JPH0662628B2 - エトサキシミド試験法、トレーサー、イムノゲンおよび抗体 - Google Patents
エトサキシミド試験法、トレーサー、イムノゲンおよび抗体Info
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- JPH0662628B2 JPH0662628B2 JP61072644A JP7264486A JPH0662628B2 JP H0662628 B2 JPH0662628 B2 JP H0662628B2 JP 61072644 A JP61072644 A JP 61072644A JP 7264486 A JP7264486 A JP 7264486A JP H0662628 B2 JPH0662628 B2 JP H0662628B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 １．技術分野 本発明は液体、特に血清、血漿又は尿の様な生物学的液
体中のエトサキシミド量測定の螢光偏光免疫試験法とそ
の試薬およびその製法に関する。特に本発明は(1)試料
中のエトサキシミド量測定用試薬（トレーサーと抗
体）、(2)抗体をあげるにつかうイムノゲン化合物、(3)
（トレーサーとイムノゲン化合物製造用）合成法および
(4)試験にあたつての分析法に関する。
体中のエトサキシミド量測定の螢光偏光免疫試験法とそ
の試薬およびその製法に関する。特に本発明は(1)試料
中のエトサキシミド量測定用試薬（トレーサーと抗
体）、(2)抗体をあげるにつかうイムノゲン化合物、(3)
（トレーサーとイムノゲン化合物製造用）合成法および
(4)試験にあたつての分析法に関する。
２．従来技術 エトサキシミドはペチーマールてんかんによつておこる
急発作治療用薬剤である。全身けいれんの度数は運動性
皮質の抑圧および中枢神経系統のけいれん刺戟限界値上
昇によつて明らかに減少する。エトサキシミドは胃腸系
統、胃粘膜系統および神経系統の重大な逆反応を他の副
作用の他におこしうる。４０乃至１００μｇ／ml量の血
漿は治療に有効と信じられまた１００μｇ／ml以上の量
は有毒と信じられている。エトサキシミドの血漿量は個
々の薬品運動学における広い変化により広く患者間で変
わる。また同じ患者においてもその状態が変わると運動
速度は変りうる。したがつて患者血液中のエトサキシミ
ド量の監視は安全有効な治療に推奨されている。
急発作治療用薬剤である。全身けいれんの度数は運動性
皮質の抑圧および中枢神経系統のけいれん刺戟限界値上
昇によつて明らかに減少する。エトサキシミドは胃腸系
統、胃粘膜系統および神経系統の重大な逆反応を他の副
作用の他におこしうる。４０乃至１００μｇ／ml量の血
漿は治療に有効と信じられまた１００μｇ／ml以上の量
は有毒と信じられている。エトサキシミドの血漿量は個
々の薬品運動学における広い変化により広く患者間で変
わる。また同じ患者においてもその状態が変わると運動
速度は変りうる。したがつて患者血液中のエトサキシミ
ド量の監視は安全有効な治療に推奨されている。
従来患者の血清又は血漿エトサキシミド量は通常高性能
液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法、ガスクロマトグラ
フ（ＧＣ）法、酵素免疫試験（ＥＩＡ）および基質結合
螢光免疫試験（ＳＬＦＩＡ）で測定されている。これら
の方法は薬品濃度検出に適当に特定しているが欠点がな
いわけではない。ＨＰＬＣとＧＣ法は試料抽出を要し試
験時間が長い。ＥＩＡとＳＬＦＩＡは酵素試験があり次
の欠点をもつ：(1)試薬が比較的不安定である、(2)ＥＩ
ＡとＳＬＦＩＡの酵素反応に影響をもつ生物学的試料中
の成分（酵素抑制剤又は同じ反応を接触する酵素の様
な）が試験結果に影響をもつ、および(3)ＥＩＡとＳＬ
ＦＩＡは吸光又は螢光のいづれかを測定しまた吸光又は
螢光（脂質、ヘモグロビン、ビリルビン又は他の発色団
又は螢光団の様な）に影響する生物学的試料中の化合物
はこの試験からえられる結果の精度に影響をもつ。
液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法、ガスクロマトグラ
フ（ＧＣ）法、酵素免疫試験（ＥＩＡ）および基質結合
螢光免疫試験（ＳＬＦＩＡ）で測定されている。これら
の方法は薬品濃度検出に適当に特定しているが欠点がな
いわけではない。ＨＰＬＣとＧＣ法は試料抽出を要し試
験時間が長い。ＥＩＡとＳＬＦＩＡは酵素試験があり次
の欠点をもつ：(1)試薬が比較的不安定である、(2)ＥＩ
ＡとＳＬＦＩＡの酵素反応に影響をもつ生物学的試料中
の成分（酵素抑制剤又は同じ反応を接触する酵素の様
な）が試験結果に影響をもつ、および(3)ＥＩＡとＳＬ
ＦＩＡは吸光又は螢光のいづれかを測定しまた吸光又は
螢光（脂質、ヘモグロビン、ビリルビン又は他の発色団
又は螢光団の様な）に影響する生物学的試料中の化合物
はこの試験からえられる結果の精度に影響をもつ。
他の物質の試験において競争結合免疫試験は更に満足な
別法を与えている。一般に競争結合免疫試験は試験試料
中の配位子測定に使われている。（本記述の目的のため
“配位子”は競争結合免疫試験法により定量測定される
生物学興味ある物質である。）配位子は配位子又は配位
子同族体に特定の抗体上の一定数の受体結合位置をラベ
ル付試薬又は“配位子同族体”又は“トレーサー”と争
う。試料中の配位子濃度は抗体に結合する配位子同族体
の量を決定する。配位子と配位子同族体の各々はその濃
度に比例して抗体と結合するので結合する配位子同族体
量は試料中の配位子濃度に逆比例する。
別法を与えている。一般に競争結合免疫試験は試験試料
中の配位子測定に使われている。（本記述の目的のため
“配位子”は競争結合免疫試験法により定量測定される
生物学興味ある物質である。）配位子は配位子又は配位
子同族体に特定の抗体上の一定数の受体結合位置をラベ
ル付試薬又は“配位子同族体”又は“トレーサー”と争
う。試料中の配位子濃度は抗体に結合する配位子同族体
の量を決定する。配位子と配位子同族体の各々はその濃
度に比例して抗体と結合するので結合する配位子同族体
量は試料中の配位子濃度に逆比例する。
螢光偏光は競争結合免疫試験で生成されたトレーサー−
抗体共役物量の定量測定法となる。螢光偏光法は螢光ラ
ベル付き化合物が平面偏光によつて励起されたときその
回転速度に逆比例する偏光度をもつ螢光を放出するとい
う原理に基づく。しがたつて螢光ラベルをもつトレーサ
ー−抗体共役物が平面偏光によつて励起されると光が吸
収されまた放出される時間の間螢光団が回転から拘束さ
れるので放出光は非常に偏光されたままでいる。反対に
結合していないトレーサーが平面偏光によつて励起され
るとその回転は対応するトレーサー−抗体共役物のそれ
よりずつと速い。結果として非結合トレーサー分子から
放出された光は消偏される。
抗体共役物量の定量測定法となる。螢光偏光法は螢光ラ
ベル付き化合物が平面偏光によつて励起されたときその
回転速度に逆比例する偏光度をもつ螢光を放出するとい
う原理に基づく。しがたつて螢光ラベルをもつトレーサ
ー−抗体共役物が平面偏光によつて励起されると光が吸
収されまた放出される時間の間螢光団が回転から拘束さ
れるので放出光は非常に偏光されたままでいる。反対に
結合していないトレーサーが平面偏光によつて励起され
るとその回転は対応するトレーサー−抗体共役物のそれ
よりずつと速い。結果として非結合トレーサー分子から
放出された光は消偏される。
この螢光偏光法は螢光団としてトリアジニルアミノ−フ
ルオレシイン部分使用に関するワングらの米国特許第
４，４２０，５６８号に応用されている。エトサキシミ
ド抗原共役物および抗体はソフアーらのカナダ特許第
１，０３７，４７５号およびバツクラーらの１９８３年
５月１９日のヨーロッパ特許出願第８３−１０４９２
９．１に記載されている。エトサキシミドの螢光偏光免
疫試験は英国ロンドンのインターナシヨナルラボラトリ
ーサーヴイセズから１９８３年出版された“エトキサシ
ミドの偏光螢光免疫試験”に記載されている。
ルオレシイン部分使用に関するワングらの米国特許第
４，４２０，５６８号に応用されている。エトサキシミ
ド抗原共役物および抗体はソフアーらのカナダ特許第
１，０３７，４７５号およびバツクラーらの１９８３年
５月１９日のヨーロッパ特許出願第８３−１０４９２
９．１に記載されている。エトサキシミドの螢光偏光免
疫試験は英国ロンドンのインターナシヨナルラボラトリ
ーサーヴイセズから１９８３年出版された“エトキサシ
ミドの偏光螢光免疫試験”に記載されている。
本発明は非常に敏感なトレーサー、その製法およびトレ
ーサーを使う試験法がエトサキシミドの測定に提供され
る点で従来技術以上にこの技術の発達をすすめる。本発
明によつてなされる試験は下記するとおり特に正確であ
る。
ーサーを使う試験法がエトサキシミドの測定に提供され
る点で従来技術以上にこの技術の発達をすすめる。本発
明によつてなされる試験は下記するとおり特に正確であ
る。
発明の要旨 本発明はエトサキシミドの螢光偏光試験、試験に使うト
レーサー、およびトレーサーの製法に関する。
レーサー、およびトレーサーの製法に関する。
本発明は新規構造をもつ独特のトレーサーの発見に関す
る。本発明によるトレーサーは式２（式中Ｒ１はＨ又は
−Ｒ−Ｚ−Ｑを表し；Ｒ２はＲ１がＨであるとき-CH2−
Ｒ−Ｚ−ＱでありまたＲ１が−Ｒ−Ｚ−Ｑであるときは
Ｒ２はメチル又はエチルであり、Ｒ３はメチル又はエチ
ルを表し；Ｑはフルオレスセイン又はフルオレスセイン
誘導体を表し；ＺはNH,CO,CS,SO2又はＣ＝NHであり；そ
してＲはヘテロ原子１０までを含みかつ直鎖又は分枝鎖
に配置された炭素原子とヘテロ原子との合計０乃至２０
をもちまた２までの環構造をもつ結合基を表すが、但し
Ｒ１が−Ｒ−Ｚ−Ｑであり、Ｑがフルオレスセインのア
ミノ誘導体であり、ＺがＣＯでありかつＲが通常アルキ
ル鎖であるときはＲは少なくとも３炭素原子をもたねば
ならない）で示される構造式で表される。
る。本発明によるトレーサーは式２（式中Ｒ１はＨ又は
−Ｒ−Ｚ−Ｑを表し；Ｒ２はＲ１がＨであるとき-CH2−
Ｒ−Ｚ−ＱでありまたＲ１が−Ｒ−Ｚ−Ｑであるときは
Ｒ２はメチル又はエチルであり、Ｒ３はメチル又はエチ
ルを表し；Ｑはフルオレスセイン又はフルオレスセイン
誘導体を表し；ＺはNH,CO,CS,SO2又はＣ＝NHであり；そ
してＲはヘテロ原子１０までを含みかつ直鎖又は分枝鎖
に配置された炭素原子とヘテロ原子との合計０乃至２０
をもちまた２までの環構造をもつ結合基を表すが、但し
Ｒ１が−Ｒ−Ｚ−Ｑであり、Ｑがフルオレスセインのア
ミノ誘導体であり、ＺがＣＯでありかつＲが通常アルキ
ル鎖であるときはＲは少なくとも３炭素原子をもたねば
ならない）で示される構造式で表される。
Ｑがフルオレスセイン又はその誘導体であるとき化合物
はトレーサーとして使われる。
はトレーサーとして使われる。
本発明はまた式２（式中Ｒ１はＨ又は−Ｒ−Ｙを表し；
Ｒ２はＲ１がＨのときは-CH2−Ｒ−Ｙを表しまたＲ１が
−Ｒ−Ｙのときはメチル又はエチルを表し；Ｒ３はメチ
ル又はエチルを表し；Ｙは-NH2、-COOH、-SO3H、-SO2Cl、S
H、-CHO、-CN又は-OHを表し；Ｒはヘテロ原子１０までを
含みまた直鎖又は分枝鎖の形の炭素原子とヘテロ原子と
の合計０乃至２０をもちまた２までの環構造をもつ結合
基を表す、但しＲ１が−Ｒ−Ｙであり、Ｒが通常アルキ
ル鎖でありまたＹがCOOHであるときはＲは少なくとも３
炭素原子をもつことが必要である）で示される化合物を
フルオレスセイン又はその誘導体と結合させることによ
りトレーサーの製法を提供する。
Ｒ２はＲ１がＨのときは-CH2−Ｒ−Ｙを表しまたＲ１が
−Ｒ−Ｙのときはメチル又はエチルを表し；Ｒ３はメチ
ル又はエチルを表し；Ｙは-NH2、-COOH、-SO3H、-SO2Cl、S
H、-CHO、-CN又は-OHを表し；Ｒはヘテロ原子１０までを
含みまた直鎖又は分枝鎖の形の炭素原子とヘテロ原子と
の合計０乃至２０をもちまた２までの環構造をもつ結合
基を表す、但しＲ１が−Ｒ−Ｙであり、Ｒが通常アルキ
ル鎖でありまたＹがCOOHであるときはＲは少なくとも３
炭素原子をもつことが必要である）で示される化合物を
フルオレスセイン又はその誘導体と結合させることによ
りトレーサーの製法を提供する。
本発明はさらにエトサキシミド濃度の測定法を提供す
る。試料をエトサキシミド抗血清およびエトサキシミド
抗血清の存在に対し検出可能な螢光偏光応答をなし得る
エトサキシミド誘導体を含むフルオレスセインと接触さ
せる。次いで平面偏光を溶液にとおして螢光偏光応答を
得た後この応答を試料中のエトサキシミド量の尺度とし
て検出する。
る。試料をエトサキシミド抗血清およびエトサキシミド
抗血清の存在に対し検出可能な螢光偏光応答をなし得る
エトサキシミド誘導体を含むフルオレスセインと接触さ
せる。次いで平面偏光を溶液にとおして螢光偏光応答を
得た後この応答を試料中のエトサキシミド量の尺度とし
て検出する。
更に本発明の目的と伴なう利点は図式と実施例と共に本
明細書によつてよく諒解されるであろう。
明細書によつてよく諒解されるであろう。
構造式の説明 下記構造式中“Fl”はフルオレスセイン部分を表わしま
た種々の他の記号は下記する。式中のＲ２とＲ３および
（又は）メチルとエチル基のオリエンテーシヨンは特定
エナンチオマー又はジアステレオマーを暗示する意味で
もなく排除もしない。
た種々の他の記号は下記する。式中のＲ２とＲ３および
（又は）メチルとエチル基のオリエンテーシヨンは特定
エナンチオマー又はジアステレオマーを暗示する意味で
もなく排除もしない。
式１は本発明により定量測定されるエトサキシミドの一
般構造式を示す。
般構造式を示す。
式２は本発明のトレーサーおよびイムノゲン並びにこれ
ら製造に使われる種々の反応体の一般構造式を示す。
ら製造に使われる種々の反応体の一般構造式を示す。
式３は本発明のトレーサーに含まれたフルオレスセイン
部分の別々の構造式と名を示している。
部分の別々の構造式と名を示している。
式４は式２のトレーサーの先駆物質を表わすとき先駆物
質にフルオレスセイン部分を結合する種々の結合基を示
している。
質にフルオレスセイン部分を結合する種々の結合基を示
している。
式５から２０までは本発明によるトレーサーの構造式の
種々の例を示している。
種々の例を示している。
式２１から２４までは本発明に用いるイムノゲン生成に
使う種々のハプテン反応体の構造式の例を示している。
使う種々のハプテン反応体の構造式の例を示している。
発明の説明 本発明の種々の形態を今や構造式に関連して詳細説明す
る。
る。
本発明はフルオレスセインとその誘導体の使用を含む。
特にフルオレスセインとその誘導体のトレーサー化合物
利用に対する必要特性はフルオレスセインの螢光であ
る。フルオレスセインは環境の酸濃度（pH）によつて式
３に示すとおり２互変異性体形で存在する。開放（酸）
型では多数の共役２重結合があり、それによつてフルオ
レスセイン（およびフルオレスセイン部分をもつ化合
物）のこの形が青光を吸収し約４ナノセコンドの励起状
態寿命の後縁螢光を放出できる様になる。開放型と閉止
型が共存するときは両者の分子の相対濃度がpH調節によ
つて容易に変えられる。一般に本発明のトレーサー化合
物はナトリウム、カリウム、アンモニウム等の様な生物
学的に許容される塩として溶液中にあり、それは本発明
の分析法を用いたとき化合物を開放螢光形で存在させ
る。存在する特定塩はpH調節に使つた緩衝剤によるだろ
う。例えばりん酸ナトリウム緩衝液の存在で本発明の化
合物は一般にナトリウム塩として開放形で存在するだろ
う。
特にフルオレスセインとその誘導体のトレーサー化合物
利用に対する必要特性はフルオレスセインの螢光であ
る。フルオレスセインは環境の酸濃度（pH）によつて式
３に示すとおり２互変異性体形で存在する。開放（酸）
型では多数の共役２重結合があり、それによつてフルオ
レスセイン（およびフルオレスセイン部分をもつ化合
物）のこの形が青光を吸収し約４ナノセコンドの励起状
態寿命の後縁螢光を放出できる様になる。開放型と閉止
型が共存するときは両者の分子の相対濃度がpH調節によ
つて容易に変えられる。一般に本発明のトレーサー化合
物はナトリウム、カリウム、アンモニウム等の様な生物
学的に許容される塩として溶液中にあり、それは本発明
の分析法を用いたとき化合物を開放螢光形で存在させ
る。存在する特定塩はpH調節に使つた緩衝剤によるだろ
う。例えばりん酸ナトリウム緩衝液の存在で本発明の化
合物は一般にナトリウム塩として開放形で存在するだろ
う。
本明細書で使う個々の化合物又は大化合物の成分として
いづれかの“フルオレスセイン”とはそれらが特定分子
に対して存在するならば螢光の関係において以外は開放
型と閉止型いづれも含むことを意味する。開放型は螢光
をおこすに必要である。
いづれかの“フルオレスセイン”とはそれらが特定分子
に対して存在するならば螢光の関係において以外は開放
型と閉止型いづれも含むことを意味する。開放型は螢光
をおこすに必要である。
フルオレスセイン分子の炭素原子の番号は分子の開放型
と閉止型のどれを考えるかによつて変わる。したがつて
フルオレスセインとその化合物に関する文献は炭素原子
番号に関して一定しない。閉止型においてフエニル環上
のラクトンのカルボニルに対するパラ−炭素は６番であ
る。開放型のフエニル環上のカルボン酸基に対するパラ
炭素は５番である。（式３参照）合成に使われた原料が
この系によつて一番普通に番号をつけられているので本
明細書では閉止型の番号を採用している。フルオレスセ
インとその化合物のカルボキシル基と反対の炭素原子は
したがつて本明細書の目的に対し“６”と番号をつけて
いる。
と閉止型のどれを考えるかによつて変わる。したがつて
フルオレスセインとその化合物に関する文献は炭素原子
番号に関して一定しない。閉止型においてフエニル環上
のラクトンのカルボニルに対するパラ−炭素は６番であ
る。開放型のフエニル環上のカルボン酸基に対するパラ
炭素は５番である。（式３参照）合成に使われた原料が
この系によつて一番普通に番号をつけられているので本
明細書では閉止型の番号を採用している。フルオレスセ
インとその化合物のカルボキシル基と反対の炭素原子は
したがつて本明細書の目的に対し“６”と番号をつけて
いる。
抗体に複合していない溶液中のトレーサーは螢光の吸収
と再放出に必要な時間以内で回転する自由である。結果
として再放出光は比較的ランダムに配向されているので
抗体に複合していないトレーサーの螢光偏光は小さくゼ
ロに近い。特定抗体と複合すると生成したトレーサー−
抗体複合物は比較的小トレーサー分子の回転よりおそい
回転をして認められる偏光を増す。したがつて配位子が
トレーサーと抗体位置をとり合うときはえられた遊離ト
レーサーとトレーサー−抗体複合物の混合物の認められ
る螢光偏光はトレーサーのそれとトレーサー−抗体複合
物のそれとの中間値となる。試料が高濃度の配位子を含
むならば認められる偏光値は遊離配位子のそれに接近し
て小さい。試験試料が低濃度配位子を含むならば偏光値
は結合配位子のそれにより近く高い。免疫試験の反応混
合物を垂直偏光次いで水平偏光で連続して励起し放出光
の垂直偏光成分のみを分析することによつて反応混合物
中の螢光偏光を正確に測定できる。偏光と測定される配
位子濃度の間の詳細な関係は既知濃度の補正物質の偏光
値測定によつて確立される。配位子の濃度はこの様につ
くられた標準曲線から挿入できる。
と再放出に必要な時間以内で回転する自由である。結果
として再放出光は比較的ランダムに配向されているので
抗体に複合していないトレーサーの螢光偏光は小さくゼ
ロに近い。特定抗体と複合すると生成したトレーサー−
抗体複合物は比較的小トレーサー分子の回転よりおそい
回転をして認められる偏光を増す。したがつて配位子が
トレーサーと抗体位置をとり合うときはえられた遊離ト
レーサーとトレーサー−抗体複合物の混合物の認められ
る螢光偏光はトレーサーのそれとトレーサー−抗体複合
物のそれとの中間値となる。試料が高濃度の配位子を含
むならば認められる偏光値は遊離配位子のそれに接近し
て小さい。試験試料が低濃度配位子を含むならば偏光値
は結合配位子のそれにより近く高い。免疫試験の反応混
合物を垂直偏光次いで水平偏光で連続して励起し放出光
の垂直偏光成分のみを分析することによつて反応混合物
中の螢光偏光を正確に測定できる。偏光と測定される配
位子濃度の間の詳細な関係は既知濃度の補正物質の偏光
値測定によつて確立される。配位子の濃度はこの様につ
くられた標準曲線から挿入できる。
本発明により生成された特定抗体とトレーサーは下記す
るとおり非常によい試験法をつくることが発見されてい
る。
るとおり非常によい試験法をつくることが発見されてい
る。
１．試薬 本発明のイムノゲンとトレーサーの両方は本発明要旨お
よび式２に示したとおり一般構造式によつて表わすこと
ができる。
よび式２に示したとおり一般構造式によつて表わすこと
ができる。
目的は抗体の認識位置に対するエトサキシミドとトレー
サー間の競合をもつことにある。ハプテンとトレーサー
の構造の大変化はこの目標を獲得させる。本発明の目的
に対し“ハプテン”はイムノゲンの先駆物質であり、一
般に免疫学的に活性な担体に結合するに適する基をもつ
置換サクシニミド誘導体を成す。
サー間の競合をもつことにある。ハプテンとトレーサー
の構造の大変化はこの目標を獲得させる。本発明の目的
に対し“ハプテン”はイムノゲンの先駆物質であり、一
般に免疫学的に活性な担体に結合するに適する基をもつ
置換サクシニミド誘導体を成す。
ａ．イムノゲンの構造 使用可能の抗体が種々のサクシニミド誘導体から生成で
きる。環の１又は３位置のいづれかに反応性化された化
合物からつくつたイムノゲンは動物中に抗体を生成でき
る。この抗体は適当なトレーサーと組合せたとき本発明
によるエトサキシミド試験に便利である。
きる。環の１又は３位置のいづれかに反応性化された化
合物からつくつたイムノゲンは動物中に抗体を生成でき
る。この抗体は適当なトレーサーと組合せたとき本発明
によるエトサキシミド試験に便利である。
本発明のイムノゲンは式２で示される一般構造式をもち
また本発明の好ましい形のイムノゲンは式２をもつ一般
構造式から誘導される。イムノゲンは式２に示す種の化
合物を下記合成法又は実施例の関係で記載する様なポリ
（アミノ酸）又はその誘導体又は免疫学的に活性な担体
とカツプルさせて製造できる。
また本発明の好ましい形のイムノゲンは式２をもつ一般
構造式から誘導される。イムノゲンは式２に示す種の化
合物を下記合成法又は実施例の関係で記載する様なポリ
（アミノ酸）又はその誘導体又は免疫学的に活性な担体
とカツプルさせて製造できる。
本発明の好ましい形のイムノゲンは式２で示される構造
式をもつ。１又は３位置いづれかの置換基が構造上同様
に好ましいが、環上１位置の誘導体において出発物質が
より容易に入手できまた合成がずつと簡単となる。しか
し与えられた動物から便利な抗血清がえられる確率は３
位置の誘導体の方がより大きいと思われる。牛血清アル
ブミンがこの好ましい形のポリ（アミノ酸）であるが、
アルブミン、血清蛋白質、例えばグロブリン、眼レンズ
蛋白質、リポプロテイン等の様な種々の蛋白質担体も使
用できることが諒解されるべきである。蛋白質担体例に
は牛血清アルブミン、キーホールリンペツトヘモシアニ
ン、卵オバルブミン、牛ガンマーグロブリン、チロキシ
ン結合グロブリン等がある。別にアスパルテートの様な
十分な数の有効カルボキシレート基をもつ合成ポリ（ア
ミノ酸）も使用できるし、同様に反応性官能基をもつ他
の合成又は天然重合体物質も使用できる。また免疫学的
担体として使用できる炭水化物、酵母、多糖類又は他の
物質もハプテンに共役させてイムノゲンを生成できる。
式をもつ。１又は３位置いづれかの置換基が構造上同様
に好ましいが、環上１位置の誘導体において出発物質が
より容易に入手できまた合成がずつと簡単となる。しか
し与えられた動物から便利な抗血清がえられる確率は３
位置の誘導体の方がより大きいと思われる。牛血清アル
ブミンがこの好ましい形のポリ（アミノ酸）であるが、
アルブミン、血清蛋白質、例えばグロブリン、眼レンズ
蛋白質、リポプロテイン等の様な種々の蛋白質担体も使
用できることが諒解されるべきである。蛋白質担体例に
は牛血清アルブミン、キーホールリンペツトヘモシアニ
ン、卵オバルブミン、牛ガンマーグロブリン、チロキシ
ン結合グロブリン等がある。別にアスパルテートの様な
十分な数の有効カルボキシレート基をもつ合成ポリ（ア
ミノ酸）も使用できるし、同様に反応性官能基をもつ他
の合成又は天然重合体物質も使用できる。また免疫学的
担体として使用できる炭水化物、酵母、多糖類又は他の
物質もハプテンに共役させてイムノゲンを生成できる。
ｂ．トレーサーの構造 本発明のトレーサーの構造における可能な変更はそのハ
プテンの構造のそれよりもずつと大きい。本発明のトレ
ーサーは式２で示す一般構造式をもつ。本発明の好まし
い形のトレーサーは式５に示す構造式をもつ。
プテンの構造のそれよりもずつと大きい。本発明のトレ
ーサーは式２で示す一般構造式をもつ。本発明の好まし
い形のトレーサーは式５に示す構造式をもつ。
トレーサーはエトサキシミド誘導体であり、それは例え
ば式４に示すとおりアミド、アミジノ、トリアジニルア
ミノ、カルバミド、チオカルバミド、カルバモイル、チ
オカルバモイル又はスルホニルカルバモイル基によつて
フルオレスセイン誘導体に結合している。トレーサーは
適当なフルオレスセイン誘導体をアミノ、カルボン酸、
スルホン酸、メルカプト、ヒドロキシ、イミデート、ヒ
ドラジド、イソシアネート、チオイソシアネート、クロ
ロホーメイト、クロロチオホーメイト、クロロスルホニ
ルカルバモイル又は下記合成法や実施例に関してあげら
れる様な同様の基をもつエトサキシミド誘導体に結合さ
せて製造できる。
ば式４に示すとおりアミド、アミジノ、トリアジニルア
ミノ、カルバミド、チオカルバミド、カルバモイル、チ
オカルバモイル又はスルホニルカルバモイル基によつて
フルオレスセイン誘導体に結合している。トレーサーは
適当なフルオレスセイン誘導体をアミノ、カルボン酸、
スルホン酸、メルカプト、ヒドロキシ、イミデート、ヒ
ドラジド、イソシアネート、チオイソシアネート、クロ
ロホーメイト、クロロチオホーメイト、クロロスルホニ
ルカルバモイル又は下記合成法や実施例に関してあげら
れる様な同様の基をもつエトサキシミド誘導体に結合さ
せて製造できる。
例として次のフルオレスセイン誘導体が使用できる； Fl-NH2 フルオレスセインアミン Fl-CO2H カルボキシフルオレスセイン Fl-NHCOCH2I α−アイオドアセトアミドフルオレス
セイン Fl-NHCOCH2Br α−ブロモアセトアミドフルオレスセ
イン （ＤＴＡＦ）2,4−ジクロロ−1,3,5−トリアジン−２−
イルアミノ−フルオレスセイン ４−クロロ−６−メトキシ−1,3,5−トリアジン−２−
イルアミノ−フルオレスセイン Fl-NCS フルオレスセインチオイソシアネート ２．抗体 本発明の抗体は上記イムノゲンに対する兎の反応を引出
して製造される。イムノゲンはこの分野の知識ある者に
よく知られた方法で動物又は免疫成分細胞の試験管内培
養物に一連の接種法によつて投与される。兎は詳記した
実験のエトサキシミドイムノゲンに対する好ましい免疫
宿主であつたが、ここに示した構造に対し抗体を生成で
きるどんな生体内又は試験管内宿主も使用できるのであ
る。
セイン Fl-NHCOCH2Br α−ブロモアセトアミドフルオレスセ
イン （ＤＴＡＦ）2,4−ジクロロ−1,3,5−トリアジン−２−
イルアミノ−フルオレスセイン ４−クロロ−６−メトキシ−1,3,5−トリアジン−２−
イルアミノ−フルオレスセイン Fl-NCS フルオレスセインチオイソシアネート ２．抗体 本発明の抗体は上記イムノゲンに対する兎の反応を引出
して製造される。イムノゲンはこの分野の知識ある者に
よく知られた方法で動物又は免疫成分細胞の試験管内培
養物に一連の接種法によつて投与される。兎は詳記した
実験のエトサキシミドイムノゲンに対する好ましい免疫
宿主であつたが、ここに示した構造に対し抗体を生成で
きるどんな生体内又は試験管内宿主も使用できるのであ
る。
式においてＲ１はＨ又は−Ｒ−Ｚでよい：Ｒ１がＲ−Ｚ
であればＲ２はメチル又はエチルであり；Ｒ１がＨであ
ればＲ２はＲ−Ｚであり；Ｒ３はメチル又はエチルであ
る。式中のＲ２とＲ３の配向はどの特定光学的対掌体を
含む意味でも除外する意味でもない。Ｒは製造がイムノ
ゲンを目標とする場合は７までのヘテロ原子を含みまた
製造がトレーサーを目ざす場合は１０までのヘテロ原子
を含みかつ直鎖又は分岐鎖中に炭素原子とヘテロ原子合
計０乃至２０をもち２までの環構造をもつ結合基であ
り；またＺは製造がイムノゲンを日ざす場合はNH2、NH
R3、Cl、Br、Ｉ又はOHでありまた製造がトレーサーを目ざ
す場合はNH2、COOH、CN、SO2Cl、SHまたはOHである。
であればＲ２はメチル又はエチルであり；Ｒ１がＨであ
ればＲ２はＲ−Ｚであり；Ｒ３はメチル又はエチルであ
る。式中のＲ２とＲ３の配向はどの特定光学的対掌体を
含む意味でも除外する意味でもない。Ｒは製造がイムノ
ゲンを目標とする場合は７までのヘテロ原子を含みまた
製造がトレーサーを目ざす場合は１０までのヘテロ原子
を含みかつ直鎖又は分岐鎖中に炭素原子とヘテロ原子合
計０乃至２０をもち２までの環構造をもつ結合基であ
り；またＺは製造がイムノゲンを日ざす場合はNH2、NH
R3、Cl、Br、Ｉ又はOHでありまた製造がトレーサーを目ざ
す場合はNH2、COOH、CN、SO2Cl、SHまたはOHである。
ａ．イムノゲンの合成 本発明のイムノゲンは一般式２（ＸがNH2、Cl、Br、Ｉ又は
OHである場合）によつて示される様なハプテンをポリ
（アミノ酸）又は免疫学的に活性な担体とカツプルさせ
て製造される。ポリ（アミノ酸）又は他の担体部分はア
ミド、チオエーテル、エーテル又はジアゾ結合によつて
ハプテンに結合される。好ましい実施態様においてポリ
（アミノ酸）は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でありハプ
テンは式２１の構造をもつ。これらの反応体はこの分野
でよく知られたアミド結合に通常使われる条件のもとで
結合させられる。カルボジイミド法はこの関係で好まし
いアミド結合をさせるに最も効果あるからこの方法を使
うことが最も好ましい。
OHである場合）によつて示される様なハプテンをポリ
（アミノ酸）又は免疫学的に活性な担体とカツプルさせ
て製造される。ポリ（アミノ酸）又は他の担体部分はア
ミド、チオエーテル、エーテル又はジアゾ結合によつて
ハプテンに結合される。好ましい実施態様においてポリ
（アミノ酸）は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でありハプ
テンは式２１の構造をもつ。これらの反応体はこの分野
でよく知られたアミド結合に通常使われる条件のもとで
結合させられる。カルボジイミド法はこの関係で好まし
いアミド結合をさせるに最も効果あるからこの方法を使
うことが最も好ましい。
イムノゲンは-NH2、-CONHNH2、CL2、Br、Ｉ又はOH基をもつ
ハプテンをポリ（アミノ酸）又は他の免疫学的に活性な
担体と結合させて製造される。-NH2の場合はジアゾニウ
ム塩を生成させこれをポリ（アミノ酸）に加えて、又は
-NH2基の存在でポリアミノ酸上のカルボン酸基を活性化
してカツプルさせる。ジアゾニウム塩法は芳香族アミン
に対してのみなされ一般に酸性液中でアミンを亜硝酸ナ
トリウムと混合してつくられる。ポリ（アミノ酸）上の
カルボン酸基の活性化はハプテンとポリ（アミノ酸）を
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣ）、１−シクロヘキシル−３−
（２−モルフオリノエチル）カルボジイミドメトール−
ｐ−トルエンスルホネート等と混合してすることができ
る。
ハプテンをポリ（アミノ酸）又は他の免疫学的に活性な
担体と結合させて製造される。-NH2の場合はジアゾニウ
ム塩を生成させこれをポリ（アミノ酸）に加えて、又は
-NH2基の存在でポリアミノ酸上のカルボン酸基を活性化
してカツプルさせる。ジアゾニウム塩法は芳香族アミン
に対してのみなされ一般に酸性液中でアミンを亜硝酸ナ
トリウムと混合してつくられる。ポリ（アミノ酸）上の
カルボン酸基の活性化はハプテンとポリ（アミノ酸）を
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣ）、１−シクロヘキシル−３−
（２−モルフオリノエチル）カルボジイミドメトール−
ｐ−トルエンスルホネート等と混合してすることができ
る。
-CONHNH2の場合は非芳香族アミノ場合と同様にカツプル
させる。アルキルクロロ、ブロモ、およびアイオドー誘
導体とスルフオネートエステルは強アルカリ性条件のも
とで担体蛋白質中のチロシン残基のフエノール性ヒドロ
キシル基をアルキル化してアルキルアリールエーテルと
しまた遊離スルフヒドリル基システインのいおうをアル
キル化してチオエーテルとする。これらの反応の好まし
い誘導体はアイオダイドおよびスルホネートエステルで
ある。スルホネートエステルは第３級アミン塩基の存在
でアルコール誘導体からスルホン酸ハライド又は無水物
との反応によつてうまく生成される。
させる。アルキルクロロ、ブロモ、およびアイオドー誘
導体とスルフオネートエステルは強アルカリ性条件のも
とで担体蛋白質中のチロシン残基のフエノール性ヒドロ
キシル基をアルキル化してアルキルアリールエーテルと
しまた遊離スルフヒドリル基システインのいおうをアル
キル化してチオエーテルとする。これらの反応の好まし
い誘導体はアイオダイドおよびスルホネートエステルで
ある。スルホネートエステルは第３級アミン塩基の存在
でアルコール誘導体からスルホン酸ハライド又は無水物
との反応によつてうまく生成される。
上記ハプテン（イムノゲン先駆物質）の合成は一般２方
法のいづれかで行なわれる。式２は本考案の方法の好ま
しい実施態様によるイムノゲン先駆物質を示している。
１−位置誘導体の製造は適当な２置換こはく酸および１
端に第１アミンと他端に望む官能基（又はその保護され
た形又は潜在形）をもつ選ばれた結合基から進行する。
環化反応は溶液中の反応体混合物をＮ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の様な脱水性試薬と
処理し又は単に反応体の緊密混合物を１００°より高い
が反応体や生成物のひどい熱分解が開始する温度より低
い温度に加熱して行なわせることができる。潜在の又は
保護された反応性度は次に現わされて化合物はポリ（ア
ミノ酸）又は他の担体にカツプルさせられる。
法のいづれかで行なわれる。式２は本考案の方法の好ま
しい実施態様によるイムノゲン先駆物質を示している。
１−位置誘導体の製造は適当な２置換こはく酸および１
端に第１アミンと他端に望む官能基（又はその保護され
た形又は潜在形）をもつ選ばれた結合基から進行する。
環化反応は溶液中の反応体混合物をＮ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の様な脱水性試薬と
処理し又は単に反応体の緊密混合物を１００°より高い
が反応体や生成物のひどい熱分解が開始する温度より低
い温度に加熱して行なわせることができる。潜在の又は
保護された反応性度は次に現わされて化合物はポリ（ア
ミノ酸）又は他の担体にカツプルさせられる。
３−位置誘導体の製造にはクネーフエナーゲル反応方法
が好ましい。適当なケトンとマロン酸又はその誘導体を
ピペリジン、モルフオリン等の様な塩基の存在で縮合さ
せてα，β−不飽和カルボン酸、ジニトリル、ジエステ
ル又はニトリルエステルを生成する。このカルボン酸誘
導体をアルカリ金属シアン化物と反応させ加水分解させ
て２酸化炭素を除去して置換こはく酸をえる、これはア
ンモニアの存在で対応するサクシニミドに環化できる。
潜在する又は保護された反応性度は次いで現わされて化
合物は担体にカツプルする。
が好ましい。適当なケトンとマロン酸又はその誘導体を
ピペリジン、モルフオリン等の様な塩基の存在で縮合さ
せてα，β−不飽和カルボン酸、ジニトリル、ジエステ
ル又はニトリルエステルを生成する。このカルボン酸誘
導体をアルカリ金属シアン化物と反応させ加水分解させ
て２酸化炭素を除去して置換こはく酸をえる、これはア
ンモニアの存在で対応するサクシニミドに環化できる。
潜在する又は保護された反応性度は次いで現わされて化
合物は担体にカツプルする。
１−位置における芳香族誘導体は適当なアニリン又はア
ラルキルアミンから製造される。１−位置におけるアル
コールは必要なアミノアルコールから製造される。対応
するカルボン酸はこれらからジヨーンズ試薬の様なクロ
ム主体の酸化剤で酸化してえられる。ヒドラジド誘導体
はカルボン酸からヒドラジン塩との活性エステルカツプ
リングによつて製造される。
ラルキルアミンから製造される。１−位置におけるアル
コールは必要なアミノアルコールから製造される。対応
するカルボン酸はこれらからジヨーンズ試薬の様なクロ
ム主体の酸化剤で酸化してえられる。ヒドラジド誘導体
はカルボン酸からヒドラジン塩との活性エステルカツプ
リングによつて製造される。
芳香族アミンは適当な芳香族化合物からサクシニミド環
の環化前又は後のいづれかに硝化し、好ましくは接触水
素添加又はナトリウムジチオナイトの様な化学還元剤に
より還元して製造できる。
の環化前又は後のいづれかに硝化し、好ましくは接触水
素添加又はナトリウムジチオナイトの様な化学還元剤に
より還元して製造できる。
アミンはサクシニミド環からヒドロキシル基をはなして
いる３以上の原子をもつアルコールを上記のとおりハラ
イドに変え又はメタンスルホネート、トルエンスルホネ
ート等の様なスルホネートエステルに変え、これをアル
カリ金属又は第４級アンモニウムアザイド等からのアザ
イドイオンで置換しえられたアジド基を接触水添又は化
学還元剤で還元して製造できる。サクシニミド環からア
ミノ基を分離している２又は３原子をもつアミンは１ア
ミノ基がジベンジルアミノの様な保護された又は潜在形
である様なジアミン上に適当なこはく酸を環化した後接
触水添等の様なサクシニミド環構造と適合する試薬によ
りアミンを脱保護又は顕現して製造される。アミンはま
たアルデヒドからアンモニウムアセテートとナトリウム
シアノボロハイドライドによる還元アミノ化反応によつ
て製造される。次いでこれらのアミン誘導体は担体にカ
ツプルさせてイムノゲンを生成するに適当である。
いる３以上の原子をもつアルコールを上記のとおりハラ
イドに変え又はメタンスルホネート、トルエンスルホネ
ート等の様なスルホネートエステルに変え、これをアル
カリ金属又は第４級アンモニウムアザイド等からのアザ
イドイオンで置換しえられたアジド基を接触水添又は化
学還元剤で還元して製造できる。サクシニミド環からア
ミノ基を分離している２又は３原子をもつアミンは１ア
ミノ基がジベンジルアミノの様な保護された又は潜在形
である様なジアミン上に適当なこはく酸を環化した後接
触水添等の様なサクシニミド環構造と適合する試薬によ
りアミンを脱保護又は顕現して製造される。アミンはま
たアルデヒドからアンモニウムアセテートとナトリウム
シアノボロハイドライドによる還元アミノ化反応によつ
て製造される。次いでこれらのアミン誘導体は担体にカ
ツプルさせてイムノゲンを生成するに適当である。
アルキルハライドはアルコールを塩化水素、臭化水素又
はよう化水素と処理し又は５塩化りん、３臭化りん、塩
化チオニル等の様なハロゲン化剤と処理して製造でき
る。これらのハライドは比較的中性条件のもとで担体上
の遊離スルフヒドリル基に又は強塩基性条件のもとでポ
リ（アミノ酸）中のチロシル残基のそれの様なフエノー
ルに直接結合する。
はよう化水素と処理し又は５塩化りん、３臭化りん、塩
化チオニル等の様なハロゲン化剤と処理して製造でき
る。これらのハライドは比較的中性条件のもとで担体上
の遊離スルフヒドリル基に又は強塩基性条件のもとでポ
リ（アミノ酸）中のチロシル残基のそれの様なフエノー
ルに直接結合する。
３−位置において環に結合している多くのエトサキシミ
ド誘導体は潜在反応性度として末端オレフインを用いて
うまく製造れる。この好ましい実施態様においてメチル
オメガ−アルケニル又はエチルオメガ−アルケニルケト
ンは上記クネーフエナーゲル法によつてサクシニミドに
変えられる。次いで末端オレフインはオゾン分解された
後ジメチルサルフアイド又は接触水添により緩還元され
てアルデヒドとなり又はナトリウムボロハイドライドの
様な還元剤を使いより激しく還元されて末端アルコール
となり又はジヨーンズ試薬などの様なクロム主体の酸化
剤で酸化されて対応するカルボン酸となる。
ド誘導体は潜在反応性度として末端オレフインを用いて
うまく製造れる。この好ましい実施態様においてメチル
オメガ−アルケニル又はエチルオメガ−アルケニルケト
ンは上記クネーフエナーゲル法によつてサクシニミドに
変えられる。次いで末端オレフインはオゾン分解された
後ジメチルサルフアイド又は接触水添により緩還元され
てアルデヒドとなり又はナトリウムボロハイドライドの
様な還元剤を使いより激しく還元されて末端アルコール
となり又はジヨーンズ試薬などの様なクロム主体の酸化
剤で酸化されて対応するカルボン酸となる。
ｂ．トレーサーの合成 本発明のトレーサーはフルオレスセイン部分又はその誘
導体を式２（式中Ｒ１はＨ又は−Ｒ−Ｙを表わし；Ｒ１
が−Ｒ−ＹであればＲ２はメチル又はエチルでありＲ１
がＨであればＲ２はCH2−Ｒ−Ｙであり；Ｒ３はメチル
又はエチルを表わし；Ｒはヘテロ原子１０までを含み直
鎖又は分岐鎖として並んだ炭素原子とヘテロ原子合計０
乃至２０をもちまた２までの環構造をもつ結合基を表わ
し；かつＹは-NH2、SO3H、COOH、CN、SO2Cl、CHO、SH又はOHを
表わす）で示される化合物とカツプルさせて製造され
る。フルオレスセイン部分は式４に示す様なアミド、ア
ミジン、ウレア、チオウレア、カルバメート、チオカル
バメート、トリアジニルアミノ、又はスルホニルカルバ
メート結合によつてアミノ、カルボキシル、イミデート
又はアルコキシ官能基に結合できる。現在好ましい実施
態様においてフルオレスセイン誘導体は６−カルボキシ
フルオレスセイン（カリホルニア州ラジオーラのカルビ
オケムから市販）であり、これは式２（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ３
＝メチル、Ｒ２＝(CH2)3NH2）をもつ先駆物質にカツプ
ルされる。６−カルボキシフルオレスセインは先づ６−
カルボキシフルオレスセインの活性エステルを生成して
３−メチル−３−アミノプロピルサクシニミドにカツプ
ルされる。好ましくい活性エステルはＮ−ヒドロキシサ
クシニミド活性エステルであり、好ましい方法は乾燥ピ
リジン中のＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド
活性化による方法である。他の１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール、ｐ−ニトロフエノールおよびカルボニルジ
イミダゾールの様な活性化基も使用でき、またジメチル
ホルムアミドやジメチルズルフオキシドの様な他の溶媒
も使用できる。反応体はアミド結合を生成する条件のも
とでカツプルさせるとよい。活性エステル法を使うと最
もよい。使用できるトレーサーは種々のエトサキシミド
誘導体から製造できる。
導体を式２（式中Ｒ１はＨ又は−Ｒ−Ｙを表わし；Ｒ１
が−Ｒ−ＹであればＲ２はメチル又はエチルでありＲ１
がＨであればＲ２はCH2−Ｒ−Ｙであり；Ｒ３はメチル
又はエチルを表わし；Ｒはヘテロ原子１０までを含み直
鎖又は分岐鎖として並んだ炭素原子とヘテロ原子合計０
乃至２０をもちまた２までの環構造をもつ結合基を表わ
し；かつＹは-NH2、SO3H、COOH、CN、SO2Cl、CHO、SH又はOHを
表わす）で示される化合物とカツプルさせて製造され
る。フルオレスセイン部分は式４に示す様なアミド、ア
ミジン、ウレア、チオウレア、カルバメート、チオカル
バメート、トリアジニルアミノ、又はスルホニルカルバ
メート結合によつてアミノ、カルボキシル、イミデート
又はアルコキシ官能基に結合できる。現在好ましい実施
態様においてフルオレスセイン誘導体は６−カルボキシ
フルオレスセイン（カリホルニア州ラジオーラのカルビ
オケムから市販）であり、これは式２（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ３
＝メチル、Ｒ２＝(CH2)3NH2）をもつ先駆物質にカツプ
ルされる。６−カルボキシフルオレスセインは先づ６−
カルボキシフルオレスセインの活性エステルを生成して
３−メチル−３−アミノプロピルサクシニミドにカツプ
ルされる。好ましくい活性エステルはＮ−ヒドロキシサ
クシニミド活性エステルであり、好ましい方法は乾燥ピ
リジン中のＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド
活性化による方法である。他の１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール、ｐ−ニトロフエノールおよびカルボニルジ
イミダゾールの様な活性化基も使用でき、またジメチル
ホルムアミドやジメチルズルフオキシドの様な他の溶媒
も使用できる。反応体はアミド結合を生成する条件のも
とでカツプルさせるとよい。活性エステル法を使うと最
もよい。使用できるトレーサーは種々のエトサキシミド
誘導体から製造できる。
アミノ、ヒドラジニル、ヒドラジド等の様な末端アミノ
基をもつすべてのエトサキシミド誘導体は活性エステル
法又は混合無水物法によつてカルボキシフルオレスセイ
ンにカツプルさせられ、また単に溶液中２物質混合によ
りフルオレスセインイソシアネート、ＤＴＡＦ又はアル
コキシＤＴＡＦにカツプルさせられる。アミノ基はホス
ゲンおよびチオホスゲンとの反応によりそれぞれイソシ
アネートおよびチオイソシアネートに変えられる。次い
でこれらはアミノフルオレスセインと縮合させられトレ
ーサーを生成する。
基をもつすべてのエトサキシミド誘導体は活性エステル
法又は混合無水物法によつてカルボキシフルオレスセイ
ンにカツプルさせられ、また単に溶液中２物質混合によ
りフルオレスセインイソシアネート、ＤＴＡＦ又はアル
コキシＤＴＡＦにカツプルさせられる。アミノ基はホス
ゲンおよびチオホスゲンとの反応によりそれぞれイソシ
アネートおよびチオイソシアネートに変えられる。次い
でこれらはアミノフルオレスセインと縮合させられトレ
ーサーを生成する。
末端カルボン酸基、例えばカルボン酸、（アミノヒドロ
キシ）アルキルカルボン酸等をもつすべてのエトサキシ
ミド誘導体は活性エステル法によりアミノフルオレスセ
インにカツプルさせられる。
キシ）アルキルカルボン酸等をもつすべてのエトサキシ
ミド誘導体は活性エステル法によりアミノフルオレスセ
インにカツプルさせられる。
末端ヒドロキシ基をもつすべてのエトサキシミド誘導体
は溶液中ＤＴＡＦ、α−アイオドアセトアミドフルオレ
スセイン、α−ブロモアセトアミドフルオレスセイン又
はフルオレスセインイソチオシアネートとの反応により
フルオレスセインにカツプルさせられる。ヒドロキシ基
はクロロスルホニルイソシアネート、ホスゲンおよびチ
オホスゲンとそれぞれ反応してクロロスルホニルカルバ
モイル、クロロホーメイトおよびクロロチオホーメート
基に変えられる。これらの誘導体は次いで溶液中でアミ
ノフルオレスセインにカツプルさせられトレーサーを生
成する。
は溶液中ＤＴＡＦ、α−アイオドアセトアミドフルオレ
スセイン、α−ブロモアセトアミドフルオレスセイン又
はフルオレスセインイソチオシアネートとの反応により
フルオレスセインにカツプルさせられる。ヒドロキシ基
はクロロスルホニルイソシアネート、ホスゲンおよびチ
オホスゲンとそれぞれ反応してクロロスルホニルカルバ
モイル、クロロホーメイトおよびクロロチオホーメート
基に変えられる。これらの誘導体は次いで溶液中でアミ
ノフルオレスセインにカツプルさせられトレーサーを生
成する。
末端メルカプト基をもつエトサキシミド誘導体はアザイ
ドについて上記したとおりハライド又はスルホネートエ
ステルとアルカリ金属硫化物から製造される。これらは
溶液中α−アイオドアセトアミドフルオレスセイン又は
α−ブロモアセトアミドフルオレスセインとカツプルさ
せられる。
ドについて上記したとおりハライド又はスルホネートエ
ステルとアルカリ金属硫化物から製造される。これらは
溶液中α−アイオドアセトアミドフルオレスセイン又は
α−ブロモアセトアミドフルオレスセインとカツプルさ
せられる。
末端ニトリル基をもつエトサキシミド誘導体はアザイド
について上記したとおりハライド又はスルホネートエス
テルから製造できる。これらは塩化水素ガスの存在で無
水アルコール中イミデートに変えられる。次いでイミデ
ートは溶液中フルオレスセインアミドにカツプルさせて
トレーサーを生成する。
について上記したとおりハライド又はスルホネートエス
テルから製造できる。これらは塩化水素ガスの存在で無
水アルコール中イミデートに変えられる。次いでイミデ
ートは溶液中フルオレスセインアミドにカツプルさせて
トレーサーを生成する。
エトサキシミド誘導体の種々のアミノ、ヒドロキシおよ
び芳香族誘導体の製造はイムノゲン製造法中で記載して
いる。
び芳香族誘導体の製造はイムノゲン製造法中で記載して
いる。
スルホン酸は上記条件のもとで適当なタウリンの様なア
ミノアルキルスルホン酸から環化して製造される。これ
らは塩化チオニル、塩化ホスホリル、５塩化りん等の様
な塩化剤との反応によつて対応する塩化スルホニルに変
えられる。芳香族環に塩化スルホニル基の直接導入はク
ロロ硫酸との処理によつてできる。次いでスルホニルハ
ライドは普通第３級アミン塩基の添加によつてアミノフ
ルオレスセイン又は反応性アミノ基をもつフルオレスセ
イン誘導体と反応させられる。
ミノアルキルスルホン酸から環化して製造される。これ
らは塩化チオニル、塩化ホスホリル、５塩化りん等の様
な塩化剤との反応によつて対応する塩化スルホニルに変
えられる。芳香族環に塩化スルホニル基の直接導入はク
ロロ硫酸との処理によつてできる。次いでスルホニルハ
ライドは普通第３級アミン塩基の添加によつてアミノフ
ルオレスセイン又は反応性アミノ基をもつフルオレスセ
イン誘導体と反応させられる。
３．試験法 本発明の特殊トレーサーと抗体は血清と血漿中のエトサ
キシミド濃度を正確明確に測定するために発見されてい
る。式１は本発明によつて定量測定できるエトサキシミ
ド薬剤の構造式である。本発明の方法は分析前に試料処
理を要しないし、試薬は化学的に熱的に安定であるしま
た試験法はエトサキシミドに似た化合物に対し最小限の
クロス−反応性をもつので、従来法よりも迅速便利なエ
トサキシミド試験法となる。
キシミド濃度を正確明確に測定するために発見されてい
る。式１は本発明によつて定量測定できるエトサキシミ
ド薬剤の構造式である。本発明の方法は分析前に試料処
理を要しないし、試薬は化学的に熱的に安定であるしま
た試験法はエトサキシミドに似た化合物に対し最小限の
クロス−反応性をもつので、従来法よりも迅速便利なエ
トサキシミド試験法となる。
本発明の分析法、即ち本発明のトレーサー化合物とイム
ノゲンを用いる螢光免疫試験法によるエトサキシミド測
定法によりエトサキシミドを含む又は含むと思われる試
料をトレーサーの生物学的に許容される塩およびエトサ
キシミドとトレーサーに特定の抗体と相互混合する。抗
体は上記の様なイムノゲンを用いて生成される。エトサ
キシミドとトレーサーは限定された抗体位置をせり合い
複合物を生成する。トレーサーと抗体の濃度を一定に保
つことによつてエトサキシミド抗体複合物の生成された
トレーサー−抗体複合物に対する比率は試料中のエトサ
キシミド量に直接比例する。したがつて混合物を線状偏
光で励起しトレーサーとトレーサー抗体複合物によつて
放出された螢光偏光を測定することによつて試料中のエ
トサキシミドが定量測定できる。
ノゲンを用いる螢光免疫試験法によるエトサキシミド測
定法によりエトサキシミドを含む又は含むと思われる試
料をトレーサーの生物学的に許容される塩およびエトサ
キシミドとトレーサーに特定の抗体と相互混合する。抗
体は上記の様なイムノゲンを用いて生成される。エトサ
キシミドとトレーサーは限定された抗体位置をせり合い
複合物を生成する。トレーサーと抗体の濃度を一定に保
つことによつてエトサキシミド抗体複合物の生成された
トレーサー−抗体複合物に対する比率は試料中のエトサ
キシミド量に直接比例する。したがつて混合物を線状偏
光で励起しトレーサーとトレーサー抗体複合物によつて
放出された螢光偏光を測定することによつて試料中のエ
トサキシミドが定量測定できる。
結果は正味ミリポーラリゼーシヨン単位、スパン（ミリ
ポーラリゼーシヨン単位で）および比較強さで定量でき
る。ミリポーラリゼーシヨン単位の測定はエトサキシミ
ドの全くないとき最大量のトレーサーが抗体に結合した
ときの最大偏光を示す。正味ミリポーラリゼーシヨン単
位の高い程トレーサーの抗体への結合はない。スパンは
抗体に結合したトレーサーの最大量と最小量の点におけ
る正味ミリポーラリゼーシヨン間の差を示す。より大き
なスパンはよりよい分析数値を与える。強さは背景以上
の信号強さの尺度である。故により大きな強さはより正
確な測定を与えるだろう。強さは本発明の好ましいトレ
ーサーに対し垂直偏光強さプラス水平偏光強さの２倍の
合計値として約0.5乃至2.0ナノモルにおいて測定され
る。トレーサー信号の強さはトレーサー濃度と他の試験
変数により背景ノイズの約３乃至約３０倍の範囲であ
る。本発明の目的に対し背景ノイズの少なくも８乃至１
０倍の強さが好ましい。
ポーラリゼーシヨン単位で）および比較強さで定量でき
る。ミリポーラリゼーシヨン単位の測定はエトサキシミ
ドの全くないとき最大量のトレーサーが抗体に結合した
ときの最大偏光を示す。正味ミリポーラリゼーシヨン単
位の高い程トレーサーの抗体への結合はない。スパンは
抗体に結合したトレーサーの最大量と最小量の点におけ
る正味ミリポーラリゼーシヨン間の差を示す。より大き
なスパンはよりよい分析数値を与える。強さは背景以上
の信号強さの尺度である。故により大きな強さはより正
確な測定を与えるだろう。強さは本発明の好ましいトレ
ーサーに対し垂直偏光強さプラス水平偏光強さの２倍の
合計値として約0.5乃至2.0ナノモルにおいて測定され
る。トレーサー信号の強さはトレーサー濃度と他の試験
変数により背景ノイズの約３乃至約３０倍の範囲であ
る。本発明の目的に対し背景ノイズの少なくも８乃至１
０倍の強さが好ましい。
表ＩからIIIまでは本発明の種々の実施態様でえられた
結果をスパン、ミリポーラリゼーシヨン単位および強さ
で示している。すべての場合蛋白質担体として牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を使用した。表Ｉに本明細書記載の
種々のトレーサーと本発明の１新規イムノゲンに対しあ
げられた抗血清の結果により生成された試験結果が示さ
れている。表IIは本発明の３−位置トレーサーが従来の
イムノゲンに対しあげられた適当な抗血清と共に使用で
きることを示している。結局表IIIは本発明の１−位置
サクシニミド誘導体であるトレーサーも適当な抗血清と
結合したとき便利であることを示している。これらの結
果からわかるとおり、式２１をもつハプテンからつくら
れたイムノゲンから式５をもつトレーサーと混合して生
成された試験物はよい結果を与える。したがつてこの組
合せは本発明の現在最もよい形である。また式２１と
８、式２１と７、式２２と７および式２３と５の組合せ
によつて表わされる。ハプテン−トレーサー混合物もよ
い結果を生じ別の好ましい組合せである。
結果をスパン、ミリポーラリゼーシヨン単位および強さ
で示している。すべての場合蛋白質担体として牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を使用した。表Ｉに本明細書記載の
種々のトレーサーと本発明の１新規イムノゲンに対しあ
げられた抗血清の結果により生成された試験結果が示さ
れている。表IIは本発明の３−位置トレーサーが従来の
イムノゲンに対しあげられた適当な抗血清と共に使用で
きることを示している。結局表IIIは本発明の１−位置
サクシニミド誘導体であるトレーサーも適当な抗血清と
結合したとき便利であることを示している。これらの結
果からわかるとおり、式２１をもつハプテンからつくら
れたイムノゲンから式５をもつトレーサーと混合して生
成された試験物はよい結果を与える。したがつてこの組
合せは本発明の現在最もよい形である。また式２１と
８、式２１と７、式２２と７および式２３と５の組合せ
によつて表わされる。ハプテン−トレーサー混合物もよ
い結果を生じ別の好ましい組合せである。
本発明の方法実施のpHはトレーサーのフルオレスセイン
部分をその開放形にするに十分でなければならない。pH
は約３乃至１２、好ましくは約５乃至１０、最も好まし
くは約６乃至９である。試験実施中pHを適当にし保つた
め種々の緩衝剤を使用できる。代表的緩衝剤にはボレー
ト、チトレート、アセテート、ホスフエート、カーボネ
ート、トリス、バルビタール等がある。使う特定緩衝剤
は本発明に重要ではないが、トリスとホスフエート緩衝
剤が好ましい。緩衝剤の陽イオン部分は一般に溶液中の
トレーサー塩の陽イオン部分を決定するだろう。
部分をその開放形にするに十分でなければならない。pH
は約３乃至１２、好ましくは約５乃至１０、最も好まし
くは約６乃至９である。試験実施中pHを適当にし保つた
め種々の緩衝剤を使用できる。代表的緩衝剤にはボレー
ト、チトレート、アセテート、ホスフエート、カーボネ
ート、トリス、バルビタール等がある。使う特定緩衝剤
は本発明に重要ではないが、トリスとホスフエート緩衝
剤が好ましい。緩衝剤の陽イオン部分は一般に溶液中の
トレーサー塩の陽イオン部分を決定するだろう。
本発明の好ましい改良試験法について今や詳述する。こ
の試験法は“均質試験法”であり、それは溶液中の結合
トレーサーが非結合トレーサーから分離されない様な溶
液から最終偏光読みがとられることを意味する。これは
結合トレーサーが読みをとられる前に非結合トレーサー
から分離されねばならない様な異質の免疫試験法よりも
明らかに利益である。
の試験法は“均質試験法”であり、それは溶液中の結合
トレーサーが非結合トレーサーから分離されない様な溶
液から最終偏光読みがとられることを意味する。これは
結合トレーサーが読みをとられる前に非結合トレーサー
から分離されねばならない様な異質の免疫試験法よりも
明らかに利益である。
本発明の螢光偏光試験用試薬はエトサキシミドとトレー
サーに特定な抗体より成る。またエトサキシミド予処理
溶液、希釈緩衝剤、エトサキシミド補正剤およびエトサ
キシミド対照液を含む殆んど普通の溶液がつくられる。
これらの試薬の代表的溶液はそのいくつかは上記した
が、イリノイ州アボツトパークのアボツトラボラトリー
ズから出ている試験箱で入手できる。
サーに特定な抗体より成る。またエトサキシミド予処理
溶液、希釈緩衝剤、エトサキシミド補正剤およびエトサ
キシミド対照液を含む殆んど普通の溶液がつくられる。
これらの試薬の代表的溶液はそのいくつかは上記した
が、イリノイ州アボツトパークのアボツトラボラトリー
ズから出ている試験箱で入手できる。
本明細書で示されているパーセントはすべて特に断らな
い限り重量／容量である。現在好ましいトレーサー調合
はpH5.5のトリス緩衝剤0.1モル；５−スルホサリチレー
ト５％およびナトリウムアザイド１％の溶液中トレーサ
ー７０ナノモルである。抗血清調合液はpH7.5のトリス
緩衝剤0.1モル、ナトリウムアザイド0.1％、牛ガマーグ
ロブリン0.01％およびエチレングリコール２％(v/v)の
溶液で兎血清を稀釈した液である。稀釈緩衝液はpH7.5
の0.1モルナトリウムホスフエート溶液、ナトリウムア
ザイド0.1％および牛ガンマーグロブリン0.01％より成
る。予処理調合液はpH5.5の0.1モルトリス緩衝液、５−
スルホサリチレート５％、ナトリウムアザイド0.1％よ
り成る。補正液はナトリウムアザイド保存剤0.1％溶液
とリツトル当り通常人血清中のエトサキシミド濃度0.
0、１０、２５、５０、１００および１５０mgより成る
ものが便利である。通常人血清中のエトサキシミドより
成る対照品はリツトル当り３５、７０および１２０mg濃
度で保存剤としてナトリウムアザイド0.1％を加えて用
意される。
い限り重量／容量である。現在好ましいトレーサー調合
はpH5.5のトリス緩衝剤0.1モル；５−スルホサリチレー
ト５％およびナトリウムアザイド１％の溶液中トレーサ
ー７０ナノモルである。抗血清調合液はpH7.5のトリス
緩衝剤0.1モル、ナトリウムアザイド0.1％、牛ガマーグ
ロブリン0.01％およびエチレングリコール２％(v/v)の
溶液で兎血清を稀釈した液である。稀釈緩衝液はpH7.5
の0.1モルナトリウムホスフエート溶液、ナトリウムア
ザイド0.1％および牛ガンマーグロブリン0.01％より成
る。予処理調合液はpH5.5の0.1モルトリス緩衝液、５−
スルホサリチレート５％、ナトリウムアザイド0.1％よ
り成る。補正液はナトリウムアザイド保存剤0.1％溶液
とリツトル当り通常人血清中のエトサキシミド濃度0.
0、１０、２５、５０、１００および１５０mgより成る
ものが便利である。通常人血清中のエトサキシミドより
成る対照品はリツトル当り３５、７０および１２０mg濃
度で保存剤としてナトリウムアザイド0.1％を加えて用
意される。
テキサス州アービングのアボツトラボラトリーズから市
販されているアボツトＴＤＸ 偏光分析器と共に使われ
る好ましい方法が特に工夫されている。５０μｌの血清
又は血漿が必要である。ＴＤＸ試料カートリッヂの試料
びんに補正液、対照液および未知試料をピペツトで直接
とる。この方法の１利点は試料の特別処理が必要ないこ
とである。ＴＤＸエトサキシミド試験箱をＴＤＸ分析器
と共に使うならば、試料を試料回転器中に直接入れ、３
試薬容器の各々から栓をとりＴＤＸ分析器内の指定ウエ
ルに入れ、この時点から試験法は完全自動化される。
販されているアボツトＴＤＸ 偏光分析器と共に使われ
る好ましい方法が特に工夫されている。５０μｌの血清
又は血漿が必要である。ＴＤＸ試料カートリッヂの試料
びんに補正液、対照液および未知試料をピペツトで直接
とる。この方法の１利点は試料の特別処理が必要ないこ
とである。ＴＤＸエトサキシミド試験箱をＴＤＸ分析器
と共に使うならば、試料を試料回転器中に直接入れ、３
試薬容器の各々から栓をとりＴＤＸ分析器内の指定ウエ
ルに入れ、この時点から試験法は完全自動化される。
手動試験をするならば、試料を稀釈緩衝液中の予処理溶
液と混合し背景読みをとる。トレーサーを次に試料と混
合する。次に抗体を最後に試験液を混入する。培養後螢
光偏光読みをとる。
液と混合し背景読みをとる。トレーサーを次に試料と混
合する。次に抗体を最後に試験液を混入する。培養後螢
光偏光読みをとる。
補正液、対照液又は試料の各螢光偏光値が測定されアボ
ツトＴＤＸ螢光偏光分析器の様なテープにプリントされ
る。非直線回帰分析を用いて各補正液の偏光対濃度をプ
ロツトして装置の標準曲線がつくられる。各対照液又は
試料の濃度は補正曲線を読みとつて出てくるテープ上に
プリントされる。
ツトＴＤＸ螢光偏光分析器の様なテープにプリントされ
る。非直線回帰分析を用いて各補正液の偏光対濃度をプ
ロツトして装置の標準曲線がつくられる。各対照液又は
試料の濃度は補正曲線を読みとつて出てくるテープ上に
プリントされる。
前記の好ましい方法に関し重要なことはトレーサー、抗
体、予処理液、補正液および対照液は約２乃至約８℃で
貯えねばならないが、稀釈緩衝液は大気温で貯えねばな
らないことである。標準曲線と対照液は２週間毎に試験
を必要としまた各補正液と対照液は２回試験が必要であ
る。対照液は毎日試験が必要でありまた試料は全部望む
ならば２回試験するとよい。
体、予処理液、補正液および対照液は約２乃至約８℃で
貯えねばならないが、稀釈緩衝液は大気温で貯えねばな
らないことである。標準曲線と対照液は２週間毎に試験
を必要としまた各補正液と対照液は２回試験が必要であ
る。対照液は毎日試験が必要でありまた試料は全部望む
ならば２回試験するとよい。
前記明細書と下記実施例は本発明の範囲を示すためのも
のであり、本発明範囲を限定するものでないことは諒解
されるべきである。この技術分野の知識ある者には種々
の修正法も明らかとなるであろう。したがつて本発明の
範囲は特許請求範囲によつてのみ決定されるものと考え
るものである。
のであり、本発明範囲を限定するものでないことは諒解
されるべきである。この技術分野の知識ある者には種々
の修正法も明らかとなるであろう。したがつて本発明の
範囲は特許請求範囲によつてのみ決定されるものと考え
るものである。
実施例 実施例ＩからXLVまでは本発明の概念によつてなされた
実験を記載している。実施例Ｉは抗体生成に便利なイム
ノゲン製造に関し、実施例IIからXXIXまではイムノゲン
とトレーサーの先駆物質の合成に関しまた実施例XXXか
らXLVまではトレーサーの製造に関するものである。
実験を記載している。実施例Ｉは抗体生成に便利なイム
ノゲン製造に関し、実施例IIからXXIXまではイムノゲン
とトレーサーの先駆物質の合成に関しまた実施例XXXか
らXLVまではトレーサーの製造に関するものである。
実施例Ｉイムノゲンの製造 好ましい試験用イムノゲンは牛血清アルブミン２９mgを
含む0.1Ｍアセテート緩衝液（pH5.0）２ml中に式２１を
もつ化合物の塩酸塩２９mgをとかしてつくつた。液を室
温で撹拌しpHを5.0から5.5に保ちながら１−エチル−３
−（３′−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミド１
４０mgを１０−１５mgづつ3.5時間にわたり加えた。え
た溶液を0.9％塩溶液に対し徹底的に透析した後１００
０rpmで３０分遠心分離した。溶液を免疫法に使うまで
冷凍貯蔵した。
含む0.1Ｍアセテート緩衝液（pH5.0）２ml中に式２１を
もつ化合物の塩酸塩２９mgをとかしてつくつた。液を室
温で撹拌しpHを5.0から5.5に保ちながら１−エチル−３
−（３′−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミド１
４０mgを１０−１５mgづつ3.5時間にわたり加えた。え
た溶液を0.9％塩溶液に対し徹底的に透析した後１００
０rpmで３０分遠心分離した。溶液を免疫法に使うまで
冷凍貯蔵した。
実施例II３−メチル−３−（３−アミノプロピル）サク
シニミド塩酸塩 ５−クロロ−２−ペンタノンエチレンケタール6.58ｇと
ジベンジルアミン7.88ｇを窒素雰囲気のもとで油浴中１
３０℃に３８時間熱した。冷した残渣をクロロホルムに
とり２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で洗い溶媒除去した残渣
を再び窒素のもとで２４時間加熱した。第２塩基を洗い
HCl除去後残渣を更に３回目４８時間加熱した。最終塩
基を洗つた後粗生成物を５５０ｇシリカゲル上クロマト
グラフ法によりヘキサン−ジクロロメタン−エチルアセ
テートを用いて５−ジベンジルアミノ−２−ペンタノン
エチレンケタール8.8ｇを殆んど無色油としてえた。こ
のケタール6.54ｇをテトラヒドロフラン２０mlにとか
し、1.5Ｍ塩酸１６mlを加えた。室温で４時間反応させ
た後混合物をエーテルと稀HClとの間に配分した。水層
を冷やし固体水酸化カリウムで塩基性としジクロロメタ
ンに抽出した。乾かし溶媒除去後５−ジベンジルアミノ
−２−ペンタノン5.5ｇを無色油としてえた。このケト
ン2.81ｇをベンゼン３０mlにとかしエチルシアノアセテ
ート1.24ｇ、酢酸0.30ｇ、アンモニウムアセテート0.11
ｇおよびピペラジン0.12ｇを加えた。混合物を２４時間
環流加熱し留出水をデイーンスタークトラツプで除去し
た。冷した液を飽和炭酸カリウム溶液で４回抽出し固体
炭酸カリウム上で乾かし５ｇシリカゲルをとおし過し
更にベンゼンで洗つた。溶媒を蒸発して殆んど純エチル
２−シアノ−６−ジベンジルアミノ−３−メチル−ヘキ
サノエート3.24ｇをえた。この不飽和シアノエステル2.
26ｇをエタノール９mlと蒸留水３mlにとかしナトリウム
シアナミド0.35ｇを加えた。室温４０分撹拌後混合物を
油浴上５０℃に３０分加熱した。溶媒を除去し残渣をジ
クロロメタン中にとり過し溶媒を除去して結晶性固体
2.28ｇをえた。この物質２ｇを１０％水酸化ナトリウム
液１０ml中にとり１５時間還流加熱した。反応混合物を
冷しHClでpH2.5酸性とし濃縮乾固した。残渣を無水メタ
ノール５０ml中に取り塩を過除去した。液を濃縮し
て固体2.6ｇをえた。その2.5ｇをメタノール１５mlと濃
アンモニア水１５mlにとかした。溶媒を蒸発し残渣を油
浴中１６５℃で３０分加熱し粗生成物を薄層クロマトグ
ラフ法で精製し５％メタノールを含むクロロホルムを用
いて３−メチル−３−（３−ジベンジルアミノプロピ
ル）サクシニミド0.48ｇをえた。この物質0.35ｇをエタ
ノール５０mlと濃HCl８５ml中で木炭上１０％パラジウ
ム0.07ｇと共に初圧３気圧で水素添加してベンジル保護
基を除去した。４日後触媒を別し白色固体３−メチル
−３−（３−アミノプロピル）サクシニミド塩酸塩0.25
ｇをえた。
シニミド塩酸塩 ５−クロロ−２−ペンタノンエチレンケタール6.58ｇと
ジベンジルアミン7.88ｇを窒素雰囲気のもとで油浴中１
３０℃に３８時間熱した。冷した残渣をクロロホルムに
とり２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で洗い溶媒除去した残渣
を再び窒素のもとで２４時間加熱した。第２塩基を洗い
HCl除去後残渣を更に３回目４８時間加熱した。最終塩
基を洗つた後粗生成物を５５０ｇシリカゲル上クロマト
グラフ法によりヘキサン−ジクロロメタン−エチルアセ
テートを用いて５−ジベンジルアミノ−２−ペンタノン
エチレンケタール8.8ｇを殆んど無色油としてえた。こ
のケタール6.54ｇをテトラヒドロフラン２０mlにとか
し、1.5Ｍ塩酸１６mlを加えた。室温で４時間反応させ
た後混合物をエーテルと稀HClとの間に配分した。水層
を冷やし固体水酸化カリウムで塩基性としジクロロメタ
ンに抽出した。乾かし溶媒除去後５−ジベンジルアミノ
−２−ペンタノン5.5ｇを無色油としてえた。このケト
ン2.81ｇをベンゼン３０mlにとかしエチルシアノアセテ
ート1.24ｇ、酢酸0.30ｇ、アンモニウムアセテート0.11
ｇおよびピペラジン0.12ｇを加えた。混合物を２４時間
環流加熱し留出水をデイーンスタークトラツプで除去し
た。冷した液を飽和炭酸カリウム溶液で４回抽出し固体
炭酸カリウム上で乾かし５ｇシリカゲルをとおし過し
更にベンゼンで洗つた。溶媒を蒸発して殆んど純エチル
２−シアノ−６−ジベンジルアミノ−３−メチル−ヘキ
サノエート3.24ｇをえた。この不飽和シアノエステル2.
26ｇをエタノール９mlと蒸留水３mlにとかしナトリウム
シアナミド0.35ｇを加えた。室温４０分撹拌後混合物を
油浴上５０℃に３０分加熱した。溶媒を除去し残渣をジ
クロロメタン中にとり過し溶媒を除去して結晶性固体
2.28ｇをえた。この物質２ｇを１０％水酸化ナトリウム
液１０ml中にとり１５時間還流加熱した。反応混合物を
冷しHClでpH2.5酸性とし濃縮乾固した。残渣を無水メタ
ノール５０ml中に取り塩を過除去した。液を濃縮し
て固体2.6ｇをえた。その2.5ｇをメタノール１５mlと濃
アンモニア水１５mlにとかした。溶媒を蒸発し残渣を油
浴中１６５℃で３０分加熱し粗生成物を薄層クロマトグ
ラフ法で精製し５％メタノールを含むクロロホルムを用
いて３−メチル−３−（３−ジベンジルアミノプロピ
ル）サクシニミド0.48ｇをえた。この物質0.35ｇをエタ
ノール５０mlと濃HCl８５ml中で木炭上１０％パラジウ
ム0.07ｇと共に初圧３気圧で水素添加してベンジル保護
基を除去した。４日後触媒を別し白色固体３−メチル
−３−（３−アミノプロピル）サクシニミド塩酸塩0.25
ｇをえた。
実施例III３−メチル−３−（３−ブテニル）サクシニ
ミド ベンゼン２５ml中に１−ヘキセン−５−１24.5ｇとエチ
ルシアノアセテート28.25ｇをとかした。酢酸2.86mlと
アンモニウムアセテート19.3ｇを加え混合物を６時間還
流加熱し留出水をデイーンスタークトラツプで捕集し
た。溶液を冷し分別ろーとに移し２回水洗した。溶媒を
真空除去し残渣を水５０mlとエタノール５０mlの混合液
にとかし氷浴中で冷しシアン化ナトリウム12.5ｇを加え
た。１５分後に氷浴をとり去り室温中２時間反応を進め
た。回転蒸発機上エタノールを除去した後混合物のpHを
HClで５に調節した。溶液をエーテルで３回洗いpHを約
１に下げた。エーテル抽出液を併せ硫酸マグネシウム上
で乾かし過し真空濃縮して金色油37.8ｇをえた。この
物質１ｇを２Ｍ水酸化ナトリウム液２ml中にとり９０℃
油浴中で４時間熱し更に２Ｍ水酸化ナトリウム液１mlを
加え更に２時間加熱した。この物質全体を２：１水−メ
タノール液に加えHClでpH３とし溶媒を除去し残渣を無
水メタノールとすりつぶした。過後溶媒を除いて淡黄
色油１ｇをえた。これを５mlの濃アンモニア水にとかし
１００℃に熱して水を留出させ更に１４０−１５０℃で
３時間熱した。冷した残渣をシリカゲル上でクロマトグ
ラフ処理しジクロロメタン−エーテルを使い白色結晶３
−メチル−３−（３−ブテニル）サクシニミド0.77ｇを
えた。融点７５℃。
ミド ベンゼン２５ml中に１−ヘキセン−５−１24.5ｇとエチ
ルシアノアセテート28.25ｇをとかした。酢酸2.86mlと
アンモニウムアセテート19.3ｇを加え混合物を６時間還
流加熱し留出水をデイーンスタークトラツプで捕集し
た。溶液を冷し分別ろーとに移し２回水洗した。溶媒を
真空除去し残渣を水５０mlとエタノール５０mlの混合液
にとかし氷浴中で冷しシアン化ナトリウム12.5ｇを加え
た。１５分後に氷浴をとり去り室温中２時間反応を進め
た。回転蒸発機上エタノールを除去した後混合物のpHを
HClで５に調節した。溶液をエーテルで３回洗いpHを約
１に下げた。エーテル抽出液を併せ硫酸マグネシウム上
で乾かし過し真空濃縮して金色油37.8ｇをえた。この
物質１ｇを２Ｍ水酸化ナトリウム液２ml中にとり９０℃
油浴中で４時間熱し更に２Ｍ水酸化ナトリウム液１mlを
加え更に２時間加熱した。この物質全体を２：１水−メ
タノール液に加えHClでpH３とし溶媒を除去し残渣を無
水メタノールとすりつぶした。過後溶媒を除いて淡黄
色油１ｇをえた。これを５mlの濃アンモニア水にとかし
１００℃に熱して水を留出させ更に１４０−１５０℃で
３時間熱した。冷した残渣をシリカゲル上でクロマトグ
ラフ処理しジクロロメタン−エーテルを使い白色結晶３
−メチル−３−（３−ブテニル）サクシニミド0.77ｇを
えた。融点７５℃。
実施例IV３−メチル−３−（４−ヒドロキシブチル）サ
クシニミド ３−メチル−３−（３−ブテニル）サクシニミド３ｇ
（１８ミリモル）をエタノール５０mlにとかしドライア
イス−イソプロパノール浴中で冷しオゾン１当量と処理
した。過剰オゾンを窒素で追出しナトリウムボロハイド
ライド６８４mg（１８ミリモル）を加えた。混合物を除
々に室温まであたため濃塩酸数滴を加えて消した。溶媒
を除去し残渣を再びジクロロメタンにとかし硫酸マグネ
シウム上で乾かしシリカゲル少々と処理し過し再びス
トリツプした。残つた無色油2.80ｇをＮＭＲと質量分析
計によりアルコールと同定した。
クシニミド ３−メチル−３−（３−ブテニル）サクシニミド３ｇ
（１８ミリモル）をエタノール５０mlにとかしドライア
イス−イソプロパノール浴中で冷しオゾン１当量と処理
した。過剰オゾンを窒素で追出しナトリウムボロハイド
ライド６８４mg（１８ミリモル）を加えた。混合物を除
々に室温まであたため濃塩酸数滴を加えて消した。溶媒
を除去し残渣を再びジクロロメタンにとかし硫酸マグネ
シウム上で乾かしシリカゲル少々と処理し過し再びス
トリツプした。残つた無色油2.80ｇをＮＭＲと質量分析
計によりアルコールと同定した。
実施例Ｖ３−メチル−３−エチル−１−（２−ヒドロキ
シエチル）サクシニミド エタノールアミン1.22ｇ（２０ミリモル）と２−エチル
−２−メチルこはく酸3.20ｇ（２０ミリモル）を溶媒な
しで混合し油浴中で加熱し除々に温度をあげて２時間で
１２０−１６０℃とした。蒸留頭をフラスコ上につけ１
３１−１３２℃、0.5Torr圧力で蒸留して無色油2.84ｇ
をえた。
シエチル）サクシニミド エタノールアミン1.22ｇ（２０ミリモル）と２−エチル
−２−メチルこはく酸3.20ｇ（２０ミリモル）を溶媒な
しで混合し油浴中で加熱し除々に温度をあげて２時間で
１２０−１６０℃とした。蒸留頭をフラスコ上につけ１
３１−１３２℃、0.5Torr圧力で蒸留して無色油2.84ｇ
をえた。
実施例VI３−メチル−３−エチル−１−（３−ヒドロキ
シ−１−プロピン）サクシニミド ３−アミノ−１−プロパノール1.50ｇ（２０ミリモル）
と２−エチル−２−メチルこはく酸3.20ｇ（２０ミリモ
ル）を溶媒なしで油浴中で加熱し除々に温度をあげ２時
間で１２０−１６０℃とした。蒸留頭をフラスコ上につ
けて圧力0.36Torrで１２６−１２８℃で蒸留する無色油
2.75ｇをえた。
シ−１−プロピン）サクシニミド ３−アミノ−１−プロパノール1.50ｇ（２０ミリモル）
と２−エチル−２−メチルこはく酸3.20ｇ（２０ミリモ
ル）を溶媒なしで油浴中で加熱し除々に温度をあげ２時
間で１２０−１６０℃とした。蒸留頭をフラスコ上につ
けて圧力0.36Torrで１２６−１２８℃で蒸留する無色油
2.75ｇをえた。
実施例VII１−ジベンジルアミノ−３−フタルイミドプ
ロパン ジベンジルアミン2.96ｇ（１５ミリモル）と３−ブロモ
プロピルフタルイミド4.02ｇ（１５ミリモル）をメタノ
ール１０mlとテトラヒドロフラン２mlの混合液中にとり
合計３０時間４０−４５℃に加熱した。２４時間後に炭
酸カリウム１当量（2.07ｇ）を加えた。反応混合物をジ
クロロメタンと１Ｍ水酸化カリウム液に配分し有機層を
更に２回水酸化カリウム液で洗い無水炭酸カリウム上で
乾かし濃縮した。準結晶性残渣をクロロホルム−メタノ
ールから晶出させて１−ジベンジルアミノ−３−フタル
イミドプロパン2.46ｇをえた。融点111.5-112.5℃。
ロパン ジベンジルアミン2.96ｇ（１５ミリモル）と３−ブロモ
プロピルフタルイミド4.02ｇ（１５ミリモル）をメタノ
ール１０mlとテトラヒドロフラン２mlの混合液中にとり
合計３０時間４０−４５℃に加熱した。２４時間後に炭
酸カリウム１当量（2.07ｇ）を加えた。反応混合物をジ
クロロメタンと１Ｍ水酸化カリウム液に配分し有機層を
更に２回水酸化カリウム液で洗い無水炭酸カリウム上で
乾かし濃縮した。準結晶性残渣をクロロホルム−メタノ
ールから晶出させて１−ジベンジルアミノ−３−フタル
イミドプロパン2.46ｇをえた。融点111.5-112.5℃。
実施例VIII１−アミノ−３−ジベンジルアミノプロパン １−ジベンジルアミノ−３−フタルイミドプロパン1.92
ｇ（５ミリモル）とヒドラジン水化物1.25ｇ（２５ミリ
モル）を温エタノール２０ml中にとかした。環流温度ま
で加熱をつづけると白色結晶性固体が沈澱した。１時間
後反応混合物を冷し固体を稀水酸化ナトリウム液にとか
し回転蒸発機上でエタノールを殆んど除去した。溶液を
固体水酸化カリウムで強塩基性としエーテルで抽出し
た。有機層を塩基水液で洗い無水炭酸カリウム上で乾か
し過し凝縮して無色油1.26ｇをえた。
ｇ（５ミリモル）とヒドラジン水化物1.25ｇ（２５ミリ
モル）を温エタノール２０ml中にとかした。環流温度ま
で加熱をつづけると白色結晶性固体が沈澱した。１時間
後反応混合物を冷し固体を稀水酸化ナトリウム液にとか
し回転蒸発機上でエタノールを殆んど除去した。溶液を
固体水酸化カリウムで強塩基性としエーテルで抽出し
た。有機層を塩基水液で洗い無水炭酸カリウム上で乾か
し過し凝縮して無色油1.26ｇをえた。
実施例IX３−メチル−３−エチル−１−（３−ジベンジ
ルアミノ−１−プロピル）サクシニミド塩酸塩 １−アミノ−３−ジベンジルアミノプロパン1.02ｇ（４
ミリモル）と２−エチル−２−メチルこはく酸0.64ｇ
（４ミリモル）を溶媒なしで混合し油浴中で１４０℃に
1.5時間加熱した。冷粗生成物をジクロロメタンとエチ
ルアセテートの混合物にとかし脱色のための少量のシリ
カゲルで処理した後過し凝縮させて無色油1.38ｇをえ
た。この物質の大半をジクロロメタンにとかし無水塩化
水素と処理した。溶液から晶出もおこらず溶媒を除去し
ても残渣は固化しなかつた。
ルアミノ−１−プロピル）サクシニミド塩酸塩 １−アミノ−３−ジベンジルアミノプロパン1.02ｇ（４
ミリモル）と２−エチル−２−メチルこはく酸0.64ｇ
（４ミリモル）を溶媒なしで混合し油浴中で１４０℃に
1.5時間加熱した。冷粗生成物をジクロロメタンとエチ
ルアセテートの混合物にとかし脱色のための少量のシリ
カゲルで処理した後過し凝縮させて無色油1.38ｇをえ
た。この物質の大半をジクロロメタンにとかし無水塩化
水素と処理した。溶液から晶出もおこらず溶媒を除去し
ても残渣は固化しなかつた。
実施例Ｘ３−メチル−３−エチル−１−（３−アミノプ
ロパン）サクシニミド塩酸塩 無水エタノール５０mlに３−メチル−３−エチル−１−
（３−ジベンジルアミノプロピル）サクシニミド塩酸塩
1.01ｇ（2.4ミリモル）をとかし木炭上１０％パラジウ
ム上で初圧２気圧において水素添加した。触媒を過し
反応中２回交換し全体で約４８時間反応させた。無色油
生成物0.57ｇをえた。
ロパン）サクシニミド塩酸塩 無水エタノール５０mlに３−メチル−３−エチル−１−
（３−ジベンジルアミノプロピル）サクシニミド塩酸塩
1.01ｇ（2.4ミリモル）をとかし木炭上１０％パラジウ
ム上で初圧２気圧において水素添加した。触媒を過し
反応中２回交換し全体で約４８時間反応させた。無色油
生成物0.57ｇをえた。
実施例XI３−（３−メチル−３−エチル−１−（４−ヒ
ドロキシ−１−ブチル）サクシニミド ４−アミノ−１−ブタノール２７０mg（３ミリモル）と
α−メチル−α−エチルこはく酸４８０mg（３ミリモ
ル）を溶媒なしで混合し油浴中１３５−１４０℃で3.5
時間加熱した。冷却生成物をジクロロメタン中にとり少
量のシリカゲルで処理して脱色した。過し溶媒を除去
して無色油を５３７mgをえた。
ドロキシ−１−ブチル）サクシニミド ４−アミノ−１−ブタノール２７０mg（３ミリモル）と
α−メチル−α−エチルこはく酸４８０mg（３ミリモ
ル）を溶媒なしで混合し油浴中１３５−１４０℃で3.5
時間加熱した。冷却生成物をジクロロメタン中にとり少
量のシリカゲルで処理して脱色した。過し溶媒を除去
して無色油を５３７mgをえた。
実施例XII３−（３−メチル−３エチル−１−サクシニ
ミジル）プロピオン酸 アセトン５ml中に３−メチル−３−エチル−１−（４−
ヒドロキシ−１−ブチル）サクシニミド２１３mg（１ミ
リモル）をとかしジヨーンズ試薬2.67Ｍ溶液0.45ml（1.
2ミリモル）を加えた。室温で２時間混合後イソプロパ
ノール数滴を加えて過剰試薬を消耗させた。更に１５分
撹拌後溶液を５mlのジクロロメタンで稀め硫酸マグネシ
ウムで乾かしセライトで過した。溶媒を除去して酸２
０７mgを無色油としてえた。
ミジル）プロピオン酸 アセトン５ml中に３−メチル−３−エチル−１−（４−
ヒドロキシ−１−ブチル）サクシニミド２１３mg（１ミ
リモル）をとかしジヨーンズ試薬2.67Ｍ溶液0.45ml（1.
2ミリモル）を加えた。室温で２時間混合後イソプロパ
ノール数滴を加えて過剰試薬を消耗させた。更に１５分
撹拌後溶液を５mlのジクロロメタンで稀め硫酸マグネシ
ウムで乾かしセライトで過した。溶媒を除去して酸２
０７mgを無色油としてえた。
実施例XIII3,3−ジメチル−１−（５−ヒドロキシ−１
−ペンチル）サクシニミド ５−アミノ−１−ペンタノール３１０mg（３ミリモル）
と2,2−ジメチルこはく酸を混合し油浴中１２５−１３
５℃に４時間加熱した。冷した残渣をジクロロメタンに
とかし少量のシリカゲルで脱色し過した。溶媒を除去
して透明無色油として3,3−ジメチル−１−（５−ヒド
ロキシペンチル）サクシニミド５６９mgをえた。
−ペンチル）サクシニミド ５−アミノ−１−ペンタノール３１０mg（３ミリモル）
と2,2−ジメチルこはく酸を混合し油浴中１２５−１３
５℃に４時間加熱した。冷した残渣をジクロロメタンに
とかし少量のシリカゲルで脱色し過した。溶媒を除去
して透明無色油として3,3−ジメチル−１−（５−ヒド
ロキシペンチル）サクシニミド５６９mgをえた。
実施例XIV3,3−ジメチル−１−（４−カルボキシブチ
ル）サクシニミド アセトン５ml中に3,3−ジメチル−１−（５−ヒドロキ
シ−１−ペンチル）サクシニミド２３６mg（1.11ミリモ
ル）をとかしジヨーンス試薬2.67Ｍ溶液５２０mlを加え
た。混合物を室温で２時間撹拌し過剰試薬を消すためイ
ソプロパノール４滴を加えた。更に１５分混合後溶液を
ジクロロメタン５mlで稀め硫酸マグネシウムと処理し
過し濃縮し無色油として酸２５０mgをえた。
ル）サクシニミド アセトン５ml中に3,3−ジメチル−１−（５−ヒドロキ
シ−１−ペンチル）サクシニミド２３６mg（1.11ミリモ
ル）をとかしジヨーンス試薬2.67Ｍ溶液５２０mlを加え
た。混合物を室温で２時間撹拌し過剰試薬を消すためイ
ソプロパノール４滴を加えた。更に１５分混合後溶液を
ジクロロメタン５mlで稀め硫酸マグネシウムと処理し
過し濃縮し無色油として酸２５０mgをえた。
実施例XV１−（６−ヒドロキシヘキシル）−３−メチル
−３−エチルサクシニミド ６−アミノ−１−ヘキサノール５８６mg（５ミリモル）
とα−メチル−α−エチルこはく酸８０１mg（５ミリモ
ル）を溶媒なしで混合し油浴中１３０℃で３時間加熱し
た。室温に冷した後残渣をジクロロメタン中にとり少量
のシリカゲルで脱色し過した。溶媒を蒸発して無色油
１−（６−ヒドロキシヘキシル）−３−メチル−３−エ
チルサキシニミド９５９mgをえた。
−３−エチルサクシニミド ６−アミノ−１−ヘキサノール５８６mg（５ミリモル）
とα−メチル−α−エチルこはく酸８０１mg（５ミリモ
ル）を溶媒なしで混合し油浴中１３０℃で３時間加熱し
た。室温に冷した後残渣をジクロロメタン中にとり少量
のシリカゲルで脱色し過した。溶媒を蒸発して無色油
１−（６−ヒドロキシヘキシル）−３−メチル−３−エ
チルサキシニミド９５９mgをえた。
実施例XVI１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチ
ル−３−エチルサキシニミド アセトン１５ml中に１−（６−ヒドロキシヘキシル）−
３−メチル−３−エチルサキシミニド７０５mg（2.9ミ
リモル）をとかし2.67Ｍジヨーンズ試薬溶液2.0ml（3.3
ミリモル）を加えた。室温で２時間混合後イソプロパノ
ール数滴を加えて過剰試薬を分解した。混合物を等量の
ジクロロメタンでうすめ硫酸マグネシウムと処理しセラ
イトでした。溶媒を蒸発し油として酸７３５mgをえ
た。
ル−３−エチルサキシニミド アセトン１５ml中に１−（６−ヒドロキシヘキシル）−
３−メチル−３−エチルサキシミニド７０５mg（2.9ミ
リモル）をとかし2.67Ｍジヨーンズ試薬溶液2.0ml（3.3
ミリモル）を加えた。室温で２時間混合後イソプロパノ
ール数滴を加えて過剰試薬を分解した。混合物を等量の
ジクロロメタンでうすめ硫酸マグネシウムと処理しセラ
イトでした。溶媒を蒸発し油として酸７３５mgをえ
た。
実施例XVII３−メチル−３−エチル−１−（５−ヒドロ
キシペンチル）サクシニミド 実施例XVの方法により首題化合物を５−アミノ−１−プ
ロパノール4.12ｇ（４０ミリモル）と２−エチル−２−
メチルこはく酸6.40ｇからつくり殆んど無色の油8.48ｇ
をえた。
キシペンチル）サクシニミド 実施例XVの方法により首題化合物を５−アミノ−１−プ
ロパノール4.12ｇ（４０ミリモル）と２−エチル−２−
メチルこはく酸6.40ｇからつくり殆んど無色の油8.48ｇ
をえた。
実施例XVIII３−メチル−３−エチル−１−（４−ガル
ボキシブチル）サクシニミド アセトン２０ml中の３−メチル−３−エチル−１−（５
−ヒドロキシペンチル）サクシニミド９０８mgの溶液を
室温において2.6Ｍジヨーンズ試薬溶液1.5mlと処理し
た。反応が適当な時間に完了しなかつたので更に0.45ml
のジヨーンズ試薬液を加えた。１時間後イゾプロパノー
ル５滴を加えて過剰試薬を分解した。混合物をセライト
でし溶媒を除去した。残渣をジクロロメタンにとり硫
酸マグネシウムと処理し再び過し溶媒を除去して無色
油として表題化合物９７８mgをえた。
ボキシブチル）サクシニミド アセトン２０ml中の３−メチル−３−エチル−１−（５
−ヒドロキシペンチル）サクシニミド９０８mgの溶液を
室温において2.6Ｍジヨーンズ試薬溶液1.5mlと処理し
た。反応が適当な時間に完了しなかつたので更に0.45ml
のジヨーンズ試薬液を加えた。１時間後イゾプロパノー
ル５滴を加えて過剰試薬を分解した。混合物をセライト
でし溶媒を除去した。残渣をジクロロメタンにとり硫
酸マグネシウムと処理し再び過し溶媒を除去して無色
油として表題化合物９７８mgをえた。
実施例XIX４−（３−メチル−３−エチル−１−サクシ
ニミジル）ニトロベンゼン ４−ニトロアニリン2.76ｇ（２０ミリモル）をα−メチ
ル−α−エチルこはく酸をよく混合し油浴中１５０−１
６０℃に２時間加熱した。冷却してえた固体生成物をメ
タノール−水から再晶出させて殆んど白色の結晶をえ
た。融点１２４−１２５℃。
ニミジル）ニトロベンゼン ４−ニトロアニリン2.76ｇ（２０ミリモル）をα−メチ
ル−α−エチルこはく酸をよく混合し油浴中１５０−１
６０℃に２時間加熱した。冷却してえた固体生成物をメ
タノール−水から再晶出させて殆んど白色の結晶をえ
た。融点１２４−１２５℃。
実施例XX４−（３−メチル−３−エチル−１−サクシニ
ミジル）アニリン エタノール５０ml中の４−（３−メチル−３−エチル−
１−サクシニミジル）ニトロベンセン５００mg（1.91ミ
リモル）を木炭上１０％パラジウム５０mgと共に初圧２
気圧のもとで水素添加した。２０分後触媒を別し溶媒
を除去して約５００mgの無色油をえて放置すると晶出し
た。メタノールから再晶出させたものは融点１４０−１
４３℃であつた。
ミジル）アニリン エタノール５０ml中の４−（３−メチル−３−エチル−
１−サクシニミジル）ニトロベンセン５００mg（1.91ミ
リモル）を木炭上１０％パラジウム５０mgと共に初圧２
気圧のもとで水素添加した。２０分後触媒を別し溶媒
を除去して約５００mgの無色油をえて放置すると晶出し
た。メタノールから再晶出させたものは融点１４０−１
４３℃であつた。
実施例XXI３−（３−メチル−３−エチル−１−サクシ
ニミジル）ニトロベンゼン ３−ニトロベンゼン2.76ｇ（２０ミリモル）とα−メチ
ル−α−エチルこはく酸3.20ｇ（２０ミリモル）をよく
混合し溶媒なしで油浴中１５０−１６０℃に２時間加熱
した。冷し固体生成物をメタノールから晶出させること
２回合計3.72ｇの結晶をえた。融点87.5-88.5℃。
ニミジル）ニトロベンゼン ３−ニトロベンゼン2.76ｇ（２０ミリモル）とα−メチ
ル−α−エチルこはく酸3.20ｇ（２０ミリモル）をよく
混合し溶媒なしで油浴中１５０−１６０℃に２時間加熱
した。冷し固体生成物をメタノールから晶出させること
２回合計3.72ｇの結晶をえた。融点87.5-88.5℃。
実施例XXII３−（３−メチル−３−エチル−１−サクシ
ニミジル）アニリン エタノール５０ml中の３−（３−メチル−３−エチル−
１−サクシニミジル）ニトロベンゼン５００mg（1.91ミ
リモル）を木炭上１０％パラジウム５０mgを使い初圧２
気圧において水添した。３０分後触媒を別し溶媒を除
いて無色油４８０mgをえて一夜おくと晶出した。メタノ
ール−水から再晶出させて無色固体をえた。融点１００
−１０２℃。
ニミジル）アニリン エタノール５０ml中の３−（３−メチル−３−エチル−
１−サクシニミジル）ニトロベンゼン５００mg（1.91ミ
リモル）を木炭上１０％パラジウム５０mgを使い初圧２
気圧において水添した。３０分後触媒を別し溶媒を除
いて無色油４８０mgをえて一夜おくと晶出した。メタノ
ール−水から再晶出させて無色固体をえた。融点１００
−１０２℃。
実施例XXIII１−ベンジル−３−メチル−３−エチルサ
クシニミド ベンジルアミン2.14ｇ（２０ミリモル）とα−メチル−
α−エチルこはく酸3.20ｇ（２０ミリモル）を溶媒なし
で混合し油浴中１４０℃で２時間加熱した。物質を冷し
ジクロロメタンにとかし少量のシリカゲルを使つて脱色
し別した。溶媒を除去して殆んど無色油１−ベンジル
−３−メチル−３−エチルサクシニミド4.32ｇをえた。
クシニミド ベンジルアミン2.14ｇ（２０ミリモル）とα−メチル−
α−エチルこはく酸3.20ｇ（２０ミリモル）を溶媒なし
で混合し油浴中１４０℃で２時間加熱した。物質を冷し
ジクロロメタンにとかし少量のシリカゲルを使つて脱色
し別した。溶媒を除去して殆んど無色油１−ベンジル
−３−メチル−３−エチルサクシニミド4.32ｇをえた。
実施例XXIV４−（３−メチル−３−エチル−１−サクシ
ニミジル（メチル）ベンゼンスルホニルクロライド クロロ硫酸３ml中に１−ベンジル−３−メチル−３−エ
チルサクシニミド９２４mg（４ミリモル）をとかし初め
の発熱反応がおさまつた後混合物を４０℃浴中で１５分
あたためた。これを砕氷上に注入しジクロロメタンで抽
出した。有機層を飽和塩溶液で２回洗い硫酸マグネシウ
ム上で乾かしシリカゲル床で過した。溶媒を除去して
無色油としてスルホニルクロライド９２６mgをえた。
ニミジル（メチル）ベンゼンスルホニルクロライド クロロ硫酸３ml中に１−ベンジル−３−メチル−３−エ
チルサクシニミド９２４mg（４ミリモル）をとかし初め
の発熱反応がおさまつた後混合物を４０℃浴中で１５分
あたためた。これを砕氷上に注入しジクロロメタンで抽
出した。有機層を飽和塩溶液で２回洗い硫酸マグネシウ
ム上で乾かしシリカゲル床で過した。溶媒を除去して
無色油としてスルホニルクロライド９２６mgをえた。
実施例XXV２−（３−メチル−３−エチル−１−サクシ
ニミジル）エチルベンゼン この化合物を本質的に実施例XVとXXIIIにおけるとおり
フエネチルアミンとα−メチル−α−エチルこはく酸か
ら製造した。生成物は殆んど無色の油であつた。
ニミジル）エチルベンゼン この化合物を本質的に実施例XVとXXIIIにおけるとおり
フエネチルアミンとα−メチル−α−エチルこはく酸か
ら製造した。生成物は殆んど無色の油であつた。
実施例XXVI２−〔２−（３−メチル−３−エチル−１−
サクシニミジル）エチル〕アニリン 酢酸無水物４ml中に２−（３−メチル−３−エチル−１
−サクシニミジル）エチルベンゼン９９０mg（3.75ミリ
モル）をとかし撹拌しながらこれに濃硝酸0.5mlと氷冷
無水酢酸２mlの混合物を加えた。室温で１５分後反応混
合物を５０℃浴中で１時間熱した。これに水を加えて冷
し揮発物質を除去した。残渣を水とエーテルに配分し有
機層を水洗し硫酸マグネシウム上で乾かし過し蒸発乾
固した。粗生成物の約1/3を予備薄層板上でクロマトグ
ラフ処理し未反応出発物質を含まないパラ−とオルト−
異性体の油状混合物３５０mgをえた。この混合物３００
mgをエタノール７５ml中木炭上１０％パラジウムを使い
初圧２気圧において水素添加した。反応は１時間以内で
完了した。生成混合物を薄層クロマトグラフ法で分離し
ベンゼン−エチルアセテートで展開してパラ−異性体１
２０mgとオルト−異性体８０mgをえた。
サクシニミジル）エチル〕アニリン 酢酸無水物４ml中に２−（３−メチル−３−エチル−１
−サクシニミジル）エチルベンゼン９９０mg（3.75ミリ
モル）をとかし撹拌しながらこれに濃硝酸0.5mlと氷冷
無水酢酸２mlの混合物を加えた。室温で１５分後反応混
合物を５０℃浴中で１時間熱した。これに水を加えて冷
し揮発物質を除去した。残渣を水とエーテルに配分し有
機層を水洗し硫酸マグネシウム上で乾かし過し蒸発乾
固した。粗生成物の約1/3を予備薄層板上でクロマトグ
ラフ処理し未反応出発物質を含まないパラ−とオルト−
異性体の油状混合物３５０mgをえた。この混合物３００
mgをエタノール７５ml中木炭上１０％パラジウムを使い
初圧２気圧において水素添加した。反応は１時間以内で
完了した。生成混合物を薄層クロマトグラフ法で分離し
ベンゼン−エチルアセテートで展開してパラ−異性体１
２０mgとオルト−異性体８０mgをえた。
実施例XXVII５−（３−メチル−３−エチル−サクシニ
ミド−１−イル）−１−ペンチルメタンスルホネート ５−（３−メチル−３−エチル−サクシニミド−１−イ
ル）−１−ペンタノール９０８mg（４ミリモル）とトリ
エチルアミン５５８ml（４ミリモル）をジシクロロメタ
ン１０mlにとかし氷水浴中で冷した。メタンスルホニル
クロライド２７７ml（４ミリモル）を加え混合物を３０
分撹拌したが５分後に氷浴をとつた。反応が完了しなか
つたのでトリエチルアミン１００mlとメタンスルホニル
クロライド４５mlを更に加えて４５分つづけた。反応混
合物を稀HClとジクロロメタン間に配分し有機層を１０
％重炭酸ナトリウム水溶液で洗い硫酸マグネシウム上で
乾かし溶媒を除去した。えたメシレート1.15ｇは無色油
であつた。
ミド−１−イル）−１−ペンチルメタンスルホネート ５−（３−メチル−３−エチル−サクシニミド−１−イ
ル）−１−ペンタノール９０８mg（４ミリモル）とトリ
エチルアミン５５８ml（４ミリモル）をジシクロロメタ
ン１０mlにとかし氷水浴中で冷した。メタンスルホニル
クロライド２７７ml（４ミリモル）を加え混合物を３０
分撹拌したが５分後に氷浴をとつた。反応が完了しなか
つたのでトリエチルアミン１００mlとメタンスルホニル
クロライド４５mlを更に加えて４５分つづけた。反応混
合物を稀HClとジクロロメタン間に配分し有機層を１０
％重炭酸ナトリウム水溶液で洗い硫酸マグネシウム上で
乾かし溶媒を除去した。えたメシレート1.15ｇは無色油
であつた。
実施例XXVIII５−（３−メチル−３−エチルサクシニミ
ド−１−イル）−１−ペンチルアザイド ジメチルホルムアミド５ml中に５−（３−メチル−３−
エチルサクシニミド−１−イル）−１−ペンチルメタン
スルホネート0.92ｇ（３ミリモル）とナトリウムアザイ
ド0.39ｇ（６ミリモル）の混合物を１４０℃において１
時間加熱撹拌した。ジメチルホルムアミドを真空除去し
少量のシリカゲルを使つて脱色し更に少量シリカゲルで
過した。溶媒を除去した殆んど無色油0.86ｇはＮＭＲ
と質量分析によつてアザイドと同定された。
ド−１−イル）−１−ペンチルアザイド ジメチルホルムアミド５ml中に５−（３−メチル−３−
エチルサクシニミド−１−イル）−１−ペンチルメタン
スルホネート0.92ｇ（３ミリモル）とナトリウムアザイ
ド0.39ｇ（６ミリモル）の混合物を１４０℃において１
時間加熱撹拌した。ジメチルホルムアミドを真空除去し
少量のシリカゲルを使つて脱色し更に少量シリカゲルで
過した。溶媒を除去した殆んど無色油0.86ｇはＮＭＲ
と質量分析によつてアザイドと同定された。
実施例XXIX５−（３−メチル−３−エチルサクシニミド
−１−イル）−１−ペンチルアミン塩酸塩 この化合物はHCl１当量を含むエタノール中で５−（３
−メチル−３−エチルサクシニミド−１−イル）−１−
ペンチルアザイドの木炭上パラジウム触媒水素添加法に
より製造した。
−１−イル）−１−ペンチルアミン塩酸塩 この化合物はHCl１当量を含むエタノール中で５−（３
−メチル−３−エチルサクシニミド−１−イル）−１−
ペンチルアザイドの木炭上パラジウム触媒水素添加法に
より製造した。
実施例XXX６−〔３−（３−メチル−３−サクシニミジ
ル）プロピルアミノカルボニル〕フルオレスセイン ６−カルボキシフルオレスセイン２１５mgとＮ−ヒドロ
キシサクシニミド６３mgを無水ピリジン５mlにとかし
Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド１２４mgを
加えた。混合物を室温で２時間混合し３−メチル−３−
（３−アミルプロピル）サクシニミド塩酸塩１０３mgを
加えた。混合物を室温で２０時間混合し粗生成物を予備
薄層クロマトグラフ法により３：１クロロホルム−メタ
ノールで２回と１：１：１ベンジル−エチルアセテート
−アセトンで１回処理して精製しトレーサーをえた。
ル）プロピルアミノカルボニル〕フルオレスセイン ６−カルボキシフルオレスセイン２１５mgとＮ−ヒドロ
キシサクシニミド６３mgを無水ピリジン５mlにとかし
Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド１２４mgを
加えた。混合物を室温で２時間混合し３−メチル−３−
（３−アミルプロピル）サクシニミド塩酸塩１０３mgを
加えた。混合物を室温で２０時間混合し粗生成物を予備
薄層クロマトグラフ法により３：１クロロホルム−メタ
ノールで２回と１：１：１ベンジル−エチルアセテート
−アセトンで１回処理して精製しトレーサーをえた。
実施例XXXI５−〔３−（３−メチル−３−サクシニミジ
ル）プロピルアミノカルボニル〕フルオレスセイン 本化合物は５−カルボキシフルオレスセイン１０mg、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド6.2mg、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（Ｎ−ヒドロキシサクシニミドより
むしろ）4.2mgおよび３−メチル−３−（３−アミノプ
ロピル）サクシニミド塩酸塩５mgから出発して実施例XX
Xの方法によつて製造した。クロロホルム−メタノール
を使い１回だけクロマトグラフ法を行なつた。
ル）プロピルアミノカルボニル〕フルオレスセイン 本化合物は５−カルボキシフルオレスセイン１０mg、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド6.2mg、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（Ｎ−ヒドロキシサクシニミドより
むしろ）4.2mgおよび３−メチル−３−（３−アミノプ
ロピル）サクシニミド塩酸塩５mgから出発して実施例XX
Xの方法によつて製造した。クロロホルム−メタノール
を使い１回だけクロマトグラフ法を行なつた。
実施例XXXII６−〔３−（３−メチルサクシニミド−３
−イル）１−プロポキシカルボニルアミノスルホニルア
ミノ〕フルオレスセイン ジクロロメタン１mlに３−メチル−３−（３−ヒドロキ
シ−１−プロピル）サクシニミド２２mg（0.13ミリモ
ル）をとかし、これをジクロロメタン１ml中にクロロス
ルホニルイソシアネート１４ml（0.16ミリモル）の氷冷
撹拌溶液に滴加した。氷浴をとり去り更に２０分撹拌し
た後溶媒を除去し残渣をアセトニトリル0.5mlとジメチ
ルホルムアミド0.2ml混合液にとかした。この液の半分
を６−アミノフルオレスセイン２０mg（0.065ミリモ
ル）およびピリジン0.0052ml（0.065ミリモル）と室温
で７時間反応させた。シリカゲル薄層板上でベンゼン−
エチルアセテート−アセトンを用いてクロマトグラフ法
により生成物を分離した。クロロホルム−メタノールを
用いて第２回クロマトグラフ法により残つた少量の副成
物を除去した。
−イル）１−プロポキシカルボニルアミノスルホニルア
ミノ〕フルオレスセイン ジクロロメタン１mlに３−メチル−３−（３−ヒドロキ
シ−１−プロピル）サクシニミド２２mg（0.13ミリモ
ル）をとかし、これをジクロロメタン１ml中にクロロス
ルホニルイソシアネート１４ml（0.16ミリモル）の氷冷
撹拌溶液に滴加した。氷浴をとり去り更に２０分撹拌し
た後溶媒を除去し残渣をアセトニトリル0.5mlとジメチ
ルホルムアミド0.2ml混合液にとかした。この液の半分
を６−アミノフルオレスセイン２０mg（0.065ミリモ
ル）およびピリジン0.0052ml（0.065ミリモル）と室温
で７時間反応させた。シリカゲル薄層板上でベンゼン−
エチルアセテート−アセトンを用いてクロマトグラフ法
により生成物を分離した。クロロホルム−メタノールを
用いて第２回クロマトグラフ法により残つた少量の副成
物を除去した。
実施例XXXIII６−｛４−〔３−（３−メチル−３−サク
シニミジル）プロピルアミノ〕−６−クロロ−1,3,5−
トリアジン−２−イルアミノ｝フルオレスセイン メタノール0.2mlに３−メチル−３−（３−アミノプロ
ピル）サクシニミド３mgと６−（4,6−ジクロロ−1,3,5
−トリアジン−２−イルアミノ）フルオレスセイン8.5m
gをとかしトリエチルアミン0.0063mlを加え混合物を室
温で一夜混合した。生成物をシリカゲル薄層板上クロロ
ホルム−メタノールを用い更にベンゼン、エチルアセテ
ートおよびアセトンの混合物を用いてクロマトグラフ法
によつて分離した。
シニミジル）プロピルアミノ〕−６−クロロ−1,3,5−
トリアジン−２−イルアミノ｝フルオレスセイン メタノール0.2mlに３−メチル−３−（３−アミノプロ
ピル）サクシニミド３mgと６−（4,6−ジクロロ−1,3,5
−トリアジン−２−イルアミノ）フルオレスセイン8.5m
gをとかしトリエチルアミン0.0063mlを加え混合物を室
温で一夜混合した。生成物をシリカゲル薄層板上クロロ
ホルム−メタノールを用い更にベンゼン、エチルアセテ
ートおよびアセトンの混合物を用いてクロマトグラフ法
によつて分離した。
実施例XXXIV６〔２−（３−メチル−３−エチル−１−
サクシニミジル）−１−エトキシカルボニルアミノ−ス
ルホニルアミノ〕フルオレスセイン ジクロロメタン５ml中に３−メチル−３−エチル−１−
（２−ヒドロキシエチル）サクシニミド３７３mg（２ミ
リモル）をとかしこれにジクロロメタン１ml中にクロロ
スルホニルイソシアネート0.173ml（２ミリモル）の液
を加えた。混合物を１０分混合し少量の沈澱を別し溶
媒を除去した。残渣を0.70mlのピリジンにとかし、この
液0.10mlをピリジン0.10ml中に６−アミノフルオレスセ
イン１０４mg（０．３ミリモル）の液を混合した。反応
を室温で４時間進め予備薄層クロマトグラフ法によりク
ロロホルムーメタノールで２回展開して生成物を分離し
た。
サクシニミジル）−１−エトキシカルボニルアミノ−ス
ルホニルアミノ〕フルオレスセイン ジクロロメタン５ml中に３−メチル−３−エチル−１−
（２−ヒドロキシエチル）サクシニミド３７３mg（２ミ
リモル）をとかしこれにジクロロメタン１ml中にクロロ
スルホニルイソシアネート0.173ml（２ミリモル）の液
を加えた。混合物を１０分混合し少量の沈澱を別し溶
媒を除去した。残渣を0.70mlのピリジンにとかし、この
液0.10mlをピリジン0.10ml中に６−アミノフルオレスセ
イン１０４mg（０．３ミリモル）の液を混合した。反応
を室温で４時間進め予備薄層クロマトグラフ法によりク
ロロホルムーメタノールで２回展開して生成物を分離し
た。
実施例XXXV６−〔３−（３−メチル−３−エチル−１−
サクシニミジル）−１−プロポキシカルボニルアミノス
ルホニルアミノ〕フルオレスセイン ジクロロメタン１ml中にクロロスルホニルイソシアネー
ト１８mg（0.125ミリモル）の撹拌氷冷溶液にジクロロ
メタン1.0ml中に３−メチル−３−エチル−１−（３−
ヒドロキシプロピル）サクシニミド２０mg（0.1モル）
の液を滴加した。１０分後液の半分をとり溶媒を除去し
た。残渣をアセトニトリル１５０mlとピリジン５０mlの
混合液にとり６−アミノフルオレスセイン17.3mg（0.05
ミリモル）を加えた。混合物を室温で2.5時間混合しシ
リカゲル予備薄層クロマトグラフ板上にすじをつけた。
ベンゼン−エチルアセテート−アセトンで展開し主生成
物をえてそれをクロロホルム−メタノールで再精製して
トレーサーをえた。
サクシニミジル）−１−プロポキシカルボニルアミノス
ルホニルアミノ〕フルオレスセイン ジクロロメタン１ml中にクロロスルホニルイソシアネー
ト１８mg（0.125ミリモル）の撹拌氷冷溶液にジクロロ
メタン1.0ml中に３−メチル−３−エチル−１−（３−
ヒドロキシプロピル）サクシニミド２０mg（0.1モル）
の液を滴加した。１０分後液の半分をとり溶媒を除去し
た。残渣をアセトニトリル１５０mlとピリジン５０mlの
混合液にとり６−アミノフルオレスセイン17.3mg（0.05
ミリモル）を加えた。混合物を室温で2.5時間混合しシ
リカゲル予備薄層クロマトグラフ板上にすじをつけた。
ベンゼン−エチルアセテート−アセトンで展開し主生成
物をえてそれをクロロホルム−メタノールで再精製して
トレーサーをえた。
実施例XXXVI５−〔３−（３−メチル−３−エチル−１
−サクシニミジル）−１−プロピルアミノチオカルボニ
ルアミノ〕フルオレスセイン ピリジン0.10ml中に３−メチル−３−エチル−１−（３
−アミノプロピル）サクシニミド塩酸塩7.5mgおよびフ
ルオレスセイン−５−イソチオシアネート11.7mgの液を
室温で４時間混合した。これを予備薄層クロマトグラフ
法によりベンゼン−エチルアセテート−アセトンで展開
して生成物を分離した。
−サクシニミジル）−１−プロピルアミノチオカルボニ
ルアミノ〕フルオレスセイン ピリジン0.10ml中に３−メチル−３−エチル−１−（３
−アミノプロピル）サクシニミド塩酸塩7.5mgおよびフ
ルオレスセイン−５−イソチオシアネート11.7mgの液を
室温で４時間混合した。これを予備薄層クロマトグラフ
法によりベンゼン−エチルアセテート−アセトンで展開
して生成物を分離した。
実施例XXXVII６−〔３−（３−メチル−３−エチル−１
−サクシニミジル）プロピルカルボニルアミノ〕フルオ
レスセイン ジメチルホルムアミド0.2ml中に３−（３−メチル−３
−エチル−１−サクシニミジル）プロピオン酸１５mgと
トリエチルアミン9.2mlをとかし氷浴中で冷しイソブチ
ルクロロホーメイト９mlを混入した。混合物を２時間か
けて室温まであたため６−アミノフルオレスセイン２３
mgを加えた。一夜カツプリング反応させて溶媒を真空除
去した。残渣をメタノールにとりシリカゲル薄層板上ク
ロマトグラフ法により５：１クロロホルム−メタノール
を用い未反応フルオレスセインアミン直上のバンドをと
つた。
−サクシニミジル）プロピルカルボニルアミノ〕フルオ
レスセイン ジメチルホルムアミド0.2ml中に３−（３−メチル−３
−エチル−１−サクシニミジル）プロピオン酸１５mgと
トリエチルアミン9.2mlをとかし氷浴中で冷しイソブチ
ルクロロホーメイト９mlを混入した。混合物を２時間か
けて室温まであたため６−アミノフルオレスセイン２３
mgを加えた。一夜カツプリング反応させて溶媒を真空除
去した。残渣をメタノールにとりシリカゲル薄層板上ク
ロマトグラフ法により５：１クロロホルム−メタノール
を用い未反応フルオレスセインアミン直上のバンドをと
つた。
実施例XXXVIII５−〔４−｛３−（３−メチル−３−エ
チル−１−サクシニミジル）−２−プロピルアミノ｝−
６−クロロ−1,3,5−トリアジン−２−イルアミノ〕フ
ルオレスセイン メタノール0.50ml中３−メチル−３−エチル−１−（３
−アミノプロピル）サクシニミド塩酸塩10.5mg、５−
（4,6−ジクロロ−1,3,5−トリアジン−２−イルアミ
ノ）フルオレスセイン23.8mgおよびトリエチルアミン0.
006mlの液を室温において一夜混合した。２回目トリエ
チルアミン0.006mlを加え更に４日間室温でつでけた。
シリカゲル薄層板上でクロマトグラフ法によりクロロホ
ルム−メタノールで展開して生成物を分離した。
チル−１−サクシニミジル）−２−プロピルアミノ｝−
６−クロロ−1,3,5−トリアジン−２−イルアミノ〕フ
ルオレスセイン メタノール0.50ml中３−メチル−３−エチル−１−（３
−アミノプロピル）サクシニミド塩酸塩10.5mg、５−
（4,6−ジクロロ−1,3,5−トリアジン−２−イルアミ
ノ）フルオレスセイン23.8mgおよびトリエチルアミン0.
006mlの液を室温において一夜混合した。２回目トリエ
チルアミン0.006mlを加え更に４日間室温でつでけた。
シリカゲル薄層板上でクロマトグラフ法によりクロロホ
ルム−メタノールで展開して生成物を分離した。
実施例XXXIX５−〔４−（3,3−ジメチル−１−サクシニ
ミジル）−１−ブチルカルボニルアミノ〕フルオレスセ
イン 3,3−ジメチル−１−（４−カルボキシ−１−ブチル）
サクシニミド14.5mgとトリエチルアミン8.3mlを２００m
lのジメチルホルムアミドにとかし混合物を氷塩浴中で
冷しイソブチルクロロホーメイト8.7mgを混入した。氷
がとける様に２時間混合をつづけ５−アミノフルオレス
セイン２２mgを加えた。混合物を一夜室温で混合し予備
薄層クロマトグラフ法により５：１クロロホルム−メタ
ノールで展開して生成物を分離した。
ミジル）−１−ブチルカルボニルアミノ〕フルオレスセ
イン 3,3−ジメチル−１−（４−カルボキシ−１−ブチル）
サクシニミド14.5mgとトリエチルアミン8.3mlを２００m
lのジメチルホルムアミドにとかし混合物を氷塩浴中で
冷しイソブチルクロロホーメイト8.7mgを混入した。氷
がとける様に２時間混合をつづけ５−アミノフルオレス
セイン２２mgを加えた。混合物を一夜室温で混合し予備
薄層クロマトグラフ法により５：１クロロホルム−メタ
ノールで展開して生成物を分離した。
実施例XL５−〔４−（３−メチル−３−エチル−１−サ
クシニミジルメチル）ベンゼンスルホニルアミド〕フル
オレスセイン ピリジン250ml中に４−（３−メチル−３−エチル−１
−サクシニミジルメチル）ベンセンスルホニルクロライ
ド２６mgと５−アミノフルオレスセイン27.4mgをとかし
室温で４５分混合した。薄層クロマトグラフにより４：
１クロロホルム−メタノールで展開し未反応アミノフル
オレスセイン直上を移動したバンドをとつて生成物を精
製した。
クシニミジルメチル）ベンゼンスルホニルアミド〕フル
オレスセイン ピリジン250ml中に４−（３−メチル−３−エチル−１
−サクシニミジルメチル）ベンセンスルホニルクロライ
ド２６mgと５−アミノフルオレスセイン27.4mgをとかし
室温で４５分混合した。薄層クロマトグラフにより４：
１クロロホルム−メタノールで展開し未反応アミノフル
オレスセイン直上を移動したバンドをとつて生成物を精
製した。
実施例XLI５−〔４−｛２−〔２−（３−メチル−３−
エチル−１−サクシニミジル）エチル〕フエニルアミ
ノ｝−６−クロロ−1,3,5−トリアジン−２−イルアミ
ノ〕フルオレスセイン メタノール１ml中に２−〔２−（３−メチル−３−エチ
ル−１−サクシニミジル）エチル〕アニリン２８mg（0.
1ミリモル）、トリエチルアミン２０mg（0.2ミリモル）
および５−〔4,6−ジクロロ−1,3,5−トリアジン−２−
イルアミノ〕フルオレスセイン42.5mg（0.08ミリモル）
をとり混合し２４時間室温で放置した。薄層クロマトグ
ラフ法で精製しクロロホルム−メタノールで溶離して生
成物を得た。
エチル−１−サクシニミジル）エチル〕フエニルアミ
ノ｝−６−クロロ−1,3,5−トリアジン−２−イルアミ
ノ〕フルオレスセイン メタノール１ml中に２−〔２−（３−メチル−３−エチ
ル−１−サクシニミジル）エチル〕アニリン２８mg（0.
1ミリモル）、トリエチルアミン２０mg（0.2ミリモル）
および５−〔4,6−ジクロロ−1,3,5−トリアジン−２−
イルアミノ〕フルオレスセイン42.5mg（0.08ミリモル）
をとり混合し２４時間室温で放置した。薄層クロマトグ
ラフ法で精製しクロロホルム−メタノールで溶離して生
成物を得た。
実施例XLII６−〔４−（３−メチル−３−エチル−１−
サクシニミジル）−１−ブチルカルボニルアミノ〕フル
オレスセイン 乾燥ジメチルホルムアミド0.50ml中に３−メチル−３−
エチル−１−（４−カルボキシブチル）サクシニミド４
８mgとトリエチルアミン２８mlの溶液を氷塩浴中で冷し
イソブチルクロロホーメイト２６mlを加えた。混合物を
２時間で室温まであたためこの液の半分を３５mgの６−
アミノフルオレセインに加え液を室温で一夜撹拌した。
シリカゲル薄層板上クロマトグラフ法により展開溶媒と
してクロロホルム−メタノールを用いて生成物を精製し
た。同じ条件で第２回クロマトグラフ法を行ない純トレ
ーサーをえた。
サクシニミジル）−１−ブチルカルボニルアミノ〕フル
オレスセイン 乾燥ジメチルホルムアミド0.50ml中に３−メチル−３−
エチル−１−（４−カルボキシブチル）サクシニミド４
８mgとトリエチルアミン２８mlの溶液を氷塩浴中で冷し
イソブチルクロロホーメイト２６mlを加えた。混合物を
２時間で室温まであたためこの液の半分を３５mgの６−
アミノフルオレセインに加え液を室温で一夜撹拌した。
シリカゲル薄層板上クロマトグラフ法により展開溶媒と
してクロロホルム−メタノールを用いて生成物を精製し
た。同じ条件で第２回クロマトグラフ法を行ない純トレ
ーサーをえた。
実施例XLIII５−〔（３−メチル−３−エチル−１−サ
クシニミジル）ペンチルカルボニルアミノ〕フルオレス
セイン ジメチルホルムアミド0.02ml中に１−（５−カルボキシ
ペンチル）−３−メチル−３−エチルサクシニミド9.2m
gとトリエチルアミン0.0048mlの液を氷水浴中で冷しイ
ソブチルクロロホーメート4.7mlを加えた。混合物を１
時間２０分撹拌し氷はとけた。フルオレスセインアミン
（５−異性体）12.5mgを加え室温で一夜撹拌をつづけ
た。薄層クロマトグラフ法により５：１クロロホルム−
メタノールを用い未反応フルオレスセインアミンより速
く移動したバンドをとつてトレーサーを精製した。
クシニミジル）ペンチルカルボニルアミノ〕フルオレス
セイン ジメチルホルムアミド0.02ml中に１−（５−カルボキシ
ペンチル）−３−メチル−３−エチルサクシニミド9.2m
gとトリエチルアミン0.0048mlの液を氷水浴中で冷しイ
ソブチルクロロホーメート4.7mlを加えた。混合物を１
時間２０分撹拌し氷はとけた。フルオレスセインアミン
（５−異性体）12.5mgを加え室温で一夜撹拌をつづけ
た。薄層クロマトグラフ法により５：１クロロホルム−
メタノールを用い未反応フルオレスセインアミンより速
く移動したバンドをとつてトレーサーを精製した。
実施例XLIV５−〔４−｛４−（３−メチル−３−エチル
−１−サクシニミジル）ペンチルアミノ−６−クロロ−
1,3,5−トリアジン−２−イル｝アミノ〕フルオレスセ
イン メタノール0.20ml中に４−（３−メチル−３−エチル−
１−サクシニミジル）アニリン2.3mgと５−〔4,6−ジク
ロロ−1,3,5−トリアジン−２−イルアミノ〕フルオレ
スセイン5.3mgをとかし室温で一夜混合した。薄層クロ
マトグラフ法により溶媒としてクロロホルム−メタノー
ルを用いて純生成物をえた。
−１−サクシニミジル）ペンチルアミノ−６−クロロ−
1,3,5−トリアジン−２−イル｝アミノ〕フルオレスセ
イン メタノール0.20ml中に４−（３−メチル−３−エチル−
１−サクシニミジル）アニリン2.3mgと５−〔4,6−ジク
ロロ−1,3,5−トリアジン−２−イルアミノ〕フルオレ
スセイン5.3mgをとかし室温で一夜混合した。薄層クロ
マトグラフ法により溶媒としてクロロホルム−メタノー
ルを用いて純生成物をえた。
実施例XLV６−〔４−｛３−（３−メチル−３−エチル
−１−サクシニミジル）フエニルアミノ−６−クロロ−
1,3,5−トリアジン−１−イル｝アミノ〕フルオレスセ
イン ３−（３−メチル−３−エチル−１−サクシニミジルア
ニリン3.7mgと６−〔4,6−ジクロロ−1,3,5−トリアジ
ン−２−イル）アミノ〕フルオレスセイン８mgをメタノ
ール0.25ml中で室温において３６時間撹拌した。シリカ
ゲル薄層板上予備クロマトグラン法によりクロロホルム
−メタノールで展開し最も移動性バンドをとつて純生成
物をえた。
−１−サクシニミジル）フエニルアミノ−６−クロロ−
1,3,5−トリアジン−１−イル｝アミノ〕フルオレスセ
イン ３−（３−メチル−３−エチル−１−サクシニミジルア
ニリン3.7mgと６−〔4,6−ジクロロ−1,3,5−トリアジ
ン−２−イル）アミノ〕フルオレスセイン８mgをメタノ
ール0.25ml中で室温において３６時間撹拌した。シリカ
ゲル薄層板上予備クロマトグラン法によりクロロホルム
−メタノールで展開し最も移動性バンドをとつて純生成
物をえた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 15/12 8318−4Ｈ (72)発明者 クリフオード マン チヤン アメリカ合衆国イリノイ州 60030 グレ イスレーク ウエスト ウインドスロー ドライブ 17652 (56)参考文献 特開 昭51−1632（ＪＰ，Ａ)
Claims (5)
- 【請求項１】構造式： （式中Ｒ１はＨ又は−Ｒ−Ｚ−Ｑを表し； Ｒ２はＲ１がＨであれば-CH2−Ｒ−Ｚ−Ｑを表し、Ｒ１
が−Ｒ−Ｚ−Ｑであればメチル又はエチルを表す； Ｒ３はメチル又はエチルを表し； Ｑはフルオレスセイン又はフルオレスセイン誘導体を表
し； ＺはNH,CO,CS,SO2又はＣ＝NHを表し； そしてＲはヘテロ原子１０までをもち、直鎖又は分枝鎖
に配置された炭素原子とヘテロ原子との合計０乃至２０
をもち且つ２までの環構造をもつ結合基を表し、但しＲ
１が−Ｒ−Ｚ−Ｑであり、Ｑがフルオレスセインのアミ
ノ誘導体であり、ＺがCOでありＲが通常のアルキル鎖で
あるときはＲは少なくとも３炭素原子をもたなければな
らない）で示される化合物。 - 【請求項２】Ｑがフルオレスセインのアミノ、アミド、
アミジノ、ウレア、チオウレア、カルバメート、チオカ
ルバメート、トリアジニルアミノ、スルホンアミド又は
（カルボキシアミノ）−スルホンアミド誘導体である特
許請求の範囲第１項記載の化合物。 - 【請求項３】Ｑが４−クロロ−６−（フルオレスセイン
−５−イルアミノ）−1,3,5−トリアジン−２−イル、
４−クロロ−６−（フルオレスセイン−６−イルアミ
ノ）−1,3,5−トリアジン−２−イル、４−メトキシ−
６−（フルオレスセイン−５−イルアミノ）−1,3,5−
トリアジン−２−イル、４−メトキシ−６−（フルオレ
スセイン−６−イルアミノ）−1,3,5−トリアジン−２
−イル、フルオレスセイン−５−イルカルボニル、フル
オレスセイン−６−イルカルボニル、（フルオレスセイ
ン−６−イル）アミノ、又は（フルオレスセイン−５−
イル）アミノである特許請求の範囲第１項記載の化合
物。 - 【請求項４】式： （式中Ｒ１はＨ又は−Ｒ−Ｙを表し； Ｒ２はＲ１がＨであるときは-CH2−Ｒ−Ｙを表し、また
はＲ１が−Ｒ−Ｙであるときはメチル又はエチルを表
し； Ｒ３はメチル又はエチルを表し； Ｙは-NH2、-COOH、-SO3H、-SO2Cl、SH、-CHO、-CN又は-OHを表
し； Ｒはヘテロ原子１０までをもち、直鎖又は分枝鎖に配列
されている炭素原子とヘテロ原子との合計０乃至２０を
もち且つ環構造２までをもつ結合基を表し、但しＲ１が
−Ｒ−Ｙであり、Ｒが通常のアルキル鎖でありかつＹが
COOHである場合はＲは少なくとも３炭素原子をもたなけ
ればならない）で示される化合物をフルオレスセイン又
はフルオレスセイン誘導体と結合させる工程より成るこ
とを特徴とするトレーサーを製造する方法。 - 【請求項５】(a)液体試料をエトサキシミド抗血清およ
びエトサキシミド抗血清の存在に対し検出可能な螢光偏
光応答を生じ得る構造式： （式中Ｒ１はＨ又は−Ｒ−Ｚ−Ｑを表し；Ｒ２はＲ１が
Ｈであれば-CH2−Ｒ−Ｚ−Ｑを表し、またはＲ１が−Ｒ
−Ｚ−Ｑであればメチル又はエチルを表す；Ｒ３はメチ
ル又はエチルを表し；Ｑはフルオレスセイン又はフルオ
レスセイン誘導体を表し；ＺはNH,CO,CS,SO2又はＣ＝NH
を表し；かつＲはヘテロ原子１０までをもち、直鎖又は
分枝鎖に配置された炭素原子とヘテロ原子との合計０乃
至２０をもち且つ２までの環構造をもつ結合基を表し、
但しＲ１がＲ−Ｚ−Ｑであり、Ｑがフルオレスセインの
アミノ誘導体であり、ＺがCOでありりＲが普通のアルキ
ル鎖であるときはＲは少なくとも３炭素原子をもたなけ
ればならない）で示される化合物と接触させ、 (b)工程(a)からえた溶液に平面偏光をとおして螢光偏光
応答を得て、 (c)工程(b)の溶液の螢光偏光応答を試料中のエトサキシ
ミドの量の尺度として検出する工程より成ることを特徴
とするエトサキシミドの濃度を測定する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71860185A | 1985-04-01 | 1985-04-01 | |
| US718601 | 1985-04-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61236799A JPS61236799A (ja) | 1986-10-22 |
| JPH0662628B2 true JPH0662628B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=24886713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61072644A Expired - Fee Related JPH0662628B2 (ja) | 1985-04-01 | 1986-04-01 | エトサキシミド試験法、トレーサー、イムノゲンおよび抗体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0199963B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0662628B2 (ja) |
| DE (1) | DE3682105D1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6472227B1 (en) | 1986-06-04 | 2002-10-29 | Abbott Laboratories | Barbiturate assay, tracers, immunogens, antibodies and kit |
| EP0373508A3 (en) * | 1988-12-12 | 1992-07-08 | Abbott Laboratories | Barbiturate assay, tracers, immunogens and antibodies |
| JP5511080B2 (ja) * | 2008-03-31 | 2014-06-04 | 興和株式会社 | １，３−ジヒドロイソベンゾフラン誘導体 |
| JP6733993B2 (ja) * | 2014-10-03 | 2020-08-05 | シンアフィックス ビー．ブイ． | スルファミドリンカー、スルファミドリンカーのコンジュゲート、及び調製の方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1511571A (en) * | 1974-06-28 | 1978-05-24 | Syva Co | Lactam compounds and conjugates |
| CA1160626A (en) * | 1980-07-30 | 1984-01-17 | Stephen D. Stroupe | Biologically interesting compounds labeled with dichlorotriazinyl-aminofluorescein |
| AU555213B2 (en) * | 1981-02-17 | 1986-09-18 | Abbott Laboratories | N-substituted-amido-fluoresein derivatives |
| CA1248086A (en) * | 1981-12-11 | 1989-01-03 | Stephen D. Stroupe | Fluorescence polarization immunoassay |
-
1986
- 1986-03-18 DE DE8686103673T patent/DE3682105D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-03-18 EP EP19860103673 patent/EP0199963B1/en not_active Expired
- 1986-04-01 JP JP61072644A patent/JPH0662628B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61236799A (ja) | 1986-10-22 |
| DE3682105D1 (de) | 1991-11-28 |
| EP0199963A1 (en) | 1986-11-05 |
| EP0199963B1 (en) | 1991-10-23 |
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|---|---|---|---|
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