoff in 20 ml Methanol 335 mg (2-(N^ Diphenylhydantoinyl)-äthoxy)-acetonitril und 5 mg 50 %iges Natriumhydrid gelöst, und die Lösung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Mach dem Hindurchleiten von gasförmigem Kohlendioxid durch das Gemisch über einen Zeitraum von 20 Minuten wurde das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft. Der Kickstand wurde in 8 ml Carbitol gelöst und einer genährten Lösung von 500 mg ESA in 20 ml Wasser bei Raumtemperatur zugesetzt, wobei der pH-Wert mit In-Natriumhydroxidlösung auf etwa 9»5 bis 10,0 gehalten wurde. Nachdem der pH-Wert 2,5 Stunden innerhalb dieses Bereichs gehalten worden war, wurde das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde dann bei 18.000 U/min. 20 Minuten zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Nach fünfmaligem Auswechseln des Wassers bildete sich ein flockenförmiger Niederschlag, der abzentrifugiert wurde, worauf die überstehende !flüssigkeit isoliert und lyophilisiert wurde, wobei 340 mg Produkt erhalten wurden. Die Haptenzahl nach der UV-Analyse betrug 37.

Beispiel 2.6

Konjugation von 5~Cp-0arboxymethoxyphenyl)-5~phenylhydantoin an RSA

Eine Lösung von 500 mg der Saure von Beispiel 1.6 in 5 trockenem Methylenchlorid wurde auf 0° abgekühlt, worauf 4· Tropfen trockenes DME¹ und anschließend 1,5 ml Oxalylchlorid zugesetzt wurden, was zu einer kräftigen Reaktion ührte. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten abgekühlt, worauf nochmals 1,5 ml Oxalylchlorid und schließlich nochmals 2 ml Oxalylchlorid zugesetzt wurden. Nach einstündigem Rühren,

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wobei das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen gelassen wurde, wurde die Hauptmenge des Lösungsmittels im Abzug mit einem Sauggebläse entfernt. Der Kolben wurde mehrmals mit je 50 ml Methylenchlorid zur Trockne ausgedampft, dann wurden 2,5 g unter Vakuum getrocknetes Celite, suspendiert in 25 ml Methylenchlorid, dem Säurechlorid zugesetzt, damit 0,5 Stunden verrührt und auf einer Buchi-Vorrichtung/zu einem trockenen Pulver eingedampft.

(Drehverdampfer)
Eine Lösung von 500 mg RSA in 5 ml destilliertem Wasser wurde auf 0° abgekühlt und mit konzentrierter ITatriumcarbonatlösung auf einen pH-Wert von 9»5 eingestellt, worauf die Celite-Säurechlorid-Suspension anteilsweise zugesetzt wurde, wobei der pH-Wert mit Hilfe eines pH-Meters überwacht wurde. Nach Bedarf wurde Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH-Wert zwischen 9 »25 und 9 »50 zu halten. Nach der vollständigen Zugabe des Celites wurde der pH-Wert stabil. Die Lösung wurde 1 Stunde bei 0° gehalten, dann durch einen Sinterglastrichter filtriert, in einen Dialysebeutel eingefüllt und jeweils gegen 4 Liter O^m-Fatriumcarbonat/Ojim-lTatriumbicarbonat (zweimaliger Wechsel) und destilliertes Wasser (zweimaliger Wechsel) über einen Zeitraum von 3 Tagen dialysiert. Das dialysierte Konjugat wurde lyophilisiert, wobei 480 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Der Konjugationsgrad wurde nach einer Standardkurve bestimmt, wobei das Verhältnis ApcW'Apqo ^zur Bestimmung der Haptenzahl verwendet wurde, die zu 17 bestimmt wurde.

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Beispiel 2.7

Konjugation von 5-(2'-Deoxo-5'-pheixylbarbituryl-5O-pentanal an RSA

Zu einer lösung von 200 mg RSA in 25 ml einer 0,05-molaren Ka₂HPO.-Lösung mit einem pH-Wert von 7?0 wurde eine Lösung von 50 mg des Aldehyds von Beispiel 1.8 in 1 ml DMF gegeben. Diesem klaren Gemisch wurden 40 mg NaCIiBH;, zugesetzt, und das Gefäß wurde bedeckt und der JrVhalt 3 Tage in einem kalten Raum gerührt.

Das klare Gemisch wurde gegen Wasser (4 Liter) dialysiert, wobei nach, dem zweiten Auswechseln des Dialysats ein Fiederschlag im Dialysebeutel auftrat. Nachdem das Dialysat noch zweimal gewechselt worden war, wurde der Niederschlag abzentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde zur Bestimmung der Haptenzahl verwendet. Bei Verwendung der Standardkurve für N-Garboxymethylprimidon wurde eine Haptenzahl von 55 erhalten. Die Lösung wurde lyophilisiert, wobei 79 mg Proteinkonjugat erhalten wurden.

Beispiel 2.8 Eonnugation von 1-Carboxymethylzarontin an RSA

Die Säure von Beispiel 1.9 (70 mg, 0,351 mMol) in 4 ml trockenem DMF wurde auf -30° abgekühlt und mit einem Äquivalent Triäthylamin behandelt, worauf innerhalb von 30 Minuten ein Äquivalent Chlorameisensäureisobutylester zugesetzt wurde. Nach dem Rühren über einen Zeitraum von 45 Minuten wurde das gemischte Anhydrid langsam zu einer Lösung von 300 mg RSA in 20 ml Wasser, dessen pH-Wert auf 8,5 eingestellt war, gegeben. Nach Bedarf wurde verdünntes Hydroxid zusammen mit dem gemischten Anhydrid zugesetzt, um den pH-Wert auf 8,5 zu halten. Der pH-Wert stabilisierte sich nach 30 Minuten, worauf die Lösung mehrmals gegen Wasser in einem kalten Raum erschöpfend dialysiert wurde. Die erhaltene Lösung wurde durch

ein feinporiges Filter filtriert und lyophilisiert, wobei 250 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Es wurde ein Durchschnittswert von 38,5 Haptenen je Mol HSA gefunden.

Beispiel 2.9 Kon.iupation von 2-Garboxyäth.7l-2-methylsuccinimid mit RSA

100,6 mg der Säure von Beispiel 1.10 wurden unter Stickstoff in 2 ml getrocknetem DMi¹ gelöst und auf -20° abgekühlt, worauf ein Äquivalent Triäthylamin zugesetzt wurde. Nach dem Rühren über einen Zeitraum von 30 Minuten wurden 71/Ul Chlorameisensäureisobutylester zugesetzt und das Gemisch wurde weitere 30 Minuten gerührt. Das gemischte Anhydrid wurde langsam zu 300 mg ESA in 20 ml Wasser mit einem pH-Wert von 8,5 zugesetzt, wobei sich der pH-Wert erhöhte. Es bildete sich langsam ein Niederschlag, wobei der pH-Wert allmählich abnahm. Die Zugabe des gemischten Anhydrids wurde fortgesetzt, und der pH-Wert wurde über einen Zeitraum von 1,5 Stunden überwacht. Die Lösung wurde in einem kalten Raum über Nacht gerührt.

Am Morgen war die Lösung vollständig klar. Sie wurde in einen Dialysebeutel gefüllt und gegen 4 Liter Bicarbonatpuffer und dann mehrmals gegen Wasser über einen Zeitraum von 2 Tagen dialysiert. Die erhaltene klare Lösung wurde durch ein feinporiges Filter filtriert und lyophilisiert, wobei 270 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Es wurde eine Haptenzahl von 42,5/RSA bestimmt.

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Beispiel 3.1

Es wurde eine Reihe von Umsetzungen durchgeführt, wobei gemischte Anhydride von Hapten-Carbonsäuren mit Carbitylcarbonat verwendet wurden. Es wurde eine allgemeine Arbeitsweise zur Herstellung des gemischten Anhydrids angewendet. Die nachstehende Arbeitsweise ist als Beispiel angegeben.

In ein Reaktionsgefäß wurden 0,5 ml Dimethylformamid (DMF), 0,055 mMol der Haptensäure und 6,95/U.l Triäthylamin eingefüllt und auf -10° abgekühlt. Dieser Lösung wurden dann 8,5/ill Ghlorameisensaurecarbitylester zugesetzt, das Gemisch wurde auf 0° erwärmt um
es gebrauchsfertig war.

wurde auf 0° erwärmt und 45 Minuten stehengelassen, wonach

Die anderen gemischten Anhydride wurden in entsprechender Weise unter Verwendung von äquimolaren Mengen in praktisch den gleichen Konzentrationen in den gleichen Lösungen hergestellt.

Eine allgemeine Arbeitsweise wurde zum Konjugieren des gemischten Anhydrids mit Glucose-ö-phosphat-Dehydrogenase angewendet. Diese Arbeitsweise ist wie folgt:

In ein Reaktionsgefäß wurde eine wäßrige, gepufferte Lösung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Giucose-6-phosphat und NADH eingefüllt. Dem Gemisch wurde dann Carbitol und anschließend ein Aliquot der vorstehend beschriebenen Anhydridlösung zugesetzt, und zwar mit Hilfe einer Spritze, deren Nadel sich unterhalb der Oberfläche befand. Nach Bedarf wurde Alkali zugesetzt, um den pH-Wert auf etwa 9!+O,5 zu halten. Nach Beendigung der Umsetzung wurden die Niederschläge bzw. Trübungen durch Zentrifugieren der Probe praktisch vollständig entfernt. Die Analyse wurde nach der im nächsten Beispiel beschriebenen Arbeitsweise durchgeführt. Die nachstehende Tabelle zeigt die verwendeten Substanzen und die prozentuale Desaktivierung und Inhibierung.

5C9863/1O31

Tabelle I

Hapten

Primidone -R-

N-R- -GH₂-

Gemischte Anhydride

Enzym- G-6-PDH Hapten NADH G-6-P Gesamt- Gesamte Puffer Temp. Dia- Desaktikonz. VoI Konz. VoI Carbitol zugesetzte lyse vierung

mg/ml ml Mol yu mg mg % v/v Base

pH·

⁰C

1,73

0,187 13

1,95 .2,5 0,19 -GH₂GH₂CH₂CH₂-0,955 0,959 0,38

-GH₂CH₂OCH₂- 0,955 0,5 0,2

0,0 TrisO,O55 0 ja

30 20 10 24 9*** 8,5 TrisO,O55 0 nein 4- 9,9 5,25 24 116 9,5 PO₄ 0,01 0-4 nein

15⁺ 20 10 17 Tropfen* 9 PO^ 0,01 0 ja

-GH(CH₃)CH₂- 1,46 0,5 0,2 9,5 19,8 10,5

TrisO,O55 0

60

Inhibierung

57

55	80
90	50
73	52
59	53

*** In-FaOH

+ DMP

++ 0,055 Tris-Puffecr - pH 7,9, 4 χ gewechselt

¹ bei Beendigung der Umsetzung

cn

Beispiel 5.2

Es wurde folgende allgemeine Arbeitsweise zur Konjugation angewendet: Handelsübliches G-6-PDH (4-,19 mg/ml, Beckman Microbics) wurde gegen O,O55m-Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7»9 dialysiert. Die erhaltene dialysierte Enzymlösung wurde dann zur Umsetzung verwendet. Ein Aliquot der Enzymlösung wurde in eine Glasampulle eingefüllt, die mit einem kleinen magnetischen Rührstab und einer pH-Elektrode versehen war; bei Anwendung von verminderten Temperaturen wurde die Ampulle in einem Eisbad gekühlt. Der gerührten Lösung wurden in fester Form IADH und Glucose-6-Phosphat zugesetzt. Dann wurden der gerührten Lösung mit Hilfe einer Spritze, deren Nadel unter die Elüssigkeitsoberflache eintauchte, langsam ausreichend Carbitol zugesetzt, um die gewünschte Menge an Hilfslosungsmittel zu liefern. Zu dieser gerührten Lösung wurde dann mit Hilfe einer Spritze in der gleichen Weise wie das Carbitol das modifizierte Hapten als Carbityloxycarbonylester in Carbitol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann inkubiert, wobei Aliquots entnommen wurden, anschließend verdünnt, worauf die Geschwindigkeiten hinsichtlich der Desaktivierung und der Inhibierung durch einen Überschuß an Antikörper bestimmt wurden.

Die nachstehende Tabelle zeigt die jeweils verwendeten Substanzmengen, die Temperaturen und Zeiten sowie die prozentuale Desaktivierung und die prozentuale Inhibierung.

Die Analysenmethode zur Bestimmung der prozentualen Desaktivierung und der prozentualen Ihhibierung ist wie folgt: 2 Volumteile einer 0,1-molaren HAD-Lösung mit einem pH-Wert von 5-6 werden mit 3 Volumteilen einer 0,11-molaren Glucose-6-Phosphat-Lösung in 0,055-molarem Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7»9 vereinigt. Ein Aliquot aus dem Konjugations-Reaktionsgemisch wird im Verhältnis 1:1000 mit dem vorstehend

SO 9883/1031

angegebenen Puffer verdünnt. Die Analysenlösung wird aus 50/Ul der G-6-P-lTAD-Lösung, 750/Ul Puffer, 50/al Puffer oder pufferhaltigem Antikörper (je nachdem, ob die Desaktivierung oder Inhibierung bestimmt wird) und 50 ml des Enzymkonjugats oder der Enzymkontrolle hergestellt. Es werden Teile der Pufferlösung verwendet, um eine quantitative Übertragung zu gewährleisten. Die Lösung wird in ein Spektrometer eingesaugt, und die Geschwindigkeit der NADH-Erzeugung wird bei 34-0 nm und 37°C verfolgt. Die Änderung der optischen Dichte je Minute wird zwischen der zweiten und der dritten Minute bestimmt.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben (R ist die verbindende Gruppe zwischen dem nicht-oxo-Oarbonyl und dem Ring).

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Tabelle II - IMIDAT

Diphenyl- Enzym- G-6-PDH Haßten HADH G-6-P Gesamt- Puffer Temp. Zeit Desakti- Inhibie-

hydantoin konz. VoI Konz. VoI Oarbitol vierung rung

mg/ml ml Mol Ai mg mg % v/v Mol % %

IT¹-R-

1,45 1 0,075 100 20 10 24 Tris 0,055 0 5,75 75 70

-OH₂- 2 0,5 0,25 60 19,8 10,45 24 Tris 0,055 4 2 54 83

* Methylester

cn ** Keine Dialyse; sonst wurden die Produkte dialysiert gegen

2 O,O55m-Tris-HCl-Lösung, pH =» 7,9 (viermal gewechselt)

Beispiel 43

Methyl- (N^-diphenylhydantoinyl) -acetimidat-Spinmarkierungssubstanz

Zu einer Lösung von 90 mg (0,28 mMol) von (I) und 44 mg (0,28 mMol) 2,2,5,5-Tetramethyl-3-aminop;7rrolidin-1-oxyl in 2 ml Chloroform wurden 40 mg (0,30 mMol) Triäthylamin-Hydrochlorid gegeben, und die erhaltene Läsung wurde über Nacht stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde unmittelbar auf Platten zur präparativen Dünnschichtchromatographie aufgebracht und mit einem 1:50-Gemisch aus konzentriertem KH. OH und Ithylacetat eluiert. Die gelbe Bande bei R^=O,7 war das gewünschte Produkt, und das abgetragene Material wurde mit dem gleichen Eluierungsmittel (100 ml) eluiert. Nach dem Abdampfen im Vakuum und dem Aufnehmen des Rückstandes in Diäthyläther wurde filtriert, das IFiltrat im Vakuum eingedampft und 1 Stunde in ein Pumpenvakuum (0,05 rom) gestellt, wobei 75

eines glasigen, gelben Rückstandes erhalten wurden. IR(CHCl₃) m 1690 cm"¹ (C=N), Molekulargewicht 448,5.

Beispiel 4.2

5- (p-Carboxymethoxyphenyl) -5-phenylhydantoin-Spinmarkierungssubstanz

1 ml trockenes DMP und 32 mg (0,1 mMol) 5-(p_-Carboxymethoxyphenyl)-5-phenylhydantoin wurden miteinander vermischt und unter einer StickstoffatmoSphäre auf -8° abgekühlt. Nach Zusatz von 17/ul Iriäthylamin trat ein Niederschlag auf. Es wurde 30 Minuten gerührt, worauf 13All Chlorameisensäureisobutylester zurgesetzt wurden und die Lösung bei -8° weitere 30 Minuten gerührt wurde. Dann wurde 1 Äquivalent 2,2,5,5-Q}etramethyl-3-amino-1-oxylpyrrolidin in ein Milliliter trockenem DMi¹ der kalten Lösung unter Rühren zugesetzt, und die Lösung wurde über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen gelassen.

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Das Reaktionsgemisch wurde dann in Wasser gegossen und zweimal mit 100 ml Äther extrahiert. Die organische Schicht wurde mit gesättigter Kochsalzlösung zurückgewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Ätherschicht wurde zu einem Öl eingedampft, das in Chloroform gelöst und auf eine Kieselsäureplatte für die präparative Dünnschichtchromatographie ausgebreitet wurde. Die Entwicklung erfolgte mit 5 % Methanol in Chloroform. Eine Bande bei etwa R^=O,30 wurde mit Aceton extrahiert, und nach dem Eindampfen wurden 24 mg eines Öls erhalten. Nach dem Verreiben mit Hexan und dem Eindampfen wurde ein brauner, wachsartiger fester Stoff erhalten, der nicht kristallisiert werden konnte. Der feste Stoff hatte ein aus drei Linien bestehendes ESR-Spektrum, einen anderen Rp-Wert als das Ausgangs-Spinmarkierungsamin und ein IR-Spektrum, das auf die Bildung des Amids des Spinmarkierungsamins und der Säure zurückzuführen war.

Beispiel 4.5 2- (2' -Carboxyäthyl) -2-meth.ylsuccinimid-Markierunsssub stanz

Eine Lösung von 92 mg der getrockneten Säure in 3 ml getrocknetem DMF wurde auf -20° abgekühlt und mit 1 Äquivalent Triäthylamin behandelt, anschließend nach 30 Minuten mit 1 Äquivalent Chlorameisensäureisobutylester. Das Gemisch wurde 45 Minuten gerührt, bevor 78 mg des Spinmarkierungsamins in 500 /Ul,.DMF zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei -20° gehalten und anschließend über Uacht bei Raumtemperatur gerührt.

Das DMF wurde durch Drehverdampfung im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 4 ml Wasser aufgelöst. Das durch Extraktion mit Äthylacetat erhaltene Öl wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie (Kieselsäure., 15 % Methanol/Chloroform) gereinigt, wobei 50 mg eines gelben Schaumes erhalten wurden. Das Massenspektrum bei 15 eV zeigte einen M^Wert von 324 (berechnetes Molekulargewicht - 324,18). B09883/103 1

Antikörper wurden wie folgt hergestellt: Etwa 10 mg Antigen, gelöst in 1 ml Kochsalzlösung, werden mit 3 ml vollständigem Sreund' schem Adj'uvans kombiniert und an vier verschiedenen Stellen verschiedenen Tieren injiziert. Nach etwa 3 Wochen werden etwa 10 mg des Antigens in 1 ml Kochsalzlösung mit 3 ml unvollständigem ireund¹ schem Adjuvans kombiniert und in der gleichen Weise injiziert. Die Injektionen werden in Abständen von etwa 1 Monat wiederholt, und innerhalb einer Woche nach jeder Injektion werden Blutungen vorgenommen. In einigen Fällen wurden die Antikörpertiter sowie die Bindungskonstante bestimmt. Die nachstehende Tabelle zeigt für Diphenylhydantoin das verwendete Antigen, die Gesamtzahl der Injektionen vor der jeweiligen Blutung und die für die erzeugten Antikörper bestimmten Werte.

Tabelle III

Antigen Tier Blutung Antikörperkonzentration Bindungsstellen

Bindekonstante x10

2,4	1	B	4	0,62
		E	5	4,3
	2	B	2,8	1,8
2,5	3	B	10	4,5
	4	B	4,25	3
			4	12
2,1	5	B	5	1
2,3	6	J	13	4,5
	7	J	5,3	1,1
	7	Έ	8,25	7

1. Bestimmt nach der Spinmarkierungs-Immunoanalysenmethode nach der USA-Patentschrift 3 690 834 unter Verwendung von ΙΓ-2,2,5,5-Tetramethyl-i -oxylpyrrolidinyl-J-N^-diphenylhydantoinylacetamidin als Sp lnmarkierungs sub stanz.

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Bei Verwendung der mit dem Antigen nach Beispiel 2.3 gebildeten Antikörper wurde nur eine geringfügige störende Reaktionsfähigkeit mit einer Anzahl von Drogen mit ähnlicher Struktur wie die von Diphenylhydantoin beobachtet.

Die Analyse wurde wie folgt durchgeführt: Es wurden Reagenslösungen miteinander vereinigt, um ein Verhältnis von Spinmarkierungssubstanz (Moleküle) zu Anti-Diphenylhydantoin (Bindungsstellen) von 1,15*1 zu erzeugen, wobei die Konzentration an Spinmarkerungssubstanz 2,64 χ 10~⁶ Mol in 0,18-molarem Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 betrug. Die Analysenlösungen wurden dann in eine ESR-Kavität eingeführt, und die Höhe der Peaks wurde bestimmt. Es wurden unterschiedliche Drogenkonzentrationen zugesetzt, um die Iquivalentkonzentration für die bestimmte Droge zu bestimmen, die den gleichen Mobilisierungsgrad der Spinmarkierungssubstanz wie Diphenylhydantoin bei einer Konzentration von 1 /Ug/ml geben würde. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Diphenylhydantoin 1 /Ug/ml

p-OH-Diphenylhydantoin 14

Secobarbital 2 ^⁰⁰ Phenobarbital > 100

Glutethimid >100

Die nachstehenden Analysen beziehen sich auf Primidon. Es wurden nach üblichen Methoden Antikörper unter Verwendung des Antigens von Beispiel 2.7 hergestellt. Die Analyse wird wie folgt durchgeführt: Eine 50yul-Probe wird mit 250/ul Pafferlösung (pH-Wert 8,1 bei 25°0; 0,55-molare Tris-HCl; 0,05 Gew.-% NaF₅; 0,005 Gew.-% Thimerosal), die 0,5 % FaCl enthielt, und mit 0,01 % v/v Triton X-100 (Kochsalzpuffer) in einem Becher von 1 ml eingefüllt. Fach der Gleichgewichtseinstellung über 60 Sekunden werden 50 /Ul der obigen Probenlösung in einen zweiten Becher· eingefüllt, dem 50yul Antikörperlösung in einem Puffer mit

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1 Gew.-% Kaninclienserumalbumin, 0,066 Mol Glucose-6-phosphat und 0,4 Mol ITAD (Mononatriumsalz) zugesetzt werden; anschließend werden noch 250yul Kochsalzpufferlösung zugesetzt. Schließlich werden 50 /ul Enzymkonjugat in der Pufferlösung mit 0,9 Gew.-% NaCl und 1 Gew.-% Kaninchenserumalbumin zugesetzt, und anschließend noch 250/ul Puffer. Das Analysengemisch wird in die Spektrometerzelle eingesaugt, und nach einer Verzögerungszeit von 15 Sekunden wird die erste Ablesung und nach 80 Sekunden die zweite Ablesung der spezifischen Absorption vorgenommen. Die Differenz zwischen den Ablesungen wird in Einheiten der optischen Dichte (OD-Einheiten) angegeben. Bei Verwendung von Proben mit bekannter Primidon-Konzentration kann eine Standardkurve angefertigt werden.

Mit dieser Analysenmethode konnten Primidon-Konzentrationen von 2,5 /ug/ml oder weniger zuverlässig im Serum nachgewiesen werden. Bei einer Untersuchung von störenden Reaktivitäten wurden folgende Drogen getestet, wobei die Konzentrationen, die die gleiche Wirkung wie 2,5/Ug/ml Primidon zeigten, nachstehend angegeben sind:

Phenobarbital > 700 /Ug/ml

Secobarbital >1000 /Ug/ml

Mephobarbital >1000 yug/ml

Diphenylhydantoin XlOOO /Ug/ml

Diese Ergebnisse zeigen, daß bei Konzentrationen, die in physiologischen Flüssigkeiten vorkommen, keine falschen positiven Ergebnisse aufgrund der Anwesenheit dieser eng verwandten Drogen auftreten können.

Die neuen Vorstafen gemäß der Erfindung ergeben stabile Konjugate, die mit hohen Haptenzahlen gebildet werden können.

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Bei der Injektion der Antigene in Säugetiere werden Antikörper mit hohen Titern und einem hohen Grad an Spezifität hinsichtlich der interessierenden Verbindung oder Verbindungen erzeugt. Weiterhin können die Verbindungen mit Detektormolekiilen, z.B. stabilen freien Radikalen und Enzymen, konjugiert werden, so daß Reagenzien erhalten werden können, die in Kombination mit den Antikörpern njamunoanalysen mit hoher Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit ergeben. Die Enzymkonjugate und die freien Radikalkongugate sind in der Lage, mit der zu analysierenden Droge in Wettbewerb zu treten, so daß Analysen durchgeführt werden können, die hinsichtlich der interessierenden Droge sehr spezifisch sind und die keinen falschen Ergebnissen aufgrund der Bindung der Antikörper an andere als die interessierende Verbindung unterliegen.

Die Erfindung wurde in einigen Einzelheiten zur Erläuterung beschrieben; es können zahlreiche Änderungen und Abwandlungen im Rahmen des Schutzumfanges der Patentansprüche vorgenommen werden.

- Patentansprüche -

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Claims

D ist ein Poly-(Aminosäure)-Antigen, das über Aminogruppen gebunden ist; oder bedeutet D¹ (CCU) , worin ρ O oder 1 ist, mit der Maßgabe, daß ρ = O ist, wenn X kein Sauerstoff ist; daß für ρ =0, D¹ Wasserstoff,' Halogen, Hydroxy oder ein gesättigter aliphatischer oder heterocyclischer organischer Rest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und 1 bis 6 Sauerist

stoffatomen, welcher ausschließlich aus Kohlenstoff, Sauerstoff und wasserstoff zusammengesetzt ist, wobei dieser Sauerstoff als Qxysauerstoff vorliegt, und wobei dieser Rest über Sauerstoff an nicht-oxo-Carbonyl, einschließlich den Stickstoff- und Schwefel-Analogen gebunden ist; für ρ = 1 ist D¹ der genannte gesättigte aliphatische oder

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heterocyclische organische Rest;

eines von X und X^ ist eine Bindung, wobei X, wenn es keine Bindung ist, Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe von 1 bis 2 Kohlenstoffatomen bedeutet; und χ ist eine Hienylgruppe, wenn oc eine Iminogruppe ist, bzw. eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wenn eine Methylengruppe ist, bzw. eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Ehenylgruppe, wennrt eine Carbamoylgruppe ist; m ist 0 oder 1, wenn D ein Antigen ist, sonst nur 1; und η ist 1, wenn D kein Antigen ist, und 1 bis diejenige Zahl, die erhalten wird, wenn das Molekulargewicht des Antigens durch 1000 geteilt wird, wenn D das Antigen ist.
2. Antigenkonjugat mit der Formel

Antigen \ —NH (C)

worin die Symbole folgende Bedeutungen haben: X ist Chalcogen oder Imino;
Antigen ist ein Poly-(Aminosäure)-Antigen; m' ist 0 oder 1;

E' ist eine verbindende Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Heteroatomen;

n¹ ist 1 bis das Molekulargewicht des Antigens, geteilt durch 1000;

eines von X und Ir ist eine Bindung; wenn es keine Bindung ist, ist Ir eine Rienylgruppe und X Wasserstoff.

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3. Antigenkonjugät mit der Formel

Antigen \—

worin die Symbole folgende Bedeutungen haben: X ist Chalcogen oder Imino; Antigen ist ein Poly-(Aminosäure)-Antigen; m' ist 0 oder 1; E¹ ist eine verbindende Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Heteroatomen; n¹ ist 1 bis zum Molekulargewicht des Antigens, geteilt

durch 100Q;

1
X ist eine Methyl- oder Athylgruppe; eines von Ί? und χ ist eine Bindung; wenn es keine Bindung ist, ist ι¹" die andere Methyl- oder Äthylgruppe, und Ί? ist Wasserstoff.
4. Antigenkonjugat mit der lOrmel

Antigen {—NH (C)

R'—

worin die Symbole folgende Bedeutungen haben:

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X ist Ghalcogen oder Imino;
Antigen ist ein Poly-(Aminosäure)-Antigen; m¹ ist 0 oder 1;

E¹ ist eine verbindende Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen rind 0 bis 1 Heteroatomen;

n¹ ist 1 bis zum Molekulargewicht des Antigens, geteilt durch 1000;

eines von Y^ und T* ist eine Bindung; wenn es keine Bindung ist, ist lP Wasserstoff und x³ eine Phenyl- oder Äthylgruppe; und
X^ ist die andere Phenyl- oder Äthylgruppe.
5. Verbindung mit der Formel

ο ¹X / ^γ

D¹ ' (CO) — C-R¹-

-OC

worin die Symbole folgende Bedeutungen haben: X ist Chalcogen oder Imino;
R' ist eine verbindende Gruppe;

M ist eine Phenyl- oder niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, und zwar eine niedere Alkylgruppe, wenn at-eine Methylengruppe ist;
Z ist Ή.2 oder Sauerstoff;

c*-ist eine Imino-, Methylen- oder Carbamoylgruppe, wobei eine Imino- oder Methylengruppe vorliegt, wenn Z Sauerstoff ist und eine Carbamoylgruppe vorliegt, wenn Z H^ ist; eines von Y und I^ ist eine Bindung; wenn es keine Bindung ist, ist Y Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe mit

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1 bis 2 Kohlenstoffatomen; und χ ist eine Phenylgruppe, wenn ex eine Iminogruppe ist, eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wenn ot eine Methylgruppe ist, und eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe, wenn tX eine Carbamoylgruppe ist;

p¹ ist 0 oder 1, und zwar 0, wenn X kein Sauerstoff ist; D¹¹ ist Wasserstoff, Hydroxy oder Halogen, mit der Maßgabe, daß p = 0 und X = Sauerstoff ist; oder ein gesättigter aliphatischer oder heterocyclischer Rest, der ausschließlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff zusammengesetzt ist und der 1 bis 12 Kohlenstoffatome und 1 bis 6 Sauerstoffatome enthält und der über Sauerstoff mit der Carbamoylgruppe oder mit C=X verbunden ist.
6. Antikörper, der durch eine Immunreaktion mit einem Antigen nach Anspruch 1 verbunden ist.

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