JPH0413360B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なテオフイリン／ポリアミノ酸
結合体化合物に関する。 本発明の化合物は、特にテオフイリンの抗体を
製造するための抗原として及びテオフイリンの競
合蛋白結合分析で使用される酵素結合体として有
用な化合物であるが、この特定な用途に限定され
るものではない。 テオフイリン（１，３−ジメチルキサンチン）
は喘息、高血圧、ネフローゼ浮腫の治療に普通使
用される薬物である。高血漿値でテオフイリンは
吐き気を起こすことが時々あり、又約25〜70μ
ｇ／mlの高血漿濃度では重大な毒性が生ずること
がある。血清テオフイリン量は患者間にかなりの
個人差があり、これは、代謝、分泌及び、投薬と
投薬との間の吸収、分布速度の変動の程度の差が
大きいことによる。幼児の場合には血液量が少い
のでこれらの問題は一層深刻である。 高血清テオフイリン量の結果としての重大な副
作用に鑑み、テオフイリン量をモニターするため
の高感度技術が提供されることが重要である。こ
の技術は迅速で、正確で、又、テオフイリンをそ
の正常代謝産物及び様々な類似体（例えばキサン
チン、カフエイン）から容易に識別するものでな
ければならない。 アメリカ特許3690834号；3817837号；3850752
号；3766162号の明細書及びそこに引用されてい
る参照文献には一連の様々な免疫分析法が記載さ
れている。均質酵素免疫分析について述べている
アメリカ特許3817837号明細書の開示内容を参考
のため本明細書に記載する。キサンチン誘導体の
合成は“Advances in Heterocyelie Chemists”
1966年第巻、Lister等著、Rev.Pure ＆
Applied Chem.（オーストラリア）に述べられて
いる。キサンチン誘導体の製造についてはアメリ
カ特許2517410号、2673848号明細書、Holmesと
Leonardの共著“J.Org.Chem”41、568頁（1976
年）、Cavalieri等著“J.Am.Chem.Soc.”76、
1119頁（1954年）を参照されたい。Rasmussen
とLeonardの共著“J.Am.Chem.Soc.”89、5439
頁（1967年）には保護基としてのピバロイルオキ
シメチル基の使用が開示されている。 本発明において、テオフイリン誘導体は抗原と
酵素とに結合される。抗原テオフイリン結合体
は、テオフイリンを特異的に認識するための抗体
の生成に用いられる。酵素結合体はテオフイリン
（特に血清中の）を測定するための競合蛋白結合
分析で用いられる。 前述の如く、本発明は３−置換−１−メチルキ
サンチン、テオフイリンの抗体を製造するための
抗原及び、競合蛋白結合分析で使用される酵素結
合体に関する。該３−置換基は短鎖であり、普通
（しかし必ずしもその必要はない）非オキソカル
ボニル基（その窒素類似基とイオウ類似基とを含
む）であり、ポリアミノ酸（天然及び合成のポリ
ペプチド、蛋白及びこれらと配合群との結合体を
包含する）に結合される。特に重要なポリアミノ
酸は抗原と酵素である。結合基は炭化水素基でよ
く、これは鎖中の炭素原子に結合された通常１〜
４個のヘテロ原子（酸素、窒素及び／又はイオウ
である）を有する。普通、該鎖は水素以外に１〜
10個の、更に普通には約２〜６個の原子からな
る。 大部分の場合、本発明で用いられるポリアミノ
酸誘導体は次の一般式で示される。 式中、PAAはポリアミノ酸、特に抗原と酵素
をさし、該抗原は通常約5000〜10000000の、更に
普通には約10000〜500000の、好ましくは約25000
〜300000の分子量を持ち、一方該酵素は通常約
10000〜600000の、更に普通には約10000〜300000
の、好ましくは約10000〜200000の分子量を持
ち； ｎはPAAに結合したキサンチン基の数であり、
平均すると少くとも１からPAAの分子量の1500
分の１、更に普通には2000分の１までであり；抗
原に対してはｎは一般に平均して４〜250、更に
普通には約６〜100であり、一方酵素に対しては
ｎは一般に約１〜30、更に普通には約２〜20、好
ましくは約２〜12であり；Ｒ基は次の一般式で
示される。 式中、ＸとX¹とは同一でも異なつてもよく、
酸素原子、イミノ基（NH）又はイオウ原子であ
り、特に酸素原子かイミノ基であり； ＴとT¹とは同一でも異なつてもよく、直接結
合か炭化水素基であり、この炭化水素基は１〜10
個の、更に普通には１〜４個の炭素原子（炭素原
子合計数は１〜８個、更に普通には１〜６個であ
る）を有し、一般には脂肪族基、好ましくは飽和
脂肪族基（特にメチレン基、ポリメチレン基）で
あり、又、T¹は窒素原子が（CX¹）に結合して
いるヒドロカルビルアミノ基（該炭化水素基と同
一の制限を持つ）でもよく； Ｙは直接結合、アミド基又はオキシ基であり； ｍとｐは０〜１の整数であり、好ましくはｐは
１であり、ｍは０であり、この場合CXはキサン
チンに結合しており、CX¹はポリアミノ酸に結合
している。 〔ヒドロカルビル基は、水素と炭素とのみから
構成される有機基であり、脂肪族、脂環式、芳香
族又はそれらの組合せでもよく、又飽和でも不飽
和でもよい。本発明においてはこのヒドロカルビ
ル基は１個以下の不飽和部位（例えばエチレン
型）を持つ〕 結合基を例示すると以下の式で示される。 −CH₂CO− −CH₂C（NH）− −COCH₂CH₂CO− −COCHCHCO− −CH₂CONHCH₂CO− −COCH₂N（CH₃）CH₂CO− −CH₂CH₂C（NH）− −COCH₂CH₂OCH₂CH₂CO− −COCH₂OCH₂CO− −CH₂CHCHCO− 本発明により製造される化合物には、７位と８
位が置換されたキサンチンは完全ないし実質上含
まれない。本発明の目的にとつては、生成物がキ
サンチンの３位置換体のみであることが必要であ
る。 ポリアミノ酸へ結合できる化合物は大部分が次
の一般式で示される。 式中、R¹は直接結合か結合基であり、この結
合基は水素原子以外に１〜12個の、更に普通には
１〜６個の、好ましくは約１〜５個の原子（炭
素、酸素、窒素及び／又はイオウの原子である）
からなり、その炭素、酸素、窒素、イオウの特徴
はＲの場合と同一であり Ｚはオキソカルボニル基（−CHO）、非オキソ
カルボニル基（窒素−イミド−類似基とイオウ−
チオノ−類似基とを含む）、カルボキシル基、、カ
ルボキシエステル基（エステル基はニトロフエニ
ル基かＮ−スクシンイミジルオキシ基である）、
アルコキシイミド基（アルコキシ基は、C_1〜3であ
る）、イソチオシアネート基又はイソシアネート
基である。 オキソ基は還元アミノ化により有効アミノ基に
結合してもよい。カルボン酸基とその窒素類似
基、イオウ類似基は、活性エステルを用いるか、
カルボジイミドで活性化するか、クロル炭酸エス
テル、例えばC_2〜7アルコキシカルボニル基を用い
て混成水物を製造することにより有効アミノ基に
直接に結合してもよい。 前述の如く、特に重要なのは、オキソカルボニ
ル基（ケト基以外）と非オキソカルボニル基がア
ミノ基（抗原であるポリペプチド又は蛋白質の一
部である）に結合している化合物である。キサン
チンのカルボニル誘導体をポリペプチド又は蛋白
質へ結合することにより、テオフイリンに対する
抗体（競合蛋白結合分析においてテオフイリンを
カフエインから識別する）を形成できる。そのま
ま抗原としても使用できるが、通常はそのままの
形では使用されない蛋白質は、免疫分析系で検出
体として用いられる酵素である。抗原としては不
活性酵素を使用できる。 ポリペプチド（本発明では一般にポリアミノ酸
と呼ぶ）は普通、約２〜100個のアミノ酸単位
（普通、分子量は約12000未満）を有する。本明細
書ではそれより大きなポリペプチドを便宜上蛋白
質と呼ぶ。蛋白質は普通、サブユニツト（共有又
は非共有結合により結合されている）と呼ばれる
１〜20個のポリペプチド鎖から構成されている。
サブユニツトは通常、約100〜300個のアミノ酸基
（又は10000〜35000の分子量）からなる。本発明
において、ポリアミノ酸は、各ポリペプチド単位
と、ヘモグロビン又はチトクロームのオキシダー
ゼの場合における様にポルフイリンの様な他官能
基と結合したサブユニツト又はポリペプチド単位
であるポリペプチドとを包含する。 キサンチン基の数は、ポリアミノ酸が酵素か抗
原であるかにより異なる。基の最大数は、溶解
性、活性等に対する置換の効果により限定され
る。抗体を形成するためには、充分の数のキサン
チン基を存在させてテオフイリンに対して満足す
べき量の抗体（抗テオフイリン）を提供すべきで
ある。さもなければ抗体とテオフイリンとの割合
が抗体と他化合物との割合に比べて低く好ましく
ないことになる。 第１に考慮すべき蛋白物質即ちポリペプチドの
群は抗原性ポリペプチドである。これらはアミノ
基を通じてテオフイリンのカルボニル基に結合で
きる。生成物はテオフイリンの抗体の形成に使用
できる。使用できる蛋白物質は様々であり、通常
は5000〜１千万の分子量、更に普通には25000〜
500000の分子量を持つ。 酵素は通常約10000〜600000の、普通には約
10000〜150000の、更に普通には12000〜80000の
範囲内の分子量を持つ。幾つかの酵素は複数の酵
素サブユニツトを持つ。酵素分子量について述べ
る時は酵素全体をさす。特定アミノ基に限定せず
に計算すれば、平均して１酵素当たり少くとも１
個の、普通には少くとも２個のキサンチン基が存
在し、希には40個以上のこともあるが、普通には
30を越えない。リゾチームの場合を例にすると、
キサンチン基の平均数は約２〜５の範囲内にあ
る。グルコース−６−ホスフエートのデヒドロゲ
ナーゼとマレートのデヒドロゲナーゼとの場合に
は平均数は２〜20、普通には２〜12の範囲内にあ
る。 テオフイリン類似体は非オキソカルボニル基を
通じてヒドロキシル基かメルカプトキ基（蛋白質
中に存在する）に結合してもよいが、大部分の場
合に結合はアミノ基に対して行なう。それゆえエ
ステルとチオエステルも存在するが、生成化合物
はアミド（窒素誘導体とイオウ誘導体、例えばア
ミジンとチオアミド、を含む。非オキソカルボキ
シル誘導体には尿素、グアニジン、チオ尿素も含
まれる）として記述される。アルデヒド誘導体は
還元アミノ化によりアミノ基にのみ結合してアル
キルアミン基を形成する。 カルボキシ修飾キサンチンへ結合するための遊
離アミノ基を持つ蛋白質中に存在するアミノ酸は
リジン、Ｎ−末端アミノ酸等である。ヒドロキシ
ル基とメルカプタン基とを含むアミノ酸はセリ
ン、システイン、チロシン、スレオニンである。 様々なタイプの蛋白質とポリペプチドとを抗原
物質として用いることができる。これらタイプに
はアルブミン、酵素、血清蛋白、例えばグロブリ
ン、水晶体蛋白、リポ蛋白等、が含まれる。蛋白
質を例示すると、牛血清アルブミン、カサガイ
（Keyhole limpet）ヘモシアニン、卵アルブミ
ン、牛γ−グロブリン等である。グラミシジンの
様に免疫原性である小さな天然ポリペプチドも用
いることができる。リジン、グルタミン酸、フエ
ニルアラニン、チロシン等のポリマーの様な様々
な合成ポリペプチドも単独で又は組み合せて用い
ることができる。特に重要なのはポリリジン又は
リジンとグルタミン酸との組合せである。いかな
る合成ポリペプチドも、例えばリジンにより提供
される様に充分な数の遊離アミノ基を有しなけれ
ばならない。 第２の蛋白分子群は検出体である。これらはカ
ルボニル修飾キサンチンが結合してもよい酵素で
ある。前述の如く、キサンチン修飾酵素は免疫分
析に役立つ。免疫分析技術については以下に記述
する。 ペプチダーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ホ
スホリラーゼ、カーボヒドラーゼ、オキシダー
ゼ、例えばデヒドロゲナーゼ、リダクターゼ等の
様々な酵素を使用できる。特に重要なのは、リゾ
チーム、ペルオキシダーゼ、α−アミラーゼ、デ
ヒドロゲナーゼ（特にマレートのデヒドロゲナー
ゼとグルコース−６−ホスフエートのデヒドロゲ
ナーゼ）、アルカリホスフアターゼ、β−グルク
ロニダーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼの様な
酵素である。I.U.B.分類に準拠すれば、重要な酵
素は１，オキシドリダクターゼ、特に１，１群
（更に詳細には１，１，１群）と１，11群（更に
詳細には１，11，１）；３，ヒドロラーゼ、特に
３，２群（更に詳細には３，２，１群）；である。 酵素テオフイリン結合体は大部分の場合に次の
一般式で示される。 式中、ENZは酵素、好ましくはオキシドリダ
クターゼ又はヒドロラーゼ、特にDPN又は
DPNPを用いるオキシドリダクターゼ、例えばデ
ヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ及びペルオキシダ
ーゼ、又はヒドロラーゼ（エステラーゼを含む）
例えばホスフアターゼ、リゾチーム等であり；こ
の酵素はその原活性の少くとも２％、一般的には
少くとも10％、更に普通には少くとも20％、好ま
しくは少くとも30％を持ち； n¹は平均すると、１から酵素分子量の約2000分
の１の、更に普通には約１〜30の、好ましくは１
〜20の、更に好ましくは約２〜16の範囲内にある
整数であり； Ｔ，Ｙ，T¹，Ｘ，X¹，ｍ，ｐは前記定義の通
りである。 用いられる酵素は、この酵素に結合したキサン
チン基が、キサンチン基に対する抗体即ち抗テオ
フイリンに結合する時にその活性が阻止されるも
のが好ましい。抗テオフイリンで飽和された時の
酵素活性失活率は結合酵素の原活性の少くとも20
％、普通には少くとも30％、好ましくは少くとも
40％、一般的には90％以下とすべきである。 本発明で使用できる様々なアミド生成物の製造
においては通常、カルボン酸を活性化させる。こ
れは様々な方法で達成できる。特に重要な２つの
方法のうちの１つは、不活性極性溶媒（例えばジ
メチルホルムアミド、アセトニトリル、THF、
DMSO、ヘキサメチルホスホルアミド）中での
カルボジイミド（普通には、水溶性の二脂肪族又
は二環式脂肪族カルボジイミド）との反応であ
る。この反応は、様々な試薬を緩和な条件下であ
わせ反応が生ずるのに充分な時間経過させること
により実施される。 第２の方法は、クロルギ酸アルキルエステル
（例えばクロルギ酸イソブチル）を用いて混成無
水物を形成することである。この混成無水物は、
カルボキシ置換キサンチン、クロルギ酸アルキル
エステル、ｔ−アミンをあわせることにより形成
される。温度は通常、周囲温度以下であり、又小
量のカルビトールを使用してもよい。 キサンチン誘導体を基準として少くとも化学量
論量の、普通には過剰量（普通、化学量論量の３
倍は越えない）のクロルギ酸エステルを用いる。
ｔ−アミンはクロルギ酸エステルに対して少くと
も等モル量で存在させる。 混合物をついで、結合すべきアミノ化合物とあ
わせ、反応を緩和な条件下で進行ささせる。 又、アミン官能体をアシル化するために水中で
使用できるカルボキシ修飾キサンチンのエステル
も用いることができる。ヒドロキシル基を例示す
ると、それぞれｐ−ニトロフエニルエステルとＮ
−スクシンイミジルオキシエステルの製造に使用
できるｐ−ニトロフエニルとＮ−ヒドロキシスク
シンイミドとである。アルデヒドを結合させるた
めには、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリ
ウを用いて還元アミノ化を極性の、普通には水性
の媒体中で実施する。 他異性体を含まない１−メチル−３−置換キサ
ンチンを製造するための新規かつ簡単な方法が提
供される。出発物質は１−メチルキサンチンであ
り、これを塩基性条件下で極性無水非ヒドロキシ
ル有機媒体例えばDMF、THF、DMSO、HMP
等）中でほぼ化学量論量のピバル酸ハロメチル
（ハロは原子番号が17〜35のもの、特にクロルで
ある）と縮合させる。０〜50℃の緩和な温度を用
いる。周囲温度が便利である。使用塩基は窒素
塩、炭酸ナトリウム、ｔ−アミン等である。反応
を進行させて完了させ、小量の二置換物質から一
置換ピバロイルオキシメチル誘導体を分離する。 ７−置換生成物を単離し、ハロ置換脂肪族カル
ボン酸のアルキルエステルと結合させる。該ハロ
は原子番号が17〜53のものであり、ヨードが好ま
しく、又他の置換基も存在することが好ましい。
アルコール部分のアルキル基はC_1〜6、好ましくは
C_1〜2であり、酸基はC_2〜7である。前述の如く類似
反応条件下で塩基性の無水非ヒドロキシ極性媒体
を用いる。 生成物の単離後にエステル基を通常の条件下で
加水分解する。塩基水溶液を約75〜100℃の温度
で用いることができる。溶液を酸性にすると所望
の１−メチル−３−カルボキシルアルキルキサン
チンを単離できる。 本発明の結合抗原に応答して製造される抗体
は、親薬物、結合抗原に対して強力な特異的結合
性を示す。 分析により０〜100μｇ／mlの濃度範囲内のテ
オフイリンを検出することが可能であり、又この
分析は零量と5μｇ／ml（好ましくは2.5μｇ／ml）
とを識別できるものでなければならない。他のサ
ンプル源も用いることもできるが、通常、対象サ
ンプルは血清である。 分析は一般に、水性被緩衝化媒体（一般には５
〜10の、更に普通には６〜９の範囲内のPH値にあ
る）中で被分析サンプルと酵素／テオフイリン結
合体と抗テオフイリンをあわせることにより実施
する。水の他に20容量％までの極性有機溶媒（例
えばアルカノール、エーテル、アミド等）も分析
媒体中に含めることができる。 試薬の量は、酵素／テオフイリン結合体の酵素
活性、抗テオフイリンが酵素／テオフイリン結合
体に結合したことによる酵素活性の低下度、測定
方法、テオフイリン濃度の違いに対する試薬系の
感度、抗テオフイリンの結合定数等により変動す
る。主要観点は、対象となるテオフイリン濃度域
をカバーできるということである。酵素変換の結
果としての分析へ媒体の吸光度の変化に起因する
光学的密度の変化を約０〜50μｇ／mlのテオフイ
リン濃度の範囲にわたつて測定する時、測定され
る吸光度の変化は少くとも約0.25ΔOD、好まし
くは少くとも0.5ΔODでなければならない。 普通、酵素／テオフイリン結合体中のテオフイ
リンに対する抗テオフイリンのモル比は結合部位
に基づいて約0.01〜100：１である。酵素／テオ
フイリン結合体の濃度は一般に約10^-5〜10^-10M
の範囲内にある。 分析媒体中に含まれるのは酵素基質である。普
通、これら基質のうちの１つが、紫外線又は可視
光線の領域内で顕著な吸光性を示す生成物に変換
される。便宜上、NAD又はNADPをNADH又は
NADPHに変換する酵素を用いることができ
NADH又はNADPHの形成後に分光光度計で測
定する。所定期間にわたつて特定波長で２度の読
みを取ることにより、酵素活性に関連した値を得
ることができる。既知濃度のテオフイリンを含む
サンプルで用いたと同一の方法を未知サンプルに
用いることにより、得られた結果をテオフイリン
濃度にかえることができる。 分析時の温度は一般には約10〜50℃の、普通に
は25〜40℃の範囲内にある。 以下の参考例及び実施例は本発明を例示するた
めに提示するものであり、限定するものではな
い。 実施例において、％は、容量による液体混合物
以外は、特記ない限り全て重量による。温度は特
記ない限り全て℃単位である。DMFはＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド；TLCは薄層クロマトグ
ラフイー；ECDIは塩酸１−エチル−３−（ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド；THFはテ
トラヒドロフラン；の略号である。 参考例 １ １−メチル−７−ピバロイルオキシメチルキサ
ンチン 窒素下の20mlの乾燥DMF中の１−メチルキサ
ンチン（844mg、5.08ミリモル）と炭酸ナトリウ
ム（538mg、5.08ミリモル）との混合物に、ピバ
ル酸クロルメチル（828μ、5.59ミリモル）の
DMF（６ml）溶液を室温で１時間かけてゆつくり
加え、反応混合物を一夜撹拌した。混合物を過
し、液を蒸発乾燥させ、残渣を50mlの10V／Ｖ
％EtOH／CHCl₃で研和した。得られた固体は出
発物質だつた。有機相をシリカゲルプレートでク
ロマトグラフイーした（10V／Ｖ％EtOH／
CHCl₃）。125mlの10V／Ｖ％EtOH／CHCl₃で溶
出することにより２つの生成物を観察し、R_f値
が0.48の帯から365mgの所望生成物を得た。他の
帯は３，７−二置換物質であることが証明され
た。 参考例 ２ １−メチル−３−（カーボエトキシプロピル）−
７−（ピバロイルオキシメチル）キサンチン 5.8mlの乾燥DMF中の１−メチル−７−（ピバ
ロイルオキシメチル）キサンチン（350mg、1.25
ミリモル）と炭酸ナトリウム（265mg、2.50ミリ
モル）と４−ヨード酪酸エチル（384μ、2.50ミ
リモル）との混合物を窒素下、室温で18時間撹拌
した。水を加え、反応混合物をクロロホルムで抽
出した。乾燥後に抽出液をストリツピング処理に
付して黄色油状物を得これを４枚の厚いシリカゲ
ルプレートでクロマトグラフイーした（10％
EtOH／CHCl₃で展開した）。帯を分離し、100ml
の25％EtOH／CHCl₃で溶出し609mgの所望生成
物を油状物として得た。 参考例 ３ １−メチル−３−（3′−カルボキシプロピル）
キサンチン １−メチル−３−（カーボエトキシプロピル）−
７−（ピバロイルオキシメチル）キサンチン（508
mg）の2N NaOH（36.2ml）中油状サスペンシヨ
ンを窒素下95〜100゜で２時間加熱した。油状物は
溶解し、TLCにより反応は完了したことが示さ
れた。反応混合物をその冷却後に15mlの12％塩酸
でPH２〜３の酸性にし、溶液を各５mlのクロロホ
ルムで３度抽出してピバル酸を除去した。クロロ
ホルム抽出液を５mlの0.5N HClで洗つた後に水
溶液をあわせ、ストリツピング処理して乾燥し、
残渣を室温で真空乾燥した。粗生成物を約22mlの
熱水に溶解し、脱色し濃縮して15mlとし、冷却し
たら159mgの結晶生成物（mp220〜221゜）が得ら
れた。 実施例 １ １−メチル−３−（3′−カルボキシプロピル）
キサンチンの牛γ−グロブリンへの結合 １−メチル−３−（３−カルボキシプロピル）
キサンチン（45mg、0.178ミリモル）のDMF（1.5
ml）澄明溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（20.5mg、0.178ミリモル）とEDCI（39.1mg、0.20
ミリモル）とを0゜で窒素下加えた。溶液を5゜で18
時間撹拌後に反応混合物を、27mlの炭酸塩緩衝剤
（PH９、0.05モル）とDMFとの混合液中の牛γ−
グロブリン（550mg）溶液に0゜で加え、混合物を
この温度に1.5時間維持した。この間、PHは1N
NaOHを使つて8.5〜9.0に維持した。混合物を5゜
で一夜撹拌後に生成物を各４の水で10回、各４
の水酸化アンモニウムで３回透析した。結合体
を凍結乾燥して470mgの蛋白質を得た。吸光分光
分析を用いてそのハプテン価は15であると測定さ
れた。 参考例 ４ ３−（2′−シアノエステル）−１−メチルキサン
チン 反応フラスコに、1.42mlのDMFに溶解した７
−ピバロイルオキシメチル−１−メチルキサンチ
ン（100mg）と44.17mgの炭酸ナトリウムと47μ
のアクリロニトリルとを導入した。100゜で16時間
加熱後に混合物を水に注ぎ入れ、水性混合物をク
ロロホルムで抽出した。クロロホルム抽出液を乾
燥し、蒸発させ、油状残渣をシリカゲルプレート
で２度クロマトグラフイーし帯を75mlの25％エタ
ノール／クロロホル（Ｖ／Ｖ）で溶出して109mg
の油状生成物（放置により固化した）を得た。
mp118〜120℃。 上記ニトリル（109mg）を0.35mlの1N水酸化ナ
トリウムにサスペンドし、0.35mlのTHFを加え
た。混合物を室温で3.5時間撹拌しついで0.2mlの
1N NaOHを加え、撹拌を更に0.5時間続けた。
混合物をついで約２mlの水に注ぎ入れ、生成水溶
液を酸性にし、クロロホルムで完全に抽出した。
クロロホルム抽出液を８％重炭酸ナトリウムで洗
い、ついで乾燥し、蒸発乾燥させた。残渣を２枚
のシリカゲルプレート（10％EtOH／CHCl₃）で
クロマトグラフイーした（125mlの25％EtOH／
CHCl₃で溶出した）。蒸発乾燥して50mgの所望生
成物を得た。 題記ニトリルは容易にイミドエステルにかえポ
リアミノ酸に存在するアミノ基に結合してアミジ
ン結合を提供するのに使用できた。 実施例 ２ ３−カルボキシプロピル−１−メチルキサンチ
ンの、グルコース−６−ホスフエートのデヒド
ロゲナーゼ（G₆PDH）への結合 G₆PDHの凍結乾燥粉末を0.055モルトリス−
HCl（PH8.1）に溶解して蛋白濃度を約２〜３mg／
mlにした。混合物を4゜で一夜放置した。 反応フラスコに３−カルボキシプロピル−１−
メチルキサンチン基（36mg、0.14ミリモル）と
16.4mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと31.4mg
のECDIと400μのDMFとを導入し混合物を4゜で
一夜撹拌した。 ５mlの上記G₆PDH溶液に50mgのグルコース−
６−ホスフエートニナトリウム塩と100mgの
NADHと1.5mlのカルビトールとを加え、PHを2N
NaOHで約8.5〜９に調整した。上記に製造した
エステルのほぼ全量の400μを10μずつで２時
間かけて撹拌酵素溶液に加えた。この間、溶液は
4゜に維持した。反応中にPHは7.5〜８に低下した。
ついで生成結合体を4゜で0.055モルトリスHCl（PH
8.1、保存料として0.5％のナトリウムアジドと
0.005％のチメロサールとを含む）で透析した。 テオフイリン分析法における本発明の化合物の
有効性を実証するために多数の分析実験を実施し
た。 実施例 ３ 分析の実施においては、フローセル付きサーモ
クヴエツトを備えたギルホード300Nミクロサン
プル分光光度計を用いた。読みは全て340nmで行
つた。次の溶液を分析し使用する試薬として調製
した。 表 緩 衝 剤 ：0.055Mトリス−HCl、PH8.1
（RT） 0.05％ ナトリウムアジド 0.005％チメロサール 酵素結合体 ：緩衝剤 0.9％ NaCl 1.0％ RSA^*、PH8.1（RT） 分析媒体中で350〜500の範囲内の
ΔOD率を示すのに充分量の酵素
結合体（実施例２） 分析用緩衝剤 ：緩衝剤 0.5％ NaCl 0.01％（Ｖ／Ｖ）トリトンＸ−
100、PH8.1（RT） 抗体 試薬 ：緩衝剤 1.0％ RSA １−メチルキサンチン 1.67μ
ｇ／ml G₆P（Na） 0.066M NAD 0.04M PH５（RT） 分析に最適化された抗テオフイリ
ン％は特記ない限り全てＷ／Ｖ
（ｇ／ml）である。 ＊RSA＝ウサギ血清アルブミン 分析の実施に用いた方法は次の通りである。 50μの被検サンプルを希釈装置に入れ、250μ
の分析用緩衝剤と共に１mlクロアンキヤツプに
入れた。被希釈サンプルの50μの分析用緩衝剤
250μと共に第２のクロアンキヤツプに入れた。
この第２のクロンキヤツプに50μの抗体試薬を
250μの分析用緩衝剤と共に導入し、ついで50μ
の酵素試薬と250μの分析用緩衝剤とを添加
した。酵素添加直後にサンプル全量をフローセル
中に吸引した。15秒後に最初の読みをとり、その
30秒後に２度目の読みをとつた。結果は2.667に
おける吸光度の差として報告した。 次表に、既知量のテオフイリンを含む多数のサ
ンプルを用いて得られた結果を示す。 表 サンプル中のテオフイリン濃度 ΔDxμ／ml 2.667 ０ 163 2.5 201 ５ 221 10 244 20 267 40 292 上記結果を半対数紙にグラフ化することによ
り、未知サンプルで得られたΔODを、上記結果
を用いて得られた濃度−ΔODブロツトと比較す
ることにより未知サンプルのテオフイリン濃度を
決定できる。 １−メチルキサンチンに起因する交差反応性は
抗体試薬に小量の（一般的には、分析媒体中で約
１〜20μｇ／mlの、好ましくは２〜15μｇ／mlを
占めるのに充分な量の）１−メチルキサンチンを
添加することにより有効に低下できる。この方法
により、被分析血清サンプル中にある程度の１−
メチルキサンチンが存在する場合に示される偽陽
性は避けることができる。 実施例 ４ テオフイリンの３位を経て抗原性ポリアミノ酸
と結合させた結合体（以下、３位結合抗原と呼
ぶ）又はテオフイリンの８位を経て抗原性ポリア
ミノ酸と結合させた結合体（以下、８位結合抗原
と呼ぶ）を、ヒツジに注射して得られた抗体を使
用して、テオフイリン類似構造の様々な化合物を
用いて交差反応性の研究を行つた。 （抗原） ３位結合抗原は、実施例１により得られた結合
体を使用した。８位結合抗原は以下のようにして
調製した。 ８位結合抗原の調製 燐酸緩衝液（0.025モル、PH6.51、50ml）中の、
牛血清アルブミン（BSA）600mgと式： を有するＣ−８テオフイリンアルデヒド306mgと
の混合物に、２mlの水に懸濁させた138mgのシア
ノボロヒドリツドナトリウムを加えた。1Nの塩
酸を添加することにより、反応混合物のPHを、１
時間、6.3に注意して保持し、次いで、得られた
懸濁物を冷室（５℃）中で攪拌した。90分後、得
られた結合体混合物を活性炭（Norit Ａ）約500
mgと共に攪拌し、次いで、遠心分離（10K 15分）
した。淡黄色の上澄み液を、ミリポアフイルター
（0.22ｍμ）に通過させ、液を水（10×４）
とアンモニア水（PH9.0、２×４）で透析した。
凍結乾燥すると、434mgの結合体を得た。紫外線
吸収分析により、テオフイリン対BSAのモル比
は25：１であつた。 （酵素結合体） テオフイリンの３位を経て酵素性ポリアミノ酸
と結合させた結合体（以下、３位結合酵素と呼
ぶ）は、実施例２により得られた結合体を使用し
た。テオフイリンの８位を経て酵素性ポリアミノ
酸と結合させた結合体（以下、８位結合酵素と呼
ぶ）は、以下のようにして調製した。 ８位結合酵素の調製 乾燥したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド500μ
に溶解させた式 のＮ−（８テオフイリンアセチル）グリシン15.5
mg、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド６mg及び
EDCI11.5mgの溶液を４℃で一夜放置した。得ら
れた活性化エステル溶液70μの10μずつを、
G6PDH2.8mg（2.7×10^-5ミリモル）、グルコース
−６−ホスフエート−ナトリウム塩10mg、
NADH二ナトリウム三水和物20mg、炭酸ナトリ
ウム緩衝液（１ml、0.1モル、PH９）中のカルビ
トール300μを含有する溶液に、０℃で加えた。
結合している間、溶液のPHを8.4に下げた。次い
で、酵素結合体を含有する溶液を、４℃でトリス
緩衝液（0.055モル、PH8.1）で５回透析した。 （テオフイリン類似化合物） 交差反応性を研究した化合物はカフエイン、１
−メチル尿酸、１，３−ジメチル尿酸、テオブロ
ミン、１−メチルキサンチン、３−メチルキサン
チンであつた。 次表に、類似化合物のテオフイリン抗血清の交
差反応性を、1.0μｇ／ｍμのテオフイリン値と同
等の応答を与えるのに必要なテオフイリン対交差
反応体比を百分率で表した結果を示す。

【表】 上記の表より、３位結合抗原に応答して得られ
た抗体が、交差反応体（テオフイリンの代謝物で
ある１−メチル尿酸、１，３−ジメチル尿酸及び
３−メチルキサンチンと、並びにカフエイン及び
テオブロミン）と有意な交差反応性を示さなかつ
たことがわかる。即ち、被検サンプルに100μ
ｇ／mlのこれらの化合物を添加したとき、観察値
は、1.0μｇ／mlのテオフイリン濃度で得られた値
より低かつた。これに対し、８位結合抗原に応答
して得られた抗体ではこれらの交差反応体と相対
的に交差反応性が高く酵素免疫分析には不適であ
つた。３位結合抗原由来の場合で、１−メチルキ
サンチンの交差反応性は、4.5〜10μｇ／mlのテオ
フイリン濃度と均等だつたが、前述の如く、少量
の１−メチルキサンチンを分析媒体中に用いる
と、更に１−メチルキサンチンを添加しても実質
上の影響はない。 上記結果より、本発明により、生理学的流動体
（特に血清）中のテオフイリンを測定するための
高感度分析法が提供される。この分析法は、テオ
フイリンが極度に低濃度であつても、極度に類似
した構造を持つ化合物と識別できる。更に、この
方法は簡単であり、迅速であり、又通常の分光光
度計で容易に実施できる。 以上に本発明を理解を明白にするために例示実
施例により若干詳細に記載したが、本発明の範囲
内において変更、修正をなしえることは明白であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式Ｉ： （式中、PAAは少なくとも約5000の分子量を
   持つ抗原性又は酵素性ポリアミノ酸であり： ｎは少なくとも１であり、かつPAAの分子量
   の1500分の１より小さく： Ｒは一般式： （式中、ＸとX′とは同一でも異つてもよく、
   酸素原子、イミノ基又はイオウ原子であり： Ｔは直接結合又はC_1-10炭化水素基であり： T¹は直接結合、C_1-10炭化水素基又はC_1-10ヒド
   ロカルビルアミノ基であり： Ｙは直接結合、アミド基又はオキシ基であり： ｍとｐとは０〜１の整数であり： 【式】はテオフイリンの窒素原子に結合してお り： 【式】はポリアミノ酸の窒素原子に結合してい る） で示されるテオフイリンの定量に有用である化合
   物。 ２ 一般式でPAAが約10000〜600000の分子量
   を持つ抗原である、特許請求の範囲第１項記載の
   化合物。 ３ 一般式でPAAが約10000〜300000の分子量
   を持つ酵素であり、ｎが約１〜30の範囲内にあ
   る、特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ４ 一般式でｍとｐとが１であり、ＴとＹとが
   各々直接結合である、特許請求の範囲第１項記載
   の化合物。 ５ 一般式でT¹がC_1-6脂肪族基である特許請
   求の範囲第４項記載の化合物。 ６ 一般式でｍが０であり、ＴとＹとが各々直
   接結合であり、T¹がC_1-6脂肪族基である、特許
   請求の範囲第１項記載の化合物。 ７ 一般式でPAAが約10000〜600000の分子量
   を持つ抗原性ポリアミノ酸であり、Ｒ−はCH₂
   （CH₂）₂CO−であり、ｎは約４〜250の範囲内に
   ある特許請求の範囲第１項に記載の化合物。 ８ 該抗原ポリアミノ酸が牛γ−グロブリンであ
   る特許請求の範囲第７項記載の化合物。 ９ 一般式でPAAが酵素であり、ｎは平均す
   ると１から該酵素の分子量の約2000分の１の範囲
   内の整数である、特許請求の範囲第１項に記載の
   化合物。 １０ 該酵素がデヒドロゲナーゼである特許請求
   の範囲第９項記載の化合物。 １１ 一般式でｍが０である、特許請求の範囲
   第１０項記載の化合物。 １２ 一般式でｍが０である、特許請求の範囲
   第９項記載の化合物。 １３ 一般式でｍで０であり、X¹が酸素原子
   であり、ｐが１であり、ＴとＹとが各々直接結合
   であり、T¹がC_1-6飽和脂肪族基を形成している、
   特許請求の範囲第９項記載の化合物。 １４ 一般式でPAAが酵素であり、Ｒ−は
   CH₂（CH₂）₂CO−であり、ｎは平均すると２〜16
   の範囲内にある特許請求の範囲第１項に記載の化
   合物。 １５ 該酵素がグルコース−６−ホスフエートの
   デヒドロゲナーゼである、特許請求の範囲第１４
   項記載の化合物。