JPS6290536A - ハプテン化合物誘導体により形成された抗体 - Google Patents

ハプテン化合物誘導体により形成された抗体

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JPS6290536A
JPS6290536A JP61188352A JP18835286A JPS6290536A JP S6290536 A JPS6290536 A JP S6290536A JP 61188352 A JP61188352 A JP 61188352A JP 18835286 A JP18835286 A JP 18835286A JP S6290536 A JPS6290536 A JP S6290536A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原性物質と結合させて使用する小さなハシ
テン化合物誘導体に関し、特にを推動物に注射した場合
に形成さｎるその特定のハシテン化合物に高度な特異性
金有する抗体を提供する。
ある化合物を他の類似構造ｔもつ化合物と区別するには
多くの色々な方法があるが、最も鋭敏でかつ正確な方法
のひとつは、ある特定構造に対して特異性金示す抗体を
使用することである。すなわち、抗体の特定化合物との
結合定数は他の類似化合物との結合定数よりも実質上高
い。抗体のこの能力を使用することによって広い範囲に
及ぶ種々の免疫検定法が開発さｎた。市場に受けい詐ら
れている免疫検定法の中には均質酵素（ｈｅｍｏｇｅｎ
ｅｏｕθｅｎｚｙｍｅ）免疫検定法、スピン標識免疫検
定法、放射免疫検定法および血球凝集反応がある。最後
の方法を除き各々の免疫検定は測定さｎるべき化合物と
ディテクター（ｄａｔｏｃｔｏｒ　）に結合する化合物
との間の競合による。
問題の化合物は抗原を製造するために単に修飾されるだ
けであろうから、そのような修飾は抗体の構造特異性に
対する効果を考慮せねばならない。
すなわち、その化合物と抗原との間の結合部位を選択す
る際、得らｎた生成物が元の化合物ｔ？認知する抗体を
提供するように選択されねばならない。
抗体が元の化合物全認知せねばならないのみならず、抗
体がその化合物に非常に類似した化合物全認知するほど
その化合物の重要な特性を変化させてもならない。さら
に、その化合物の抗原への結合は、この化合物の高いタ
イターならびにその化合物の高い結合定数全提供すべき
である。
ジペンゾアゼピン化合物に関する論説かに見出される。
米国特許第２．９４８．７１８号には薬理学的特性を有
することが報告さｎているジペンゾアゼピン誘導体が開
示されている。
ジペンゾ（ｂ、　ｆｌアゼピン化合物はオキン脂肪族基
金介して抗原性物質、特にポリペプチドおよび蛋白質に
結合する。ここでオキソ基は抗原に励合し、またアルキ
ル基はカルバモイル基の窒素に結合し、こｎは順にアゼ
ピン環の窒素に結合する。を椎動物へ注射すると、これ
らの化合物が薬剤テグレトールＲ（ＴｅｇｒｅｔｏｌＲ
）　（カルパムアゼピン）に高度な特異性を示す抗体全
産生することが認められる。この化合物はジペンゾアゼ
ピンをホスゲンと反応させ、次いでアミノアルコールと
反応させることによって製造さｎる。アルコールを酸化
してオキソ基にし、次にこｎ２アミド又はアルキルアミ
ン結合を介して適当な抗原、特にポリペプチド又は蛋白
質に結合させうる。
本発明で用いられる化合物はカルバムアゼビンのＮ−誘
導体であり、これは、少なくとも１個ないし約８個より
多くない炭素原子、通例約２ないし６個の炭素原子の脂
肪族鎖および口ないし１個のへテロ原子（これはカルコ
ゲノもしくは窒素であり、特に原子番号７ないし８のへ
テロ原子である）を介して結合したオキソ官能基、たと
えばアルデヒドもしくはカルボキシ誘導体し、そこで酸
素はその脂肪族鎖中においてオキシとして存在し、かつ
窒素は水素原子なしで存在する。このカルボキシ誘導体
は主としてペゾチＰ結合によって抗原、たとえばポリペ
プチド又は蛋白質と結合し、このアルデヒド誘導体は還
元的アミノ化によりアルキルアミン結合を介して結合す
る。この結合した抗原を抗体全生産させるためにを椎動
物、特に家畜に注射する。あらかじめ決定しておいた計
画に基き注射を稠度か繰り返した後、この抗体は血清か
ら取り出しそのままで、又はこの抗体を濃縮するように
更に精製して用いうる。
概して、本発明による抗体の生産に用いらｎる化合物は
次式 を有する。式中、ｍはＯ又は１である　Ｒ１は連結基で
あり、望ましくは、０から８個の炭素原子および０から
１個のへテロ原子（カルコゲノおよび窒素、好ましくは
酸素および窒素、特に好ましくは酸素）の脂肪族連結基
であり、酸素はオキシとして存在し、かつ窒素は水素原
子なしで存在し、その鎖中のへテロ原子間には少くとも
２個の炭素原子が存在し、この鎖は分枝状又は直鎖状で
もよく、好ましくは直鎖状であり、ｍが００時Ｒは少く
とも２個の炭素原子′Ｊｔ有するという条件付で、唯一
個の脂肪族不飽和として０から１個のエチレン不飽和部
位で有する。２は水素、ヒドロヤシル、１から６１ｉ！
の炭素原子、通常１から３個の炭素原子のアルコキシ、
炭酸アルキル（０００２Ａ　、ここでＡは１ないし６個
の炭素原子、通常１ないし４個の炭素原子のアルキル基
であるン、ニトロフェノキシ、特にパラ又はＹｌここで
Ｙはポリアミノ酸、たとえばポリペプチド残基（蛋白質
のポリペプチドサブユニット（５ｕｂｕｎｉｔ　）　ｆ
含む）である。そしてｎは２がＹである時を除いて１で
あり、またｎが２で示さｎるアミノおよびチロシン基に
結合しているアシル基の数に等しい時、ｎは少くとも１
であり、また結合に利用し５るアミノおよびチロシン官
能基の数より大きくなく、通常はＹの分子量’ｒ５００
で割った数よりも多くなく、より通常はＹの分子ｆｉ’
ａ−１５００で割った数より多くなく、かつ通常は分子
量１００．０００につき少くとも１である。
好ましいＲ基としてはアルキレン、アルケニレン、アル
キレンオキシアルキレン（ここでアルキレン基は少くと
も２個の炭素原子によって分けらｎる）、Ｎ−低級アル
キル（１−６個の炭素原子）、アルキレンアミノアルキ
レン（ここでアルキレン基は少くとも２個の炭素原子に
よって分けらｎる〕があげらｎる。
第一の重要な化合物は２がＹであり、抗原としての使用
が認めらｎｌかつＹが抗原性ポリアミノ酸である化合物
である。こｎらの化合物は太体次の式 全有する。
式中、ｍは０又は１である。Ｒ１は結合を表わすか又は
１から８個の炭素原子、よジ通常は２から６個の炭素原
子、標準的にはｍがＯである時少くとも２個の炭素原千
金もつ脂肪族基であり、こｎは唯一個の不飽和として０
から１個のエチレン不飽和部位と、通常炭素に単独結合
している酸素および窒素、特に鎖中ではオキシとして存
在する酸素である０から１個のへテロ原子とｔもち、ま
た分枝状鎖又は直鎖状鎖、好ましくは直鎖状鎖、すなわ
ちポリメチレンであり得る。ｙｌは少くとも分子量ｉ、
ｏｏｏ、より通常は少くとも分子量１０．０００．の抗
原性ポリアミノ酸であり、分子量ｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ、
ｏ　ｏ　ｏ又はそｎ以上でもよく、通常は分子量およそ
５００．０００　ｋ越えない。そしてｎｌは少くとも１
、通常は１より大きく一般にはｙｌの分子量金５００で
、より通常は１．０００で、および好ましくはおよそ２
，０００で割った数を越えず、かつ少くともｙｌの分子
量に１００．０００で割った数、より通常はｙｌの分子
量ｆ　５０．０００で割った数である。中間の分子量？
もつ抗原、すなわち２０．０００ないし１，０００．０
００の範囲にある分子量ｔもつ抗原の場合、その数は一
般的にはおよそ２５０まで、よジ通常は４ないし１００
である。低分子！？ｒもつ抗原（分子量１．０００ない
し５．０００　）の場合、その数はおよそ１ないし１０
、通常２ないし５である。
前述のごとく、特に重要な化合物はオキソ−カルボニル
基（ケト以外〕と非オキンーカルポニル基とが、ポリペ
プチド又は蛋白質構造の一部であるアミノ基に結合して
いる化合物である。ポリペブチｒおよび蛋白質の一部は
抗原性があジ、その結果ジベンズアゼピンのカルボニル
誘導体をそのポリペプチド又は蛋白質へ結合させること
によジ、ジベンズアゼピンに対して抗体が形成さｎうる
。
抗原として使用さｎることもできるが通例はそういった
使用はされないよシせまいクラスの蛋白質は、免疫検定
でディテクター（ｄａｔｏｃｔｏｒ　）として用いられ
る酵素である。抗原としては不活性酵素が使用さｎうる
。
ポリペプチド〔本発明中では一般にポリアミノ酸として
言及さｎている〕は通常訃よそ２から１００アミノ酸単
位（通常はおよそ分子量１　’２，０００以下）からな
る。よジ大きなポリペプチドは適宜に蛋白質と呼ばｎる
。蛋白質は通常１個から２０個のサプユニツ）　（５ｕ
ｂｕｎｉｔ　）と呼ばｎるポリペプチド鎖からなり、こ
ｎは共有又は非共有結合による会合体である。サブユニ
ットは標準としてはおよそ１００から６００のアミノ酸
基（又はｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏないし３５，０００の分子
量）からなる。本発明ではポリペプチド単位だけからな
るか、又は他の官能基と一緒のポリペプチド単位からな
るかにかかわらず、たとえばヘモグロビン又はチトクロ
ームオキシダーゼ中のポリフィリンのように、ポリアミ
ノ酸はポリペプチド単位および蛋白質のサブユニットで
あるポリペプチド全包含する。
ジベンズアゼピン基の数はポリアミノ酸が酵素であるか
又は抗原であるかによって異る。基の最大数は溶解度、
活性等に対する置換の影響によって限定さｎる。抗体の
生成には、ジベンズアゼピンに対する抗体が満足に取り
出せるように充分な数のジベンズアゼピン基が存在せね
ばならない。
もしそうでなければ他の化合物に対する抗体に比較して
ジベンズアゼピンに対する抗体の割合は好ましくなく低
いものとなる。
考えらｎる蛋白質物質又はポリペプチドの第一の群は抗
原性ポリペプチドである。これらはアミン基によってジ
ベンズアゼピン類縁化合物のカルボニル基に結合し５る
。この生成物はジベンズアゼピンに対する抗体の形成に
用いられうる。使用さｎつる蛋白質物質は広い範囲に及
び、筐た標準的には１．０００からｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ
、ｏ　ｏ　ｏの分子量、通例、２０．０００から５００
．０００の分子量である。
酵素は通常はおよそ１０．０００ないし６０　［］、０
００の範囲内の、通常はおよそ１２．０００ないし１５
０．０００の範囲内の、モしてより通常は１２．０００
ないし８０．０００の範囲内にある分子量をもつ。いく
つかの酵素は複数の酵素サブユニットを有する。酵素の
分子量について述べる時には全体の酵素全指すことにす
る。標識を特異的アミノ基に限定しない場合には平均し
て酵素当り少くともおよそ１ジベンズアゼピン、通常は
酵素当り少くともおよそ２ベンズアゼぎンであり、はと
んど酵素当り４０ジベンズアゼピン以上のことはなく、
通常は酵素当９６０ジベンズアゼピン以下である。たと
えばリゾチームではジベンズアゼピン基の平均数はおよ
そ２ないし５の範囲内にある。
グルコース−６−リン酸脱水素酵素では平均数は２ない
し２０の範囲内にある。
ジベンズアゼピン類縁化合物は非才キン−カルボニル基
によって蛋白質中に存在するヒドロキシル又はメルカプ
ト基に結合さｎうるが、大部分の結合はアミノに対して
である。それゆえ化合物はエステルおよびチオエステル
も存在し５るがアミドとして記載される。アルデヒド誘
導体は単独でアミノへ結合して還元的アミノ化によりア
ルキルアミン基金形成する。
カルボキシ修飾ジベンズアゼピンへ結合する遊離アミノ
基ｔもつ蛋白質中に存在するアミノ酸にはリジン、Ｎ−
末端アミノ酸等がある。ヒドロキシルおよびメルカゾト
含有アミノ酸にはセリン、システィン、チロシンおよび
スレオニンがある。
種々の蛋白質およびポリペプチド型は抗原性物質として
用いられうる。こｎらの型にはアルブミン、酵素、血清
蛋白、たとえばグロブリン、接眼レンズ蛋白質（ｏｃｕ
ｌａｒ　１ｅｎｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）、リポプロティ
ン等がある。実例としての蛋白質上あげると牛の血清ア
ルブミン、キーホールアオガイヘモシアニン（ｋｅｙｈ
ｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　）、卵
アルブミン、牛のガンマ−グロブリン等がある。グラミ
シジンのような免疫形成性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　
）である小さな中性ポリペプチドもまた使用さｎうる。
種々の合成ポリペプチド、たとえばリジンのポリマー、
グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン等がそｉｔ
自身で、又は−緒であるかのいずれかの状態で用いらｎ
うる。特に興味深いのにポリリジン又はリジンとグルタ
ミン酸の組み合わせである。どの合成ポリペプチドも、
たとえばリジンによって提供さｎるよ５な充分な数の遊
離アミノ基金包含していなげｎばならない。
蛋白質分子の第二の群はディテクターである。
こｎらはカルボニル修飾ジベンズアゼピンが結合する酵
素である。上記のごとく、ジベンズアゼピン修飾酵素は
免疫検定に有用である。免疫検定法については後に記載
する。
種々の酵素、たとえばペプチダーゼ、エステラーゼ、ア
ミダーゼ、ホスホリラーゼ、カルボヒドラーゼ、酸化酵
素、たとえば、脱水素酵素、還元酵素等が用いらｎうる
。特に重要なものはりゾチーム、過酸化酵素、α−アミ
ラーゼ、脱水素酵素、特にマレイン酸脱水素酵素とグル
コース−６−リン酸脱水素酵素、アルカリホスファター
ゼ、β−グルクロニダーゼ、セルラーゼおよびホスホリ
パーゼのような酵素である。工、Ｕ、Ｂ、分類による興
味ある酵素は１．オキシドレダクターゼ、詳細にはグル
ープ１．１、より詳細には１．１．１、および１．１１
、よフ詳細にＩ′ｉ１．１１．１それに３．ヒ８−ゼ、
詳細には３．２、より詳細には３．２．１である。
置換酵素は大体次の式ｔ−Ｗする。
式中、ｍｂよびＲ１は前に記載したとおりである。Ｙ２
は活性部位以外で置換された酵素であり、結合以前の元
の活性の少くとも６０、好ましくは少くとも５０パーセ
ントを有している。Ｒ２は通常は１から５０であり、よ
り通常は２から６５であり、好ましくは２ないし１４、
より好ましくは２ないし１２であり、小さな酵素たとえ
ばリゾチームはすべての利用しうる結合さｎたリジン基
含有しているが、一般的には平均して酵素中の利用しう
る全リジン基のおよそ６０パーセント以下である。
酵素の代わりに安定な遊離基上免疫検定における検出の
ための官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ　）として
用いてもよい。安定な遊離基は環状員（ａｎｎｕｌａｒ
ｍｅｍｂｅｒ　）としてニトロオキシドの窒素と、環状
員として０から１個の他のベテロ原子、たとえば酸素お
よび窒素と全方する環状ニトロオキシドである。ジベン
ズアゼピン誘導体の非オキソ−カルボニルに結合する安
定な遊離基分子は標準的には７から１６個の炭素原子、
より通常は７から１２個の炭素原子をもつ。アミノ官能
基は環状炭素原子に直接結合してもよいし、又は１から
４個の炭素原子、よシ通常は１から２個の炭素原子をも
つ脂肪族鎖によって環に結合してもよい。その分子は唯
一個の不飽和として０から２のエチレン不飽和部位、よ
シ通常は０から１のエチレン不飽和部位ｋＴＩｔ、ても
よい。
概して、ジベンズアゼピン誘導体の非才キンカルボニル
に結合する安定なニトロオキシド官能基は次の式 全方する。
式中、Ｄは環状原子として通常脂肪族として飽和の１か
ら６個の炭素原子、より通常は１から６個の炭素原子、
わずか１から６個、通常は２から３個の炭素原子をもつ
２価の脂肪族基であり、Ａは低級アルキル（１ないし６
個、通常は１ないし６個の炭素原子）、特にメチルであ
る。
大体、化合物はピロリドン又はピペリジン誘導体であシ
、Ｄは炭化水素である。
本発明で使用する種々のアミド生成物を形成させる際に
は、通例カルボンＥｌ！’に活性化する。これは多くの
方法でなし５る。特に興味深い２つの方法をあげると、
ひとつはカルボジイミド、通常は水溶性のジ脂肪族カル
ボジイミドもしくはジ環式脂肪族カルボジイミドと、不
活性溶媒、たとえばジメチルホルムアミド、アセトニト
リルおよびヘキサ−メチルホスホロアミド中にて反応さ
せることである。反応は緩和な条件下で種々の試薬を用
い、かつ反応が起こるのに必要な充分な時間で与えるこ
とによって行わ几る。
二番目の方法はアルキルクロロホルメートたとえばイン
ブチルクロロホルメートを用いて混成酸無水物上製造す
ることである。混成酸無水物はカルボキシ置換ジベンズ
アゼピン、アルキルクロロホルメートおよび第三アミン
を合併することにより形成さｎる。温度は通常環境温度
以下である。
ジベンズアゼピン誘導体に基き少くともクロロホルメー
トの化学量論量、および通常は化学量論】０６倍を越え
ない過剰量が用いらｎる。第三アミンはクロロホルメー
トに対して少くとも等モル量存在する。
次にこの混合物を結合すべきアミノ化合物と合併し、反
応が緩和な条件下で進むようにさせる。
又、アミン官能基をアシル化するために水中で働くカル
ボキシ修飾ジベンズアゼピンのエステルを用いてもよい
。ヒドロキシリック基の実例をあケルとｐ−ニトロフェ
ニルエステルを製造するのに使用されうるｐ−ニトロフ
ェニルがある。アルデヒド結合には還元的アミノ化が極
性、通常は水性溶媒中にて、還元剤としてナトリウムシ
アノポロヒドライドを用いて行われる。
本発明の結合抗原に応じて製造される抗体は親の化合物
、結合抗原、抗原への結合に用いられる化合物又はその
誘導体、酸標識化合物、たとえば酵素結合体およびスピ
ン標識結合体に対する強力な特異結合性を有する。
次側は本発明を説明するものであり、これにより本発明
を限定するものではない。表示のない温度はすべて摂氏
度（０Ｃ）を表わ、す。例Ｉ−■は本発明による抗体の
産生に用いるバッテン化・金物および抗原に関するもの
である。
例Ｉ　Ｎ−クロルカルポニルシヘンス（ｂ　、　ｔ　）
アゼピン ６０−の乾燥トルエン中１４．１０　＃　（０，０７３
モル）のジベンズ（ｂ、ｆ）アゼピンを含むスラリーへ
、室温にてベンゼン中１２．５％Ｏ，ｔ；スピン（過剰
）を含む１２０Ｍの溶液を４５分間にわたり滴下添加す
る。得られた黄色スラリーを室温にて２゛時間攪拌し、
さらに２時間加熱還流してから、室温にて一夜攪拌する
。反応混合物を７−ド中で回転蒸発器により濃縮して薄
黄色固体を得、これを２００１７ベンゼンにとかし、か
つ沸騰下ノリッ）　−Ａ　　（Ｎｏｒｉｔ−Ａ　　）で
処理する。この熱溶液をセライトでろ過し、元の量の半
分になるまで＃縮し、室温まで冷却し、かつ濁るまで石
油エーテルを加える。白色結晶の題記生成物が沈澱する
。収量１４．４ｇ、融点１４５−１５０°。ベンゼン−
ヘキサンから再結晶させると融点１５０−１５６．５゜
の針状晶を得る。
例ＩＩ　　５−（Ｎ−［６’−ヒドロキシへキシル〕カ
ルバモイル）−ジベンズ（ｂ、ｆ）−アゼピン １ＤＯＩｍ＋７）乾燥ペンｅ　７中ノ３．８５１　（０
，０１５モル）の酸塩化物（例Ｉ）へ、２ＱＯｒｄの乾
燥ベンゼン中に懸濁させた７、２　、Ｆ　（０，６２モ
ル）の６−アミノへキサノールを加える。反応混合物を
乾燥管により大気中の水分から保護しながら２４時間還
流する。得られた溶液を冷却し、水性１ｏチ）ｉｏｌ、
飽和水性Ｎａ２００３、次いで水にて洗浄し、乾燥（Ｍ
ｇＳＯ４）させる。溶媒を蒸発させて５ｇの粗アルコー
ル生成物を得る。
例１　５−　（Ｎ　−（３’−ヒドロキシプロピル〕カ
ルバモイル）−ジベンズ（ｔ＋、ｆ）−アゼピン ２００ＩＩＬｌの乾燥ベンゼン中の３．８３　＆　（０
，０１５モル）の酸塩化物（例Ｉ）を含むスラリーへ、
４．５．９　（０，６モル）の６−アミノゾロパノール
を加える。この混合物を一夜放置してから２４時間還流
する。得られた黄色溶液を冷却し、５ｏＩＬｔの水性２
．５　％　Ｈｃｌ、５Ｑｄの飽和水性Ｎａ２００３、次
いで水にて洗浄する。ベンゼン溶液を乾燥（ＭｇＳＯ４
）させ、元の量の半分になるまで濃縮し、濁るまで石油
エーテルを加える。この混合物を冷却して２．７５　ｇ
（６３％）の生成物、融点１２９−００゜を得る。
例ｆｆ　　５−（Ｎ−（５’−カルがキシペンチル〕カ
ルバモイル）−ジベンズ（ｂ、ｆ〕−アゼピン Ａ、２５ａＪのアセトン中に１．９０　、Ｐ　（５，６
ミリモル）のアルコール（例■）を含む、水浴中にて冷
却した溶液へ、７．０ゴのジョーンズ試薬（Ｊｏｎｅｓ
ｒｅａｇｅｎｔ　）　（Ｈ２ＳＯ４中約１．５ｙの０ｒ
０３　）をゆっくりと加え、反応混合物を０°ないし５
°間に保持する。この温度にて１．５時間攪拌後、過剰
のジョーンズ試薬を２０ｄのイソビロビルアルコールヲ
添加し、かつ更に６０分間攪拌することによって分解す
る。得られた反応混合物をろ過し、がつろ液を濃縮し、
ａＩ！ｌ整用ＴＬＯ（１Ｑ％ＭｅＯＨ／　９０％０ＨＯ
１３）で精製して１．４０．９（６５％）の粗酸生成物
を得る。かろうじてメタノール−水から結晶化させ、か
つＰ２Ｏ５で０．１１．６９°にて６日間乾燥させるこ
とにより更に精製して物質、融点１３５−１３６°、を
得る。
Ｂ、７０ｍの乾燥ベンゼンと６Ｍの乾燥トリエチルアミ
ン中に：１４１’（１，１ミリモルンの６−アミノカプ
ロン酸を冨むスラリーへ、室温にて２５６７１＆（１ミ
リモル）の生成物を一度に加える。
この反応混合物を一夜遠流し、冷却し、かつ濃縮乾燥さ
せる。得られた残留物を７０−の０ＨＯ１３に溶かし、
１０ゴの水で２回、飽和プラインで一度洗浄してから乾
燥（ＭｇＳＯ４）させる。ろ過したクロロホルム溶液な
一縮して６４７ダの橙黄色油状物を得る。結晶化（酢酸
エチル−シクロヘキサン）させて６１ｍ９の精製生成物
を得る。
例Ｖ　　５−　（Ｎ　−２’−カルボキシエチルカルバ
モイル）−ジベンズ［ｂ、ｆ］アゼピンの製造 Ｏｏまで冷却させ゛た２５αのアセトン中に２．ＯＩ（
６，８ミリモル）のＮ−７’ロピルアルコール（例１）
を含む溶液へ、９ｄの２ヨーンズ試薬（０ｒ０３．２．
７．９　；　Ｈ２ＢＯ３，２，５ｍｌ　；　Ｈ２Ｏ，７
＋ｎｌ　）を滴下添加し、０°ないし５°にて９０分間
攪拌する。過剰のジョーンズ試薬を２０４のイソグロビ
ルアルコールを加えて分解する。この緑色混合物をろ過
し、まず２００１のｃａｃｌ、にて、次いで再び２５０
Ｍのｃａｃｌ３にて抽出する。合併した０Ｈ（３１３抽
出物を５０ｗＬｌの飽和ＢｒａＨＣＯ３にて抽出する。
重炭酸塩抽出物を２５ｒｒＬｌの０Ｈ２０］、２にて洗
浄し、次いで０°にて濃ＨＯＩで酸性にして背白色固体
の生成物を得る。この固体を数ゴの氷冷Ｈ２０にて一度
洗浄し、ろ過し、かつ乾燥して（デシケータ−）６４チ
収量にて１．３３．９の目的物を得る。酢酸エチル−ヘ
キサンから再結晶し、無色の結晶として生成物を得る。
融点１６４−１６５°。
例ＶＩ　　５−（Ｎ−（５’−（Ｎ’−（２“、２“、
５“。
５１−テトラメチル−１′−オキシルピロリジニル−６
１〕−ホルミアミド）−ジベンズ（ｂ、ｆ）アゼピンの
製造 ２ゴの乾燥ＤＭＦ中に１１２Ｗ（０，３２ミリモル）の
カルボキシ−ペンチル酸（例■）を含む溶液を乾燥水冷
アセトン浴により一１２°まで冷却し、そこへ１００μ
ｌ（約１ミリモル）のＭｔ３Ｎを加える。
この反応混合物を６０分間攪拌して７０μｌ　（０，５
ミリモル）のインブチルクロロホルメートを添加する。
２Ｉｌｔ７！の乾燥ＤＭＩＰ中に６６　’Ｗ　（０，４
ミリモル）のスピン標識アミン（２，２，５，５−テト
ラメチル−６−アミノ−１−オキ７ビロリジン）を含む
溶液を添加し、得られた反応混合物を一１０°にで１時
間、および室温で一夜攪拌する。ＤＭ？および過剰の溶
媒を温水浴中にて０．５ｍｍで除去する。
黄色残留物を５ＱｍのＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、ｉｏｍｌ
のＨ２Ｏで６回、次いで飽和プラインで洗浄し、乾燥（
Ｍｇ８０４　）させ、かつ濃縮して黄色中固体（２６０
Ｉｎｇ）の生成物を得る。この粗生成物を酢酸エチルお
よびヘキサンで室温にて処理し、薄黄色固体（９１１１
１５７，５９チ）を得る。酢酸エチル−ヘキサンから再
結晶して分析上純粋な物質を得る。
融点１６９−１７０°。
例■　５−　（Ｎ　−（５’−カルボキシペンチル−１
′〕カルバモイル）−ジベンズ（ｂ、ｆ：ｌアゼピンの
牛血清アルブミン（ＢＳＡ　）への結合７ｄの乾燥ＤＭ
Ｆ中の１４０ダ（０，４ミリモル）のカルボヤシペンチ
ル酸（例■）の溶液〔血清キャップ（ｃａｐ　）のつい
た２　５　ｍｌ　ｃｒ）　Ｒ，Ｂ、フラスコ内の〕へ、
−１０ないし一１５°にて７０μｌのｍｔ３Ｎ　（約０
．５ミリモル）を添加し、続いて６２μｊ（約０．５ミ
リモル）のイソブチルクロロホルメートを添加する。得
られた白色スラリーを２時間−１０ないし一１５°にて
攪拌する。
上記混成酸無水物を、水冷浴中にて１５−の水および０
．０５　Ｎ　ＮａＯＨ中の２２０　ｙｒ９　（約０．０
０３ミリモル）のＢＡＡの溶液へ５０分間にわたり一８
．５−９．０で添加しく反応混合物の−は希求性Ｎ＆Ｏ
Ｈで８．５に維持する）、冷室で更に２時間攪拌する。
得られた反応混合物はわずかに混濁している。この溶液
を４１のＱ、１Ｍ　ＮａＨＣ！０３−Ｑｙ１ＭＮａ２Ｃ
Ｏ３緩衝液で６回、１２時間間隔で透析し、この方法を
水で繰り返して行う。
透析した溶液を０．２２　ｐミリボア（ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ　）を得る。この結合体をＵｖ分析にかけると、こ
の結合体中に６９０Ｉ〜ノテンが存在することがわかる
。
例■　５−　（Ｎ　−（２’−カルボキシエチル−１’
）−カルバモイル）−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンの牛
血清アルブミン（ＢＳム）への結合 乾燥ＤＭＦ　（４Ａモレキュラーシープ）中の６０５Ｉ
ｎ９（，００１ｍ）のＮ−（２−カルボキンエチルカル
バモイル）５−Ｈ−ジベンズ（ｂ、ｆ）アゼピンの攪拌
溶液へ、−５℃にて１６９μｌ　（，００１ｍ）のトリ
エチルアミンを加え、続いて１２６μｊ（，００１７ｙ
Ｌ）のインブチルクロロホルメートを加える。この混合
物を一５°にて１．５時間攪拌し、その後２０ゴのＤＭ
Ｆ中および０．１　Ｍ炭酸塩５Ｑｉｄ中の１．０１ｍ　
１７）ＥＳムの冷却溶液（０°）、ｐＨ９、へ、この混
合物を５分間にわたり滴下添加する。この反応混合物を
冷室中にて一夜攪拌する。−９の０．０５　Ｍ炭酸塩４
１で２回、次にｐＨ９，５の水性アンモニア４１で２回
透析し、続いて凍結乾燥すると１，０３５ｇｍの所望の
生成物が得られ、これはＵＶによりハプテン数６０と計
算される。
例！［５−（Ｎ−（５’−力ルボキシペンチルー１’）
カルバモイル）−ジベンズ〔す、ｆ〕アゼピンのグルコ
ース−６−リン酸テヒドロデナーゼ（（）　−６−ＰＤ
Ｈ）への結合Ａ０反応フラスコ中へ１２５μｌのＤＭＩ
Ｆ中の例■のカルボキンペンチル誘導体８．４　Ｉｎ９
（０，０５ミリモル）を入れ、そこへ当モル量のカルピ
トールクロロホルメートおよびトリエチルアミンを加え
、温度をおよそ−２０００に維持する。
次に上記混合物を１０Ｉｎ９のグルコース−６−リン酸
および２０〜のＭＡＤＨの存在下、温度４°にて０．６
ｄのＤＭＦを含有する−８．１の０．０５５　Ｍ　トリ
ス緩衝液中の１．９ｍ９／ｄのグルコース−６−リン酸
デヒＰｒ：１デナーゼの溶液へゆっくりと添加する。
次いで生成物を０．０５５　Ｍ　）リス、ｐｉ（８，１
、で４０時間（２１で４回）透析すると３ＦＬｔの透析
物が残る。
Ｂ、失活パーセントおよび阻害パーセントを測定する検
定方法は次の通りであるすなわち阻５−６の０．１　Ｍ
　ＮＡＤ溶液の２容量部と、−八９００．０５５　Ｍ　
）リスーＨ０Ｉ緩衝液中の肌１１Ｍのグルコース−６−
リン酸の６容量部とを合併する。
透析した結合体の一部を上記緩衝液で１：１００に希釈
する。検定溶液は、５０μｌの（（）−６−Ｆ　）　−
ＮＡＤ溶液、７５０μ！！７）緩衝液、失活が測定され
るか、あるいは阻害が測定されるかどうかにより、５０
μｊの緩衝液又は抗体を含有する緩衝液、および５０　
ｐｉの酵素結合体又は酵素対照から形成される。数部の
緩衝液は定量的な転移を確認するのに用いられる。溶液
を分光計に吸引し、ＮＡＤＨの生成割合を３４０ｍｍ、
３０°Ｃにて追う。
１分当りのＯＤの変化を２分目と６分目との間で測定す
る。酵素結合体は８８チ失活し、６５チ阻害されること
が認められる。
Ｃ１検定は種々の址のテグＶトール（Ｔθｇｒｅｔｏｌ
）で行われる。この検定は次のように行われる。
５０　ｐｉのサンプルは０．５％塩化ナトリウムを含有
する２５０μｌの緩衝液（ｐｉ（８，１，２５℃、０．
５５　Ｍ　）リス−Ｍｏｌ、０．０５％η〜ナトリウム
アジド、０．００５％ｗ／ｖチメロサールおよび０．０
１チヅｖ　トリトンＸ−１００（塩緩衝液）とともに１
ｒＩＬｌのカップ中に分与される。６０秒の平衡後５０
μ！の上記サンプル溶液を、１％ｗ／ｖ家兎血清アルデ
ミン、０．０６６Ｍグルコース−６−リン酸および０．
４　Ｍ　ＮＡＤモノナトリウム塩を含有する緩衝液中の
５０μｊの抗体溶液を加えた二番目のカップへ分与し、
続いて２５０μｌの塩緩衝液を分与する。最後に０．９
チｙ／ｙ　Ｈａｏｌおよび１％ｗ／ｖ　１１兎血清アル
デミンを含肩する緩衝液中の５０μｌの酵素結合体を加
え、続いて２５０μ！の緩衝液を添加する。この検定混
合物を分光計セル中に吸引し、１５秒後最初の吸光度を
読みとり、８０秒後に２回目の吸光度を読む。この読み
の差をＯＤ年単位して記載する。既知傘テグレトール（
ＴｅＨｒｅｔｏｌ）濃度の試料を用い、テグレトールを
含まないものと１μｓ／　ｍｌ　濃度との間の差を調べ
てみると１１０Ｄ単位であり、テグレトールを含まない
ものと１０Ｍｇ／ａｔとの間の差は５１単位である。
例Ｘ　５−カルバミル（Ｎ−ゾロパナリル）−５Ｈ−ジ
ベンズ（ｂ、ｆ）アゼぎンの製造１５０Ｍの乾燥ａＨ２
ｏｘ、　（３Ａモレキュラーシープ）中に９．７Ｍ（，
０１２ミリ）乾燥（４Ａモレキユラーシープ）ピリジン
を含有する溶液を急速に攪拌し、６．ＯＪｉ’　（，０
６−ｒ＝ｈ　）の乾燥ＣｒＯ３を加える。この溶液を乾
燥管により水分から保護し、水浴中にて６０分間攪拌す
る。７ゴの０Ｈ２０１２中のＮ−（３−ヒドロキシゾロ
ビルカルバモイル）５−Ｈ−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アぜピ
ン（２，９１Ｌ、０１　ｍ　）を一度に加え、反応混合
物を室温で４５分間攪拌する。溶液をフラスコから注ぎ
出し、タール状残留物を１５０ｄのＣ■２Ｃ１□で洗う
。溶液を合併し、１０　ｍｌ　１Ｎ　ＮａＯＨで６回、
１［］０ｄｌＮＨ０１で６回、１Ｑ［ｌ＋ｍの飽和Ｎａ
ＨＣＯ３で６回、飽和プラインで連続的に洗浄し、次い
でＮａ２　ＳＯ４で乾燥させる。すべての洗液をエーテ
ルでもどし洗浄する。エーテルもどし洗液物およびｃａ
２ａｘ２溶液を合併し、生成物から溶媒をとばす。油状
残留物を放置して結晶化させ、１．７１ｊ！の表題化合
物を得る（５９％）。ベンビン−石油エーテルから再結
晶させると白色固体、融点１２１−１２２．５°、が得
られる。
例Ｘｌ５−カルバミル−（Ｎ−プロパナリル）〜５Ｈ−
ジベンズ（ｔ＋、ｆ）アゼピンのＢＳＡへの結合 ４ＣＩＩｄの一７リン酸緩衝液（１，０２Ｍン中０６０
０〜ＢＳＡ（ベンテックス再結晶）の冷却溶液（５°）
へ、５Ｍメタノール中の例Ｘのアルデヒド２９４ダ（，
００１ｍ）を加える。わずかに濁った混合物へ６８４１
（、［３０１１ｍ）のナトリウムシアンボロヒドリドを
加え、ＫＨ２ＰＯ４を添加して−を７．６に調整する。
この反応混合物を冷室にて４０時間、次いで室温にて４
時間攪拌すると回り落ちてくる。この沈殿物を８Ｍ尿素
中に再懸濁させ、遠心分離にかけた後この溶液を上澄液
と合併し、４１の０．０５　Ｍ　Ｎａ２００３、−９、
で２回オヨＵ４１　ノＮＨ４ＯＨ，ｐＨ９，５で２回透
析する。凍結乾燥すると５８８ヤの結合体が得られ、こ
れはＵＶ測定でハプテン数２８が測定される。
例Ｘ［［５−カルバミル（Ｎ−プロパナリル）−５Ｈ−
ジベンズ（ｂ、ｆ〕アゼピンのＢＧＧへの結合 メタノール（１５Ｍ）をｐｉ（７００，２Ｍリン酸中の
６００　ｒｎｔｉの牛がンマグロプリン（ベンテックス
分画■）溶１Ｍ８０ｍ１へ添加する。この溶液を５゜に
冷却し、５ゴのメタノール中の２９３ｎＴ９（，００１
ｍ）のアルデヒｒ（例Ｘ）を加え、続いてすぐに６８ｍ
９（，００１１ＴｒＬ）のナトリウＡ　シフ　：ｙ　＄
　ロヒドリドを添加する。この混合物を１日冷室にで、
次いで２日目は室温にて攪拌する。混合物は回り落ちて
き、上澄液を再懸濁沈殿物（９Ｍ尿素）と合併する。
透析を２１６Ｍ尿素−０，０５Ｍ炭酸塩−９で一回、２
１４Ｍ尿素−０，０５Ｍ炭酸塩ｐＨ９で一回、２Ｍ尿素
−０，０５Ｍ炭酸塩ｐＨ９で一回、４１０．０５　Ｍ炭
酸塩ＰＨ９で２回、そして最後に４１　ｐＨ１０Ｎ）（
、ＯＨで２回透析する。透析後溶液は回り落ちてき、凍
結乾燥すると２２６　ｒｎ９の結合体が得られ、またこ
れはＵ４測定によりハプテン数１８であることが測定さ
れた。
例　　１ 例ｖＨの抗原を用いる抗体の産生評ｆｄ□検定において
本発明による化合物の効果を証明するために、例■の抗
原を用いて抗体を製造する。
この検定を行うにはＯ，０５５Ｍ　）リス−Ｈ０Ｉ　、
ｄ（８，１，２５°０　；　０．０５％ｗ／ｖ　ｆ　ト
リウムアジド；０．００５％ｗ／ｖチメｏｆ−ル；オよ
び２．０　ｗ量パーセントの塩化ナトリウム（Ｗ／Ｖは
１００ｒｒＬｌ当りのグラム）からなる緩衝液を用いる
。恢定は５０μｊの試料、たとえば血清、を２５０μｌ
の緩衝液の入ったカップへ移し、続いて１％ｙ／Ｖ家兎
血清アルデミン、０．０６６Ｍグルコース−６−リン酸
および０．４　Ｍ　ＮＡＤ　（モノナトリウム塩）を含
有する緩衝液中の５０μｌの抗体浴液を添加し、次いて
２５０μｌの緩衝液を添加することにより行われる。最
後に肌９％ｗ７ｖ　Ｎａ（３１および１　％　Ｗ／Ｖ家
兎血清アルブミンを貧有する緩衝液中５０μｌの例■の
酵素結合体を添加し、続いて２５０μｌの緩衝液を添加
する。この検定混合物を分光計セル中に吸引し、１５秒
後最初の吸光度を読み、８０秒後に２回目の吸光度を読
む。セルの温度は６０°０である。読みの差をＯＤ単位
×１０３として記載する。テグレトールを含まない試料
およびｉｌｌ当り１μＩのテグレトールを含む試料間で
２００Ｄ単位の差が得られる。
交叉反応性研究ではイミノスチルベンはテグレトールの
Ｉｎｇ／ｍと同等の反応にはおよそ１６７μ９／ｍ１以
上を必要とするが、類似構造をもつ他の化合物たとえば
カルパムアゼビンー１０．１１エポキシド、イミノラミ
ン、アミトリブチリンおよびデスメチルイミノラミンは
１０００ｐｊＩμ以上でもテグレトールの１ｍ！ｌ／Ｉ
ＬＩに等しい反応は示さない。
上記のデータから本発明でにテグレトールに非常に感受
性の強い、かつテグＶトール構造に特異的な抗体が製造
されうろことがわかる。更に鋭敏な効力検定は酵素、た
とえばグルコース−６−リン酸デヒドロデナーゼ、に結
合したテグレトール誘導体、を用いて展開されうる。
上述の発明は理解を明確にするために例示もしくは具体
例によっである程度詳述したが、ある程度の変化および
修正は特許請求の範囲内で行われうろことは明らかであ
る。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼（１） （式中ｍは０または１であり、Ｒ＾１は結合を表わすか
    又は唯一の不飽和として０から１個のエチレン不飽和部
    位と炭素に単独結合する０から１個の原子番号７〜８の
    ヘテロ原子とをもつ１から８個の炭素原子の脂肪族基で
    あり、但しｍが０である時Ｒ＾１は少くとも２個の炭素
    原子を有し、Ｙ＾１は少くとも分子量１，０００の抗原
    ポリアミノ酸であり、ｎ＾１は少くとも１であり、かつ
    Ｙ＾１の分子量を５００で割つたものより大きくない） で示される化合物 に応答して形成された抗体。
  2. （２）Ｙ＾１の分子量がおよそ１０，０００〜５００，
    ０００の範囲内にあり、かつｎ＾１が約４〜２５０の範
    囲内にある特許請求の範囲第１項の抗体。
  3. （３）Ｒ＾１が２〜６個の炭素原子を有するポリメチレ
    ンである特許請求の範囲第１項の抗体。
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