DE2649903A1

DE2649903A1 - Dibenz eckige klammer auf b,f eckige klammer zu azepin-verbindungen und damit erzeugte antikoerper

Info

Publication number: DE2649903A1
Application number: DE19762649903
Authority: DE
Inventors: Prithipal Singh
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1976-01-12
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1977-07-14
Also published as: JPS5287223A; JPS6290536A; US4058511A; FR2337556B1; JPS64662B2; FR2337556A1; JPS6217187B2; GB1567768A; CA1059907A

Description

DibeiizCb^lazepin-Verbindungen und damit erzeugte Antikörper

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Derivaten von kleinen Eapt en- Verb indungen für die Verwendung in Konjugation (in Verbindung) mit Antigen-Materialien zur Herstellung von Antigenen, die nach dem Einspritzen in Wirbeltiere die Bildung von Antikörpern hervorrufen, die eine hohe Spezifität für die Jeweilige Hapten-Verbindung aufweisen.

Es gibt zwar bereits eine Eeihe von verschiedenen Möglichkeiten zur Unterscheidung einer Verbindung von anderen Verbindungen nit einer ähnlichen Struktur, eine der vielseitigsten und genauesten davon ist aber die Verwendung eines Antikörpers, der für eine bestimmte Struktur spezifisch ist. Das heißt, die Bindung3konstante des Antikörpers mit einer spezifischen Verbindung ist wesentlich höher als seine Bindungskonstante mit anderen Verbindungen einer ähnlichen Struktur. Es ist

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bereits eine große Anzahl von verschiedenen Immunoassays (immunologischen Nachweisverfahren) entwickelt worden, in denen diese Fähigkeiten der Antikörper ausgenutzt werden.» Zu den Immunoassays, die technische Anwendung gefunden haben, gehören die homogenen Enzym-Immunoassays, die Spinmarkierungs-Immunoassays, die Radioimmunoassays und die Hämagglutination. Mit Ausnahme der zuletzt genannten Methode hängt jeder der Immunoassays von der Konkurrenz zwischen dem Arzneimittel, das bestimmt werden soll, und einem an eine Nachweissubstanz gebundenen Arzneimittel ab«,

Da die interessierende Verbindung nur modifiziert wird zur Herstellung des Antigens, muß bei dieser Modifizierung der Einfluß auf die Strukturspezifität des Antikörpers in Betracht gezogen werden. Das heißt, die Auswahl einer Konjugationsstelle (Verbindungsstelle) zwischen dem Arzneimittel und dem Antigen muß so getroffen werden, daß das dabei erhaltene Produkt Antikörper ergibt, die das ursprüngliche Arzneimittel erkennen lassen. Der Antikörper muß nicht nur das ursprüngliche Arzneimittel erkennen lassen, sondern eine signifikante Charakteristik des Arzneimittels darf nicht so verändert werden, daß der Antikörper Verbindungen erkennen läßt, die mit dem interessierenden Arzneimittel nahe verwandt sind. Außerdem sollte das Konjugat zwischen dem Arzneimittel und dem Antigen hohe Titer an dem interessierenden Arzneimittel und hohe Bindungskonstanten für das interessierende Arzneimittel ergeben.

Ein zusammenfassender Artikel über Dibenzazepinverbindungen ist in "Chemical Reviews", 2£, 101 (1974-), zu finden. In der US-Patentschrift 2 948 718 sind Dibenzazepin-Derivate beschrieben, die pharmakologische Eigenschaften aufweisen«,

Gegenstand der Erfindung sind neue Dibenz[b,f]azepin-Verbindungen, die an Antigen-Materialien, insbesondere Polypeptide und

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Proteine, über eine oxoaliphatische Gruppe gebunden sind, wobei die CteogrupOe an das Antigen und die Alkylgruppe an das Stickstoffatom einer Carbamoylgruppe gebunden sind, die ihrerseits an das Stickstoffatom des Azepinringes gebunden ist. Beim Einspritzen in Wirbeltiere rufen diese Verbindungen, wie gefunden wurde, die Bildung von Antikörpern mit einer hohen Spezifität gegenüber dem Arzneimittel Tegretol·-^ (Carbamazepin) hervor. Diese Verbindungen werden hergestellt durch Umsetzung des Dibenzazepine mit Phosgen und anschließende Umsetzung mit einem Aminoalkohol. Der Alkohol wird zu einer Oxogruppe oxydiert, die dann über Amid- oder Alkylamin-Brückenbindungen an ein geeignetes Antigen, insbesondere ein PoIypeptid oder Protein, gebunden (konjugiert) werden kann.

Bei den erfindungsgemäßen Präparaten (Verbindungen) handelt es sich um N-Derivate von Garbamazepin mit einer Oxo-Funktion, z.B. Aldehyd oder Carboxy, die über eine aliphatisch^ Kette mit mindestens 1 und nicht mehr als etwa 8, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Heteroatom, bei dem es sich um ein Ohalcogen oder Stickstoff, insbesondere um ein Heteroatom mit der Atomzahl 7 "bis 8 handelt, gebunden ist, v/ob ei der Sauerstoff in der Oxy-Form in der Kette und der Stickstoff frei von Wasserstoffatomen vorliegen. Das Carboxyderivat wird in erster Linie durch Peptid-Bindungen an ein Antigen, wie z.B₀ ein Polypeptid oder Protein, gebunden und das Aldehydderivat wird durch reduktive Aminierung über Alkylaminbindungen gebunden. Die konjugierten (verbundenen) Antigene werden einem Wirbeltier, insbesondere einem Haustier, eingespritzt, um Antikörper zu gewinnen. Nach wiederholtem Einspritzen nach einem vorher festgelegten Programm können die Antikörper aus dem Serum gewonnen und in dem Zustand, wie sie erhalten werden, verwendet oder weiter gereinigt werden, um die interessierenden Antikörper zu konzentriereno

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■<o

Die erfindungsgemäßen Präparate (Verbindungen) haben zum größten Teil die folgende allgemeine Formel

ONHR-(GO)_m-

worin bedeuten:

m die Zahl O oder 1,

R eine verbindende (brückenbildende) Gruppe, vorzugsweise eine aliphatische verbindende Gruppe mit O bis 8 Kohlenstoffatomen und O bis 1 Heteroatom (Chalcogen und Stickstoff, vorzugsweise Sauerstoff und Stickstoff, besonders bevorzugt Sauerstoff), wobei der Sauerstoff in der Oxy-IOrm und der Stickstoff frei von Wasserstoffatomen vorliegen, wobei in der Kette mindestens 2 Kohlenstoffatome zwischen Heteroatomen angeordnet sind, die verzweigtkettig oder geradkettig (unverzweigt), vorzugsweise geradkettig, sein kann und O bis 1 " äthylenische Unsättigung als einzige aliphatische Unsättigung aufweist, mit der Maßgabe, daß R mindestens 2 Kohlenstoffatome aufweist, wenn m » 0,

Z Wasserstoff, Hydroxyl, AUoxyl mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkylcarbonat (OGO₂A, worin A eine Alkylgruppe mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4-Kohlenstoffatomen darstellt), Uxtrophenoxy, insbesondere p-Mtrophenoxy, oder Y, wobei Y eine Poly(aminosäure), z.B. einen Polypeptidrest (einschließlich der PoIy-

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peptiduntereinheiten von Proteinen) darstellt, und

η die Zahl 1, jedoch mit der Ausnahme, daß dann, wenn Z Y bedeutet, η gleich der Anzahl der Acylgruppen ist, die an die Amino- und Eyrosin-G-ruppen von Z gebunden sind, wobei η eine Zahl von mindestens 1 darstellt und nicht größer ist als die Anzahl der funktionellen Amino- und Q}.yrosin-Gruppen, die für die Bindung zur Verfügung stehen, in der Regel nicht größer ist als das Molekulargewicht von Y, geteilt durch 500, vorzugsweise nicht größer ist als das Molekulargewicht von Y, geteilt durch 1500, und in der Regel mindestens 1/100 000 des Molekulargewichts beträgtο

Zu bevorzugten Gruppen R gehören Alkylen, Alkenylen, Alkylenoxyalkylen (worin die Alkylengruppen durch mindestens zwei Kohlenstoffatome voneinander getrennt sind), N-Niedrigalkyl (mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen), Alkylenaminoalkylen (worin die Alkylengruppen durch mindestens zwei Kohlenstoffatome voneinander getrennt sind). Bei den hauptsächlich interessierenden Verbindungen handelt es sich um solche, in denen Z Y bedeutet, und/als Antigene verwendet werden, wobei Y eine Antigen-PoIy(aminosäure) darstellt. Diese Verbindungen haben größtenteils die folgende allgemeine Formel

W
COMffi¹-(CO) -

'm

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worin bedeuten:

m die Zahl O oder 1,

R eine Bindung oder einen aliphatischen Rest mit 1 "bis 8, vorzugsweise 2 "bis 6, normalerweise mindestens 2 Kohlenstoffatomen, wenn m = O, der O oder 1 äthylenische Unsättigung als einzige Unsättigung und O oder 1 Heteroatom, bei dem es sich um Sauerstoff und Stickstoff handelt, das in der Regel nur an Kohlenstoff gebunden ist, insbesondere der Sauerstoff in der Oxy-Form in der Kette, aufweist und verzweigtkettig oder geradkettig (unverzweigt), vorzugsweise geradkettig sein kann, ivie z_eB. Polymethylen,

Y eine Antigen-Poly(aminosäure) mit einem Molekulargewicht von mindestens 1000, vorzugsweise von mindestens 10 000, das auch 10 Millionen oder mehr betragen kann, im allgemeinen jedoch etwa 500 000 nicht übersteigt, und

η eine Zahl von mindestens 1, in der Regel von größer als 1, die jedoch im allgemeinen das Molekulargewicht von Y , geteilt durch 500, vorzugsweise geteilt durch lOOOund besonders bevorzugt geteilt durch etwa 2000,nicht übersteigt und die mindestens gleich dem Molekulargewicht von Y ν geteilt durch 100 000, vorzugsweise dem Molekulargewicht von Y , geteilt durch 50 000, entspricht«, Bei Antigenen mit einem mittleren Molekulargewicht beträgt bei denjenigen mit Molekulargewichten innerhalb des Bereiches von 20 000 bis 1 Million die Zahl η im allgemeinen bis zu etwa 250, vorzugsweise 4- bis 10O₀ Bei Antigenen mit einem niedrigen Molekulargewicht (Molekulargewicht 1000 bis 5000) beträgt die Zahl n¹ etwa 1 bis etwa 10, vorzugsweise 2 bis 5»

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Wie oben angegeben, sind die Verbindungen von besonderem Interesse, in denen die Oxocarbonylgruppe (zu unterscheiden von der Ketogruppe) und die Nicht-Oxocarbonylgruppe an eine Amino gruppe gebunden sind, die Teil einer Polypeirbid- oder Proteinstruktur ist. Eine Gruppe von Polypeptiden und Proteinen ist antigen, so daß durch Bindung des Carbonylderivats von Dibenzazepin an das Polypeptid oder Protein mit Dibenzazepin Antikörper gebildet werden können. Eine engere Klasse von Proteinen, die ebenfalls als Antigene verwendet werden können, die jedoch normalerweise nicht als solche verwendet werden, sind Enzyme, die als Fachweissubstanz in einem Immunoassay-System verwendet werden. Als Antigene können inaktive Enzyme verwendet werdenο

Polypeptide (sie werden hier allgemein als Poly(aminosäure) bezeichnet) umfassen in der Regel etwa 2 bis etwa 100 Aminosäure einheit en (mit einem Molekulargewicht von üblicherweise weniger als etwa 12 00O)₀ Größere Polypeptide werden üblicherweise als Proteine bezeichnete Proteine bestehen in der Regel aus 1 bis 20 Polypeptidketten, die als Untereinheiten bezeichnet werden und durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen miteinander verbunden sind«, Die Untereinheiten bestehen normalerweise aus etwa 100 bis etwa 300 Aminosäuregruppen (oder haben ein Molekulargewicht von 10 000 bis 35 000) _o Der hier verwendete Ausdruck "Poly(aminosäure)" umfaßt sowohl die einzelnen Polypeptideinheiten als auch die Polypeptide, die Untereinheiten der Proteine darstellen, unabhängig davon, ob diese nur aus Polypeptideinheiten oder aus Polypeptideinheiten in Kombination mit anderen funktionellen Gruppen, wie z.B. Porphyrinen,bestehen, wie in Hämoglobin oder Gytochromoxydase₀

Die Anzahl der Dibenzazepingruppen variiert in Abhängigkeit davon, ob die PoIy(aminosäure) ein Enzym oder ein Antigen ist. Die maximale Anzahl von Gruppen ist beschränkt durch den Einfluß der Substitution auf die Löslichkeit, die Aktivität und

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dgl. Für die Bildung von Antikörpern sollte eine ausreichende Anzahl von Dibenzazepingruppen vorhanden sein, um eine befriedigende Ausbeute an Antikörpern für das Dibenzazepin zu ergeben» Wenn dies nicht der Fall ist, kann der Mengenanteil von Antikörpern für Dibenzazepin im Vergleich zu den Antikörpern für andere Verbindungen unerwünscht niedrig sein.

Die erste Gruppe von Proteinmaterialien oder Polypeptiden, die hier betrachtet werden, sind die antigenen Polypeptide (Antigen-Polypeptide)o Diese können über eine Aminogruppe an die Carbonylgruppe des Dibenzoazeninanalogons gebunden sein_o Das Produkt kann zur Bildung von Antikörpern für Dibenzazepin verwendet werden. Die Proteinmaterialien, die verwendet werden können, variieren stark und haben normalerweise ein Molekulargewicht von 1000 bis 10 Millionen,vorzugsweise von 20 000 bis 500 00O₀

Enzyme haben normalerweise Molekulargewichte innerhalb des Bereiches von etwa 10 000 bis etwa 600 000, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von etwa 12 000 bis etwa 150 000, besonders bevorzugt innerhalb des Bereiches von 12 000 bis 80 000. Einige Enzyme weis en eine Vielzahl von Enzym-Untereinheiten aufο Wenn hier von Enzym-Molekulargewichten die Rede ist, so beziehen sich diese auf das gesamte Enzym,, V/enn die Markierung nicht auf eine spezifische Aminogruppe begrenzt ist, liegen im Durchschnitt mindestens etwa ein Dibenzazepin pro Enzym, in der Regel mindestens etwa zwei Dibenzazepine pro Enzym und seHtetimehr als 4-0 Dibenzazepine pro Enzym, in der Regel nicht mehr als 30 Dibenzazepine pro Enzym vor» So liegt "beispielsweise bei Lysozym die durchschnittliche Anzahl der Dibenzoazepingrupoen innerhalb des Bereiches von etwa bis etwa 5» Bei Glukose-6—phosphat-dehydrogenase liegt die durchschnittliche Anzahl innerhalb des Bereiches von 2 bis

Obgleich die Dibenzazepin-Analoga über die Nicht-Oxocarbonylgruppe an Hydroxyl- oder Mercaptogruppen, die in den Proteinen

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vorhanden sind, gebunden sein können, erfolgt die Bindung meistenteils über die Aminogruppe_o Deshalb werden die Verbindungen als Amide beschrieben, obgleich auch Ester und Thioester vorhanden sein können« Das Aldehydderivat wird nur gebunden an Amino unter Bildung von Alkylamingruopen durch reduktive Aminierung.

Zu Aminosäuren, die in Proteinen vorhanden sind, die freie Aminogruppen für die Bindung an das Carboxy-modifizier-te Dibenzazepin aufweisen, gehören Lysin, N-endständige Aminosäuren und dglc Zu den Hydroxyl und Mercaptan enthaltenden Aminosäuren gehören Serin, Cystein, Tyrosin und Threonin.

Als antigenes Material (Antigen-Material) können verschiedene Protein- und Polypeptid—Typen verwendet werden. Zu diesen Typen gehören Albumine, Enzyme, Serumproteine, wie Globuline, Augenlinsenproteine, Lipoproteine und dgl„ Zu Beispielen für Proteine gehören Rinderserumalbumin, Keyhole limpet-Hämocyanin, Eialbumin, Rindergammaglobulin und dgl_o Es können auch kleine neutrale Polypeptide, die immunogen sind, wie Gramicidine, verwendet werden. Auch verschiedene synthetische Polypeptide können verwendet werden, wie z.B_e Polymere von Lysin, Glutaminsäure, Phenylalanin, Tyrosin und dgl., entweder allein oder in Form von Kombinationen,, Von besonderem Interesse ist Polylysin oder eine Kombination aus Lysin und Glutaminsäure« Jedes synthetische Polypeptid muß eine ausreichende Anzahl von freien Aminogruppen enthalten, wie sie beispielsweise durch Lysin bereitgestellt werden.

Die zweite Gruppe von Proteinmolekülen sind die Nachweissubstanzen (Detektoren). Dabei handelt es sich um die Enzyme, mit denen das öarbohyl-modifizierte Dibenzazepin verbunden (konjugiert) sein kanne Wie angegeben, eignet sich das mit Dibenzazepin modifizierte Enzym für Immunoassays (immunologische Jfachweisverfahren) _o Nachfolgend wird die Immunoassay—

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Technik näher beschriebene

Es können verschiedene Enzyme verwendet werden, wie z.B„ Peptidasen, Esterasen, Amidasen, Phosphorylasen, Carbohydrasen, Oxydasen, wie Dehydrogenase, Reduktasen und dgl_o Von besonderem Interesse sind Enzyme, wie Lysozym, Peroxydase, oc-Amylase, Dehydrogenasen, insbesondere Maleatdeh^drogenase und Glukose-6-phosphat-dehydrogenase, alkalische Phosnhatase, ß-Glukoronidase, Gellulase und Phospholipase. Entsprechend der I.UoB.-Klassifikation handelt es sich bei den interessanten Enzymen um: 1. Oxidoreduktasen, insbesondere der Gruppen 1.1.und bevorzugt der Gruppen 1.1.1 und 1.11, besonders bevorzugt der Gruppen 1.11.1, und 3· Hydrolasen, insbesondere 3.2 und besonders bevorzugt 3ο2.1.

Die substituierten Enzyme haben zum größten Teil die folgende allgemeine Formel

worin bedeuten:

m und R die oben angegebenen Bedeutungen,

Y ein Enzym, das an einer anderen Stelle als dem aktiven Zentrum substituiert ist und mindestens 3Oi vorzugsweise mindestens 50 % seiner ursprünglichen Aktivität vor der Konjugation aufweist, und

in der Regel eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise von 2 bis 35» besonders bevorzugt von 2 bis 14-, ins-

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"besondere von 2 bis 12, die jedoch im allgemeinen durchschnittlich nicht mehr als etwa 60 % der gesamten in dem Enzym verfügbaren Lysingruppen darstellt, obgleich in kleinen Enzymen, wie Lysozym, alle verfügbaren Lysingruppen konjugiert sein können_o

Anstelle eines Enzyms kann als Funktion für den Nachweis in dem Immunoassay ein stabiles freies Radikal verwendet werden.. Bei den stabilen freien Radikalen handelt es sich um cyclische Nitroxide, wobei der Stickstoff des Nitroxids als Ringglied vorliegt, die 0 oder 1 .. anderes Heteroatom, d.h. Sauerstoff und Stickstoff, als Ringglieder aufweisen» Die stabilen freien Radikal-Moleküle, die an die Nicht-Oxocarbonylgruppe der Dibenzazepinderivate gebunden sind, weisen normalerweise 7 bis 16, vorzugsweise 7 bis 12 Kohlenstoffatome auf. Die Aminofunktion kann direkt an das Ringkohlenstoffatom oder über eine aliphatische Kette mit 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 2 Kohlenstoffatomen an den Ring gebunden sein. Die Moleküle können 0 bis 2 äthylenische Unsättigungen, vorzugsweise 0 oder 1 äthylenische Unsättigung als einzige unsättigung enthaltene

Die an das Mcht-Oxocarbonyl des Dibenzazepinderivate gebundenen stabilen Nitroxid-Funktionen haben größtenteils die folgende allgemeine Formel

NH-

worin bedeuten:

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D einen divalenten aliphatischen Rest, der in der Regel aliphatisch gesättigt ist, mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 "bis 3 Kohlenstoffatomen, wobei nur 1 bis 3, "vorzugsweise 2 bis der Kohlenstoffatome in D Ringatome darstellen, und

A niederes Alkyl (mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatomen), vorzugsweise Methyl,,

Bei den Verbindungen handelt es sich größtenteils um Pyrrolidin- oder Piperidinderivate und D steht für Kohlenwasserstoff.

Bei der Herstellung der verschiedenen ATiidprodukte, die erfindungsgemäß verwendet werden, wird die Garbonsäure normalerweise aktivierte Dies kann auf die verschiedenste Art erfolgen< Zwei Arten von besonderem Interesse sind die Umsetzung mit einem Carbodiimid, in der Regel einem wasserlöslichen dialiphatischen oder dicycloalipharischen Carbodiimid in einem inerten polaren Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Acetonitril und HexamethylphosT)horamido Die Umsetzung wird in der Weise durchgeführt, daß man die verschiedenen Reagentien unter milden Bedingungen zusammenbringt und ausreichend lange die Reaktion ablaufen läßt_o

Ein zweites Verfahren besteht darin, unter Verwendung eines Alkylchlorformiats, wie Isobutylchlorformiat, ein gemischtes Anhydrid herzustellen,, Das gemischte Anhydrid xvird hergestellt durch Vereinigen des Carboxy-substituierten Dibenzazepine mit dem Alkylchlorformiat und einem tertiären Amin_o Die Temperatur liegt normalerweise unterhalb Umgebungstemperatur_o

Es wird mindestens eine stöchiometrische Menge des Chlorformiats, bezogen auf das Dibenzazepinderivat, verwendet und in der Regel wird ein Überschuß verwendet, der jedoch in der Regel das Dreifache der stöchiometrischen Menge nicht übersteigt ο Das tertiäre Amin ist in mindestens äoaimolarer Menge

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zu dem Chlorformiat vorhandene

Die Mischung wird dann mit der Aminoverbindung, mit der sie verbunden (konjugiert) werden soll, vereinigt und die Reaktion wird unter milden Bedingungen ablaufen gelassene

Es können auch Ester des Carboxy-modifizierten Dibenzazepins verwendet werden, die in V/asser wirksam sind für die Acylierung von Aminfunktionen_o Eine beispielhafte Hydroxylgruppe ist p-UTitrophenyl, das zur Herstellung des p-Nitrophenylesters verwendet werden kann. Für die Aldehydkonjugation wird eine reduktive Aminierung in einem polaren Lösungsmittel, in der Regel in einem wäßrigen Medium, unter Verwendung von ITatriumcyanoborhydrid als Reduktionsmittel durchgeführt.

Die Antikörper, die als Reaktion (biologische Antwort) auf die erfindungsßemäßen konjugierten Antigene gebildet werden, weisen eine feste spezifische Bindung an das Stamm-Arzneimittel, das konjugierte Antigen, die zum Konjugieren (Verbinden) mit dem Antigen verwendete Verbindung oder ein Derivat davon, die säuremarkierten Verbindungen, wie ein Enzymkonjugat und ein Spinmarki erungs-Kon.iugat, auf.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein_o Die darin angegebenen Temperaturen beziehen sich auf ⁰O₀

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Beispiel 1
N-Chlorcarbonyl-dibenz£b_iAf2azeOin

Zu einer Aufschlämmung von 14,10 g (0,073 Mol) Dibenz[b,f]-azepin in 60 ml trockenem Toluol wurden bei Raumtemperatur 120 ml einer 12,5 %igen Lösung von Phosgen in Benzol (im Überschuß) innerhalb eines Zeitraumes von 4S Minuten zugetropft ο Die dabei erhaltene gelbe Aufschlämmung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, weitere 2 Stunden lang auf Rückflußtemperatur erhitzt und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührte Fach dem Einengen der Reaktionsmischung mit einem Rotationsverdampfer im Abzug erhielt man einen blaßgelben Peststoff, der in 200 ml Benzol aufgenommen und mit Norit-A unter Sieden behandelt wurde. Die heiße Lösung wurde durch Gelite filtriert, auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens eingeengt, auf Raumtemperatur abgekühlt und bis zur Trübung mit Petroläther versetzt; dabei fielen weiße Kristalle des oben genannten Produkts aus, Ausbeute 14,4 g, Ρ» 145 bis 150⁰Oo Nach der Umkristallisation aus Benzol/Hexan erhielt man Nadeln, F. I50 bis 156,5°C_O

Beispiel 2
5-_(N- C 6'

Zu 3,85 g (0,015 Mol) des Säurechlorids (aus Beispiel 1) in 100 ml trockenem Benzol wurden 7,2. g (0,62 Mol) 6-Aminohexa nol, suspendiert in 200 ml trockenem Benzol, zugegeben» Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, wobei sie während dieser Zeit mit einem Trockenrohr gegen Luftfeuchtigkeit geschützt war. Die dabei erhaltene Lösung wurde abgekühlt, mit 10 %iger wäßriger HCl, einer gesättigten wäßrigen NagGO^-Lösung, dann mit Wasser gewaschen und getrocknet (über MgSO^). Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhielt man 5 S des rohen Alkoholprodukts_o

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Beispiel 3
j?-.(N-[ 3,' Z

Zu einer Aufschlämmung von 3,83 g (0,015 Mol) Säurechlorid (wie in Beispiel 1) in 200 ml trockenem Benzol wurden 4,5 g (0,6 Mol) 3-Aminopropanol zugegebene Die Mischung wurde über Nacht stehen gelassen und dann 24 Stunden lang unter Rückfluß erhitzte Die dabei erhaltene gelbe Lösung wurde abgekühlt, mit 50 ml 2,5 %iger wäßriger HCl, 50 ml einer gesättigten wäßrigen NapGO^-Lösung und dann mit Wasser gewaschen. Die Benzollösung wurde getrocknet (über MgSO₁,), auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens eingeengt, es wurde Petroläther bis zur Trübung zugegeben und die Mischung wurde abgekühlt, wobei man 2,75 S (63 %) Produkt erhielt, F. 129 bis 130°0.

Beispiel 4
5-(N-[5' Z

A) Zu einer Lösung von 1,90 g (5>6 mMol) Alkohol (wie in Beispiel 2) in 25 ml Aceton, die in einem Eisbad gekühlt wurde, wurden langsam 7>0 ml Jones-Reagens (etwa 1,5 S OrO, in HpSO^) zugegeben, wobei die Reaktionsmischung zwischen 0 und 5° C gehalten wurde. Nach 1,5-stündigem Rühren bei dieser Temperatur wurde das überschüssige Jones-Reagens durch Zugabe von 20 ml Isopropylalkohol und weiteres 30 Minuten langes Rühren zerstörte Die dabei erhaltene Reaktionsmischung wurde filtriert und das "Piltrat wurde eingeengt und durch präparative Dünnschichtchromatographie (TLO) (10 % CH^OH/90 % GHCl₅) gereinigt, wobei man 1,40 g (65 %) des rohen Säureproduktes erhielte Nach weiterer schwieriger Reinigung durch Kristallisation in Methanol/Wasser und nach 3-tägigem Trocknen bei 39°C und 0,1 mm über P₂ ⁰ 5 ^ΘΓηί^β1* ^man d-ie gewünschte Verbindung, F. 135

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B) Zu der Aufschlämmung von 144 mg (1,1 mMol) £ -Aminocapronsäure in 70 ml trockenem Benzol und 3 ml trockenem Triäthylamin wurden bei Raumtemperatur 256 mg (1 mMol) des Produkts des Beispiels 1 auf einmal zugegebene Die Regletionsmischung wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt, abgekühlt und zur Trockne eingeengte Der dabei erhaltene Rückstand wiirde in 70 ml GHGl- aufgenommen, mit 2 mal 10 ml Wasser und 1 mal mit einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (über MgSO^)_o Nach dem Einengen der filtrierten Chloroformlösung erhielt man ein orangegelbes öl mit einem Gewicht von 347 mg. Durch Kristallisation (in iithylacetat/Crrclohexan) erhielt man 61 mg Rohprodukt.

Beispiel 5

Herstellung von 5-(N-2'-Carboxyäthyl-carbamoyl)dibenz[b,f]-azerpin _

Zu einer Lösung von 2,0 g (6,8 mMol) des N-Propvlalkohols (wie in Beispiel 3) in 2S ml Aceton, die auf 0°G gekühlt worden war, wurden 9 ml Jones-Reagens (2,7 g CrO^, 2,5 ml Hp.30_/; und 7 ml HpO) zugetropft und es wurde 90 Minuten lang; bei 0 bis 5°C gerührte Das überschüssige Jones-Reagens wurde durch Zugabe von 20 ml Isopropylalkohol zerstört. Die erhaltene grüne Mischung wurde filtriert, zuerst mit 200 ml CHCl^ und dann erneut mit 250 ml CHGl^ extrahiert» Die vereinigten GHGl^- Extrakte wurden mit 50 ml einer gesättigten NaHCO^-Lösung extrahierte Der Bicarbonatextrakt wurde mit 25 ml CHpCIp gewaschen und dann bei 0⁰G mit konzentrierter HGl angesäuert, wobei man das Produkt in Form eines blassen Feststoffes erhielte Der Feststoff wurde einmal mit wenigen ml eiskaltem HpO gewaschen, filtriert und getrocknet (im Exsikkator), Ausbeute 1,33 g (64 %). Nach der Umkristallisation aus ilthylacetat/Hexan erhielt man das Produkt in Form von farblosen Kristallen, F. 164 bis 165°C_O

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Beispiel 6

Herstellung von 5-(N-[5^l-(N'-[2",2",5" ,5"-Tetramethyl-

Zu einer Lösung von 112 mg (0,32 mMol) der Carboxypentylsäure (des Beispiels 4) in 2 ml trockenem Dimethylformamid (DIvIF), die in einem Trockeneis/Aceton-Bad auf -12°C abgekühlt worden war, wurden 100 ill (etwa 1 mMol) (G₂H_n-)^H zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang gerührt und es wurden 70 nl (0,5 mMol) Isobutylchlorformiat zugegebene Eine Lösung von 66 mg (0,4 mMol) eines spinmarkierten Amins (2,2,5,5-Tetramethyl-3-amino-1-oxypyrrolidin) in 2 ml trockenem DME wurde zugegeben, die dabei erhaltene Reaktionsmisch wurde 1 Stunde lang bei -10°C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das DMF und die überschüssigen Lösungsmittel wurden in einem Warmwasserbad bei 0,5 dm abgezogene Der gelbe Rückstand wurde in 50 ml CHpCIp aufgenommen, mit 3 x 10 ml H₀O, dann mit einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (über MgSO^.) und eingeengt, wobei man 260 mg gelbes halbfestes Produkt erhielte Das Rohprodukt wurde mit Äthylacetat und Hexan bei Raumtemperatur behandelt, wobei man ^Λ mg (59 /0 eines blaßgelben Feststoffes erhielt. Fach der Umkristallisation aus Äthylacetat/Hexan erhielt man ein analytisch reines Material, F. 169 bis 17O⁰C.

Beispiel 7

Konjugation von 5-(N-C5'-Carboxypentyl-1 ']carbamoyl)dibenz- _[b_j_f ]_a_zepin jm_Rn.nders_erumalbumin (RSiO

Zu einer Lösung von 140 mg (0,4 mMol) der Oarboxypentylsäure (des Beispiels 4) in 7 ml trockenem DMF (in einem 25 ml R.Bo-Kolben, der mit einem Serumdeckel versehen war) wurden

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bei -10 bis -15°C 70 p.± (etwa 0,5 mMol) ( C₂Hj₅H" zugegeben, danach wurden 62 ul (etwa 0,5 mMol) Isobutylchlorformiat zugegeben» Die dabei erhaltene weiße Aufschlämmung wurde 2 Stunden lang bei -10 bis -15°C gerührte

Das vorstehend angegebene gemischte Anhydrid wurde innerhalb eines Zeitraums von 30 Minuten zu einer Lösung von 220 mg (etwa 0,003 mMol) ESA in 15 ml Wasser und 0,05 η NaOH bei pH 8,5 bis 9,0 in einem Eisbad (der pH-Wert der Eeaktionsmischung wurde mit rerdünnter wäßriger HaOH bei 8,5 gehalten) zugegeben und es wurde weitere 2 Stunden lang in dem Kühlraum gerührt. Die dabei erhaltene Eeaktionsmisch-ung wurde schwach trübe. Diese Lösung wurde gegen 4 1 eines 0,1 M NaHCO^-O,1 M NapGO^-Puffers 3 mal in 12 Stunden-Zeitabständen dialysiert und das Verfahren wurde mit Wasser wiederholt.

Die dialysierte Lösung wurde durch ein 0,22 11-Milliporen-Filter filtriert, 1 Stunde lang bei 10 000 UpM zentrifugiert und in einem sterilisierten Lyophilisierungskolben lyophilisiert, wobei 155 mg des Konjugats erhalten wurden. Die UV-Analyse des Kongugats zeigte die Anwesenheit von 39 Haptenen in diesem Konjugat«,

Beispiel 8

Konjugation von 5-(N-[2'-Carboxyäthyl-1']carbamoyl)-dibenzanEinderserumalbumin

Zu einer gerührten Lösung von 305 mg (0,001 Mol) N-(2-Carboxyäthylcarbamoyl)-5-H-dibenz[b,fjazepin in trockenem DMP (4-A-Molekularsiebe) wurden bei -5°C 139 ul (0,001 Mol) Triäthylamin zugegeben und danach wurden 126 11I (0,001 Mol) Isobutylchlorformiat zugegeben· Diese Mischung wurde 1,5 Stunden lang bei -5 G gerührt, danach wurde sie innerhalb eines Zeitraums von 5 Minuten in eine gekühlte Lösung (O⁰G) von 1,0 g ESA in 20 ml DMF und 50 ml 0,1 M Carbonat, pH-Wert 9,

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eingetropft. Diese Reaktionsmischung wurde in dem Kühlraum über Nacht gerührte Nach der Dialyse (zweimal) gegen 4 1 0,05 M Carbonat, pH 9, und anschließend zweimal gegjen 4 1 wäßriges Ammoniak, pH 9>5» und anschließender Lyophilisierung erhielt man 1,035 g des gewünschten Produktes mit einer Hapten-Zahl von 30, bestimmt durch UV₀

Beispiel 9

Konjugation von 5~(N-C5'-Carboxypentyl-1']carbamoyl)dibenz-[b,f]azepin

A) In einen Reaktionskolben wurden 8,4 mg (0,05 mMol) des Garboxypentylderivats des Beispiels 4 in 125 W.1 DME¹ eingeführt und es wurden äquimolare Mengen an Carbitolchlorformiat und Triäthylamin zugegeben, während die Temperatur bei etwa -20⁰C gehalten wurde_β Die obige Mischung wurde dann langsam zu einer Lösung von 1,9 mg/ml Glukose-6-phosphatdehydrogenase in einem 0,055 M Iris-Puffer bei pH 8,1, die 0,3 ml DMi¹ enthielt, in Gegenwart von 10 mg Glukose-6-phosphat und 20 mg NADH bei einer Temperatur von 4⁰O langsam zugetropft ο Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1 η Natrixunhydroxid zwischen 8 und 9 gehalten, wozu etwa 200 ml erforderlich warenο Das Produkt wurde dann 40 Stunden lang gegen den 0,055 M Tris-Puffer (4 mal 2 l) dialysiert, wobei 3 ml Dialysat zurückblieben«,

B) Das Verfahren zur Bestimmung des Prozentsatzes der Desaktivierung und des Prozentsatzes der Hemmung (Inhibierung) wurde wie folgt durchgeführt: 2 Volumenteile einer 0,1 M NAD-Lösung mit einem pH-Wert von 5 "bis 6 wurdenmit 3 Volumenteilen 0,11 M Glukose-6-phosphat in 0,055 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,9, vereinigt. Ein aliquoter Anteil des dialysierten Konjugats wurde mit dem oben angegebenen Puffer im Verhältnis 1:100 verdünnt. Es wurde eine Bestimmungslösung hergestellt aus 50yal der (G-6-P)-NAD-Lösung, 750 yul Puffer, 50^1

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' 26A99Ü3

Puffer oder Puffer mit darin enthaltendemAntikörper, je nachdem, ob die Desaktivierung oder die Hemmung (Inhibierung) bestimmt wurde, und 50 JiI des Enzymkonjugats oder des Enzymkontrollmaterials β Zur Bestimmung von quantitativen Übertragungen wurden Puffer-Portionen verwendete Die Lösung wurde in ein Spektrometer eingesaugt und die Geschwindigkeit der HÄDH-Bildung bei 30⁰C wurde bei 340 nm verfolgt«, Die Änderung der OD pro Minute zwischen der zweiten und der dritten Minute wurde bestimmte Es wurde gefunden, daß das Enzymkonjugat zu 88 % desaktiviert und zu 65 % gehemmt (inhibiert) war.

C) Mit variierenden Mengen Tegretol wurde ein Versuch durchgeführte Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt: eine 50 #1-Probe wurde zusammen mit 250^uI Puffer (pH 8,1 bei 25°C, 0,55 M Tris-HCl, 0,0 5 Gew./Vol.-% Natriumazid, 0,005 Gew./Vol.-% Thimerosal), der 0,5 % Natriumchlorid enthielt, und 0,01 Vol./Vol.-% Triton X-100 (Kochsalzpuffer) in einen 1 ml-Becher gegeben. Uach 60 Sekunden langer Äquilibrierung wurden 50 ill der obigen Probelösung in einen zweiten Becher gegeben, dem 50 »1 Antikörper lösung in dem 1 Gew. /Vol. -% Kaninchenserumalbumin, 0,066 M Glukose-6-phosphat und 0,4 M HAD-Mononatriumsalz enthaltenden Puffer zugegeben wurden, danach wurden 250 nl Kochsalz-Puffer zugegebene Schließlich wurden 50 ni des Enzymkonjugats in dem Puffer, der 0,9 Gew./Vol.-% ITaGl und 1 Gew./Vol.-% Kaninchenserumalbumin enthielt, zugegeben, woran sich die Zugabe von 250 nl Puffer anschloß· Die Probemischung wurde in eine SpektrometerzeHe eingesaugt und nach 15 Sekunden langer Verzögerung wurde eine erste Extinktionsmessung durchgeführt und 80 Sekunden später wurde eine zweite Extinktionsmessung durchgeführt. Die Differenz zwischen den Meßwerten ist in OD-Einheiten angegeben. Bei Verwendung von Proben mit einer bekannten Tegretol-Konzentration betrug die Differenz zwischen einer Tegretol-Konzentration 0 und einer Konzentration 1 ug/ml 11 OD-Einheiten,und die Differenz zwischen einer Tegretol-Konzentration 0 und einer Konzentration 10 iig/ml betrug 51 Einheiten.

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Beispiel 10

Herstellung von 5-Carbamyl(N-propanalyl)-5H-dibenz[b,f]-azepip.

Zu einer stark gerührten Lösung von 9,7 ml (0,012 Mol) trockenem (4A-Molekularsiebe) Pyridin in 150 ml trockenem (3A-Molekularsiebe) GH₂Gl₂ wurden 6,0 g (0,06 Mol) getrocknetes GrO₇, zugegeben. Diese Lösung wurde 30 Minuten lang in einem Eisbad und geschützt gegen Feuchtigkeit durch ein Trockenrohr gerührt. Auf einmal wurden 2,91 g (0»01 Mol) N-(3-Hydroxypropylcarbamoyl)-5H-dibenz[b,f]azepin in 7 ml CHpGl₂ zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 4S Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt„ Die Lösung wurde aus dem Kolben gegossen und der teerartige Rückstand wurde mit 150 ml GH₂Gl₂ gespülte Die Lösungen wurden miteinander vereinigt und nacheinander mit 3 mal 10 ml 1 η NaOH, 3 mal 100 ml 1 η HGl, 3 mal 100 ml einer gesättigten NaHCO^-Lösung, einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen und dann über Na₂SO. getrocknetο Alle Waschlösungen wurden mit Äther zurückgewaschen«, Die Ätherrückwaschungen und die GHpCI₂-Losungen wurden miteinander vereinigt und das Produkt wurde von dem Lösungsmittel befreite Der ölige Rückstand kristallisierte beim Stehenlassen aus und man erhielt 1,71 S (59 %) der Titel verbindung β Nach der Umkristallisation aus Benzol/Petroläther erhielt man weiße Kristalle, IO 121 bis 122,5°G_O

Beispiel 11

Konjugation von 5-Gar'bamyl-(N-pi¹opanalyl)-5H-dibenzCb,f3-R SA

Zu einer gekühlten Lösung (5°C) von 600 mg RSA (aus Pentex umkristallisiert) in 40 ml (1,02 M) eines pH 7-Phosphatpuffers wurden 294 mg (0,001 Mol) des Aldehyds des Beispiels 10 in 5 ml Methanol zugegebene Nach der Zugabe wurden weitere 2 ml

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2C/₊9903

Methanol zugegeben, um eine Lösung zu erhaltene Zu der schwach trüben Mischung wurden 68 mg (0,0011 Mol) Natriumcyanoborfaydrid zugegeben und der pH-Wert wurde durch Zugabe von KHqPO^ auf 7>3 eingestellte Diese Reaktionsmischung wurde 4-0 Stunden lang in dem Kühlraum und dann 4- Stunden lang bei Räumtecrneratur gerührt, bevor sie ausgeschleudert wurde_o Der Niederschlag wurde in 8 M Harnstoff wieder suspendiert und diese Lösung wurde nach dem Zentrifugieren mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt undgegsi2 mal 4- 1 0,05 M Na₂CO-., pH 9, und 2 mal 4- 1 NH^OH, pH 9,5, dialysiert« Nach dem Lyophilisieren erhielt man 588 mg Konjugat mit einer Hapten-Zahl von 28, bestimmt durch UV.

Beispiel 12

Konjugation von 5-Carbamyl(N-propanalyl)-5H-dibenz[b,f]-azepin_an jRind_ergammaglobulin

15 ml Methanol wurden zu einer 80 ml—Lösung von 600 mg Rindergammaglobulin (Pentex-Iraktion II) in 0,2 M Phosphat, pH 7j zugegebene Diese Lösung wurde auf 5°C abgekühlt, bevor 293 mg (0,001 Mol) des Aldehyds des Beispiels 10 in 5 ml Methanol zugegeben wurden, gleich darauf wurden 68 mg (0,0011 Mol) Natriumcyanoborhydrid zugegebene Diese Mischung wurde einen Tag lang in dem Kühlraum und dann einen zweiten Tag lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde ausgeschleudert und die überstehende Flüssigkeit wurde mit dem erneut suspendierten Niederschlag (9 M Harnstoff) vereinigte Es wurde dialysiert gegenüber 1 mal 2 1 6 M Harnstoff - 0,05 M Oarbonat, pH 9; 1 mal 2 1 4- M Harnstoff - 0,05 M Oarbonat, pH 9» 1 mal 2 M Harnstoff - 0,05 M Oarbonat, pH 9; 2 mal 4- 1 0,05 M Oarbonat, pH 9; und schließlich 2 mal 4- 1 JSH.OH, pH 1Oo Die Lösung wurde nach der Dialyse ausgeschleudert und lyophilisiert, wobei man 226 mg Konjugat mit einer Hapten-Zahl 18, bestimmt durch UY, erhielte

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Um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Präparate (Verbindungen) in einem Versuch zu zeigen, wurden unter Verwendung des Antigens des Beispiels 8 Antikörper hergestellte Zur Durchführung des Versuchs wurde ein Puffer verwendet, bei dem es sich um 0,055 M Tris-HCl, pH 8,1, bei 25°G mit 0,05 Gew.-/Vol.-% Natriumazid, 0,005 Gew./Vol.-% Thimerosal und 2,0 Gew.-% Natriumchlorid (Gew.-/Vol.-% steht für Gramm pro 100 ml) handelte. - - Der Versuch wurde durchgeführt, indem man 50 »1 der Probe, z.B_o Serum, zusammen mit 250 ul Puffer in einen Becher überführte, danach 50 ail der Antikörperlösung in dem Puffer, die 1 Gew.-/Vol_o-% Kaninchenserumalbumin, 0,066 M Glukose-6-phosphat und 0,4- M NAD (Mononatriumsalz) enthielt, und danach 250 ul Puffer zugabe Schließlich wurden 50 nl des Enzymkonjugats des Beispiels 9 in dem Puffer, enthalend 0,9 Gew./Vol.-^ NaGl und 1 Gew./Vol.-% Kaninchenserumalbumin, zugegeben, daran schlaß sich die Zugabe von 250 ul Puffer an_o Die Versuchsmischung wurde in eine Spektrometerzelle eingesaugt und nach einer I5 Sekunden langen Verzögerung wurde eine erste Extxnktionsmessung durchgeführt und 80 Sekunden später wurde eine zweite Extinktionsmessung durchgeführte Die Temperatur der Zelle betrug 30°G. Die Differenz zwischen den Meßwerten ist in OD-Einheiten mal angegebene Eine Differenz von 20 OD-Einheiten wurde zwischen einer Probe ohne Tegretol und einer Probe mit 1 iig/ml Tegretol erhalten·

In einem Reaktivität s-Kreuzversuch waren für ein Ansprechen (eine Reaktion) auf 1 ng/ml Tegretol mehr als etwa 167 Mg/ml Iminostilben erforderlich, während andere Verbindungen mit einer ähnlichen Struktur, wie z.B. 0arbamazepin-10,11-epoxid, Imipramin, Amitriptylin und Desmethylimxpramin, kein äquivalentes Ansprechen auf 1 η g/ml Tegretol bei mehr als 1000 iig/ml zeigten«.

Die vorstehen angegebenen Daten zeigen, daß erfindungsgemäß Antikörper hergestellt werden können, die hochempfindlich gegen-

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über Tegretol und spezifisch, für die iDegretolstrulcbur sind. Außerdem kann unter Verwendung der an ein Enzym, wie G-lukose-6-phosphat-dehydrogenase, gebundenen (konjugierten) Tegretolderivate ein empfindlicher Fachweis (Assay) entwickelt werden.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche

1. Dibenz[b,f]azepin-Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

•ff

GomiR¹-(co)_m-J

worin bedeuten:

m die Zahl O oder 1,

R eine Bindung oder einen aliphatischen Rest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 äthylenische Unsättigung als einzige Unsättigung und 0 bis 1 Heteroatom mit der Atomzahl 7 "bis 8, das nur an Kohlenstoff gebunden ist, mit der Maßgabe, daß R mindestens 2 Kohlenstoffatome aufweist, wenn m » O,

Y eine Antigen-Poly(aminosäure) mit einem Molekulargewicht von mindestens 1000 und

η eine Zahl von mindestens 1, die jedoch nicht größer ist als das Molekulargewicht von Y , geteilt durch 500»

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel Y ein Molekulargewicht innerhalb

des Bereiches von etwa 10 000 bis etwa 500 000 hat und η eine Zahl innerhalb des Bereiches von etwa 4- bis etwa 250 bedeutet.

3ο Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein Albumin bedeutete

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ORIGINAL INSPKTTED

2G49903

-χ-

4_O Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein Globulin bedeutet.

5o Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R Polyethylen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.

6ο Antikörper, wie sie als Reaktion (Immunantwort) auf eine Verbindung nach Anspruch 1, 2 oder 5 erhalten worden. sind ο

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