JP4711509B2 - 生物学的流体中のバンコマイシンの検出および定量化 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、試験試料中のバンコマイシンの定量化に関する。特に、本発明は、試験試料中のバンコマイシンの特異的定量化のための免疫原、そのような免疫原から調製した抗体、および蛍光偏光イムノアッセイに使用されることが好ましい標識試薬に関する。
【０００２】
発明の背景
過去３０年間、バンコマイシンはメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによって引き起こされるグラム陽性菌感染の治療のための薬物として選択されてきた。β−ラクタム抗生物質に対してアレルギーをもつ患者の細菌感染の治療にも使用されてきた。バンコマイシンはＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（以前はＮｏｃａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓと呼ばれた）によって産生される。バンコマイシンはグラム陰性菌に対して耐性である。他の抗生物質との交差耐性は未知であり、長期間使用されてきたにもかかわらず、治療中の耐性生物の出現に関する報告はわずかである。バンコマイシンは胃腸管からは吸収されないため、この抗生物質はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって腸で発症する全腸炎の治療に使用される。ナガラジャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ），Ｒ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４６：１１８１（１９９３）。バンコマイシンは、細菌細胞壁のペプチドグリカンの生合成に含まれるペプチド中間体と優先的に結合することによってその抗菌作用を発揮する。
【０００３】
バンコマイシンは腎を通って排泄される。この薬物の半減期は通常患者では５〜１１時間であり、腎不全患者では２〜５日まで伸び、透析患者ではさらに伸びる。バンコマイシンは比較的安全な薬物であるが、これまで観察された副作用としては腎毒性と自己中毒が挙げられる。
【０００４】
バンコマイシンを安全に投与するために、患者の血液中のバンコマイシン量の測定が慣例的に行われている。腎に障害のある患者の体内では薬物がより長期間存在するため、体内温度により長くさらされることになり、それによって結晶分解生成物（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ）ＩおよびＩＩ（ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩ）として知られる分解生成物の蓄積が起こることが示唆されている。ＣＤＰ−ＩとＣＤＰ−ＩＩは回転異性体であり、別々に単離することが可能である。バンコマイシンとこれら２つの主分解生成物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩをそれぞれ図１〜３に示す。
【０００５】
バンコマイシンは水性環境では使用できないことが知られている。ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）らに付与された米国特許第４，６７０，２５８号では、バンコマイシンと水溶液で薬物を安定化させると言われるトリペプチドとの組成物が開示されている。しかし、このようなトリペプチドはイムノアッセイ技術を妨害することがある。例えば、このような妨害は、分析物の同じ結合部位において抗体と安定化ペプチドが競合する場合に起こりうる。
【０００６】
歴史的に見て、生物学的流体中のバンコマイシン濃度は、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素増幅イムノアッセイ（ＥＭＩＴ）、または微生物学的方法によって測定されている。ＨＰＬＣはバンコマイシンのすべての定量法の中で最も正確であると当業者は考えているが高度に訓練された人と、すべての臨床的状況でいつも使用されるわけではない専門的な装置とを必要とする緩慢で労働集約的な方法である。
【０００７】
より最近では、蛍光偏光法がバンコマイシンの分析に使用されている。蛍光偏光法は、競合結合イムノアッセイの原理に基づいている。蛍光偏光における原理は、直線偏光によって励起された場合に、蛍光標識化合物がその回転速度に反比例する偏光度を有する蛍光を放出するということである。従って、蛍光標識トレーサー−抗体複合体は直線偏光によって励起され、光が吸収され発光する時間の間に蛍光体の回転が制約されるため、放出される光は偏光度が高いまま維持される。「遊離」トレーサー化合物（すなわち、抗体と結合していない）が直線偏光によって励起される場合は、競合結合イムノアッセイで生成する対応するトレーサー−抗体結合体よりも回転がはるかに速い。
【０００８】
蛍光偏光法および蛍光標識としての使用に適した化合物は、従来技術で開示されている。例えば、Ｋｉｒｋｅｍｏらに付与された米国特許第４，５１０，２５１号および第４，６１４，８２３号のそれぞれでは、アミノメチルフルオレセイン誘導体を使用するリガンドの蛍光偏光アッセイが開示されている。フィノ（Ｆｉｎｏ）らに開示された米国特許第４，４７６，２２９号には、蛍光偏光イムノアッセイに使用するための、バンコマイシン類似体を含む置換カルボキシフルオレセインなどの置換カルボキシフルオレセイン類が開示されている。ワング（Ｗａｎｇ）らに付与された米国特許第４，４２０，５６８号および第５，０９７，０９７号には、置換トリアジニルアミノフルオレセインをトレーサーとして使用する蛍光偏光イムノアッセイが開示されている。ワング（Ｗａｎｇ）に付与された米国特許第４，４２０，５５８号には、バンコマイシンとジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）の反応が開示されれている。しかし、この特許にはこのような反応の生成物の構造や、この反応の不均一系への適用については記載されていない。グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）ら（ＪＡＣＳ １１５，６４８２（１９９３））は、Ｃ末端にアルキル基、イミダゾール基、およびアミン基が結合したバンコマイシンの選択的合成方法を記載しており、別の官能基を有する誘導体の調製にもこの方法が有用であることを示している。しかしながら、免疫原性物質または免疫成分の合成、ならびにそれらのバンコマイシンの定量化への使用については記載されていない。
【０００９】
市販のバンコマイシン用蛍光偏光アッセイ（ＦＰＩＡ）を利用することができる。例えば、市販のアッセイ（アボット（Ａｂｂｏｔｔ）ＴＤＸ（登録商標）アッセイ、ＴＤＸＦＬＸ（登録商標）アッセイ、（以降、「市販のアボットバンコマイシンアッセイ」と呼ぶ））は、血清試料または血漿試料中のバンコマイシンの定量測定のための試薬を含む。これらのアッセイでは、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）で標識したバンコマイシン誘導体（以降、「市販のトレーサー」と呼ぶ）、およびバンコマイシンに対するヒツジポリクローナル抗体（以降、「市販の抗体」と呼ぶ）を使用する。
【００１０】
廃棄する放射性物質がなく、容易かつ迅速に実施可能な均一アッセイであるという点において、ＦＰＩＡはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）よりもすぐれている。しかし、市販のバンコマイシンアッセイではバンコマイシン測定値が場合により増加し、ＨＰＬＣ測定値と一致しないことがあるという報告がある。これらの増加は、ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩとの交差反応性の増加によるものである。前述のように、異性体ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩは別々に単離可能である。予想されるように、ＣＤＰ−Ｉから得られる任意の溶液は常に両異性体の平衡混合物を含む。従って、ここで報告されるＣＤＰ−Ｉ交差反応性の測定値は、平衡混合物の交差反応性の測定値である。
【００１１】
このように、生物学的流体中で、交差反応性分解生成物の存在下におけるバンコマイシン濃度を迅速かつ正確に測定可能である改善されたアッセイがなお必要とされている。従って本発明は、試験試料中のバンコマイシンの定量化のための特別な抗体試薬および標識試薬を提供する。本発明は、これらの特別な試薬を使用するイムノアッセイ法も提供する。このような抗体試薬の生成に使用される免疫原の調製のための合成手順、ならびにこのような標識試薬の調製手順も提供する。
【００１２】
バンコマイシン濃度測定のためのアッセイに使用可能である安定なバンコマイシンキャリブレータおよび対照試料を得るために使用可能であり、重要となる場合が多い抗体試料も提供する。
【００１３】
本発明によると、標識試薬および抗体試薬は、試験試料中のバンコマイシンの定量化のためのイムノアッセイに使用する場合、当技術分野において従来の公知の手順よりも優れている。特に、本発明の抗体試薬は代謝物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩとの交差反応性が実質的にないことを発見した。さらに、本発明の抗体試薬は、バンコマイシンの定量化のためバンコマイシン分子を安定化するポリペプチドの存在下で使用することができる。本発明ではこのようなポリペプチドの存在は、試料中のバンコマイシンの定量化を妨害しない。
【００１４】
発明の要約
本発明は、試験試料中のバンコマイシンの定量方法を提供し、本方法では、
（ａ）試験試料を、バンコマイシンと特異的に結合可能であり図６の免疫原（式中、Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が連続して直接結合することができ、この配列は−Ｏ−Ｏ結合を含むことはできず、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる）を使用して生成される抗体を有する抗体試料、および図８の標識試薬（式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｘは０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が連続して直接結合することができ、この配列は−Ｏ−Ｏ結合を含むことはできず、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる）と接触させて、反応溶液を調製し、
（ｂ）試験試料中のバンコマイシン量の関数として、抗体と結合するあるいは結合しない反応溶液中の標識試薬量を測定する。
【００１５】
本発明は、蛍光偏光が使用される上記方法をさらに提供する。
【００１６】
本発明の好ましい方法では、抗体は図６の免疫原を用いて生成され、標識試薬は図８に示されるものである。
【００１７】
さらに本発明は、バンコマイシンと特異的に結合する抗体を精製するために有用である図６の新規免疫原を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、バンコマイシンに対して特異的であり、ＣＤＰ ＩおよびＣＤＰ ＩＩとの交差反応性が実質的に存在せず、バンコマイシン上の任意の非ペプチド性部位と結合することができる抗体を提供する。特に、本発明の抗体は、バンコマイシンの安定化に使用される安定化ペプチド、特にポリペプチドと、バンコマイシンのペプチド結合部位に対する結合で競合しない。
【００１９】
本発明は、ＨＢ １１８３４と命名されるハイブリドーマ細胞株、およびその産生するモノクローナル抗体も提供する。このようなモノクローナル抗体は、バンコマイシンの定量のために最も好ましく、最も好ましくは蛍光偏光法によって行われる。
【００２０】
本発明は、バンコマイシンの定量に使用するための安定なキャリブレータも提供する。本発明のキャリブレータは水溶液の形態であり、ポリペプチドで安定化したバンコマイシン分子を含む。このポリペプチドは、抗体とバンコマイシン分子の結合を妨害しない。
【００２１】
抗体試薬と標識試薬とを有する、試験試料中のバンコマイシンの定量に有用なキットも提供する。好ましいキットは図６の免疫原から生成される抗体を有し、最も好ましくは図５の免疫原から生成されるモノクローナルＩｇＧ抗体である。
【００２２】
本発明は、このような抗体試薬の生成に使用される免疫原を調製するための合成手順、およびこのような標識試薬を調製するための合成手順も提供する。
【００２３】
図面の簡単な説明
本特許のファイルは、カラーで描かれた図面を少なくとも１つ含んでいる。カラーの図面を含む本特許の複写は、特許商標局に請求し必要な費用を支払えば入手できる。
【００２４】
図１は、バンコマイシンの構造を示している。
【００２５】
図２はバンコマイシンの主代謝物の１つであるＣＤＰ−Ｉの構造を示している。
【００２６】
図３は、バンコマイシンのもう１つの主代謝物であるＣＤＰ−ＩＩの構造を示している。
【００２７】
図４ａから４ｃはバンコマイシンと担体タンパク質のカップリングのための代表的合成経路を示している。
【００２８】
図５ａから５ｄは本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【００２９】
図６は、本発明の免疫原の構造を示している。
【００３０】
図７は、本発明の最も好ましい免疫原の構造を示している。
【００３１】
図８は、本発明の標識試薬の構造を示している。
【００３２】
図９は、本発明の最も好ましい標識試薬の一般構造を示している。
【００３３】
図１０ａおよび１０ｂは、本発明の方法によるバンコマイシンとフルオレセインのカップリングのための合成経路を示している。
【００３４】
図１１は、現行の市販用アッセイと、本発明の最も好ましい抗体を使用する本発明のアッセイとの相関結果を示している。
【００３５】
図１２は、本発明のアッセイとＨＰＬＣの相関を示している。
【００３６】
図１３は、本発明の蛍光偏光イムノアッセイの結果を示している。
【００３７】
図１４ａから１４ｃは、Ｎ−バンコサミニル、Ｎ−メチルロイシル、カルボキシル−ＨＤＡから誘導されるトレーサーの合成の化学的手法を示している。
【００３８】
図１５は、ビオチン活性エステル（２）、６−カルボキシフルオレセイン活性エステル（３）、およびアクリジニウム化学ルミネセンス標識（４）を示している。これらの化合物は、図１４に示されるＮ−バンコサミニルから誘導されるトレーサー、およびカルボキシル−ＨＤＡから誘導されるトレーサーの合成のための種々の化学的手法に使用される。
【００３９】
図１６ａおよび１６ｂは、バンコマイシン類似体およびトレーサーの構造を示している。
【００４０】
図１７は、環−２デクロロバンコマイシン（●で示される）およびビオチン標識カルボキシル−ＨＤＡバンコマイシントレーサー（○で示される）の平衡解離定数を求めるための溶液競合曲線を示している。
【００４１】
図１８は、バンコマイシンと細胞壁ペプチド類似体（ＮαＮε−ジアセチル）ＫＡＡの間の結合相互作用のモデルを示している。点線は水素結合を表す。
【００４２】
図１９は、バンコマイシン、抗バンコマイシンＦａｂフラグメント、およびバンコマイシン／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント複合体の、アミノカプロエート誘導（Ｎε−アセチル）ＫＡＡトリペプチドバイオセンサー表面への結合を示している。
【００４３】
図２０は、本発明の抗体が結合するバンコマイシンの部位を示している。特に、本発明の抗体は、黒、赤、および緑で示される領域と結合する。しかし、本発明の抗体は青で示されるペプチド結合領域とは結合しない。
【００４４】
図２１は、化学ルミネセンストレーサーであるバンコマイシニル−Ｎ−メチルロイシルアクリジニウムを示している。
【００４５】
発明の詳細な説明
本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、以下の用語はそれぞれこのような意味を有する：
「ヘテロ原子」は窒素、酸素、硫黄、およびリンを意味する。
【００４６】
「ＣＨＣｌ３」はクロロホルムを意味し、「ＣＤＣｌ３」はジューテロクロロホルムを意味し、「ＭｅＯＨ」はメタノールを意味し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味し、「ＣＨ２Ｃｌ２」は塩化メチレンを意味し、「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルを意味し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを意味する。
【００４７】
「連結部分」、「つなぎ」、「スペ−サー」、「スペーサーアーム」、および「リンカー」は交換可能に使用され、ある定義された物質（ハプテンなど）を第２の定義された物質（免疫原性担体または検出可能部分など）と分離する任意の共有結合を規定する化合物部分を意味する。
【００４８】
「安定」は、水性環境におけるバンコマイシンの、その分解生成物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩへの時間の関数としての変化を意味する。本明細書で記載されるように、本発明のキャリブレータは少なくとも２か月間安定である。
【００４９】
「ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩとの交差反応性が実質的にない」とは、本発明の抗体と代謝物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩの交差反応性が、本明細書の表３に示されるようにバンコマイシンの分析の感度を下回ることを意味する。
【００５０】
「非ペプチド性部位」は、バンコマイシン分子上のペプチド結合部位以外の任意の部位を意味する。
【００５１】
本発明は、バンコマイシンの定量への使用に好適である免疫原、そのような免疫原から調製される抗体、および標識試薬を提供する。バンコマイシンの特異的定量は、最初に試験試料を、本発明の標識試薬（本明細書ではトレーサーともよぶ）および本発明の抗体試薬と、同時またはどちらかの順序で連続的に接触させ、次に、抗体試薬との結合反応に関与したまたはしなかった標識試薬量を試験試料中のバンコマイシン量の関数として測定することによって行われる。本発明の抗体および標識試薬は、バンコマイシンの特異的定量のための蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）において特に有用である。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様によると、標識試薬および抗体試薬は蛍光偏光イムノアッセイで使用され、特異性に迅速性および均一法の利便性が加わって、試験試料のバンコマイシンの信頼性の高い定量が行え、さらにバンコマイシンの主代謝物であるＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩによる妨害が避けられる。
【００５３】
試験試料は、天然の体液、あるいはその抽出物または希釈物であってよく、限定するものではないが、全血、血清、血漿、尿、便、唾液、脳脊髄液、脳組織などが挙げられる。
【００５４】
当業者には公知であるが、特異的抗体と相補的な標識ハプテンとを調製する場合、抗体反応を誘発するために使用される免疫原と標識ハプテンの両方の化学構造を考慮する必要がある。従来、選択的抗体を得るために重要であるハプテン特有の部分から離れたハプテン上の部位で、ハプテンと担体タンパク質を結合させている。同様に、このような抗体と結合可能な標識ハプテンを調製する場合、慣例的に、担体タンパク質をハプテンと結合させるために使用される部位と同じハプテンの部位に標識を結合させている。このようなことを行う理由の１つは、担体タンパク質によって、ハプテンの一部への免疫系の関与が立体的に妨害される可能性があるからである。相補的な標識ハプテンは、免疫原として担体タンパク質を結合させる部位と同じハプテンの部位に標識を結合させることによって合成され、そのためハプテンの重要な部分と抗体との結合が妨害されない。
【００５５】
従って、バンコマイシンの別の部位に結合することによって誘導される本発明のバンコマイシン免疫原によって、バンコマイシンに特異的な抗体と、バンコマイシンの主代謝物に対して優れた交差反応特性を有する分析法が開発されることは驚くべき予想外の発見であった。最も驚くべき発見は、この分析の感度の限界に関するものであり、ＨＢ １１８３４から産生されるモノクローナル抗体が、ＣＤＰ、特にＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩに対して実質的に交差反応性を示さないことである。さらに、このモノクローナル抗体がペプチド結合部位とは結合しないということも驚くべき発見であった。これによって、バンコマイシンの定量のための改善された分析法が開発でき、安定なキャリブレータおよび対照物質を使用することができる。
【００５６】
免疫原の合成
ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方の本発明の抗体は、図６の一般式で示されるようにバンコマイシンのカルボン酸を介して担体タンパク質と結合するバンコマイシン分子から調製される免疫原を使用して生成され、式中Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは連結部分である。
【００５７】
本発明の免疫原において、好ましくはＸは、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が直接結合することができ、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる。
【００５８】
当業者であれば理解できるように、免疫原性担体物質Ｐは従来公知である任意のものから選択することができる。ほとんどの場合では、Ｐはタンパク質またはポリペプチドであるが、十分な大きさおよび免疫原性を有する炭化水素、多糖類、リポ多糖類、ポリ（アミノ）酸、核酸などの他の物質を使用することもできる。好ましくは、免疫原性担体物質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリンなどのタンパク質である。
【００５９】
好ましい免疫原では、Ｐはチログロブリンであり、Ｘは−ＮＨ（ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）−である。最も好ましい免疫原は図７に示される。しかし、式７の化合物が、バンコマイシンおよび免疫原性担体の１種類の複合体のみに限定されるものではないことは当業者であれば理解できよう。すなわち、バンコマイシン誘導体と免疫原性担体の比は、免疫原性担体Ｐ上で化学的に利用可能な官能基数によって定まり、これらの２種類の物質の比は合成において制御することができる。Ｐのバンコマイシン誘導体による置換度は、免疫原性担体上の利用可能な官能基の１〜１００％の間で変動させることができる。この置換度は、１０％〜９５％の間が好ましく、より好ましくは１５％〜８５％の間である。
【００６０】
前述のように、本発明の免疫原性複合体は、バンコマイシンのカルボン酸末端を介してバンコマイシンと担体物質とをカップリングさせることによって調製される。図４ａ〜４ｃに示されるように、当業者には公知である方法によって、バンコマイシンをＶ−Ｘ−Ｙで表される二官能性化合物とカップリングされ、式中Ｘは連結部分であって、Ｖ−および−Ｙは官能基であり、これらの官能基の１つはバンコマイシン（Ｉ）のカルボン酸と反応することができ、もう一方はＰの化学的に利用可能な官能基と反応することができる。多くの二官能性リンカーが当技術分野において公知である。例えば、ヘテロ二官能性リンカーは、例えばビエニアルツ（Ｂｉｅｎｉａｒｚ）らに付与された米国特許第５，００３，８８３号に記載されている。ヘテロ二官能性リンカーは、官能基の一方に関する末端が特異的となるため好ましくなる場合がある。同様に、免疫原合成を好都合に行うために、当業者には公知であるか容易に習得できる技術によって、希望するときに官能基Ｖ−および−Ｙを保護し、脱保護することができる（例えば、Ｔ．Ｗ．グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびＰ．Ｇ．Ｍ．ワッツ（Ｗｕｔｔｓ），「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．（有機合成における保護基第２版）」１９９１，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）を参照されたい）。
【００６１】
一般に、本発明の免疫原の調製において、Ｖは−ＯＨ、−ハロ（−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）、−ＳＨ、または−ＮＨＲ’−からなる群より選択され、式中Ｒ’はＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールから選択される。Ｙは、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、アミノ（−ＮＨ２）、アルデヒド（−ＣＨ（＝Ｏ））、またはアジド（−Ｎ３）からなる群より選択することができる。前述したように、Ｘは、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が直接結合することができ、Ｖ−Ｘ−Ｙの並びはＯ−Ｏ結合を含むことはできず、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる。
【００６２】
図４ａ〜４ｃに示される代表的な合成図式を参照すると、バンコマイシン（図４ａ）とＶ−Ｘ−Ｙの反応によって、官能基Ｙの結合した連結部分Ｘを有する連結中間化合物（図４ｂ）が生成する。当業者には公知である数種類の方法の任意のものによって、官能基−Ｙを免疫原性担体の官能基と反応させることができる。アミド結合を形成することが好ましく、通常この結合は安定である。アミド結合は、最初にＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの添加剤を加えて１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの活性化試薬と反応させることによって、スペーサーアームのカルボン酸部分［Ｙ＝（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）］を活性化させることで形成される。次に活性化形態（図４ｂ参照）を、免疫原性担体物質を含む緩衝液と反応させる。あるいは、カルボン酸基を、反応性の高い無水物、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾリド混合物、またはカーボネート混合物に転化させて、単離を行うかまたは行わないで、免疫原性担体物質と結合させることもできる。当業者には容易に明らかとなるように、上述のもの以外にアミド結合を形成するために使用できる試薬は多数存在し、このような試薬については特に挙げる必要はないであろう。
【００６３】
あるいは、末端アミン官能基（Ｙ＝−ＮＨ２）を有するスペーサーアームは、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミドなどの好適な溶媒中でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートと反応させることによって、反応性の高いＮ−ヒドロキシスクシンイミドウレタンを生成することができる。次に、得られたウレタンを緩衝水溶液中の免疫原性担体と反応させると免疫原が得られる。
【００６４】
さらに、末端アルデヒド官能基［Ｙ＝−ＣＨ（＝Ｏ）］を有するスペーサーアームは、当業者に公知の方法による還元的アミノ化によって、水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下で緩衝水溶液中において免疫原性担体とカップリングさせることができる
あるいは、アルコール基［Ｙ＝−ＯＨ］を含むスペーサーアームは、ホスゲン、あるいはジホスゲン、トリホスゲン、またはカルボニルジイミダゾールなどのホスゲン同等物とまず反応させ、反応性の高いクロロギ酸エステルまたはイミダゾロギ酸エステル誘導体（通常は単離しない）を生成することによって、免疫原性担体物質とカップリングさせることができる。得られた活性ギ酸エステルを、次に緩衝水溶液中で免疫原性担体と反応させる。
【００６５】
あるいは、Ｙ＝−Ｎ３の場合は、連結中間体は、緩衝水溶液中の光分解によって免疫原性担体とカップリングさせることができる。
【００６６】
図６の好ましい免疫原は、図５ａ〜５ｄの図式に従って調製される。バンコマイシンのカルボキシル基（図５ａ参照）は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を用いて活性化される。さらにリンカーの４−アミノ酪酸メチルエステル［Ｖ＝−ＮＨ２、Ｘ＝−（ＣＨ２）３−、Ｙ＝−ＣＯ２Ｈ］と反応させた後で加水分解を行って、連結中間体［Ｘ＝−（ＣＨ２）３−、Ｙ＝−ＣＯ２Ｈ］を得る。次にＹを１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）で活性化させ、Ｐとカップリングさせる。当業者であれば、ペプチド結合形成の他の方法も同様に首尾よく使用することができることが分かるであろう。
【００６７】
このように、今述べた方法では、バンコマイシンは、従来技術で公知の種々の方法によって、この部位およびアミンまたはアルコールなどの分子の他の反応性部位で、免疫原性担体物質とカップリングさせることができ、ここでＰは前述と同様の免疫原性担体物質である。
【００６８】
さらに、ハプテンを担体物質と結合させるための類似の方法では、スペーサーアームの反応性基と相補的な意味で反応性であるアミノ基、水酸基、またはカルボキシル基などの官能基を有する固体支持体とスペーサーアームを結合させることができる。この方法によって、ハプテンに対する抗体の分離または生成に使用することができる固体相が得られる。このようなカップリング技術も当技術分野において公知である。
【００６９】
本発明の抗体
ａ．抗体の生成
本発明の免疫原は、当技術分野において公知である方法に従って、ポリクローナルとモノクローナルの両方の抗体の調製に使用することができる。一般に、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、またはウマなどのホスト動物に、免疫原の種々の部位の１種類以上が通常アジュバントとの混合物として注入される。その後、血液を採取して抗体力価の測定を行いながら、最適な力価に到達するまで、規則的または不規則な間隔で同じ部位または異なる部位をさらに注入する。ホスト動物の血液を採取して抗血清を得るか、あるいは体細胞交雑技術または他の当技術分野で公知の技術によってモノクローナル抗体を得るかのいずれかによって抗体が得られ、例えば−２０℃でこれを貯蔵することができる。無傷の免疫グロブリン以外に、本明細書で使用される抗体という用語は、公知の方法によって生成することができる免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖも含んでいる。
【００７０】
市販の抗体を本発明の好ましい抗体に置き換えるだけで、バンコマイシンアッセイの性能が向上することの注目されたい。
【００７１】
本発明の好ましい方法は、検出を意図していない代謝物との結合が分析の精度に影響を与える程度には結合しない抗体を使用し、特に代謝物はＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩであるということも注目されたい。
【００７２】
ｂ．本発明の抗体の特異性および結合親和性
本発明の免疫原によって生成する抗体はバンコマイシンに対して特異的であり、代謝物のＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩに対しては実質的に交差反応性を示さない。
【００７３】
さらに、本発明の抗体はバンコマイシン分子の任意の非ペプチド性部位と結合する。本発明の抗体は結合しないバンコマイシンのペプチド結合部位は、図２０に青色で示している。本発明の抗体が結合するバンコマイシン分子の非ペプチド性部位は、図２０に黒、赤、および緑で示している。好ましくは本発明の抗体は、図２０の２つの糖部分（赤で示される）、および図２０の塩素化フェニル（緑で示される）と結合する。
【００７４】
本発明の抗体はバンコマイシンのペプチド結合部位とは結合しないので、バンコマイシンのペプチド結合部位は安定化ペプチドの結合のために残される。ペプチド結合部位にペプチドが結合することによって、水溶液中のバンコマイシンを安定化することができる。バンコマイシンの安定化に使用することができるペプチドは、バンコマイシンとの結合親和性を有することが知られているポリペプチドである。好ましいポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸残基を含み、その構造中にα，ε−ジＡｃ・Ｌ−ｌｙｓ・Ｄ−ａｌａ・Ｄ−ａｌａのフラグメントを含むポリペプチドである。
【００７５】
バンコマイシン分子のペプチド結合部位以外の部位に対して結合親和性であるため、バンコマイシン濃度測定用アッセイに使用可能なバンコマイシンのキャリブレータおよび対照試料を作製するために、本発明の抗体を使用することができる。本発明のキャリブレータおよび対照試料は水溶液であり、ポリペプチドで安定化したバンコマイシン分子を含む。上述の１種類以上のポリペプチドを、バンコマイシン分子の安定化に使用することができる。バンコマイシン分子の安定化に使用されるポリペプチドは、抗体とバンコマイシン分子の結合を妨害しない。本発明のキャリブレータは、少なくとも２か月間安定であり、好ましくは６か月間、最も好ましくは１年を超える期間安定である。
【００７６】
標識試薬の調製
前述したように、本発明の標識バンコマイシン試薬は、バンコマイシンの二級アミノ末端、すなわち担体タンパク質が結合する位置とは異なる位置で標識と結合させることによって調製される。
【００７７】
バンコマイシン用の本発明の標識試薬は、図８で示される一般式を有し、式中Ｑは化学ルミネセンス部分または蛍光性部分などの検出可能部分であり、Ｘは連結部分である。好ましい標識試薬では、Ｑは、４’−アミノメチルフルオレセイン、５−アミノメチルフルオレセイン、６−アミノメチルフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５および６−アミノフルオレセイン、チオ尿素フルオレセイン、およびメトキシトリアジニルアミノフルオレセインからなる群より選択されるフルオレセイン誘導体、あるいはバンコマイシン−Ｎ−メチルロイシルアクリジニウムなどの化学ルミネセンス部分であり；Ｘは好ましくは、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が直接結合することができ、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる。より好ましい標識試薬では、ＱはクロロトリアジニルアミノフルオレセインでありＸ＝０である、すなわちバンコマイシン誘導体が直接フルオレセイン誘導体と結合する。本発明好ましい標識試薬は図９に示される構造を有する。
【００７８】
免疫原性複合体の合成と類似の方法において、まず１級アミノ基を他と異なるように保護し（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｔｓ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ」、１９９１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ参照）、続いて２級アミノ基を検出可能部分と選択的に反応させることによって、本発明の標識試薬はバンコマイシンから合成される。
【００７９】
より具体的には、好ましい標識試薬は、図１０ａおよび１０ｂに示されるように合成することができ、（ｉ）バンコマイシン基剤と希ＨＣｌをｐＨ６．０で反応させて１級アミノ基を４級化窒素として保護し、続いて（ｉｉ）これをジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）と反応させることによって標識試薬を得ることができる。
【００８０】
最も好ましい態様では、上記合成方法が図９の標識試薬の生成に使用される。
【００８１】
蛍光偏光イムノアッセイを使用するバンコマイシンアッセイ
本発明の試薬を使用する蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）方式に従って、試験試料のバンコマイシンの濃度または量を正確に定量することができる。バンコマイシンの特異的定量のためのＦＰＩＡを実施するために、バンコマイシン濃度が既知であるキャリブレータから検量線が作成される。
【００８２】
一般に、蛍光偏光法は、ある特性波長の直線偏光によって励起された場合に、入射励起光に対して偏光度が保持される別の特性波長の光（すなわち蛍光）発し、この偏光度が所与の媒体中のトレーサーの回転速度と反比例の関係にあるという原理に基づいている。この性質によって、粘稠溶液相中に存在する、または回転速度が比較的より遅い他の溶液成分と結合するなどによって回転の制限されたトレーサー物質は、放射光の偏光度が、自由な溶液中にある場合よりも比較的大きな値に保持される。従って、リガンドとトレーサーが抗体との結合で競合する時間範囲内で、トレーサーとリガンドの結合速度から、遊離トレーサーと結合トレーサーの適切な比が得られ、選択性、感度、および精度などの重要な性能パラメータは維持される。
【００８３】
本発明によるバンコマイシンの特異的定量のための蛍光偏光イムノアッセイを行う場合、バンコマイシンを含むと思われる試験試料を、本発明の標識試薬の存在下で本発明による免疫原を用いて調製した抗血清またはモノクローナル抗体と接触させる。次に直線偏光を溶液に通過させて蛍光偏光応答を得て、この応答を試験試料中に存在するバンコマイシン量の測定値として検出する。
【００８４】
蛍光偏光アッセイは、市販の自動化装置（例えば、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＴＤＸ（登録商標）、およびＴＤＸＦＬＸ（登録商標））で行うことができる。
【００８５】
本発明によると、図６に示す免疫原から誘導される抗体と図８の蛍光標識試薬を使用した場合に、バンコマイシンの定量に関して優れた蛍光偏光イムノアッセイ結果が得られるという予想外で驚くべきことが分かった。
【００８６】
特に、図９の標識試薬を図７の免疫原に対する応答で生成するモノクローナル抗体と組み合わせて使用することでバンコマイシンの主代謝物のＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩに対する交差反応性が非常に低く、実質的に０である（すなわちこのアッセイの感度限界より低い）アッセイが行えるという予想外で驚くべきことが分かった。名称ＡＴＣＣ ＨＢ １１８３４のハイブリドーマから産生されるモノクローナルＩｇＧ抗体を使用する蛍光偏光法が最も好ましい。
【００８７】
抗体と結合するトレーサーの量は、試験試料に存在するバンコマイシン量と反比例して変動する。従って、バンコマイシンおよびトレーサーの抗体結合部位に対する相対的な結合親和性がこのアッセイ系の重要な要素である。
【００８８】
他のアッセイ方式
蛍光偏光イムノアッセイ以外に、本発明によるバンコマイシン定量方法に従って、種々の他のイムノアッセイ方式を実施することができる。一般に、このようなイムノアッセイ系は、免疫グロブリンの能力、すなわち全抗体またはそのフラグメントの試験試料の特定の分析物に結合する能力に依存し、この場合標識試薬または検出可能試薬は結合量を求めるために使用される。このような検出可能標識としては、限定することを意図するものではないが、酵素、放射性標識、ビオチン、毒素、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リポソーム、発色団、限定するものではないが図２１に記載されるものなどの化学ルミネセンス、着色粒子および着色微粒子、および前述のような蛍光性化合物が挙げられる。
【００８９】
通常、このようなイムノアッセイ系方式における結合量は、標識試薬中に存在する、分析物との結合反応によって沈殿したまたはしなかった検出可能部分の量によって求められ、検出され測定された検出可能部分量を、試験試料中に存在する分析物の量と相関させることが必要である。例えば、競合イムノアッセイ系では、測定される物質（リガンドと呼ばれることが多い）は、リガンドと構造が非常によく似ており検出可能部分がカップリングした物質（トレーサーと呼ばれることが多い）と、リガンドおよび構造が類似しているトレーサーの１つ以上の部分に対して特異的である抗体の限られた数の結合部位に関して競合する。
【００９０】
試験キット
本発明による試験キットは、試験試料中のバンコマイシンの定量のための所望のイムノアッセイを行うために必要な試薬を含む。試験キットは、必要な試薬を含む１つ以上の容器の組み合わせ、および／または試薬が相溶性となる組成物または混合物としての製品包装形態にすることができる。好ましくは試験キットは、アッセイを行うために必要なすべての試薬、標準物質、緩衝液、希釈剤などを含む。
【００９１】
バンコマイシンの定量に関して前述した蛍光トレーサー化合物および抗体を含む、試験試料中のバンコマイシンの定量のための蛍光偏光イムノアッセイ用試験キットが特に好ましい。当然ながら試験キットは、当技術分野において公知であり使用者の観点から望ましいと思われる他の物質を含むことができることは理解できるであろうし、このような物質としては試料予備処理溶液、緩衝液、希釈剤、標準物質などが挙げられる。
【００９２】
限定することを意図するものではない以下の実施例によって本発明を説明する。
【００９３】
実施例１．バンコマイシン免疫原の合成
ａ）４−アミノ酪酸メチルの合成
４−アミノ酪酸（５．００ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）を２００ｍｌ丸底フラスコに入れる。ジメトキシプロパン（８０ｍｌ、６５ｍｍｏｌ）を撹拌しながらフラスコに加える。濃塩酸（１５ｍｌ）を反応混合物に加え、室温で終夜撹拌する。加熱せずにロータリーエバポレーターを使用して減圧下で溶媒を除去する。得られた固形分を最小限の量のＭｅＯＨに溶解し、エーテルで再沈殿させる。沈殿した固形分を吸引ろ過し、Ｅｔ２Ｏ（２×５０ｍｌ）で洗浄する。得られた固形分（収量：６．９ｇ（９６％））を次に減圧乾燥する。
【００９４】
遊離アミンの１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．１（５重項、２Ｈ）、２．５（３重項、２Ｈ）、３．２（ブロードな３重項、２Ｈ）、３．７（１重項、３Ｈ）、８．１（１重項、２Ｈ）。
【００９５】
ｂ）バンコマイシン−アミノ酪酸誘導体の合成
バンコマイシン（５００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）基剤を２５ｍｌ丸底フラスコに入れる。ＤＭＳＯ（４ｍｌ）を加えて、必要であれば温めながら透明な溶液が得られるまで撹拌する。実施例１（ａ）の４−アミノ酪酸メチル（５０６ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、さらにヒドロキシベンゾトリアゾール（１０５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．０９７６ｍｌ、０．６９ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物をＮ２雰囲気下で室温において３〜７日間撹拌する。反応はＨＰＬＣで追跡する。出発物質が消費されてから、沈殿した固体をろ過して除去し、ろ液を後述のＣ−１８カラムを使用する逆相ＨＰＬＣによって精製する。採取した分画を凍結乾燥する（収量：３１０ｍｇ）。
【００９６】
分析用ＨＰＬＣ条件は以下のとおりである：カラムは７．８ｍｍ×３００ｍｍのＣ−１８（Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ−１８、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、マールボロ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ）、マサチューセッツ州）であり、アセトニトリル：酢酸アンモニウム（５０ｍＭ）の連続的グラジエント移動相（１５分間で１０％アセトニトリルから５０％アセトニトリル）を使用し、流速は３．０ｍｌ／分である。検出は２５４ｎｍで行う。
【００９７】
分取ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：カラムは１９ｍｍ×２５０ｍｍのＣ−１８（Ｄｙｎａｍａｘ ６０Ａ Ｃ−１８、レイニン（Ｒａｉｎｉｎ）、ウォーバーン（Ｗｏｂｕｒｎ）、マサチューセッツ州）であり、アセトニトリル：酢酸アンモニウム（５０ｍＭ）の連続的グラジエント移動相（１５分間で１０％アセトニトリルから５０％アセトニトリル）を使用し、流速は８．０ｍｌ／分である。検出は２５４ｎｍで行う。
【００９８】
質量分析（ＭＳ）：電子スプレーイオン化法（ＥＳＩ）ＭＨ＋１５４７、（ＭＨ２）２＋７７４。
【００９９】
ｃ）バンコマイシンハプテンの合成
実施例１（ｂ）のバンコマイシン−アミノ酪酸エステル誘導体（１６５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を２５ｍｌ丸底フラスコ中でＤＭＦ／水（２ｍｌ：３ｍｌ）に溶解する。このフラスコを０℃に冷却し、ＬｉＯＨを加えて２時間撹拌し、室温まで温めて、ＨＰＬＣで反応を追跡する。出発物質が消費されてから、逆相カラムを使用する分取ＨＰＬＣで直接反応物質を精製する。溶媒を凍結乾燥して生成物（収量：１６０ｍｇ）を得る。分析用ＨＰＬＣおよび分取ＨＰＬＣの両方は前述の通りである。
【０１００】
質量分析（ＭＳ）：ＥＳＩ ＭＳより（ＭＨ）＋が１５３３で得られ、これはバンコマイシンに結合した加水分解リンカーの正確な分子量を示している。
【０１０１】
ｄ）免疫原の合成
チログロブリン（１００ｍｇ、０．０００２ｍｍｏｌ）をリン酸二水素ナトリウム緩衝液（５ｍｌ、希薄ＮａＯＨでｐＨを６．７に調整）に溶解する。実施例１（ｃ）のバンコマイシンハプテン（５０ｍｇ、０．０３２１ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥＤＡＣ（９．２ｍｇ、０．０４８２ｍｍｏｌ）を加える。得られた反応混合物を室温で２日間撹拌する。内容物を膜に移して、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（一塩基性、ＮａＯＨでｐＨ７．８に調整）を用いて溶媒を４時間ごとに交換しながら２日間透析する。透析袋の内容物を凍結乾燥して、所望の免疫原１３０ｍｇを得る。
【０１０２】
実施例２．抗バンコマイシン抗体１５−１０９−５９２の生成
メス、６〜８週齢のＲＢＦ／ＤｎＪマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーハーバー（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）、メイン州）を、フロイントのアジュバント（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州）で乳化した実施例１のバンコマイシン免疫原で免疫する。一次免疫ではフロイントの完全アジュバントを用いて投与し、続く追加免疫ではフロイントの不完全アジュバントを用いて投与する。この長期免疫化動物の追加免疫間隔は１週間、３週間、５週間、１２週間、１７週間、および２４週間であり、それぞれの投与量は１匹当り２５、１２．５、１２．５、１０、１０、および１０μｇであり、最初の３回の追加免疫では１つの皮下部位および１つの腹膜内部位に行い、最後の３回の追加免疫では毎回２つの皮下部位で行う。定期的に、採血を行い、抗体応答の進行を確認する。７週間の停止期間の後、動物の脾臓に１０μｇの追加免疫を行い、細胞融合を行った。
【０１０３】
細胞融合を行う日に、迅速な頚椎脱臼によってマウスを安楽死させ、脾臓を摘出する。脾細胞をイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）変法ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）培地（ＩＭＤＭ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）で１回洗浄し、１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離する。ペレット状になった脾細胞をＳＰ２／０ミエローマ細胞（Ｄｒ．ミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＵＫ）と１：１の比で混合し、ＩＭＤＭで洗浄して、遠心分離する。上澄液を除去し、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；アメリカン・タイプ・ティシュー・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）を１分間ペレットに加え、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ Ｇｉｂｃｏ）、および１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ハイクローン・ラボ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ユタ州）を含むＩＭＤＭに再懸濁させる。細胞融合頻度を向上させるために、０．５％ｖ／ｖのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍマイトジェン（ＳＴＭ；ＲＩＢＩ免疫化学研究所（ＲＩＢＩ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）モンタナ州）と１％ｖ／ｖのＯＲＩＧＥＮ（イゲン（Ｉｇｅｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）とを融合細胞浮遊液に加え、２４ウェル組織培養プレートに配置する。
【０１０４】
細胞融合の最初のスクリーニングを、集密的培養の１０日目に行った。市販のアッセイ（ＴＤＸ（登録商標）、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用して、上澄試料の抗バンコマイシン反応性を検出する。組織培養の上澄を試料ウェル２つずつに入れ、市販のキャリブレータキットのＡキャリブレータ（バンコマイシン０μｇ／ｍｌ）またはＦキャリブレータ（バンコマイシン１００μｇ／ｍｌ）のいずれか１０μｌを希釈前のウェルに加える。希釈緩衝液を試薬パックのＳポットとＰポットに入れ、市販のトレーサーはＴポットに入れて使用する。ハイブリドーマ培養上澄液は非常に希薄であるため、試料体積を９０μｌに増加させる。試料の偏光を測定し、Ｆキャリブレータの存在下での偏光の減少を基準にして、ただ１つのハイブリッド１５−１０９が、バンコマイシンに特異的であると同定される（表１参照）。遊離のバンコマイシンが抗体と結合し、トレーサーの結合が阻害されるためであり、それによって信号の減少が起こる。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
ハイブリッド１５−１０９は、１−１００から１−１００，０００までで限界希釈法を行うことによりクローニングを行う。クローニング培地は、１０％ｖ／ｖＦＢＳと１％ｖ／ｖＨＴサプリメント（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を含むＩＭＤＡである。２００μｌの細胞浮遊液を、９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに加える。
【０１０７】
新しく１５−１０９−１３３と命名されたハイブリットは、集密的培養の上澄のクローンニングのさらなるスクリーニングに基づいてさらに評価するために選択される。
【０１０８】
アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ろ過システムを使用して、モノクローナル抗体ハイブリッド１５−１０９−１３３をまず１０倍に濃縮する。次に、飽和硫酸アンモニウム（５０％）を使用して未処理抗体（抗体はなおウシ胎児血清中にある）を分画する。次にこの溶液を４０００ＲＰＭ（回転／分）で遠心分離して、上澄を廃棄する。得られたペレットを濃縮後の元の体積の１／１０の体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に差懸濁する。この抗体溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で透析し、透析後に市販の緩衝液（リン酸塩、アジド、およびウシγグロブリンの緩衝液）を使用して以下のように希釈する：希釈せず、１：２、１：４、１：８、１：１６、および１：３２。前述の同じモード１のバンコマイシンアッセイの２（２０μｌ）ではなく、１０（１００μｌ）の試料体積で試料ウェル２ずつに試料を注入する。前述のようにして装置によってｍＰ（ミリ偏光値）を計算し、最も高いｍＰが得られる抗体の希釈率を、試薬キットのＳポット（抗体ポット）に使用する抗体の希釈率として選択する。抗体を、１０％グリセロールと５％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液で希釈する。トレーサーポットはＨＰＬＣで再度精製した既存の市販のトレーサーを含み、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（＋０．７％ＳＤＳおよび０．５％ＬＤＳ）で希釈される。この精製したトレーサーをトレーサーポット中で１．７μｇ／ｍｌまで希釈する。ポッパーは２０ｍＭの硫酸銅と２．５％の５−ＳＳＡで構成される。バンコマイシン（分析物）と共にこの試薬パックをキャリブレータとして０、５、１０、２５、５０、および１００μｌ／ｍｌで装入し、７、３５、および７５μｇ／ｍｌの対照試料とともに２回ずつ測定を行う。モード１によるアッセイ１６ピペット操作をこの装置で使用し、検量線を較正して保存する。ＣＤＰ−Ｉの交差反応性が存在しないことを確認するため、種々の濃度のＣＤＰ−Ｉ試料で測定を行う。
【０１０９】
さらなるスクリーニングに基づき、新しく１５−１０９−５９２と命名したクローンを委託用に選択する。
【０１１０】
１５−１０９−５９２として同定された細胞株から分泌されるモノクローナル抗体のアイソタイプを抗体アイソタイピングキット（マウス・モノクローナル（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）、サザン・バイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、＃５０８０−０５、バーミンガム（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）、アラバマ州）で求めた。このアッセイは供給元の推奨に従って行われ、その結果はＩｇＧ１κ軽鎖のアイソタイプであることを示している。
【０１１１】
細胞株の委託
ブダペスト条約に従って、名称がハイブリッド１５−１０９−５９２であるハイブリドーマ細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２、米国）に委託する。委託した日付は１９９５年２月１６日であり、この細胞株に付与されたＡＴＣＣ番号はＨＢ １１８３４である。この委託物はＡＴＣＣ貯蔵所で保管され、これは公的な保管所であり、最も新しい要求から３０年間または５年間、あるいは、特許の効力のある期間の長い方の期間保管され、この期間中に生育不能となれば交換される。さらに、本出願人らは、試料の生育能力の提示を含む３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０１−１．８０９のすべての要求基準を満たしている。
【０１１２】
実施例３．バンコマイシンクロロトリアジニルアミノフルオレセイントレーサーの合成
バンコマイシン塩基（５７６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、１．５当量）を広口の５０ｍｌ丸底フラスコに入れたＤＭＦ（８ｍｌ）に溶解する（必要であれば４０℃まで加温する）。小型ｐＨ電極を挿入して、反応混合物のｐＨを監視する。ジクロロトリアジニルアミノフルオレセインＨＣｌ（ＤＴＡＦ；１３２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液をフラスコに加える。反応混合物はオレンジ色〜黄色に変化し、ｐＨは６．０±０．５まで低下し、このｐＨを維持しながら終夜撹拌する。反応生成物は、分析用ＨＰＬＣで監視する。すべてのＤＴＡＦが消費されてから、約２〜３ｍｌになるまで減圧下でＤＭＦを除去する。残留物をＨＰＬＣで精製する。適切な分画を採取し、溶媒を凍結乾燥して、オレンジイレローの粉末（収量３５０ｍｇ）を得る。
【０１１３】
分析用ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。カラムは３．９ｍｍ×３００ｍｍのＣ−１８（ＤＹＮＡＭＡＸ Ｃ−１８，Ｒａｉｎｉｎ）であり、連続グラジエント移動相（Ａ＝酢酸アンモニウム；Ｂ＝アセトニトリル（５０ｍＭ）；Ｂ＝１０％からＢ＝５０％で１５分間で展開）を使用し、流速１．５ｍｌ／分である。検出は２５４ｎｍまたは４８６ｎｍのいずれかで行う。
【０１１４】
分取ＨＰＬＣは上記と同様の条件を使用し、１９ｍｍ×２５０ｍｍのＣ−１８カラム（ＤＹＮＡＭＡＸ Ｃ−１８，Ｒａｉｎｉｎ）を使用する。
【０１１５】
ＭＳ：ＥＳＭＳよりＭＨ＋が１９０８で得られ、（ＭＨ２）２＋が９５３で得られる。
【０１１６】
実施例４．バンコマイシンの蛍光偏光イムノアッセイ
バンコマイシンの存在下でＣＤＰ−Ｉ交差反応性がないという利点を有しながらＴＤＸ（登録商標）／ＴＤＸＦＬＸ（登録商標）アボットバンコマイシンアッセイと同等以上に行えるように、トレーサー（実施例３）およびモノクローナル抗体＃１５−１０９−５９２（実施例２）を最適化する。前述したように、一定濃度の抗体とトレーサーを試験試料に加えることによって、生成するバンコマイシン−抗体複合体とトレーサー−抗体複合体の比は、試料中のバンコマイシン量に正比例する。混合物が直線偏光で励起されると、未結合トレーサーとトレーサー−抗体複合体とによって放出される蛍光の偏光が測定され、試験試料中のバンコマイシンの定量または定性が可能となる。結果は正味のミリ偏光単位（ｍＰ）およびスパンによって定量化することができる。正味のミリ偏光は、最大量のトレーサーが抗体と結合する（すなわち、バンコマイシンが存在しない）場合に検出される偏光を意味する。正味のｍＰ単位が大きいほど、トレーサーの抗体に対する結合が良好である。アッセイのスパンは、バンコマイシンが全く存在しない状態で 最大量のトレーサーが結合する場合に得られる正味のミリ偏光値と、特定の量のバンコマイシンが試験試料中に存在する場合に得られる正味のミリ偏光との差である。ミリ偏光単位は、保存された検量線から自動的に補間され、試料１ｍｌ当りのバンコマイシン量（ｍｇ）として表される。
【０１１７】
精製した（硫酸アンモニウム分画）バンコマイシン抗体１５−１０９−１３３を２．５％ウシ血清アルブミンと１０％グリセロールを含むリン酸緩衝液で濃度２０μｇ／ｍｌまで希釈し、これがＳポットを構成する。トレーサーポット（Ｔポット）は０．７％ラウリル硫酸ナトリウムおよび０．５％ラウリル硫酸リチウムを含むトリス緩衝液で濃度０．２７５μｇ／ｍｌまで希釈したバンコマイシン−ＤＴＡＦトレーサーである。これら２つの成分を予備処理ポット（Ｐポット）に加えことによって、３５００〜４５００単位の範囲の強度値を有する９６．９４ｍＰのスパンが得られる（強度値は抗体とトレーサーが互いに反応する影響の測定値である。このアッセイで抗体またはトレーサーの濃度のいずれかが増加すると、強度値も増大する）。
【０１１８】
本発明のバンコマイシンアッセイの精度は、市販のバンコマイシンアッセイと、５６の患者試料を使用して比較することによって示される。両方のアッセイの相関性はＲ＝０．９９６およびｙ＝０．９２ｘ−０．００８（図１１）であった。さらに、本発明のアッセイをＨＰＬＣ定量と比較した。この新規アッセイのＨＰＬＣに対する相関は、Ｒ＝０．９９８およびｙ＝１．００７＋１．０５３（図１２）であり、一方市販のバンコマイシンアッセイのＨＰＬＣに対する相関はＲ＝０．９９６およびｙ＝１．０８８ｘ＋１．２５２（データは示していない）であった。本発明のアッセイと、市販のバンコマイシンアッセイの両方は、感度が２．００μｇ／ｍｌ未満であり、試料中の０〜１００μｇ／ｍｌのバンコマイシンを検出可能である。１００μｇ／ｍｌを超えるバンコマイシンを含む試料は、アッセイのマニュアルに記載されるように、試料体積を１．０または０．５まで減少させることによって２倍または４倍に自動的に希釈することができる。本発明のアッセイと市販のバンコマイシンアッセイの精度は同等である。すべての試験の間、試験内、および変動の全係数（ＣＶ）は６％未満である（表２参照）。
【０１１９】
交差反応性に関しては、０、４０、および８０μｇ／ｍｌの量のバンコマイシンについて、０、１、１０、５０、および１００μｇ／ｍｌの量で存在する種々の交差反応物質と共に試験を行う。驚くべきことに、ＣＤＰ−Ｉを含むすべての交差反応物質は、バンコマイシンとの交差反応性が２％未満であり、これはすべての測定値がアッセイの感度（２μｇ／ｍｌ）を下回っていることを意味する。対照的に、市販のバンコマイシンアッセイでは、バンコマイシンが存在するかしないかでＣＤＰ−Ｉの交差反応性が３９．５８％〜６５％まで上昇する。驚くべきことに、本発明の抗体は、試験が行われる最も高濃度でもＣＤＰ−Ｉに対して検出可能な交差反応性がない。これらの結果は既存の市販アッセイよりも有意に改良されている（ＣＤＰ−Ｉの交差反応性データについては表３を参照）。
【０１２０】
図１３は、実施例４の方法を使用したバンコマイシン０〜１００μｇ／ｍｌにおけるｍＰを示す代表的データである。
【０１２１】
本発明のバンコマイシン抗体（Ｓポット）１５−１０９−５９２は４５℃で１４日間保存可能であり、凍結／融解サイクルによる変化に対してこのモノクローナル抗体の抵抗性が高いという予期せぬ発見をした。このモノクローナル抗体は３回の凍結／融解サイクルで、スパンおよび強度値の変化を最小限にすることができる。さらに、この抗体はモノクローナル抗体であるので、スパン、交差反応性、および安定性などの分析パラメータはロット間で実質的に同じである。さらに、ハイブリドーマは中空線維細胞培養システムを使用して培養することができるので製造性が向上する。抗体は臨床分析器内の２つのエアセットフラクチュエーション（約１．５℃）にも耐えることができるので、アッセイの動力学は分析装置環境（約３４±０．５℃）においても安定である。最後に、予備処理溶液（１０％の５−スルホサリシシレート、０．１Ｍのトリス、２０ｍＭの硫酸銅）を使用することによって、ビリルビン妨害（上限３０ｍｇ／ｄｌ）を５％未満にすることができ、キャリーオーバー（バンコマイシン試料２５０μｇ／ｍｌの場合）がアッセイの感度の２％より低くなる。アッセイのためのバンコマイシンを遊離するために、予備処理溶液はバンコマイシンと結合する任意のタンパク質からタンパク質を除去する。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
【表４】
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
実施例５．バンコマイシンモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントとバンコマイシン類似体とトレーサーの間の構造的結合の関係の分析
ａ）材料と方法
プロテインＡアフィニティ−パック（Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｐａｋ）カラムとＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｆａｂ調製キット、ＤｕｐＨリン酸緩衝食塩水パック、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ １０Ｋ ＭＷＣＯ透析カセット、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイキット、およびＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州）より入手した。マイクロ濃縮装置をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）（ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）より入手した。バンコマイシンをアボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のケミカル・アンド・アグリカルチュラル・プロダクツ・ディビジョン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（アボット・パーク（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ）、イリノイ州）より入手した。抗バンコマイシンｍＡｂをアボット細胞培養施設（アボットパーク、イリノイ州）より入手した（Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．ら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，２０：１９１−２０１（１９９８）参照）。（Ｎα，Ｎε−ジアセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドをペニンシュラ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ベルモント（Ｂｅｌｍｏｎｔ）、カリフォルニア州）より入手した。アミノカプロエート誘導（Ｎε−セチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドをリサーチ・ジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（ハンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州）より入手した。図１５に示される化合物（２）であるビオチン活性エステル（以降「化合物２」と呼ぶ）をウィルチェック（Ｗｉｌｃｈｅｋ），Ｍ．ら、「Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ビオチン含有試薬）」に記載されるウィルチェックの方法によって調製した。Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（アビジン−ビオチン法）（Ｍ．ウィルチェック編著）１２３〜１３８ページ、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、に記載されるものであり、この記載内容を本明細書に引用する。図１５に示される化合物（３）である６−カルボキシフルオレセイン活性エステル（以降「化合物３」と呼ぶ）を、Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８：２５３−２５５（１９９７）に記載されるＡｄａｍｃｚｙｋらの方法によって調製した（この文献の記載内容を本明細書に引用する。図１５に示される化合物（４）であるアクリジニウム化学ルミネセンス標識（以降「化合物４」と呼ぶ）を、マティングリ（Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ），Ｐ．Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７−１１４（１９９１）および米国特許第５，４６８，６４６号（両文献の記載内容を本明細書に引用する）に記載の一般手順に従って調製した。図１６に示される化合物（５）であるデスバンコサミニルバンコマイシン（以降「化合物５」と呼ぶ）、図１６に示される化合物（６）であるアグルコバンコマイシン（以降「化合物６」と呼ぶ）、および図１６に示される化合物（７）であるＮ−アセチルバンコサミニルバンコマイシン（以降「化合物７」と呼ぶ）は、カナン（Ｋａｎｎａｎ），Ｒ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：２９４６−２９５３（１９８８）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って調製した。図１６に示される化合物（８）である環−２デクロロバンコマイシン（以降「化合物８」と呼ぶ）をハリス（Ｈａｒｒｉｓ），Ｃ．Ｍ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７：６６５２−６６５８（１９８５）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法によって調製した。図１６に示される化合物（１０）である結晶分解生成物（ＣＤＰ）（以降「化合物１０」と呼ぶ）を、マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ），Ｆ．Ｊ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１８−２２（１９６５）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って調製した。図１６に示される化合物（１２）である環−２デクロロＣＤＰ（以降「化合物１２」と呼ぶ）を、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ），Ｃ．Ｍ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７：６６５２−６６５８（１９８５）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って調製した。合成に使用した他のすべての試薬は、アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）より入手し、さらなる精製は行わずに使用した。合成した化合物は、ＨＰＬＣ（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）（ミルフォード（Ｍｉｌｌｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ３０００ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（分取クロマトグラフィー）システムに、Ｌａｍｂｄａ−Ｍａｘ ２８１ ＵＶ検出器、モデル７４０データモジュール、および４０×１００ｍｍ μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラムを取付けた）で精製した。分析用ＨＰＬＣは、同じシステムに８×１００ｍｍ μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラムを使用して行った。ＨＰＬＣカラムは、前述したように５０ｍＭギ酸アンモニウム中５〜５０％ＣＨ３ＣＮの直線グラジエント（以降「溶媒Ａ」と呼ぶ）で溶離させるか、あるいはトリフルオロ酢酸を含むＣＨ３ＣＮの定組成水溶液（ｖ：ｖ：ｖ、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ；以降「溶媒Ｂ」と呼ぶ）で溶離させた。溶離特性は２５４ｎｍで記録した。電子スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ／ＭＳ）は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）（ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット州）Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ １００ Ｂｅｎｃｈｔｏｐシステムにターボ・イオンスプレー（Ｔｕｒｂｏ ｌｏｎＳｐｒａｙ）（商標）イオン源を使用して行った。タンパク質は、バイオラド・ミニゲル・システム（ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉｇｅｌ ｓｙｓｔｅｍ）（ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリフォルニア州）に１２．５％ポリアクリルアミドゲル（７ｃｍ×１０ｃｍ×１ｍｍ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）で染色して分析した。表面プラズモン共鳴測定ＢＩＡｃｏｒｅ １００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）自動システムにＣＭ−５ ４チャネルセンサーチップを使用して行った。ＢＩＡｃｏｒｅ装置の試薬は、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％の界面活性剤Ｐ−２０）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含むカップリングキット、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、および１Ｍのエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）で構成され、すべてＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．製である。
【０１２７】
ｂ）アグルコＣＤＰの調製
ＣＤＰである化合物１０（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ），Ｆ．Ｊ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１８−２２（１９６５）を参照）（１００ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を１ＮのＨＣｌ（３ｍｌ）中で水浴上において１時間加熱した。この混合物を周囲温度まで冷却し、固形分をろ取した。この粗生成物を飽和ＮａＨＣＯ３に溶解し、分取ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速４５ｍｌ／分）で精製し、凍結乾燥（４５ｍｇ、５７％）した。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速２ｍｌ／分）：保持時間９．４分、９９％。ＥＳＩ ＭＳｍ／ｚ：１１４５（ＭＨ＋）。
【０１２８】
ｃ）Ｎ−バンコサミニルから誘導されるバンコマイシントレーサーの調製手順
バンコマイシン（４８２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）溶液に、化合物２、３または４（０．３６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．９１ｍｌ、６．６ｍｍｏｌ）を加えた。Ｎ２雰囲気下で周囲温度において２４時間撹拌した後、未精製反応混合物を分取ＨＰＬＣで精製して凍結乾燥した。
【０１２９】
図１６に示される化合物（１３）（以降「化合物１３」と呼ぶ）は、バンコマイシンとビオチン活性エステルとから得た（４０５ｍｇ、８１％）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａで１５分間、流速２ｍｌ／分）：保持時間９．４分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１６７４（ＭＨ＋）、１３０５（ＭＨ＋−バンコサミニルビオチン）、１１４３（ＭＨ＋−二糖−ビオチン）、５５４（二糖＋ビオチン＋Ｎａ＋）。
【０１３０】
図１６に示される化合物（１４）（以降「化合物１４」と呼ぶ）は、バンコマイシンと６−カルボキシフルオレセイン活性エステルとから得た（２０ｍｇ、１１％）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、３０：７０：０．１；流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、３０：７０：０．１；流速２ｍｌ／分）：保持時間４．０分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１８０９（ＭＨ＋）、９０４（ＭＨ２ ２＋）、１３０５（ＭＨ＋−バンコサミニルフルオレセイン）、１１４３（ＭＨ＋−二糖−フルオレセイン）、６６５（二糖＋フルオレセイン）。
【０１３１】
図１６に示される化合物（１５）（以降「化合物１５」と呼ぶ）は、バンコマイシンとアクリジニウム活性エステルとから得た（４０９ｍｇ、７０％）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速２ｍｌ／分）： 保持時間１０．４分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：２０１６（ＭＨ＋）、１３０５（ＭＨ＋−バンコサミニルアクリジニウム）、１１４３（ＭＨ＋−二糖−アクリジニウム）、７１０（二糖＋アクリジニウム）。
【０１３２】
ｄ）Ｎ−メチルロイシルから誘導されるバンコマイシントレーサーの調製手順
バンコマイシン（２９６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１０ｍｌ）溶液に、ビオチンまたは１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボキサミド（０．２０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシベンズトリアゾール（３３ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）とを加えた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（２０６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加え、その混合物をＮ２で周囲温度において７２時間撹拌した。得られた未精製反応混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。
【０１３３】
図１６に示される化合物（１６）（以降「化合物１６」と呼ぶ）は、バンコマイシンとビオチンから得た（１３６ｍｇ、４０％）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速２ｍｌ／分）：保持時間９．４分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１６７５（ＭＨ＋）、１５３１（ＭＨ＋−バンコサミン）、１３７２（ＭＨ＋−二糖）、８３８（ＭＨ２ ２＋）。
【０１３４】
図１６に示される化合物（１７）（以降「化合物１７」と呼ぶ）は、バンコマイシンと１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボキサミド（１９０ｍｇ、３５％）とから得た。分取ＨＰＬＣ（溶媒を２０分間、流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａを１５分間、流速２ｍｌ／分）：保持時間１２．１分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：２０１６（ＭＨ＋）、１８７４（ＭＨ＋−バンコサミン）、１７１１（ＭＨ＋−二糖）、６９４（Ｎ−メチルロイシルアクリジニウム）。
【０１３５】
ｅ）カルボキシルから誘導されるバンコマイシントレーサーの調製手順
（ｉ）化合物９を、サンドラム（Ｓｕｎｄｒａｍ），Ｕ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：１１０２−１１０３（１９９５）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って調製した。０℃のバンコマイシン（５００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）およびヘキサンジアミン塩酸塩（１９６ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ／ＤＭＦ（ｖ：ｖ、１：１、８ｍｌ）溶液にＨＢＴＵ（２６２ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（４８０μｌ、２．７６ｍｍｏｌ）を加えた。周囲温度で７２時間撹拌した後、得られた未精製反応混合物を分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、１７：８３：０．０；流速４０ｍｌ／分）で精製し、凍結乾燥した（２２８ｍｇ、４３％）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、１７：８３：０．０；流速２ｍｌ／分）：保持時間７．９分、９９％、ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１５４８（ＭＨ＋）。
【０１３６】
（ｉｉ）化合物９（１９ｍｇ、１２μｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（０．５ｍｌ）溶液に、化合物２、３、または４（１２μｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（２μｌ、１２μｍｏｌ）を加えた。Ｎ２雰囲気下で周囲温度において２４時間撹拌した後、得られた未精製反応混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。
【０１３７】
図１６に示される化合物（１８）（以降「化合物１８」と呼ぶ）は、化合物９とビオチン活性エステルとから得た（９ｍｇ、３１％、回収した出発物質から計算）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２０：８０：０．０５；流速４０ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２０：８０：０．０５；流速２ｍｌ／分）：保持時間６．１分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１７９７（Ｍ＋Ｎａ＋、１７７５ＭＨ＋）、１６３２（ＭＨ＋−バンコサミン）、１４６９（ＭＨ−−二糖）。
【０１３８】
図１６に示される化合物（１９）（以降「化合物１９」と呼ぶ）は、化合物９と６−カルボキシフルオレセイン活性エステル（４ｍｇ、２６％、回収した出発物質から計算）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２７：７３：０．０５；流速４０ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２７：７３：０．０５；流速２ｍｌ／分）：保持時間７．５分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１９２９（Ｍ＋Ｎａ＋）、１９０７（ＭＨ＋）、１７６４（ＭＨ＋−バンコサミン）、１６００（ＭＨ−−二糖）。
【０１３９】
図１６に示される化合物（２０）（以降「化合物２０」と呼ぶ）は、化合物９とアクリジニウム活性エステルとから得た（３ｍｇ、３５％、回収した出発物質から計算）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２７：７３：０．０５；流速４０ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２７：７３．０．０５；流速２ｍｌ／分）：保持時間５．８分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：２１３７（Ｍ＋ＮＡ＋）、２１１５（ＭＨ＋）、１９７２（ＭＨ＋−バンコサミン）、１８１０（ＭＨ−−二糖）。
【０１４０】
ｆ）抗バンコマイシンモノクローナル抗体の調製
カルボキシ末端アミノ酪酸リンカーを介してチログロブリンとカップリングしたバンコマイシンに対する抗バンコマイシンｍＡｂを、製造元による手順に従ってアフィニティ−パック（Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｐａｋ）プロテインＡカラムで精製した。簡潔に述べると、ｍＡｂを含む細胞培養液（２５．４ｍｇ）を遠心分離（３５００Ｇ、３０分間）で不純物を除き、０．２μｍフィルターでろ過し、その上澄をアフィニティ−パックプロテインカラムに注入し、１２ｍｌのＩｇＧ結合緩衝液で平衡化させた。ＩｇＧ結合緩衝液で洗浄した後、抗体を６ｍｌのＩｇＧ溶離緩衝液で溶離させ、１．０ｍｌの１．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を含むびんに採取した。精製したＩｇＧをＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で４℃において１２時間透析し、次にアミコン・ミクロコン（Ａｍｉｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）−５０マイクロ濃縮装置で約１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｐ．Ｋ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：７６−８５（１９８５）に記載のマイクロＢＣＡタンパク質アッセイによって求めたｍＡｂ濃度は１２．４ｍｇ／ｍｌであった。精製したｍＡｂの全回収量は１８．６ｍｇであった。
【０１４１】
ｇ）抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの調製
製造元の手順に従ってイムノピュア（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ）Ｆａｂ調製キットを使用して、抗バンコマイシンｍＡｂの消化を行った。精製した抗バンコマイシンｍＡｂ（約１２ｍｇ）を消化緩衝液（０．５ｍｌ；２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および３０ｍＭのシステイン、ｐＨ７．０）に加えたものに、固定化パパイン含有消化緩衝液（０．５ｍｌ）を加えて３７℃のインキュベーター−シェーカーで５時間インキュベートした。パパインで消化した抗バンコマイシンｍＡｂを次に、キットに付属の予備平衡化した固定化プロテインＡカラム（２ｍｌ）に通して、未消化ｍＡｂおよびＦｃフラグメントを除去した。プロテインＡカラムをさらなるイムノピュア結合緩衝液１３ｍｌで洗浄した。Ｆａｂフラグメントを含むカラム通過液およびカラム洗浄液を集め、ＰＢＳ緩衝液で４℃において１２時間透析し、セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）−１０濃縮装置で濃縮した。マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２を標準物質として使用したミクロＢＣＡ法によって測定すると、抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの濃度は２．０ｍｇ／ｍｌであった。精製した抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの特定決定をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＥＳＩ質量分析によって行った。Ｆａｂフラグメントの重鎖および軽鎖の分子量はそれぞれ、２３，９８６Ｄａと２４，０３３Ｄａであった。すべての試験は抗バンコマイシンｍＡｂのＦａｂフラグメントで行い、モノクローナル抗体の二価性に関連する複雑性を解消した。
【０１４２】
ｈ）バイオセンサー表面の作製
アミンカップリングにより、化合物９またはアミノカプロエート誘導（Ｎε−アセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドのＣＭ−５センサーチップへの固定化を、Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９：２３−３２（１９９８）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って行った。簡潔に述べると、バイオセンサー表面上にＨＢＳ緩衝液を１０μｌ／分で連続的に流し始める。０．０５ＭのＨＮＳと０．２ＭのＥＤＡＣの溶液を３．５分間注入することによって、センサー表面上のカルボキシメチル化デキストランマトリックスを活性化した。化合物９またはアミノカプロエート誘導（Ｎε−アセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチド（１０μＭ）とエタノールアミン（９９０μＭ；ＨＢＳ緩衝液中の全アミンは１ｍＭ）の溶液を注入し（７分間）、続いて１．０Ｍのエタノールアミン塩酸塩を７分間注入して、残留する未反応の活性エステル基をブロックした。リガンド固定化段階を省略した以外は同一条件でブランク面を形成した。
【０１４３】
ｉ）バンコマイシン類似体／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント結合相互作用の溶液競合分析
Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９：２３−３２（１９９８）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の手順に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００で溶液競合試験を行った。塩酸グアニジン６Ｍ、６Ｍ、および１．５Ｍの各１分間のパルスを連続して注入してバイオセンサー面を再生した。抗バンコマイシンＦａｂフラグメントのバイオセンサー面への結合の初期比率を、注入２０秒後から開始して１５秒間で測定した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ）に組み込まれた溶液アフィニティ−モデルを使用した非線形回帰分析によってデータを評価した。
【０１４４】
ｊ）バンコマイシン類似体およびトレーサーの調製
糖または環−２塩素を欠いたバンコマイシン類似体を、カナン（Ｋａｎｎａｎ），Ｒ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：２９４６−２９５３（１９８８）およびハリス（Ｈａｒｒｉｓ），Ｃ．Ｍ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７：６６５２−６６５８（１９８５）に記載されるようにして調製した。ビオチンのＮＨＳ活性エステル（化合物２）、６−カルボキシフルオレセインのＮＨＳ活性エステル（化合物３）、または１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボキサミドのＮＨＳ活性エステル（化合物４）とバンコマイシンをカップリングさせることによって、誘導Ｎ−バンコサミニル炭水化物部分を含むトレーサー化合物１３〜１５を収率１１〜８１％で調製し、分取ＨＰＬＣで精製した（図１４の図式１参照）。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールの存在下で、遊離ビオチンまたはアクリジニウム酸をバンコマイシンとカップリングさせることによって、誘導Ｎ−メチルロイシル部分を有するバンコマイシントレーサー化合物１６および１７をそれぞれ収率４０％と３５％で調製した（図１４の図式１参照）。バンコマイシンの遊離カルボキシル基のアミノアルキルリンカーを含む化合物９は、サンドラム（Ｓｕｎｄｒａｍ），Ｕ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：１１０２−１１０３（１９９５）に記載の方法によって調製した。前述のビオチンのＮＨＳ活性エステル（化合物２）、６−カルボキシフルオレセインのＮＨＳ活性エステル（化合物３）、または１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボジイミドのＮＨＳ活性エステル（化合物４）の化合物９とのカップリングによって、カルボキシルおよびＮ−バンコサミニル炭水化物誘導バンコマイシントレーサーの混合物を得た。分取ＨＰＬＣで繰返し精製を行うことによって、純粋なカルボキシル修飾トレーサー化合物１８〜２０を収率２６〜３５％で得た（図１４の図式１参照）。結晶分解生成物の類似体は、バンコマイシン類似体の調製で説明した文献の手順または一般方法に従って調製した（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）Ｆ．Ｊ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ（バンコマイシンの構造研究），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８：１８（１９６５）参照、この記載内容を本明細書に引用する）。バンコマイシンＨＣｌ（１００ｍｇ）を水（２ｍｌ）に溶解し、１ＮのＮａＯＨでｐＨを４．２に調整した。油浴中でこの溶液を内部温度６０〜７０℃まで４０時間加熱した。ＣＤＰ−Ｉをろ過によって回収し、冷水で洗浄し、乾燥させた。収率は約６０％であった。
【０１４５】
ｋ）固定化バンコマイシンバイオセンサー表面の作製
バイオセンサー表面の形成の最初の試みは、ＣＭ−５センサーチップの活性化カルボキシメチルデキストラン表面にバンコマイシンをバンコサミン糖部分の１級アミンによって固定化することであった。後の抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの飽和量の試験から、抗体フラグメントの結合能力が最小限であることが分かった。対照的に、遊離カルボキシル官能基からアミノアルキルリンカーを含む化合物９の固定化では、同一条件において、抗バンコマイシンＦａｂフラグメントに対して比較的高い結合能力（ＲＵｍａｘ＝４０００）と高い親和性を有するバイオセンサーが得られた。抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの固定化アミノアルキル修飾バンコマイシン表面に対するさらなる結合試験から、物質によって結合が制限され、後述の溶液結合試験での使用に好適であることが分かった。
【０１４６】
ｌ）抗バンコマイシンＦａｂフラグメントに対するバンコマイシン類似体およびトレーサーの結合親和性の測定
抗バンコマイシンＦａｂフラグメントに対する数種類のバンコマイシン類似体およびトレーサーの結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００による溶液競合実験によって求めた。まず、既知の濃度の抗バンコマイシンＦａｂフラグメント（０〜２２ｎＭ）をアミノアルキルバンコマイシンバイオセンサー表面に注入した。各抗バンコマイシンＦａｂフラグメント濃度における結合の初期比率を、注入２０秒後に開始して１４５秒間で観測される結合比率を平均することによって求めた。各センサーの最初の２０秒間のデータは、注入開始時の試料の分散の影響のため省いた。初期結合比率対抗バンコマイシンＦａｂフラグメント濃度のプロットを４−パラメータロジスティック（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０の一般モデル）を使用してフィッティングにより、検量線を得た。これらの測定の過程で数種類の検量線が得られ、すべては実験誤差範囲内で同一であった。次に、固定濃度の抗バンコマイシンＦａｂフラグメント（２０ｎＭ）を１２種類の濃度の各バンコマイシン類似体またはトレーサーと混合し、平衡に到達させた。これらの平衡混合物をアミノアルキルバンコマイシンバイオセンサー表面にそれぞれ注入して、残留する遊離の抗バンコマイシンＦａｂフラグメント濃度を、前述のバイオセンサー表面への初期結合比率の測定によって定量した。遊離の抗バンコマイシンＦａｂフラグメント対添加した類似体またはトレーサーの全濃度のプロットから競合曲線が得られる。図１７は、この実施例に従って得られる代表的な競合曲線を示している。データ点は、可溶性類似体またはトレーサーの所要の濃度における平衡溶液中の遊離の抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの実験的に求めた濃度を表している。この曲線は下記の式１（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトフェアの溶液アフィニティ−モデル）：
【０１４７】
【数１】
を使用した非線形最適データを表しており、式中Ｆａｂｆは平衡溶液中の遊離のバンコマイシンＦａｂフラグメント濃度であり、Ｆａｂτは溶液中の抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの全濃度（２０ｎＭ）であり、Ａは加えたバンコマイシン類似体またはトレーサーの全濃度であり、ＫＤは溶液中のバンコマイシン類似体またはトレーサーの抗バンコマイシンＦａｂフラグメントとの結合における平衡解離定数である。
【０１４８】
平衡解離定数（ＫＤ）の変化によって求めたバンコマイシン類似体と抗バンコマイシン Ｆａｂフラグメントの間の相互作用における構造と結合の関係を以下の表４に示す。
【０１４９】
【表６】
【０１５０】
表４、バンコマイシンとＮ−アセチルバンコサミニル誘導類似体（化合物７）が、ＢＩＡｃｏｒｅ装置で溶液競合試験で正確な値が得られる範囲を超えたＫＤ値を有し、非常に強く結合することを示している。バンコマイシンの遊離カルボキシル官能基上にアミノアルキルリンカーを導入することで得られる化合物９は、固定化バンコマイシンバイオセンサー表面の作製に使用したが、溶液中での抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの認識への影響が最小限である。環−２の塩素原子をバンコマイシンから除去すると、抗体フラグメントによる結合認識が有意に低下する（上記表４の化合物８の結果を参照）。バンコマイシンの炭水化物環の一方または両方が酸加水分解によって開裂すると、それぞれ化合物５および６が得られ、各単糖が失われることで抗体フラグメントによる結合認識がさらに連続して低下する結果が得られる。抗バンコマイシンＦａｂフラグメントとバンコマイシン分解生成物の結合相互作用は天然の抗生物質の結合相互作用と比べると非常に弱かった。結晶分解生成物（化合物１０）はＫＤが４８８±３４ｎＭで結合する。２−位の塩素原子を除去することによって、抗バンコマイシンＦａｂフラグメントによる結合認識が有意に低下し、炭化水素環を完全に分解して化合物１１を得ると、抗バンコマイシンＦａｂフラグメントとの結合相互作用が弱すぎるため溶液競合試験で求めることができない。
【０１５１】
平衡解離定数（ＫＤ）の変化で測定した、バンコマイシントレーサーと抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの間の結合相互作用における構造と結合の関係を表５にまとめる。
【０１５２】
【表７】
【０１５３】
表５は、結合相互作用がトレーサー上のラベルによって変動していることが分かる。しかし、同じ標識を含むＮ−メチルロイシル−（化合物１６および１７）ならびにカルボキシル−ＨＤＡから誘導されるトレーサー（化合物１８〜２０）は同様の親和性で抗体フラグメントと結合する。対照的に、同等の量の標識を含むＮ−バンコサミニルから誘導されるトレーサー（化合物１３〜１５）は抗体フラグメントとの結合が実質的に弱くなる。
【０１５４】
ｍ）抗バンコマイシンＦａｂフラグメント認識におけるバンコマイシン／ＫＤＡＤＡトリペプチド結合相互作用の評価
抗バンコマイシンＦａｂフラグメント認識に関して重要であるバンコマイシンのトポロジーをさらに評価するため、抗生物質のペプチド結合ポケットに配置する残基の役割を調べた（図１８参照）。これらの研究では、アミンカップリングによって、アミノ末端からアミノカプロエートリンカーを含む（Ｎε−アセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドをＣＭ−５センサーチップの活性化カルボキシメチルデキストラン表面に固定化した。バンコマイシン（０．５μＭ）がこの表面に結合する（図１９参照）。しかし、抗生物質の質量が小さいため、装置の応答が比較的小さい（平衡時で約５０Ｒｕ）。対照的に、９９％以上のバンコマイシンが抗体フラグメントによって結合しているバンコマイシン（０．５μＭ）／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント（１μＭ）複合体を注入すると、複合体となって質量が増加したために応答が約１０倍に増加する（図１９参照）。抗バンコマイシンＦａｂフラグメント単独では、固定化トリペプチド表面に対して親和性を示さない（図１９）。バンコマイシンのポケットと結合するペプチドと抗体が互いに排他的であることをさらに確認するために、バンコマイシン／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント溶液の結合相互作用を、（Ｎα，Ｎε−ジアセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチド（５００μＭ）の存在下で上記条件において再度調べた。（Ｎα，Ｎε−ジアセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドの存在下、溶液中のバンコマイシン／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント結合相互作用について得られたＫＤ値は、トリペプチドの非存在下（０．２ｎＭ以下）で得られた値と同一であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 バンコマイシンの構造を示している。
【図２】 バンコマイシンの主代謝物の１つであるＣＤＰ−Ｉの構造を示している。
【図３】 バンコマイシンのもう１つの主代謝物であるＣＤＰ−ＩＩの構造を示している。
【図４ａ】 バンコマイシンと担体タンパク質のカップリングのための代表的合成経路を示している。
【図４ｂ】 バンコマイシンと担体タンパク質のカップリングのための代表的合成経路を示している。
【図４ｃ】 バンコマイシンと担体タンパク質のカップリングのための代表的合成経路を示している。
【図５ａ】 本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【図５ｂ】 本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【図５ｃ】 本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【図５ｄ】 本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【図６】 本発明の免疫原の構造を示している。
【図７】 本発明の最も好ましい免疫原の構造を示している。
【図８】 本発明の標識試薬の構造を示している。
【図９】 本発明の最も好ましい標識試薬の一般構造を示している。
【図１０ａ】 本発明の方法によるバンコマイシンとフルオレセインのカップリングのための合成経路を示している。
【図１０ｂ】 本発明の方法によるバンコマイシンとフルオレセインのカップリングのための合成経路を示している。
【図１１】 現行の市販用アッセイと、本発明の最も好ましい抗体を使用する本発明のアッセイとの相関結果を示している。
【図１２】 本発明のアッセイとＨＰＬＣの相関を示している。
【図１３】 本発明の蛍光偏光イムノアッセイの結果を示している。
【図１４ａ】 Ｎ−バンコサミニルから誘導されるトレーサーの合成の化学的スキームを示している。
【図１４ｂ】 Ｎ−メチルロイシルから誘導されるトレーサーの合成の化学的スキームを示している。
【図１４ｃ】 カルボキシル−ＨＤＡから誘導されるトレーサーの合成の化学的スキームを示している。
【図１５】 ビオチン活性エステル（２）、６−カルボキシフルオレセイン活性エステル（３）、およびアクリジニウム化学ルミネセンス標識（４）を示している。
【図１６ａ】 バンコマイシン類似体およびトレーサーの構造を示している。
【図１６ｂ】 バンコマイシン類似体およびトレーサーの構造を示している。
【図１７】 環−２デクロロバンコマイシン（●で示される）およびビオチン標識カルボキシル−ＨＤＡバンコマイシントレーサー（○で示される）の平衡解離定数を求めるための溶液競合曲線を示している。
【図１８】 バンコマイシンと細胞壁ペプチド類似体（ＮαＮε−ジアセチル）ＫＡＡの間の結合相互作用のモデルを示している。点線は水素結合を表す。
【図１９】 バンコマイシン、抗バンコマイシンＦａｂフラグメント、およびバンコマイシン／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント複合体の、アミノカプロエート誘導（Ｎε−アセチル）ＫＡＡトリペプチドバイオセンサー表面への結合を示している。
【図２０】 本発明の抗体が結合するバンコマイシンの部位を示している。特に、本発明の抗体は、黒、赤、および緑で示される領域と結合する。しかし、本発明の抗体は青で示されるペプチド結合領域とは結合しない。
【図２１】 化学ルミネセンストレーサーであるバンコマイシニル−Ｎ−メチルロイシルアクリジニウムを示している。
発明の分野
本発明は、試験試料中のバンコマイシンの定量化に関する。特に、本発明は、試験試料中のバンコマイシンの特異的定量化のための免疫原、そのような免疫原から調製した抗体、および蛍光偏光イムノアッセイに使用されることが好ましい標識試薬に関する。
【０００２】
発明の背景
過去３０年間、バンコマイシンはメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによって引き起こされるグラム陽性菌感染の治療のための薬物として選択されてきた。β−ラクタム抗生物質に対してアレルギーをもつ患者の細菌感染の治療にも使用されてきた。バンコマイシンはＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（以前はＮｏｃａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓと呼ばれた）によって産生される。バンコマイシンはグラム陰性菌に対して耐性である。他の抗生物質との交差耐性は未知であり、長期間使用されてきたにもかかわらず、治療中の耐性生物の出現に関する報告はわずかである。バンコマイシンは胃腸管からは吸収されないため、この抗生物質はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって腸で発症する全腸炎の治療に使用される。ナガラジャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ），Ｒ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４６：１１８１（１９９３）。バンコマイシンは、細菌細胞壁のペプチドグリカンの生合成に含まれるペプチド中間体と優先的に結合することによってその抗菌作用を発揮する。
【０００３】
バンコマイシンは腎を通って排泄される。この薬物の半減期は通常患者では５〜１１時間であり、腎不全患者では２〜５日まで伸び、透析患者ではさらに伸びる。バンコマイシンは比較的安全な薬物であるが、これまで観察された副作用としては腎毒性と自己中毒が挙げられる。
【０００４】
バンコマイシンを安全に投与するために、患者の血液中のバンコマイシン量の測定が慣例的に行われている。腎に障害のある患者の体内では薬物がより長期間存在するため、体内温度により長くさらされることになり、それによって結晶分解生成物（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ）ＩおよびＩＩ（ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩ）として知られる分解生成物の蓄積が起こることが示唆されている。ＣＤＰ−ＩとＣＤＰ−ＩＩは回転異性体であり、別々に単離することが可能である。バンコマイシンとこれら２つの主分解生成物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩをそれぞれ図１〜３に示す。
【０００５】
バンコマイシンは水性環境では使用できないことが知られている。ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）らに付与された米国特許第４，６７０，２５８号では、バンコマイシンと水溶液で薬物を安定化させると言われるトリペプチドとの組成物が開示されている。しかし、このようなトリペプチドはイムノアッセイ技術を妨害することがある。例えば、このような妨害は、分析物の同じ結合部位において抗体と安定化ペプチドが競合する場合に起こりうる。
【０００６】
歴史的に見て、生物学的流体中のバンコマイシン濃度は、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素増幅イムノアッセイ（ＥＭＩＴ）、または微生物学的方法によって測定されている。ＨＰＬＣはバンコマイシンのすべての定量法の中で最も正確であると当業者は考えているが高度に訓練された人と、すべての臨床的状況でいつも使用されるわけではない専門的な装置とを必要とする緩慢で労働集約的な方法である。
【０００７】
より最近では、蛍光偏光法がバンコマイシンの分析に使用されている。蛍光偏光法は、競合結合イムノアッセイの原理に基づいている。蛍光偏光における原理は、直線偏光によって励起された場合に、蛍光標識化合物がその回転速度に反比例する偏光度を有する蛍光を放出するということである。従って、蛍光標識トレーサー−抗体複合体は直線偏光によって励起され、光が吸収され発光する時間の間に蛍光体の回転が制約されるため、放出される光は偏光度が高いまま維持される。「遊離」トレーサー化合物（すなわち、抗体と結合していない）が直線偏光によって励起される場合は、競合結合イムノアッセイで生成する対応するトレーサー−抗体結合体よりも回転がはるかに速い。
【０００８】
蛍光偏光法および蛍光標識としての使用に適した化合物は、従来技術で開示されている。例えば、Ｋｉｒｋｅｍｏらに付与された米国特許第４，５１０，２５１号および第４，６１４，８２３号のそれぞれでは、アミノメチルフルオレセイン誘導体を使用するリガンドの蛍光偏光アッセイが開示されている。フィノ（Ｆｉｎｏ）らに開示された米国特許第４，４７６，２２９号には、蛍光偏光イムノアッセイに使用するための、バンコマイシン類似体を含む置換カルボキシフルオレセインなどの置換カルボキシフルオレセイン類が開示されている。ワング（Ｗａｎｇ）らに付与された米国特許第４，４２０，５６８号および第５，０９７，０９７号には、置換トリアジニルアミノフルオレセインをトレーサーとして使用する蛍光偏光イムノアッセイが開示されている。ワング（Ｗａｎｇ）に付与された米国特許第４，４２０，５５８号には、バンコマイシンとジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）の反応が開示されれている。しかし、この特許にはこのような反応の生成物の構造や、この反応の不均一系への適用については記載されていない。グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）ら（ＪＡＣＳ １１５，６４８２（１９９３））は、Ｃ末端にアルキル基、イミダゾール基、およびアミン基が結合したバンコマイシンの選択的合成方法を記載しており、別の官能基を有する誘導体の調製にもこの方法が有用であることを示している。しかしながら、免疫原性物質または免疫成分の合成、ならびにそれらのバンコマイシンの定量化への使用については記載されていない。
【０００９】
市販のバンコマイシン用蛍光偏光アッセイ（ＦＰＩＡ）を利用することができる。例えば、市販のアッセイ（アボット（Ａｂｂｏｔｔ）ＴＤＸ（登録商標）アッセイ、ＴＤＸＦＬＸ（登録商標）アッセイ、（以降、「市販のアボットバンコマイシンアッセイ」と呼ぶ））は、血清試料または血漿試料中のバンコマイシンの定量測定のための試薬を含む。これらのアッセイでは、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）で標識したバンコマイシン誘導体（以降、「市販のトレーサー」と呼ぶ）、およびバンコマイシンに対するヒツジポリクローナル抗体（以降、「市販の抗体」と呼ぶ）を使用する。
【００１０】
廃棄する放射性物質がなく、容易かつ迅速に実施可能な均一アッセイであるという点において、ＦＰＩＡはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）よりもすぐれている。しかし、市販のバンコマイシンアッセイではバンコマイシン測定値が場合により増加し、ＨＰＬＣ測定値と一致しないことがあるという報告がある。これらの増加は、ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩとの交差反応性の増加によるものである。前述のように、異性体ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩは別々に単離可能である。予想されるように、ＣＤＰ−Ｉから得られる任意の溶液は常に両異性体の平衡混合物を含む。従って、ここで報告されるＣＤＰ−Ｉ交差反応性の測定値は、平衡混合物の交差反応性の測定値である。
【００１１】
このように、生物学的流体中で、交差反応性分解生成物の存在下におけるバンコマイシン濃度を迅速かつ正確に測定可能である改善されたアッセイがなお必要とされている。従って本発明は、試験試料中のバンコマイシンの定量化のための特別な抗体試薬および標識試薬を提供する。本発明は、これらの特別な試薬を使用するイムノアッセイ法も提供する。このような抗体試薬の生成に使用される免疫原の調製のための合成手順、ならびにこのような標識試薬の調製手順も提供する。
【００１２】
バンコマイシン濃度測定のためのアッセイに使用可能である安定なバンコマイシンキャリブレータおよび対照試料を得るために使用可能であり、重要となる場合が多い抗体試料も提供する。
【００１３】
本発明によると、標識試薬および抗体試薬は、試験試料中のバンコマイシンの定量化のためのイムノアッセイに使用する場合、当技術分野において従来の公知の手順よりも優れている。特に、本発明の抗体試薬は代謝物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩとの交差反応性が実質的にないことを発見した。さらに、本発明の抗体試薬は、バンコマイシンの定量化のためバンコマイシン分子を安定化するポリペプチドの存在下で使用することができる。本発明ではこのようなポリペプチドの存在は、試料中のバンコマイシンの定量化を妨害しない。
【００１４】
発明の要約
本発明は、試験試料中のバンコマイシンの定量方法を提供し、本方法では、
（ａ）試験試料を、バンコマイシンと特異的に結合可能であり図６の免疫原（式中、Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が連続して直接結合することができ、この配列は−Ｏ−Ｏ結合を含むことはできず、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる）を使用して生成される抗体を有する抗体試料、および図８の標識試薬（式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｘは０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が連続して直接結合することができ、この配列は−Ｏ−Ｏ結合を含むことはできず、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる）と接触させて、反応溶液を調製し、
（ｂ）試験試料中のバンコマイシン量の関数として、抗体と結合するあるいは結合しない反応溶液中の標識試薬量を測定する。
【００１５】
本発明は、蛍光偏光が使用される上記方法をさらに提供する。
【００１６】
本発明の好ましい方法では、抗体は図６の免疫原を用いて生成され、標識試薬は図８に示されるものである。
【００１７】
さらに本発明は、バンコマイシンと特異的に結合する抗体を精製するために有用である図６の新規免疫原を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、バンコマイシンに対して特異的であり、ＣＤＰ ＩおよびＣＤＰ ＩＩとの交差反応性が実質的に存在せず、バンコマイシン上の任意の非ペプチド性部位と結合することができる抗体を提供する。特に、本発明の抗体は、バンコマイシンの安定化に使用される安定化ペプチド、特にポリペプチドと、バンコマイシンのペプチド結合部位に対する結合で競合しない。
【００１９】
本発明は、ＨＢ １１８３４と命名されるハイブリドーマ細胞株、およびその産生するモノクローナル抗体も提供する。このようなモノクローナル抗体は、バンコマイシンの定量のために最も好ましく、最も好ましくは蛍光偏光法によって行われる。
【００２０】
本発明は、バンコマイシンの定量に使用するための安定なキャリブレータも提供する。本発明のキャリブレータは水溶液の形態であり、ポリペプチドで安定化したバンコマイシン分子を含む。このポリペプチドは、抗体とバンコマイシン分子の結合を妨害しない。
【００２１】
抗体試薬と標識試薬とを有する、試験試料中のバンコマイシンの定量に有用なキットも提供する。好ましいキットは図６の免疫原から生成される抗体を有し、最も好ましくは図５の免疫原から生成されるモノクローナルＩｇＧ抗体である。
【００２２】
本発明は、このような抗体試薬の生成に使用される免疫原を調製するための合成手順、およびこのような標識試薬を調製するための合成手順も提供する。
【００２３】
図面の簡単な説明
本特許のファイルは、カラーで描かれた図面を少なくとも１つ含んでいる。カラーの図面を含む本特許の複写は、特許商標局に請求し必要な費用を支払えば入手できる。
【００２４】
図１は、バンコマイシンの構造を示している。
【００２５】
図２はバンコマイシンの主代謝物の１つであるＣＤＰ−Ｉの構造を示している。
【００２６】
図３は、バンコマイシンのもう１つの主代謝物であるＣＤＰ−ＩＩの構造を示している。
【００２７】
図４ａから４ｃはバンコマイシンと担体タンパク質のカップリングのための代表的合成経路を示している。
【００２８】
図５ａから５ｄは本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【００２９】
図６は、本発明の免疫原の構造を示している。
【００３０】
図７は、本発明の最も好ましい免疫原の構造を示している。
【００３１】
図８は、本発明の標識試薬の構造を示している。
【００３２】
図９は、本発明の最も好ましい標識試薬の一般構造を示している。
【００３３】
図１０ａおよび１０ｂは、本発明の方法によるバンコマイシンとフルオレセインのカップリングのための合成経路を示している。
【００３４】
図１１は、現行の市販用アッセイと、本発明の最も好ましい抗体を使用する本発明のアッセイとの相関結果を示している。
【００３５】
図１２は、本発明のアッセイとＨＰＬＣの相関を示している。
【００３６】
図１３は、本発明の蛍光偏光イムノアッセイの結果を示している。
【００３７】
図１４ａから１４ｃは、Ｎ−バンコサミニル、Ｎ−メチルロイシル、カルボキシル−ＨＤＡから誘導されるトレーサーの合成の化学的手法を示している。
【００３８】
図１５は、ビオチン活性エステル（２）、６−カルボキシフルオレセイン活性エステル（３）、およびアクリジニウム化学ルミネセンス標識（４）を示している。これらの化合物は、図１４に示されるＮ−バンコサミニルから誘導されるトレーサー、およびカルボキシル−ＨＤＡから誘導されるトレーサーの合成のための種々の化学的手法に使用される。
【００３９】
図１６ａおよび１６ｂは、バンコマイシン類似体およびトレーサーの構造を示している。
【００４０】
図１７は、環−２デクロロバンコマイシン（●で示される）およびビオチン標識カルボキシル−ＨＤＡバンコマイシントレーサー（○で示される）の平衡解離定数を求めるための溶液競合曲線を示している。
【００４１】
図１８は、バンコマイシンと細胞壁ペプチド類似体（ＮαＮε−ジアセチル）ＫＡＡの間の結合相互作用のモデルを示している。点線は水素結合を表す。
【００４２】
図１９は、バンコマイシン、抗バンコマイシンＦａｂフラグメント、およびバンコマイシン／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント複合体の、アミノカプロエート誘導（Ｎε−アセチル）ＫＡＡトリペプチドバイオセンサー表面への結合を示している。
【００４３】
図２０は、本発明の抗体が結合するバンコマイシンの部位を示している。特に、本発明の抗体は、黒、赤、および緑で示される領域と結合する。しかし、本発明の抗体は青で示されるペプチド結合領域とは結合しない。
【００４４】
図２１は、化学ルミネセンストレーサーであるバンコマイシニル−Ｎ−メチルロイシルアクリジニウムを示している。
【００４５】
発明の詳細な説明
本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、以下の用語はそれぞれこのような意味を有する：
「ヘテロ原子」は窒素、酸素、硫黄、およびリンを意味する。
【００４６】
「ＣＨＣｌ３」はクロロホルムを意味し、「ＣＤＣｌ３」はジューテロクロロホルムを意味し、「ＭｅＯＨ」はメタノールを意味し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味し、「ＣＨ２Ｃｌ２」は塩化メチレンを意味し、「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルを意味し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを意味する。
【００４７】
「連結部分」、「つなぎ」、「スペ−サー」、「スペーサーアーム」、および「リンカー」は交換可能に使用され、ある定義された物質（ハプテンなど）を第２の定義された物質（免疫原性担体または検出可能部分など）と分離する任意の共有結合を規定する化合物部分を意味する。
【００４８】
「安定」は、水性環境におけるバンコマイシンの、その分解生成物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩへの時間の関数としての変化を意味する。本明細書で記載されるように、本発明のキャリブレータは少なくとも２か月間安定である。
【００４９】
「ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩとの交差反応性が実質的にない」とは、本発明の抗体と代謝物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩの交差反応性が、本明細書の表３に示されるようにバンコマイシンの分析の感度を下回ることを意味する。
【００５０】
「非ペプチド性部位」は、バンコマイシン分子上のペプチド結合部位以外の任意の部位を意味する。
【００５１】
本発明は、バンコマイシンの定量への使用に好適である免疫原、そのような免疫原から調製される抗体、および標識試薬を提供する。バンコマイシンの特異的定量は、最初に試験試料を、本発明の標識試薬（本明細書ではトレーサーともよぶ）および本発明の抗体試薬と、同時またはどちらかの順序で連続的に接触させ、次に、抗体試薬との結合反応に関与したまたはしなかった標識試薬量を試験試料中のバンコマイシン量の関数として測定することによって行われる。本発明の抗体および標識試薬は、バンコマイシンの特異的定量のための蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）において特に有用である。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様によると、標識試薬および抗体試薬は蛍光偏光イムノアッセイで使用され、特異性に迅速性および均一法の利便性が加わって、試験試料のバンコマイシンの信頼性の高い定量が行え、さらにバンコマイシンの主代謝物であるＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩによる妨害が避けられる。
【００５３】
試験試料は、天然の体液、あるいはその抽出物または希釈物であってよく、限定するものではないが、全血、血清、血漿、尿、便、唾液、脳脊髄液、脳組織などが挙げられる。
【００５４】
当業者には公知であるが、特異的抗体と相補的な標識ハプテンとを調製する場合、抗体反応を誘発するために使用される免疫原と標識ハプテンの両方の化学構造を考慮する必要がある。従来、選択的抗体を得るために重要であるハプテン特有の部分から離れたハプテン上の部位で、ハプテンと担体タンパク質を結合させている。同様に、このような抗体と結合可能な標識ハプテンを調製する場合、慣例的に、担体タンパク質をハプテンと結合させるために使用される部位と同じハプテンの部位に標識を結合させている。このようなことを行う理由の１つは、担体タンパク質によって、ハプテンの一部への免疫系の関与が立体的に妨害される可能性があるからである。相補的な標識ハプテンは、免疫原として担体タンパク質を結合させる部位と同じハプテンの部位に標識を結合させることによって合成され、そのためハプテンの重要な部分と抗体との結合が妨害されない。
【００５５】
従って、バンコマイシンの別の部位に結合することによって誘導される本発明のバンコマイシン免疫原によって、バンコマイシンに特異的な抗体と、バンコマイシンの主代謝物に対して優れた交差反応特性を有する分析法が開発されることは驚くべき予想外の発見であった。最も驚くべき発見は、この分析の感度の限界に関するものであり、ＨＢ １１８３４から産生されるモノクローナル抗体が、ＣＤＰ、特にＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩに対して実質的に交差反応性を示さないことである。さらに、このモノクローナル抗体がペプチド結合部位とは結合しないということも驚くべき発見であった。これによって、バンコマイシンの定量のための改善された分析法が開発でき、安定なキャリブレータおよび対照物質を使用することができる。
【００５６】
免疫原の合成
ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方の本発明の抗体は、図６の一般式で示されるようにバンコマイシンのカルボン酸を介して担体タンパク質と結合するバンコマイシン分子から調製される免疫原を使用して生成され、式中Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは連結部分である。
【００５７】
本発明の免疫原において、好ましくはＸは、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が直接結合することができ、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる。
【００５８】
当業者であれば理解できるように、免疫原性担体物質Ｐは従来公知である任意のものから選択することができる。ほとんどの場合では、Ｐはタンパク質またはポリペプチドであるが、十分な大きさおよび免疫原性を有する炭化水素、多糖類、リポ多糖類、ポリ（アミノ）酸、核酸などの他の物質を使用することもできる。好ましくは、免疫原性担体物質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリンなどのタンパク質である。
【００５９】
好ましい免疫原では、Ｐはチログロブリンであり、Ｘは−ＮＨ（ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）−である。最も好ましい免疫原は図７に示される。しかし、式７の化合物が、バンコマイシンおよび免疫原性担体の１種類の複合体のみに限定されるものではないことは当業者であれば理解できよう。すなわち、バンコマイシン誘導体と免疫原性担体の比は、免疫原性担体Ｐ上で化学的に利用可能な官能基数によって定まり、これらの２種類の物質の比は合成において制御することができる。Ｐのバンコマイシン誘導体による置換度は、免疫原性担体上の利用可能な官能基の１〜１００％の間で変動させることができる。この置換度は、１０％〜９５％の間が好ましく、より好ましくは１５％〜８５％の間である。
【００６０】
前述のように、本発明の免疫原性複合体は、バンコマイシンのカルボン酸末端を介してバンコマイシンと担体物質とをカップリングさせることによって調製される。図４ａ〜４ｃに示されるように、当業者には公知である方法によって、バンコマイシンをＶ−Ｘ−Ｙで表される二官能性化合物とカップリングされ、式中Ｘは連結部分であって、Ｖ−および−Ｙは官能基であり、これらの官能基の１つはバンコマイシン（Ｉ）のカルボン酸と反応することができ、もう一方はＰの化学的に利用可能な官能基と反応することができる。多くの二官能性リンカーが当技術分野において公知である。例えば、ヘテロ二官能性リンカーは、例えばビエニアルツ（Ｂｉｅｎｉａｒｚ）らに付与された米国特許第５，００３，８８３号に記載されている。ヘテロ二官能性リンカーは、官能基の一方に関する末端が特異的となるため好ましくなる場合がある。同様に、免疫原合成を好都合に行うために、当業者には公知であるか容易に習得できる技術によって、希望するときに官能基Ｖ−および−Ｙを保護し、脱保護することができる（例えば、Ｔ．Ｗ．グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびＰ．Ｇ．Ｍ．ワッツ（Ｗｕｔｔｓ），「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．（有機合成における保護基第２版）」１９９１，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）を参照されたい）。
【００６１】
一般に、本発明の免疫原の調製において、Ｖは−ＯＨ、−ハロ（−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）、−ＳＨ、または−ＮＨＲ’−からなる群より選択され、式中Ｒ’はＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールから選択される。Ｙは、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、アミノ（−ＮＨ２）、アルデヒド（−ＣＨ（＝Ｏ））、またはアジド（−Ｎ３）からなる群より選択することができる。前述したように、Ｘは、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が直接結合することができ、Ｖ−Ｘ−Ｙの並びはＯ−Ｏ結合を含むことはできず、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる。
【００６２】
図４ａ〜４ｃに示される代表的な合成図式を参照すると、バンコマイシン（図４ａ）とＶ−Ｘ−Ｙの反応によって、官能基Ｙの結合した連結部分Ｘを有する連結中間化合物（図４ｂ）が生成する。当業者には公知である数種類の方法の任意のものによって、官能基−Ｙを免疫原性担体の官能基と反応させることができる。アミド結合を形成することが好ましく、通常この結合は安定である。アミド結合は、最初にＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの添加剤を加えて１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの活性化試薬と反応させることによって、スペーサーアームのカルボン酸部分［Ｙ＝（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）］を活性化させることで形成される。次に活性化形態（図４ｂ参照）を、免疫原性担体物質を含む緩衝液と反応させる。あるいは、カルボン酸基を、反応性の高い無水物、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾリド混合物、またはカーボネート混合物に転化させて、単離を行うかまたは行わないで、免疫原性担体物質と結合させることもできる。当業者には容易に明らかとなるように、上述のもの以外にアミド結合を形成するために使用できる試薬は多数存在し、このような試薬については特に挙げる必要はないであろう。
【００６３】
あるいは、末端アミン官能基（Ｙ＝−ＮＨ２）を有するスペーサーアームは、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミドなどの好適な溶媒中でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートと反応させることによって、反応性の高いＮ−ヒドロキシスクシンイミドウレタンを生成することができる。次に、得られたウレタンを緩衝水溶液中の免疫原性担体と反応させると免疫原が得られる。
【００６４】
さらに、末端アルデヒド官能基［Ｙ＝−ＣＨ（＝Ｏ）］を有するスペーサーアームは、当業者に公知の方法による還元的アミノ化によって、水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下で緩衝水溶液中において免疫原性担体とカップリングさせることができる
あるいは、アルコール基［Ｙ＝−ＯＨ］を含むスペーサーアームは、ホスゲン、あるいはジホスゲン、トリホスゲン、またはカルボニルジイミダゾールなどのホスゲン同等物とまず反応させ、反応性の高いクロロギ酸エステルまたはイミダゾロギ酸エステル誘導体（通常は単離しない）を生成することによって、免疫原性担体物質とカップリングさせることができる。得られた活性ギ酸エステルを、次に緩衝水溶液中で免疫原性担体と反応させる。
【００６５】
あるいは、Ｙ＝−Ｎ３の場合は、連結中間体は、緩衝水溶液中の光分解によって免疫原性担体とカップリングさせることができる。
【００６６】
図６の好ましい免疫原は、図５ａ〜５ｄの図式に従って調製される。バンコマイシンのカルボキシル基（図５ａ参照）は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を用いて活性化される。さらにリンカーの４−アミノ酪酸メチルエステル［Ｖ＝−ＮＨ２、Ｘ＝−（ＣＨ２）３−、Ｙ＝−ＣＯ２Ｈ］と反応させた後で加水分解を行って、連結中間体［Ｘ＝−（ＣＨ２）３−、Ｙ＝−ＣＯ２Ｈ］を得る。次にＹを１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）で活性化させ、Ｐとカップリングさせる。当業者であれば、ペプチド結合形成の他の方法も同様に首尾よく使用することができることが分かるであろう。
【００６７】
このように、今述べた方法では、バンコマイシンは、従来技術で公知の種々の方法によって、この部位およびアミンまたはアルコールなどの分子の他の反応性部位で、免疫原性担体物質とカップリングさせることができ、ここでＰは前述と同様の免疫原性担体物質である。
【００６８】
さらに、ハプテンを担体物質と結合させるための類似の方法では、スペーサーアームの反応性基と相補的な意味で反応性であるアミノ基、水酸基、またはカルボキシル基などの官能基を有する固体支持体とスペーサーアームを結合させることができる。この方法によって、ハプテンに対する抗体の分離または生成に使用することができる固体相が得られる。このようなカップリング技術も当技術分野において公知である。
【００６９】
本発明の抗体
ａ．抗体の生成
本発明の免疫原は、当技術分野において公知である方法に従って、ポリクローナルとモノクローナルの両方の抗体の調製に使用することができる。一般に、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、またはウマなどのホスト動物に、免疫原の種々の部位の１種類以上が通常アジュバントとの混合物として注入される。その後、血液を採取して抗体力価の測定を行いながら、最適な力価に到達するまで、規則的または不規則な間隔で同じ部位または異なる部位をさらに注入する。ホスト動物の血液を採取して抗血清を得るか、あるいは体細胞交雑技術または他の当技術分野で公知の技術によってモノクローナル抗体を得るかのいずれかによって抗体が得られ、例えば−２０℃でこれを貯蔵することができる。無傷の免疫グロブリン以外に、本明細書で使用される抗体という用語は、公知の方法によって生成することができる免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖも含んでいる。
【００７０】
市販の抗体を本発明の好ましい抗体に置き換えるだけで、バンコマイシンアッセイの性能が向上することの注目されたい。
【００７１】
本発明の好ましい方法は、検出を意図していない代謝物との結合が分析の精度に影響を与える程度には結合しない抗体を使用し、特に代謝物はＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩであるということも注目されたい。
【００７２】
ｂ．本発明の抗体の特異性および結合親和性
本発明の免疫原によって生成する抗体はバンコマイシンに対して特異的であり、代謝物のＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩに対しては実質的に交差反応性を示さない。
【００７３】
さらに、本発明の抗体はバンコマイシン分子の任意の非ペプチド性部位と結合する。本発明の抗体は結合しないバンコマイシンのペプチド結合部位は、図２０に青色で示している。本発明の抗体が結合するバンコマイシン分子の非ペプチド性部位は、図２０に黒、赤、および緑で示している。好ましくは本発明の抗体は、図２０の２つの糖部分（赤で示される）、および図２０の塩素化フェニル（緑で示される）と結合する。
【００７４】
本発明の抗体はバンコマイシンのペプチド結合部位とは結合しないので、バンコマイシンのペプチド結合部位は安定化ペプチドの結合のために残される。ペプチド結合部位にペプチドが結合することによって、水溶液中のバンコマイシンを安定化することができる。バンコマイシンの安定化に使用することができるペプチドは、バンコマイシンとの結合親和性を有することが知られているポリペプチドである。好ましいポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸残基を含み、その構造中にα，ε−ジＡｃ・Ｌ−ｌｙｓ・Ｄ−ａｌａ・Ｄ−ａｌａのフラグメントを含むポリペプチドである。
【００７５】
バンコマイシン分子のペプチド結合部位以外の部位に対して結合親和性であるため、バンコマイシン濃度測定用アッセイに使用可能なバンコマイシンのキャリブレータおよび対照試料を作製するために、本発明の抗体を使用することができる。本発明のキャリブレータおよび対照試料は水溶液であり、ポリペプチドで安定化したバンコマイシン分子を含む。上述の１種類以上のポリペプチドを、バンコマイシン分子の安定化に使用することができる。バンコマイシン分子の安定化に使用されるポリペプチドは、抗体とバンコマイシン分子の結合を妨害しない。本発明のキャリブレータは、少なくとも２か月間安定であり、好ましくは６か月間、最も好ましくは１年を超える期間安定である。
【００７６】
標識試薬の調製
前述したように、本発明の標識バンコマイシン試薬は、バンコマイシンの二級アミノ末端、すなわち担体タンパク質が結合する位置とは異なる位置で標識と結合させることによって調製される。
【００７７】
バンコマイシン用の本発明の標識試薬は、図８で示される一般式を有し、式中Ｑは化学ルミネセンス部分または蛍光性部分などの検出可能部分であり、Ｘは連結部分である。好ましい標識試薬では、Ｑは、４’−アミノメチルフルオレセイン、５−アミノメチルフルオレセイン、６−アミノメチルフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５および６−アミノフルオレセイン、チオ尿素フルオレセイン、およびメトキシトリアジニルアミノフルオレセインからなる群より選択されるフルオレセイン誘導体、あるいはバンコマイシン−Ｎ−メチルロイシルアクリジニウムなどの化学ルミネセンス部分であり；Ｘは好ましくは、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子を含み、１０個以下のヘテロ原子を含む連結部分であって、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖、あるいは環状部分として配列し、但し、２つ以下のヘテロ原子が直接結合することができ、環状部分は６個以下の環原子を含み、分岐は炭素原子上でのみ起こりうる。より好ましい標識試薬では、ＱはクロロトリアジニルアミノフルオレセインでありＸ＝０である、すなわちバンコマイシン誘導体が直接フルオレセイン誘導体と結合する。本発明好ましい標識試薬は図９に示される構造を有する。
【００７８】
免疫原性複合体の合成と類似の方法において、まず１級アミノ基を他と異なるように保護し（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｔｓ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ」、１９９１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ参照）、続いて２級アミノ基を検出可能部分と選択的に反応させることによって、本発明の標識試薬はバンコマイシンから合成される。
【００７９】
より具体的には、好ましい標識試薬は、図１０ａおよび１０ｂに示されるように合成することができ、（ｉ）バンコマイシン基剤と希ＨＣｌをｐＨ６．０で反応させて１級アミノ基を４級化窒素として保護し、続いて（ｉｉ）これをジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）と反応させることによって標識試薬を得ることができる。
【００８０】
最も好ましい態様では、上記合成方法が図９の標識試薬の生成に使用される。
【００８１】
蛍光偏光イムノアッセイを使用するバンコマイシンアッセイ
本発明の試薬を使用する蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）方式に従って、試験試料のバンコマイシンの濃度または量を正確に定量することができる。バンコマイシンの特異的定量のためのＦＰＩＡを実施するために、バンコマイシン濃度が既知であるキャリブレータから検量線が作成される。
【００８２】
一般に、蛍光偏光法は、ある特性波長の直線偏光によって励起された場合に、入射励起光に対して偏光度が保持される別の特性波長の光（すなわち蛍光）発し、この偏光度が所与の媒体中のトレーサーの回転速度と反比例の関係にあるという原理に基づいている。この性質によって、粘稠溶液相中に存在する、または回転速度が比較的より遅い他の溶液成分と結合するなどによって回転の制限されたトレーサー物質は、放射光の偏光度が、自由な溶液中にある場合よりも比較的大きな値に保持される。従って、リガンドとトレーサーが抗体との結合で競合する時間範囲内で、トレーサーとリガンドの結合速度から、遊離トレーサーと結合トレーサーの適切な比が得られ、選択性、感度、および精度などの重要な性能パラメータは維持される。
【００８３】
本発明によるバンコマイシンの特異的定量のための蛍光偏光イムノアッセイを行う場合、バンコマイシンを含むと思われる試験試料を、本発明の標識試薬の存在下で本発明による免疫原を用いて調製した抗血清またはモノクローナル抗体と接触させる。次に直線偏光を溶液に通過させて蛍光偏光応答を得て、この応答を試験試料中に存在するバンコマイシン量の測定値として検出する。
【００８４】
蛍光偏光アッセイは、市販の自動化装置（例えば、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＴＤＸ（登録商標）、およびＴＤＸＦＬＸ（登録商標））で行うことができる。
【００８５】
本発明によると、図６に示す免疫原から誘導される抗体と図８の蛍光標識試薬を使用した場合に、バンコマイシンの定量に関して優れた蛍光偏光イムノアッセイ結果が得られるという予想外で驚くべきことが分かった。
【００８６】
特に、図９の標識試薬を図７の免疫原に対する応答で生成するモノクローナル抗体と組み合わせて使用することでバンコマイシンの主代謝物のＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩに対する交差反応性が非常に低く、実質的に０である（すなわちこのアッセイの感度限界より低い）アッセイが行えるという予想外で驚くべきことが分かった。名称ＡＴＣＣ ＨＢ １１８３４のハイブリドーマから産生されるモノクローナルＩｇＧ抗体を使用する蛍光偏光法が最も好ましい。
【００８７】
抗体と結合するトレーサーの量は、試験試料に存在するバンコマイシン量と反比例して変動する。従って、バンコマイシンおよびトレーサーの抗体結合部位に対する相対的な結合親和性がこのアッセイ系の重要な要素である。
【００８８】
他のアッセイ方式
蛍光偏光イムノアッセイ以外に、本発明によるバンコマイシン定量方法に従って、種々の他のイムノアッセイ方式を実施することができる。一般に、このようなイムノアッセイ系は、免疫グロブリンの能力、すなわち全抗体またはそのフラグメントの試験試料の特定の分析物に結合する能力に依存し、この場合標識試薬または検出可能試薬は結合量を求めるために使用される。このような検出可能標識としては、限定することを意図するものではないが、酵素、放射性標識、ビオチン、毒素、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リポソーム、発色団、限定するものではないが図２１に記載されるものなどの化学ルミネセンス、着色粒子および着色微粒子、および前述のような蛍光性化合物が挙げられる。
【００８９】
通常、このようなイムノアッセイ系方式における結合量は、標識試薬中に存在する、分析物との結合反応によって沈殿したまたはしなかった検出可能部分の量によって求められ、検出され測定された検出可能部分量を、試験試料中に存在する分析物の量と相関させることが必要である。例えば、競合イムノアッセイ系では、測定される物質（リガンドと呼ばれることが多い）は、リガンドと構造が非常によく似ており検出可能部分がカップリングした物質（トレーサーと呼ばれることが多い）と、リガンドおよび構造が類似しているトレーサーの１つ以上の部分に対して特異的である抗体の限られた数の結合部位に関して競合する。
【００９０】
試験キット
本発明による試験キットは、試験試料中のバンコマイシンの定量のための所望のイムノアッセイを行うために必要な試薬を含む。試験キットは、必要な試薬を含む１つ以上の容器の組み合わせ、および／または試薬が相溶性となる組成物または混合物としての製品包装形態にすることができる。好ましくは試験キットは、アッセイを行うために必要なすべての試薬、標準物質、緩衝液、希釈剤などを含む。
【００９１】
バンコマイシンの定量に関して前述した蛍光トレーサー化合物および抗体を含む、試験試料中のバンコマイシンの定量のための蛍光偏光イムノアッセイ用試験キットが特に好ましい。当然ながら試験キットは、当技術分野において公知であり使用者の観点から望ましいと思われる他の物質を含むことができることは理解できるであろうし、このような物質としては試料予備処理溶液、緩衝液、希釈剤、標準物質などが挙げられる。
【００９２】
限定することを意図するものではない以下の実施例によって本発明を説明する。
【００９３】
実施例１．バンコマイシン免疫原の合成
ａ）４−アミノ酪酸メチルの合成
４−アミノ酪酸（５．００ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）を２００ｍｌ丸底フラスコに入れる。ジメトキシプロパン（８０ｍｌ、６５ｍｍｏｌ）を撹拌しながらフラスコに加える。濃塩酸（１５ｍｌ）を反応混合物に加え、室温で終夜撹拌する。加熱せずにロータリーエバポレーターを使用して減圧下で溶媒を除去する。得られた固形分を最小限の量のＭｅＯＨに溶解し、エーテルで再沈殿させる。沈殿した固形分を吸引ろ過し、Ｅｔ２Ｏ（２×５０ｍｌ）で洗浄する。得られた固形分（収量：６．９ｇ（９６％））を次に減圧乾燥する。
【００９４】
遊離アミンの１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．１（５重項、２Ｈ）、２．５（３重項、２Ｈ）、３．２（ブロードな３重項、２Ｈ）、３．７（１重項、３Ｈ）、８．１（１重項、２Ｈ）。
【００９５】
ｂ）バンコマイシン−アミノ酪酸誘導体の合成
バンコマイシン（５００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）基剤を２５ｍｌ丸底フラスコに入れる。ＤＭＳＯ（４ｍｌ）を加えて、必要であれば温めながら透明な溶液が得られるまで撹拌する。実施例１（ａ）の４−アミノ酪酸メチル（５０６ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、さらにヒドロキシベンゾトリアゾール（１０５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．０９７６ｍｌ、０．６９ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物をＮ２雰囲気下で室温において３〜７日間撹拌する。反応はＨＰＬＣで追跡する。出発物質が消費されてから、沈殿した固体をろ過して除去し、ろ液を後述のＣ−１８カラムを使用する逆相ＨＰＬＣによって精製する。採取した分画を凍結乾燥する（収量：３１０ｍｇ）。
【００９６】
分析用ＨＰＬＣ条件は以下のとおりである：カラムは７．８ｍｍ×３００ｍｍのＣ−１８（Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ−１８、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、マールボロ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ）、マサチューセッツ州）であり、アセトニトリル：酢酸アンモニウム（５０ｍＭ）の連続的グラジエント移動相（１５分間で１０％アセトニトリルから５０％アセトニトリル）を使用し、流速は３．０ｍｌ／分である。検出は２５４ｎｍで行う。
【００９７】
分取ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：カラムは１９ｍｍ×２５０ｍｍのＣ−１８（Ｄｙｎａｍａｘ ６０Ａ Ｃ−１８、レイニン（Ｒａｉｎｉｎ）、ウォーバーン（Ｗｏｂｕｒｎ）、マサチューセッツ州）であり、アセトニトリル：酢酸アンモニウム（５０ｍＭ）の連続的グラジエント移動相（１５分間で１０％アセトニトリルから５０％アセトニトリル）を使用し、流速は８．０ｍｌ／分である。検出は２５４ｎｍで行う。
【００９８】
質量分析（ＭＳ）：電子スプレーイオン化法（ＥＳＩ）ＭＨ＋１５４７、（ＭＨ２）２＋７７４。
【００９９】
ｃ）バンコマイシンハプテンの合成
実施例１（ｂ）のバンコマイシン−アミノ酪酸エステル誘導体（１６５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を２５ｍｌ丸底フラスコ中でＤＭＦ／水（２ｍｌ：３ｍｌ）に溶解する。このフラスコを０℃に冷却し、ＬｉＯＨを加えて２時間撹拌し、室温まで温めて、ＨＰＬＣで反応を追跡する。出発物質が消費されてから、逆相カラムを使用する分取ＨＰＬＣで直接反応物質を精製する。溶媒を凍結乾燥して生成物（収量：１６０ｍｇ）を得る。分析用ＨＰＬＣおよび分取ＨＰＬＣの両方は前述の通りである。
【０１００】
質量分析（ＭＳ）：ＥＳＩ ＭＳより（ＭＨ）＋が１５３３で得られ、これはバンコマイシンに結合した加水分解リンカーの正確な分子量を示している。
【０１０１】
ｄ）免疫原の合成
チログロブリン（１００ｍｇ、０．０００２ｍｍｏｌ）をリン酸二水素ナトリウム緩衝液（５ｍｌ、希薄ＮａＯＨでｐＨを６．７に調整）に溶解する。実施例１（ｃ）のバンコマイシンハプテン（５０ｍｇ、０．０３２１ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥＤＡＣ（９．２ｍｇ、０．０４８２ｍｍｏｌ）を加える。得られた反応混合物を室温で２日間撹拌する。内容物を膜に移して、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（一塩基性、ＮａＯＨでｐＨ７．８に調整）を用いて溶媒を４時間ごとに交換しながら２日間透析する。透析袋の内容物を凍結乾燥して、所望の免疫原１３０ｍｇを得る。
【０１０２】
実施例２．抗バンコマイシン抗体１５−１０９−５９２の生成
メス、６〜８週齢のＲＢＦ／ＤｎＪマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーハーバー（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）、メイン州）を、フロイントのアジュバント（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州）で乳化した実施例１のバンコマイシン免疫原で免疫する。一次免疫ではフロイントの完全アジュバントを用いて投与し、続く追加免疫ではフロイントの不完全アジュバントを用いて投与する。この長期免疫化動物の追加免疫間隔は１週間、３週間、５週間、１２週間、１７週間、および２４週間であり、それぞれの投与量は１匹当り２５、１２．５、１２．５、１０、１０、および１０μｇであり、最初の３回の追加免疫では１つの皮下部位および１つの腹膜内部位に行い、最後の３回の追加免疫では毎回２つの皮下部位で行う。定期的に、採血を行い、抗体応答の進行を確認する。７週間の停止期間の後、動物の脾臓に１０μｇの追加免疫を行い、細胞融合を行った。
【０１０３】
細胞融合を行う日に、迅速な頚椎脱臼によってマウスを安楽死させ、脾臓を摘出する。脾細胞をイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）変法ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）培地（ＩＭＤＭ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）で１回洗浄し、１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離する。ペレット状になった脾細胞をＳＰ２／０ミエローマ細胞（Ｄｒ．ミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＵＫ）と１：１の比で混合し、ＩＭＤＭで洗浄して、遠心分離する。上澄液を除去し、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；アメリカン・タイプ・ティシュー・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）を１分間ペレットに加え、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ Ｇｉｂｃｏ）、および１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ハイクローン・ラボ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ユタ州）を含むＩＭＤＭに再懸濁させる。細胞融合頻度を向上させるために、０．５％ｖ／ｖのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍマイトジェン（ＳＴＭ；ＲＩＢＩ免疫化学研究所（ＲＩＢＩ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）モンタナ州）と１％ｖ／ｖのＯＲＩＧＥＮ（イゲン（Ｉｇｅｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）とを融合細胞浮遊液に加え、２４ウェル組織培養プレートに配置する。
【０１０４】
細胞融合の最初のスクリーニングを、集密的培養の１０日目に行った。市販のアッセイ（ＴＤＸ（登録商標）、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用して、上澄試料の抗バンコマイシン反応性を検出する。組織培養の上澄を試料ウェル２つずつに入れ、市販のキャリブレータキットのＡキャリブレータ（バンコマイシン０μｇ／ｍｌ）またはＦキャリブレータ（バンコマイシン１００μｇ／ｍｌ）のいずれか１０μｌを希釈前のウェルに加える。希釈緩衝液を試薬パックのＳポットとＰポットに入れ、市販のトレーサーはＴポットに入れて使用する。ハイブリドーマ培養上澄液は非常に希薄であるため、試料体積を９０μｌに増加させる。試料の偏光を測定し、Ｆキャリブレータの存在下での偏光の減少を基準にして、ただ１つのハイブリッド１５−１０９が、バンコマイシンに特異的であると同定される（表１参照）。遊離のバンコマイシンが抗体と結合し、トレーサーの結合が阻害されるためであり、それによって信号の減少が起こる。
【０１０５】
【表１】
ハイブリッド１５−１０９は、１−１００から１−１００，０００までで限界希釈法を行うことによりクローニングを行う。クローニング培地は、１０％ｖ／ｖＦＢＳと１％ｖ／ｖＨＴサプリメント（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を含むＩＭＤＡである。２００μｌの細胞浮遊液を、９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに加える。
【０１０７】
新しく１５−１０９−１３３と命名されたハイブリットは、集密的培養の上澄のクローンニングのさらなるスクリーニングに基づいてさらに評価するために選択される。
【０１０８】
アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ろ過システムを使用して、モノクローナル抗体ハイブリッド１５−１０９−１３３をまず１０倍に濃縮する。次に、飽和硫酸アンモニウム（５０％）を使用して未処理抗体（抗体はなおウシ胎児血清中にある）を分画する。次にこの溶液を４０００ＲＰＭ（回転／分）で遠心分離して、上澄を廃棄する。得られたペレットを濃縮後の元の体積の１／１０の体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に差懸濁する。この抗体溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で透析し、透析後に市販の緩衝液（リン酸塩、アジド、およびウシγグロブリンの緩衝液）を使用して以下のように希釈する：希釈せず、１：２、１：４、１：８、１：１６、および１：３２。前述の同じモード１のバンコマイシンアッセイの２（２０μｌ）ではなく、１０（１００μｌ）の試料体積で試料ウェル２ずつに試料を注入する。前述のようにして装置によってｍＰ（ミリ偏光値）を計算し、最も高いｍＰが得られる抗体の希釈率を、試薬キットのＳポット（抗体ポット）に使用する抗体の希釈率として選択する。抗体を、１０％グリセロールと５％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液で希釈する。トレーサーポットはＨＰＬＣで再度精製した既存の市販のトレーサーを含み、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（＋０．７％ＳＤＳおよび０．５％ＬＤＳ）で希釈される。この精製したトレーサーをトレーサーポット中で１．７μｇ／ｍｌまで希釈する。ポッパーは２０ｍＭの硫酸銅と２．５％の５−ＳＳＡで構成される。バンコマイシン（分析物）と共にこの試薬パックをキャリブレータとして０、５、１０、２５、５０、および１００μｌ／ｍｌで装入し、７、３５、および７５μｇ／ｍｌの対照試料とともに２回ずつ測定を行う。モード１によるアッセイ１６ピペット操作をこの装置で使用し、検量線を較正して保存する。ＣＤＰ−Ｉの交差反応性が存在しないことを確認するため、種々の濃度のＣＤＰ−Ｉ試料で測定を行う。
【０１０９】
さらなるスクリーニングに基づき、新しく１５−１０９−５９２と命名したクローンを委託用に選択する。
【０１１０】
１５−１０９−５９２として同定された細胞株から分泌されるモノクローナル抗体のアイソタイプを抗体アイソタイピングキット（マウス・モノクローナル（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）、サザン・バイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、＃５０８０−０５、バーミンガム（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）、アラバマ州）で求めた。このアッセイは供給元の推奨に従って行われ、その結果はＩｇＧ１κ軽鎖のアイソタイプであることを示している。
【０１１１】
細胞株の委託
ブダペスト条約に従って、名称がハイブリッド１５−１０９−５９２であるハイブリドーマ細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２、米国）に委託する。委託した日付は１９９５年２月１６日であり、この細胞株に付与されたＡＴＣＣ番号はＨＢ １１８３４である。この委託物はＡＴＣＣ貯蔵所で保管され、これは公的な保管所であり、最も新しい要求から３０年間または５年間、あるいは、特許の効力のある期間の長い方の期間保管され、この期間中に生育不能となれば交換される。さらに、本出願人らは、試料の生育能力の提示を含む３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０１−１．８０９のすべての要求基準を満たしている。
【０１１２】
実施例３．バンコマイシンクロロトリアジニルアミノフルオレセイントレーサーの合成
バンコマイシン塩基（５７６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、１．５当量）を広口の５０ｍｌ丸底フラスコに入れたＤＭＦ（８ｍｌ）に溶解する（必要であれば４０℃まで加温する）。小型ｐＨ電極を挿入して、反応混合物のｐＨを監視する。ジクロロトリアジニルアミノフルオレセインＨＣｌ（ＤＴＡＦ；１３２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液をフラスコに加える。反応混合物はオレンジ色〜黄色に変化し、ｐＨは６．０±０．５まで低下し、このｐＨを維持しながら終夜撹拌する。反応生成物は、分析用ＨＰＬＣで監視する。すべてのＤＴＡＦが消費されてから、約２〜３ｍｌになるまで減圧下でＤＭＦを除去する。残留物をＨＰＬＣで精製する。適切な分画を採取し、溶媒を凍結乾燥して、オレンジイレローの粉末（収量３５０ｍｇ）を得る。
【０１１３】
分析用ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。カラムは３．９ｍｍ×３００ｍｍのＣ−１８（ＤＹＮＡＭＡＸ Ｃ−１８，Ｒａｉｎｉｎ）であり、連続グラジエント移動相（Ａ＝酢酸アンモニウム；Ｂ＝アセトニトリル（５０ｍＭ）；Ｂ＝１０％からＢ＝５０％で１５分間で展開）を使用し、流速１．５ｍｌ／分である。検出は２５４ｎｍまたは４８６ｎｍのいずれかで行う。
【０１１４】
分取ＨＰＬＣは上記と同様の条件を使用し、１９ｍｍ×２５０ｍｍのＣ−１８カラム（ＤＹＮＡＭＡＸ Ｃ−１８，Ｒａｉｎｉｎ）を使用する。
【０１１５】
ＭＳ：ＥＳＭＳよりＭＨ＋が１９０８で得られ、（ＭＨ２）２＋が９５３で得られる。
【０１１６】
実施例４．バンコマイシンの蛍光偏光イムノアッセイ
バンコマイシンの存在下でＣＤＰ−Ｉ交差反応性がないという利点を有しながらＴＤＸ（登録商標）／ＴＤＸＦＬＸ（登録商標）アボットバンコマイシンアッセイと同等以上に行えるように、トレーサー（実施例３）およびモノクローナル抗体＃１５−１０９−５９２（実施例２）を最適化する。前述したように、一定濃度の抗体とトレーサーを試験試料に加えることによって、生成するバンコマイシン−抗体複合体とトレーサー−抗体複合体の比は、試料中のバンコマイシン量に正比例する。混合物が直線偏光で励起されると、未結合トレーサーとトレーサー−抗体複合体とによって放出される蛍光の偏光が測定され、試験試料中のバンコマイシンの定量または定性が可能となる。結果は正味のミリ偏光単位（ｍＰ）およびスパンによって定量化することができる。正味のミリ偏光は、最大量のトレーサーが抗体と結合する（すなわち、バンコマイシンが存在しない）場合に検出される偏光を意味する。正味のｍＰ単位が大きいほど、トレーサーの抗体に対する結合が良好である。アッセイのスパンは、バンコマイシンが全く存在しない状態で 最大量のトレーサーが結合する場合に得られる正味のミリ偏光値と、特定の量のバンコマイシンが試験試料中に存在する場合に得られる正味のミリ偏光との差である。ミリ偏光単位は、保存された検量線から自動的に補間され、試料１ｍｌ当りのバンコマイシン量（ｍｇ）として表される。
【０１１７】
精製した（硫酸アンモニウム分画）バンコマイシン抗体１５−１０９−１３３を２．５％ウシ血清アルブミンと１０％グリセロールを含むリン酸緩衝液で濃度２０μｇ／ｍｌまで希釈し、これがＳポットを構成する。トレーサーポット（Ｔポット）は０．７％ラウリル硫酸ナトリウムおよび０．５％ラウリル硫酸リチウムを含むトリス緩衝液で濃度０．２７５μｇ／ｍｌまで希釈したバンコマイシン−ＤＴＡＦトレーサーである。これら２つの成分を予備処理ポット（Ｐポット）に加えことによって、３５００〜４５００単位の範囲の強度値を有する９６．９４ｍＰのスパンが得られる（強度値は抗体とトレーサーが互いに反応する影響の測定値である。このアッセイで抗体またはトレーサーの濃度のいずれかが増加すると、強度値も増大する）。
【０１１８】
本発明のバンコマイシンアッセイの精度は、市販のバンコマイシンアッセイと、５６の患者試料を使用して比較することによって示される。両方のアッセイの相関性はＲ＝０．９９６およびｙ＝０．９２ｘ−０．００８（図１１）であった。さらに、本発明のアッセイをＨＰＬＣ定量と比較した。この新規アッセイのＨＰＬＣに対する相関は、Ｒ＝０．９９８およびｙ＝１．００７＋１．０５３（図１２）であり、一方市販のバンコマイシンアッセイのＨＰＬＣに対する相関はＲ＝０．９９６およびｙ＝１．０８８ｘ＋１．２５２（データは示していない）であった。本発明のアッセイと、市販のバンコマイシンアッセイの両方は、感度が２．００μｇ／ｍｌ未満であり、試料中の０〜１００μｇ／ｍｌのバンコマイシンを検出可能である。１００μｇ／ｍｌを超えるバンコマイシンを含む試料は、アッセイのマニュアルに記載されるように、試料体積を１．０または０．５まで減少させることによって２倍または４倍に自動的に希釈することができる。本発明のアッセイと市販のバンコマイシンアッセイの精度は同等である。すべての試験の間、試験内、および変動の全係数（ＣＶ）は６％未満である（表２参照）。
【０１１９】
交差反応性に関しては、０、４０、および８０μｇ／ｍｌの量のバンコマイシンについて、０、１、１０、５０、および１００μｇ／ｍｌの量で存在する種々の交差反応物質と共に試験を行う。驚くべきことに、ＣＤＰ−Ｉを含むすべての交差反応物質は、バンコマイシンとの交差反応性が２％未満であり、これはすべての測定値がアッセイの感度（２μｇ／ｍｌ）を下回っていることを意味する。対照的に、市販のバンコマイシンアッセイでは、バンコマイシンが存在するかしないかでＣＤＰ−Ｉの交差反応性が３９．５８％〜６５％まで上昇する。驚くべきことに、本発明の抗体は、試験が行われる最も高濃度でもＣＤＰ−Ｉに対して検出可能な交差反応性がない。これらの結果は既存の市販アッセイよりも有意に改良されている（ＣＤＰ−Ｉの交差反応性データについては表３を参照）。
【０１２０】
図１３は、実施例４の方法を使用したバンコマイシン０〜１００μｇ／ｍｌにおけるｍＰを示す代表的データである。
【０１２１】
本発明のバンコマイシン抗体（Ｓポット）１５−１０９−５９２は４５℃で１４日間保存可能であり、凍結／融解サイクルによる変化に対してこのモノクローナル抗体の抵抗性が高いという予期せぬ発見をした。このモノクローナル抗体は３回の凍結／融解サイクルで、スパンおよび強度値の変化を最小限にすることができる。さらに、この抗体はモノクローナル抗体であるので、スパン、交差反応性、および安定性などの分析パラメータはロット間で実質的に同じである。さらに、ハイブリドーマは中空線維細胞培養システムを使用して培養することができるので製造性が向上する。抗体は臨床分析器内の２つのエアセットフラクチュエーション（約１．５℃）にも耐えることができるので、アッセイの動力学は分析装置環境（約３４±０．５℃）においても安定である。最後に、予備処理溶液（１０％の５−スルホサリシシレート、０．１Ｍのトリス、２０ｍＭの硫酸銅）を使用することによって、ビリルビン妨害（上限３０ｍｇ／ｄｌ）を５％未満にすることができ、キャリーオーバー（バンコマイシン試料２５０μｇ／ｍｌの場合）がアッセイの感度の２％より低くなる。アッセイのためのバンコマイシンを遊離するために、予備処理溶液はバンコマイシンと結合する任意のタンパク質からタンパク質を除去する。
【０１２２】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
実施例５．バンコマイシンモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントとバンコマイシン類似体とトレーサーの間の構造的結合の関係の分析
ａ）材料と方法
プロテインＡアフィニティ−パック（Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｐａｋ）カラムとＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｆａｂ調製キット、ＤｕｐＨリン酸緩衝食塩水パック、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ １０Ｋ ＭＷＣＯ透析カセット、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイキット、およびＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州）より入手した。マイクロ濃縮装置をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）（ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）より入手した。バンコマイシンをアボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のケミカル・アンド・アグリカルチュラル・プロダクツ・ディビジョン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（アボット・パーク（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ）、イリノイ州）より入手した。抗バンコマイシンｍＡｂをアボット細胞培養施設（アボットパーク、イリノイ州）より入手した（Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．ら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，２０：１９１−２０１（１９９８）参照）。（Ｎα，Ｎε−ジアセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドをペニンシュラ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ベルモント（Ｂｅｌｍｏｎｔ）、カリフォルニア州）より入手した。アミノカプロエート誘導（Ｎε−セチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドをリサーチ・ジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（ハンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州）より入手した。図１５に示される化合物（２）であるビオチン活性エステル（以降「化合物２」と呼ぶ）をウィルチェック（Ｗｉｌｃｈｅｋ），Ｍ．ら、「Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ビオチン含有試薬）」に記載されるウィルチェックの方法によって調製した。Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（アビジン−ビオチン法）（Ｍ．ウィルチェック編著）１２３〜１３８ページ、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、に記載されるものであり、この記載内容を本明細書に引用する。図１５に示される化合物（３）である６−カルボキシフルオレセイン活性エステル（以降「化合物３」と呼ぶ）を、Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８：２５３−２５５（１９９７）に記載されるＡｄａｍｃｚｙｋらの方法によって調製した（この文献の記載内容を本明細書に引用する。図１５に示される化合物（４）であるアクリジニウム化学ルミネセンス標識（以降「化合物４」と呼ぶ）を、マティングリ（Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ），Ｐ．Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７−１１４（１９９１）および米国特許第５，４６８，６４６号（両文献の記載内容を本明細書に引用する）に記載の一般手順に従って調製した。図１６に示される化合物（５）であるデスバンコサミニルバンコマイシン（以降「化合物５」と呼ぶ）、図１６に示される化合物（６）であるアグルコバンコマイシン（以降「化合物６」と呼ぶ）、および図１６に示される化合物（７）であるＮ−アセチルバンコサミニルバンコマイシン（以降「化合物７」と呼ぶ）は、カナン（Ｋａｎｎａｎ），Ｒ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：２９４６−２９５３（１９８８）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って調製した。図１６に示される化合物（８）である環−２デクロロバンコマイシン（以降「化合物８」と呼ぶ）をハリス（Ｈａｒｒｉｓ），Ｃ．Ｍ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７：６６５２−６６５８（１９８５）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法によって調製した。図１６に示される化合物（１０）である結晶分解生成物（ＣＤＰ）（以降「化合物１０」と呼ぶ）を、マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ），Ｆ．Ｊ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１８−２２（１９６５）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って調製した。図１６に示される化合物（１２）である環−２デクロロＣＤＰ（以降「化合物１２」と呼ぶ）を、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ），Ｃ．Ｍ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７：６６５２−６６５８（１９８５）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って調製した。合成に使用した他のすべての試薬は、アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）より入手し、さらなる精製は行わずに使用した。合成した化合物は、ＨＰＬＣ（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）（ミルフォード（Ｍｉｌｌｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ３０００ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（分取クロマトグラフィー）システムに、Ｌａｍｂｄａ−Ｍａｘ ２８１ ＵＶ検出器、モデル７４０データモジュール、および４０×１００ｍｍ μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラムを取付けた）で精製した。分析用ＨＰＬＣは、同じシステムに８×１００ｍｍ μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラムを使用して行った。ＨＰＬＣカラムは、前述したように５０ｍＭギ酸アンモニウム中５〜５０％ＣＨ３ＣＮの直線グラジエント（以降「溶媒Ａ」と呼ぶ）で溶離させるか、あるいはトリフルオロ酢酸を含むＣＨ３ＣＮの定組成水溶液（ｖ：ｖ：ｖ、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ；以降「溶媒Ｂ」と呼ぶ）で溶離させた。溶離特性は２５４ｎｍで記録した。電子スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ／ＭＳ）は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）（ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット州）Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ １００ Ｂｅｎｃｈｔｏｐシステムにターボ・イオンスプレー（Ｔｕｒｂｏ ｌｏｎＳｐｒａｙ）（商標）イオン源を使用して行った。タンパク質は、バイオラド・ミニゲル・システム（ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉｇｅｌ ｓｙｓｔｅｍ）（ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリフォルニア州）に１２．５％ポリアクリルアミドゲル（７ｃｍ×１０ｃｍ×１ｍｍ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）で染色して分析した。表面プラズモン共鳴測定ＢＩＡｃｏｒｅ １００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）自動システムにＣＭ−５ ４チャネルセンサーチップを使用して行った。ＢＩＡｃｏｒｅ装置の試薬は、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％の界面活性剤Ｐ−２０）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含むカップリングキット、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、および１Ｍのエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）で構成され、すべてＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．製である。
【０１２７】
ｂ）アグルコＣＤＰの調製
ＣＤＰである化合物１０（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ），Ｆ．Ｊ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１８−２２（１９６５）を参照）（１００ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を１ＮのＨＣｌ（３ｍｌ）中で水浴上において１時間加熱した。この混合物を周囲温度まで冷却し、固形分をろ取した。この粗生成物を飽和ＮａＨＣＯ３に溶解し、分取ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速４５ｍｌ／分）で精製し、凍結乾燥（４５ｍｇ、５７％）した。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速２ｍｌ／分）：保持時間９．４分、９９％。ＥＳＩ ＭＳｍ／ｚ：１１４５（ＭＨ＋）。
【０１２８】
ｃ）Ｎ−バンコサミニルから誘導されるバンコマイシントレーサーの調製手順
バンコマイシン（４８２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）溶液に、化合物２、３または４（０．３６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．９１ｍｌ、６．６ｍｍｏｌ）を加えた。Ｎ２雰囲気下で周囲温度において２４時間撹拌した後、未精製反応混合物を分取ＨＰＬＣで精製して凍結乾燥した。
【０１２９】
図１６に示される化合物（１３）（以降「化合物１３」と呼ぶ）は、バンコマイシンとビオチン活性エステルとから得た（４０５ｍｇ、８１％）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａで１５分間、流速２ｍｌ／分）：保持時間９．４分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１６７４（ＭＨ＋）、１３０５（ＭＨ＋−バンコサミニルビオチン）、１１４３（ＭＨ＋−二糖−ビオチン）、５５４（二糖＋ビオチン＋Ｎａ＋）。
【０１３０】
図１６に示される化合物（１４）（以降「化合物１４」と呼ぶ）は、バンコマイシンと６−カルボキシフルオレセイン活性エステルとから得た（２０ｍｇ、１１％）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、３０：７０：０．１；流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、３０：７０：０．１；流速２ｍｌ／分）：保持時間４．０分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１８０９（ＭＨ＋）、９０４（ＭＨ２ ２＋）、１３０５（ＭＨ＋−バンコサミニルフルオレセイン）、１１４３（ＭＨ＋−二糖−フルオレセイン）、６６５（二糖＋フルオレセイン）。
【０１３１】
図１６に示される化合物（１５）（以降「化合物１５」と呼ぶ）は、バンコマイシンとアクリジニウム活性エステルとから得た（４０９ｍｇ、７０％）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速２ｍｌ／分）： 保持時間１０．４分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：２０１６（ＭＨ＋）、１３０５（ＭＨ＋−バンコサミニルアクリジニウム）、１１４３（ＭＨ＋−二糖−アクリジニウム）、７１０（二糖＋アクリジニウム）。
【０１３２】
ｄ）Ｎ−メチルロイシルから誘導されるバンコマイシントレーサーの調製手順
バンコマイシン（２９６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１０ｍｌ）溶液に、ビオチンまたは１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボキサミド（０．２０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシベンズトリアゾール（３３ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）とを加えた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（２０６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加え、その混合物をＮ２で周囲温度において７２時間撹拌した。得られた未精製反応混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。
【０１３３】
図１６に示される化合物（１６）（以降「化合物１６」と呼ぶ）は、バンコマイシンとビオチンから得た（１３６ｍｇ、４０％）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａで２０分間、流速２ｍｌ／分）：保持時間９．４分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１６７５（ＭＨ＋）、１５３１（ＭＨ＋−バンコサミン）、１３７２（ＭＨ＋−二糖）、８３８（ＭＨ２ ２＋）。
【０１３４】
図１６に示される化合物（１７）（以降「化合物１７」と呼ぶ）は、バンコマイシンと１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボキサミド（１９０ｍｇ、３５％）とから得た。分取ＨＰＬＣ（溶媒を２０分間、流速４５ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ａを１５分間、流速２ｍｌ／分）：保持時間１２．１分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：２０１６（ＭＨ＋）、１８７４（ＭＨ＋−バンコサミン）、１７１１（ＭＨ＋−二糖）、６９４（Ｎ−メチルロイシルアクリジニウム）。
【０１３５】
ｅ）カルボキシルから誘導されるバンコマイシントレーサーの調製手順
（ｉ）化合物９を、サンドラム（Ｓｕｎｄｒａｍ），Ｕ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：１１０２−１１０３（１９９５）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って調製した。０℃のバンコマイシン（５００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）およびヘキサンジアミン塩酸塩（１９６ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ／ＤＭＦ（ｖ：ｖ、１：１、８ｍｌ）溶液にＨＢＴＵ（２６２ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（４８０μｌ、２．７６ｍｍｏｌ）を加えた。周囲温度で７２時間撹拌した後、得られた未精製反応混合物を分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、１７：８３：０．０；流速４０ｍｌ／分）で精製し、凍結乾燥した（２２８ｍｇ、４３％）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、１７：８３：０．０；流速２ｍｌ／分）：保持時間７．９分、９９％、ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１５４８（ＭＨ＋）。
【０１３６】
（ｉｉ）化合物９（１９ｍｇ、１２μｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（０．５ｍｌ）溶液に、化合物２、３、または４（１２μｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（２μｌ、１２μｍｏｌ）を加えた。Ｎ２雰囲気下で周囲温度において２４時間撹拌した後、得られた未精製反応混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。
【０１３７】
図１６に示される化合物（１８）（以降「化合物１８」と呼ぶ）は、化合物９とビオチン活性エステルとから得た（９ｍｇ、３１％、回収した出発物質から計算）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２０：８０：０．０５；流速４０ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２０：８０：０．０５；流速２ｍｌ／分）：保持時間６．１分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１７９７（Ｍ＋Ｎａ＋、１７７５ＭＨ＋）、１６３２（ＭＨ＋−バンコサミン）、１４６９（ＭＨ−−二糖）。
【０１３８】
図１６に示される化合物（１９）（以降「化合物１９」と呼ぶ）は、化合物９と６−カルボキシフルオレセイン活性エステル（４ｍｇ、２６％、回収した出発物質から計算）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２７：７３：０．０５；流速４０ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２７：７３：０．０５；流速２ｍｌ／分）：保持時間７．５分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：１９２９（Ｍ＋Ｎａ＋）、１９０７（ＭＨ＋）、１７６４（ＭＨ＋−バンコサミン）、１６００（ＭＨ−−二糖）。
【０１３９】
図１６に示される化合物（２０）（以降「化合物２０」と呼ぶ）は、化合物９とアクリジニウム活性エステルとから得た（３ｍｇ、３５％、回収した出発物質から計算）。分取ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２７：７３：０．０５；流速４０ｍｌ／分）。分析用ＨＰＬＣ（溶媒Ｂ、２７：７３．０．０５；流速２ｍｌ／分）：保持時間５．８分、９９％。ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ：２１３７（Ｍ＋ＮＡ＋）、２１１５（ＭＨ＋）、１９７２（ＭＨ＋−バンコサミン）、１８１０（ＭＨ−−二糖）。
【０１４０】
ｆ）抗バンコマイシンモノクローナル抗体の調製
カルボキシ末端アミノ酪酸リンカーを介してチログロブリンとカップリングしたバンコマイシンに対する抗バンコマイシンｍＡｂを、製造元による手順に従ってアフィニティ−パック（Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｐａｋ）プロテインＡカラムで精製した。簡潔に述べると、ｍＡｂを含む細胞培養液（２５．４ｍｇ）を遠心分離（３５００Ｇ、３０分間）で不純物を除き、０．２μｍフィルターでろ過し、その上澄をアフィニティ−パックプロテインカラムに注入し、１２ｍｌのＩｇＧ結合緩衝液で平衡化させた。ＩｇＧ結合緩衝液で洗浄した後、抗体を６ｍｌのＩｇＧ溶離緩衝液で溶離させ、１．０ｍｌの１．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を含むびんに採取した。精製したＩｇＧをＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で４℃において１２時間透析し、次にアミコン・ミクロコン（Ａｍｉｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）−５０マイクロ濃縮装置で約１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｐ．Ｋ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：７６−８５（１９８５）に記載のマイクロＢＣＡタンパク質アッセイによって求めたｍＡｂ濃度は１２．４ｍｇ／ｍｌであった。精製したｍＡｂの全回収量は１８．６ｍｇであった。
【０１４１】
ｇ）抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの調製
製造元の手順に従ってイムノピュア（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ）Ｆａｂ調製キットを使用して、抗バンコマイシンｍＡｂの消化を行った。精製した抗バンコマイシンｍＡｂ（約１２ｍｇ）を消化緩衝液（０．５ｍｌ；２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および３０ｍＭのシステイン、ｐＨ７．０）に加えたものに、固定化パパイン含有消化緩衝液（０．５ｍｌ）を加えて３７℃のインキュベーター−シェーカーで５時間インキュベートした。パパインで消化した抗バンコマイシンｍＡｂを次に、キットに付属の予備平衡化した固定化プロテインＡカラム（２ｍｌ）に通して、未消化ｍＡｂおよびＦｃフラグメントを除去した。プロテインＡカラムをさらなるイムノピュア結合緩衝液１３ｍｌで洗浄した。Ｆａｂフラグメントを含むカラム通過液およびカラム洗浄液を集め、ＰＢＳ緩衝液で４℃において１２時間透析し、セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）−１０濃縮装置で濃縮した。マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２を標準物質として使用したミクロＢＣＡ法によって測定すると、抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの濃度は２．０ｍｇ／ｍｌであった。精製した抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの特定決定をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＥＳＩ質量分析によって行った。Ｆａｂフラグメントの重鎖および軽鎖の分子量はそれぞれ、２３，９８６Ｄａと２４，０３３Ｄａであった。すべての試験は抗バンコマイシンｍＡｂのＦａｂフラグメントで行い、モノクローナル抗体の二価性に関連する複雑性を解消した。
【０１４２】
ｈ）バイオセンサー表面の作製
アミンカップリングにより、化合物９またはアミノカプロエート誘導（Ｎε−アセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドのＣＭ−５センサーチップへの固定化を、Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９：２３−３２（１９９８）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の方法に従って行った。簡潔に述べると、バイオセンサー表面上にＨＢＳ緩衝液を１０μｌ／分で連続的に流し始める。０．０５ＭのＨＮＳと０．２ＭのＥＤＡＣの溶液を３．５分間注入することによって、センサー表面上のカルボキシメチル化デキストランマトリックスを活性化した。化合物９またはアミノカプロエート誘導（Ｎε−アセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチド（１０μＭ）とエタノールアミン（９９０μＭ；ＨＢＳ緩衝液中の全アミンは１ｍＭ）の溶液を注入し（７分間）、続いて１．０Ｍのエタノールアミン塩酸塩を７分間注入して、残留する未反応の活性エステル基をブロックした。リガンド固定化段階を省略した以外は同一条件でブランク面を形成した。
【０１４３】
ｉ）バンコマイシン類似体／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント結合相互作用の溶液競合分析
Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９：２３−３２（１９９８）（この記載内容を本明細書に引用する）に記載の手順に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００で溶液競合試験を行った。塩酸グアニジン６Ｍ、６Ｍ、および１．５Ｍの各１分間のパルスを連続して注入してバイオセンサー面を再生した。抗バンコマイシンＦａｂフラグメントのバイオセンサー面への結合の初期比率を、注入２０秒後から開始して１５秒間で測定した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ）に組み込まれた溶液アフィニティ−モデルを使用した非線形回帰分析によってデータを評価した。
【０１４４】
ｊ）バンコマイシン類似体およびトレーサーの調製
糖または環−２塩素を欠いたバンコマイシン類似体を、カナン（Ｋａｎｎａｎ），Ｒ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：２９４６−２９５３（１９８８）およびハリス（Ｈａｒｒｉｓ），Ｃ．Ｍ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７：６６５２−６６５８（１９８５）に記載されるようにして調製した。ビオチンのＮＨＳ活性エステル（化合物２）、６−カルボキシフルオレセインのＮＨＳ活性エステル（化合物３）、または１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボキサミドのＮＨＳ活性エステル（化合物４）とバンコマイシンをカップリングさせることによって、誘導Ｎ−バンコサミニル炭水化物部分を含むトレーサー化合物１３〜１５を収率１１〜８１％で調製し、分取ＨＰＬＣで精製した（図１４の図式１参照）。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールの存在下で、遊離ビオチンまたはアクリジニウム酸をバンコマイシンとカップリングさせることによって、誘導Ｎ−メチルロイシル部分を有するバンコマイシントレーサー化合物１６および１７をそれぞれ収率４０％と３５％で調製した（図１４の図式１参照）。バンコマイシンの遊離カルボキシル基のアミノアルキルリンカーを含む化合物９は、サンドラム（Ｓｕｎｄｒａｍ），Ｕ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：１１０２−１１０３（１９９５）に記載の方法によって調製した。前述のビオチンのＮＨＳ活性エステル（化合物２）、６−カルボキシフルオレセインのＮＨＳ活性エステル（化合物３）、または１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボジイミドのＮＨＳ活性エステル（化合物４）の化合物９とのカップリングによって、カルボキシルおよびＮ−バンコサミニル炭水化物誘導バンコマイシントレーサーの混合物を得た。分取ＨＰＬＣで繰返し精製を行うことによって、純粋なカルボキシル修飾トレーサー化合物１８〜２０を収率２６〜３５％で得た（図１４の図式１参照）。結晶分解生成物の類似体は、バンコマイシン類似体の調製で説明した文献の手順または一般方法に従って調製した（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）Ｆ．Ｊ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ（バンコマイシンの構造研究），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８：１８（１９６５）参照、この記載内容を本明細書に引用する）。バンコマイシンＨＣｌ（１００ｍｇ）を水（２ｍｌ）に溶解し、１ＮのＮａＯＨでｐＨを４．２に調整した。油浴中でこの溶液を内部温度６０〜７０℃まで４０時間加熱した。ＣＤＰ−Ｉをろ過によって回収し、冷水で洗浄し、乾燥させた。収率は約６０％であった。
【０１４５】
ｋ）固定化バンコマイシンバイオセンサー表面の作製
バイオセンサー表面の形成の最初の試みは、ＣＭ−５センサーチップの活性化カルボキシメチルデキストラン表面にバンコマイシンをバンコサミン糖部分の１級アミンによって固定化することであった。後の抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの飽和量の試験から、抗体フラグメントの結合能力が最小限であることが分かった。対照的に、遊離カルボキシル官能基からアミノアルキルリンカーを含む化合物９の固定化では、同一条件において、抗バンコマイシンＦａｂフラグメントに対して比較的高い結合能力（ＲＵｍａｘ＝４０００）と高い親和性を有するバイオセンサーが得られた。抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの固定化アミノアルキル修飾バンコマイシン表面に対するさらなる結合試験から、物質によって結合が制限され、後述の溶液結合試験での使用に好適であることが分かった。
【０１４６】
ｌ）抗バンコマイシンＦａｂフラグメントに対するバンコマイシン類似体およびトレーサーの結合親和性の測定
抗バンコマイシンＦａｂフラグメントに対する数種類のバンコマイシン類似体およびトレーサーの結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００による溶液競合実験によって求めた。まず、既知の濃度の抗バンコマイシンＦａｂフラグメント（０〜２２ｎＭ）をアミノアルキルバンコマイシンバイオセンサー表面に注入した。各抗バンコマイシンＦａｂフラグメント濃度における結合の初期比率を、注入２０秒後に開始して１４５秒間で観測される結合比率を平均することによって求めた。各センサーの最初の２０秒間のデータは、注入開始時の試料の分散の影響のため省いた。初期結合比率対抗バンコマイシンＦａｂフラグメント濃度のプロットを４−パラメータロジスティック（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０の一般モデル）を使用してフィッティングにより、検量線を得た。これらの測定の過程で数種類の検量線が得られ、すべては実験誤差範囲内で同一であった。次に、固定濃度の抗バンコマイシンＦａｂフラグメント（２０ｎＭ）を１２種類の濃度の各バンコマイシン類似体またはトレーサーと混合し、平衡に到達させた。これらの平衡混合物をアミノアルキルバンコマイシンバイオセンサー表面にそれぞれ注入して、残留する遊離の抗バンコマイシンＦａｂフラグメント濃度を、前述のバイオセンサー表面への初期結合比率の測定によって定量した。遊離の抗バンコマイシンＦａｂフラグメント対添加した類似体またはトレーサーの全濃度のプロットから競合曲線が得られる。図１７は、この実施例に従って得られる代表的な競合曲線を示している。データ点は、可溶性類似体またはトレーサーの所要の濃度における平衡溶液中の遊離の抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの実験的に求めた濃度を表している。この曲線は下記の式１（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトフェアの溶液アフィニティ−モデル）：
【０１４７】
【数１】
【０１４８】
平衡解離定数（ＫＤ）の変化によって求めたバンコマイシン類似体と抗バンコマイシン Ｆａｂフラグメントの間の相互作用における構造と結合の関係を以下の表４に示す。
【０１４９】
【表６】
表４、バンコマイシンとＮ−アセチルバンコサミニル誘導類似体（化合物７）が、ＢＩＡｃｏｒｅ装置で溶液競合試験で正確な値が得られる範囲を超えたＫＤ値を有し、非常に強く結合することを示している。バンコマイシンの遊離カルボキシル官能基上にアミノアルキルリンカーを導入することで得られる化合物９は、固定化バンコマイシンバイオセンサー表面の作製に使用したが、溶液中での抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの認識への影響が最小限である。環−２の塩素原子をバンコマイシンから除去すると、抗体フラグメントによる結合認識が有意に低下する（上記表４の化合物８の結果を参照）。バンコマイシンの炭水化物環の一方または両方が酸加水分解によって開裂すると、それぞれ化合物５および６が得られ、各単糖が失われることで抗体フラグメントによる結合認識がさらに連続して低下する結果が得られる。抗バンコマイシンＦａｂフラグメントとバンコマイシン分解生成物の結合相互作用は天然の抗生物質の結合相互作用と比べると非常に弱かった。結晶分解生成物（化合物１０）はＫＤが４８８±３４ｎＭで結合する。２−位の塩素原子を除去することによって、抗バンコマイシンＦａｂフラグメントによる結合認識が有意に低下し、炭化水素環を完全に分解して化合物１１を得ると、抗バンコマイシンＦａｂフラグメントとの結合相互作用が弱すぎるため溶液競合試験で求めることができない。
【０１５１】
平衡解離定数（ＫＤ）の変化で測定した、バンコマイシントレーサーと抗バンコマイシンＦａｂフラグメントの間の結合相互作用における構造と結合の関係を表５にまとめる。
【０１５２】
【表７】
表５は、結合相互作用がトレーサー上のラベルによって変動していることが分かる。しかし、同じ標識を含むＮ−メチルロイシル−（化合物１６および１７）ならびにカルボキシル−ＨＤＡから誘導されるトレーサー（化合物１８〜２０）は同様の親和性で抗体フラグメントと結合する。対照的に、同等の量の標識を含むＮ−バンコサミニルから誘導されるトレーサー（化合物１３〜１５）は抗体フラグメントとの結合が実質的に弱くなる。
【０１５４】
ｍ）抗バンコマイシンＦａｂフラグメント認識におけるバンコマイシン／ＫＤＡＤＡトリペプチド結合相互作用の評価
抗バンコマイシンＦａｂフラグメント認識に関して重要であるバンコマイシンのトポロジーをさらに評価するため、抗生物質のペプチド結合ポケットに配置する残基の役割を調べた（図１８参照）。これらの研究では、アミンカップリングによって、アミノ末端からアミノカプロエートリンカーを含む（Ｎε−アセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドをＣＭ−５センサーチップの活性化カルボキシメチルデキストラン表面に固定化した。バンコマイシン（０．５μＭ）がこの表面に結合する（図１９参照）。しかし、抗生物質の質量が小さいため、装置の応答が比較的小さい（平衡時で約５０Ｒｕ）。対照的に、９９％以上のバンコマイシンが抗体フラグメントによって結合しているバンコマイシン（０．５μＭ）／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント（１μＭ）複合体を注入すると、複合体となって質量が増加したために応答が約１０倍に増加する（図１９参照）。抗バンコマイシンＦａｂフラグメント単独では、固定化トリペプチド表面に対して親和性を示さない（図１９）。バンコマイシンのポケットと結合するペプチドと抗体が互いに排他的であることをさらに確認するために、バンコマイシン／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント溶液の結合相互作用を、（Ｎα，Ｎε−ジアセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチド（５００μＭ）の存在下で上記条件において再度調べた。（Ｎα，Ｎε−ジアセチル）ＫＤＡＤＡトリペプチドの存在下、溶液中のバンコマイシン／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント結合相互作用について得られたＫＤ値は、トリペプチドの非存在下（０．２ｎＭ以下）で得られた値と同一であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 バンコマイシンの構造を示している。
【図２】 バンコマイシンの主代謝物の１つであるＣＤＰ−Ｉの構造を示している。
【図３】 バンコマイシンのもう１つの主代謝物であるＣＤＰ−ＩＩの構造を示している。
【図４ａ】 バンコマイシンと担体タンパク質のカップリングのための代表的合成経路を示している。
【図４ｂ】 バンコマイシンと担体タンパク質のカップリングのための代表的合成経路を示している。
【図４ｃ】 バンコマイシンと担体タンパク質のカップリングのための代表的合成経路を示している。
【図５ａ】 本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【図５ｂ】 本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【図５ｃ】 本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【図５ｄ】 本発明の方法によるバンコマイシンとチログロブリンのカップリングのための合成経路を示している。
【図６】 本発明の免疫原の構造を示している。
【図７】 本発明の最も好ましい免疫原の構造を示している。
【図８】 本発明の標識試薬の構造を示している。
【図９】 本発明の最も好ましい標識試薬の一般構造を示している。
【図１０ａ】 本発明の方法によるバンコマイシンとフルオレセインのカップリングのための合成経路を示している。
【図１０ｂ】 本発明の方法によるバンコマイシンとフルオレセインのカップリングのための合成経路を示している。
【図１１】 現行の市販用アッセイと、本発明の最も好ましい抗体を使用する本発明のアッセイとの相関結果を示している。
【図１２】 本発明のアッセイとＨＰＬＣの相関を示している。
【図１３】 本発明の蛍光偏光イムノアッセイの結果を示している。
【図１４ａ】 Ｎ−バンコサミニルから誘導されるトレーサーの合成の化学的スキームを示している。
【図１４ｂ】 Ｎ−メチルロイシルから誘導されるトレーサーの合成の化学的スキームを示している。
【図１４ｃ】 カルボキシル−ＨＤＡから誘導されるトレーサーの合成の化学的スキームを示している。
【図１５】 ビオチン活性エステル（２）、６−カルボキシフルオレセイン活性エステル（３）、およびアクリジニウム化学ルミネセンス標識（４）を示している。
【図１６ａ】 バンコマイシン類似体およびトレーサーの構造を示している。
【図１６ｂ】 バンコマイシン類似体およびトレーサーの構造を示している。
【図１７】 環−２デクロロバンコマイシン（●で示される）およびビオチン標識カルボキシル−ＨＤＡバンコマイシントレーサー（○で示される）の平衡解離定数を求めるための溶液競合曲線を示している。
【図１８】 バンコマイシンと細胞壁ペプチド類似体（ＮαＮε−ジアセチル）ＫＡＡの間の結合相互作用のモデルを示している。点線は水素結合を表す。
【図１９】 バンコマイシン、抗バンコマイシンＦａｂフラグメント、およびバンコマイシン／抗バンコマイシンＦａｂフラグメント複合体の、アミノカプロエート誘導（Ｎε−アセチル）ＫＡＡトリペプチドバイオセンサー表面への結合を示している。
【図２０】 本発明の抗体が結合するバンコマイシンの部位を示している。特に、本発明の抗体は、黒、赤、および緑で示される領域と結合する。しかし、本発明の抗体は青で示されるペプチド結合領域とは結合しない。
【図２１】 化学ルミネセンストレーサーであるバンコマイシニル−Ｎ−メチルロイシルアクリジニウムを示している。
Claims (13)
- 試験試料中のバンコマイシンの定量方法であって、該方法が、
（ａ）該試験試料を、
（ｉ）バンコマイシンに対して特異的に結合することができ、式：
および（ii）式：
と接触させて反応溶液を形成するステップと、
（ｂ）該試験試料中のバンコマイシン量の関数として、該抗体と結合するか結合していないかのいずれかの該反応溶液中の該標識試薬の量を測定するステップを含み、
抗体のバンコマイシンへの結合を妨害しないポリペプチドで安定化したバンコマイシンを含有する水溶液である安定性キャリブレータを使用することを特徴とする方法。 - 前記検出可能部分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学ルミネセンス分子、りん光分子、および発光分子からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
- 前記免疫原性担体物質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン、およびチログロブリンからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
- 前記標識試薬の前記検出可能部分が蛍光分子であって、試験試料中のバンコマイシンの定量が蛍光偏光イムノアッセイにより行われる請求項１に記載の方法。
- ステップ（ｂ）の測定が、（ａ）蛍光偏光応答を得るために前記反応溶液に偏光面を通過させ、（ｂ）前記試験試料中のバンコマイシン量の関数として前記反応溶液の該蛍光偏光応答を検出することによって行われる請求項４に記載の方法。
- 前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセイン、アミノフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、チオ尿素フルオレセイン、およびジクロロトリアジニルアミノフルオレセインからなる群より選択される請求項５に記載の方法。
- 前記標識試薬が
- 前記抗体がＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ １１８３４と命名されたハイブリドーマ細胞株によって分泌される請求項７に記載の方法。
- 試験試料中のバンコマイシンを定量するための試験キットであって、該試験キットが、
（ａ）試験試料中のバンコマイシンに対して特異的に結合することができる抗体を含む抗体試薬であって、該抗体が、式：
（ｂ）該抗体の該バンコマイシンに対する結合を置換することができる標識試薬と、
（ｃ）ポリペプチドで安定化したバンコマイシン分子を含有する水溶液を含み、該ポリペプチドは抗体の該バンコマイシン分子に対する結合を妨害しない安定性キャリブレータと、
を含む試験キット。 - 前記標識試薬が式：
- 前記免疫原性担体物質が、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびチログロブリンからなる群より選択される請求項９に記載の試験キット。
- 前記免疫原性担体がチログロブリンである請求項９に記載の試験キット。
- 前記抗体がＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ １１８３４と命名されたハイブリドーマ細胞株から分泌される請求項９に記載の試験キット。
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