FI90542C - Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä - Google Patents
Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä Download PDFInfo
- Publication number
- FI90542C FI90542C FI873609A FI873609A FI90542C FI 90542 C FI90542 C FI 90542C FI 873609 A FI873609 A FI 873609A FI 873609 A FI873609 A FI 873609A FI 90542 C FI90542 C FI 90542C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- group
- conjugate
- formula
- sample
- antibody
- Prior art date
Links
- GMPHVYZTQKNUCB-UHFFFAOYSA-N C(C1CCC1)C1CCCC1 Chemical compound C(C1CCC1)C1CCCC1 GMPHVYZTQKNUCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N CC1CCCC1 Chemical compound CC1CCCC1 GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UJVBWZDUCLNLCL-UHFFFAOYSA-N CCC(C1)CC1=C(C1)CC1C1CCCC1 Chemical compound CCC(C1)CC1=C(C1)CC1C1CCCC1 UJVBWZDUCLNLCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
- C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D219/00—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems
- C07D219/04—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Pyridine Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Pyrane Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Liquid Crystal Substances (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden kayttO luminesenssi-immunoanalyyseissa 1 90542
KeksinnOn kohteena ovat kemiluminoivat akridiini-5 johdannaiset, menetelmSt niiden valmistamiseksi ja niiden kayttO luminesenssi-immunoanalyyseissa.
Luminoivilla yhdisteilia on jo monipuolista k3yt-toa. Niita kaytetaan indikaattoreina eiainkokeissa, ent-syymi-immunoanalyyseissa ja luminesenssi-immunoanalyy-10 seissa (vrt. W.P. Collins "Alternative Immunoassays",
Verlag John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985), mutta niita kaytetaan myds nukleiinihappohybridointianalyyseis-sa (vrt. J.A. Matthews ym. "Analytical Biochemistry", 151, 205 - 209, 1985). Lisaksi kemiluminoivia yhdisteita 15 kaytetaan "flow injection analyysin" yhteydessa, "post column" -detektoreina nestekromatografiassa, virtaustut-kimuksessa ja keinotekoisissa valolåhteissa.
Kemiluminesenssi-immunoanalyysien yhteydessa huo-mattavampaa merkitysta on saavuttanut erityisesti kaksi 20 kemiluminoivien merkkiaineiden rakennetyyppia. Kyseessa ovat tailOin toisaalta luminoli- tai isoluminolijohdannaiset, joita ovat selostaneet H.R. Schroeder ym., "Methods in Enzymology", Academic Press Inc., New York, Vol. LVII, 1978, 424 ff, samoin kuin ne, joita on selos-25 tettu GB-patenteissa 2 008 247 ja 2 041 920, DE-patentti-julkaisuissa 2 618 419 ja 2 618 511, samoin kuin EP-pa-tenttihakemuksessa 137 071. Yleiskatsaus isoluminoliyh-disteiden kaytOsta kaytannon sovellutuksissa luminesens-si-indikaattoreina on lOydettavissa julkaisusta W.G.
• 30 Wood, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 1984, 905 - 918.
Toisaalta akridiniumesteriyhdisteille on ldytynyt kayttdS myos kemiluminoivina merkkiaineina. Niiden kal-taisia akridiniumestereita tunnetaan myos US-patentin 3 352 791, GB-patenttien 1 316 363 ja 1 461 877 sekS EP---: 35 patenttihakemuksen 82 636 perusteella. Akridiniumesterien 2 > Π 5 42 kayttea merkkiaineina inununoanalyyseissa on selostettu julkaisussa Weeks ym., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1 474 -1 479. Myds fenantridiniumesterien kayttd merkkiaineena luminesenssi-immunoanalyyseissa tunnetaan jo EP-patentti-5 hakemuksen 170 415 perusteella.
Akridiniumesterien kemiluminointi voidaan kaynnis-taa lisaamaiia alkalista H202-liuosta. Kemiluminoinnin mekanismista vakuuttavan selostuksen on esittanyt F. McCapra, Acc. Chem. Res. 9, 201, 1976. Taildin ratkaiseva 10 merkitys on ilmeisesti poistuvan ryhman laadulla sekå va-lokvanttituoton etta myds hydrolyyttisen stabiilisuuden kannalta.
Toistaiseksi jo tunnettujen akridiniumesterien etuna luminoli- ja isoluminoliyhdisteisiin nahden on 15 suurempi valokvanttituotto, johon mytiskaan indikaattoriin sitoutuneilla proteiineilla ei ole haitallista vaikutus-ta (vrt. Weeks ym., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1 474 -1 479).
Vaikkakin EP-patenttihakemuksen 82 636 perusteella 20 tunnetuilla akridiniumfenyyliestereilia kemiluminoinnin aktivoitumisessa mietojen hapetusaineiden vaikutuksesta on erinomaisen suuri naytttiherkkyys, niilia on kaytanndn sovellutusten kannalta hairitsevia varjopuolia. Ennen kaikkea fenyyliesterisidos on vesipitoisissa seoksissa jo 25 huoneen lampdtilassakin hyvin labiili. Lisaksi siina mai-nituissa hapetusolosuhteissa akridiniumfenyyliestereilia esiintyy valoemissiota, joka vasta noin 10 sekunnin ku-luttua on vaimentunut oleellisesti, se on yli 95-%:isesti. Tahan verrattuna toisten ei isotooppisten 30 analyysimenetelmien mittausajat ovat huomattavasti ly- hyempia ja mahdollistavat siten suuremman naytteiden ia-pikulun.
Taman keksinndn tehtavanå oli sen vuoksi saada kaytettavaksi uusia akridiniumjohdannaisia, joilla suu-35 ren valokvanttituoton ohella on nopeampi reaktiokinetiik- 3 90542 ka ja mahdollistavat siten lyhyet mittausajat luminesens-si-immunoanalyysissa.
KeksinnOn kohteena on kaavan (I) mukainen, kemilu-minoiva akridiniumjohdannainen 5 R1 L JT Tf J a® |r> ίο 0=C-R4 jossa R1 on vety tai 1-10 hiiliatomia sisaitava alkyy-15 liryhma, R* on kaavan (V) mukainen substituoitu sulfon-amidiryhma .X-R5 (V) 20 ^"S02-R6 tai kaavan (VI) mukainen substituoitu sulfonamidiryhma /R6 25 _NC (VI) ^so2-x-r5 tai kaavan (II) mukainen tioalkyyli- tai tioaryyliryhma '30 -S - X - R5 (II) jolloin X on haaroittunut tai suora C^-Cs-alkyleeniryhma tai orto-, meta- tai parafenyleeniryhma, R5 on kaavan III mukainen ryhma ·· ·-: 35 4 90542 0 Vi II / , -C-O-N (III) ^- 5 O' R6 on fenyyliryhma, joka voi olla substituoitu 1-4 hii-liatomia sisaitavaiia alkoksilla, ja A© on anioni, jolla ei ole haitallista vaikutusta kemiluminointiin.
Biologisesti mielenkiintoisilla aineilla tarkoite-10 taan ennen kaikkea antigeeneja. Taman kasitteen piiriin sisaityvat myOs hormonit, steroidit, laakeaineet, laake-ainemetaboliitit, toksiinit, alkaloidit ja myOs vasta-ai-neet.
Kemiluminointiin haitallisesti vaikuttamaton anio-15 ni voi olla tetrafluoriboraatti-, perkloraatti-, haloge- nidi-, alkyylisulfaatti-, halogeenisulfonaatti-, alkyyli-sulfonaatti- tai aryylisulfonaattianioni. Mydskin jokais-ta muuta anionia voidaan kayttaa, mikali se ei sammuta tai heikenna kemiluminointia.
20 Yleensa akridiniumjohdannaisiksi valitaan sellai- sia, joissa X on metyleeni-, etyleeni-, propyleeni- tai orto-, meta- tai para-fenyleeniryhma. Akridiniumjohdan-naisten vesiliukoisuuden parantamiseksi naissa ryhmissa voi olla mytts heteroatomeja sisaitavia, hydrofiilisia 25 substituentteja.
Erityinen merkitys keksinndn mukaisten akridinium-johdannaisten kayttdmahdollisuuksien kannalta on substi-tuentilla R5. Valitsemalla tama ryhma sopivalla tavalla akridiinijohdannainen saa niin suuren reaktiivisuuden, 30 etta se jo lievissa olosuhteissa voi selektiivisesti muo-dostaa sidoksen osoitettavan biologisen aineen reaktioky-kyisen ryhman kanssa. Keksinndn mukaisissa yhdisteissa R5 on I: 5 o V| -C-O-N (III) 5
Lisaksi ensisijaisina pidetaan myOs akridiniumjoh-dannaisia, joissa R1 on metyyliryhma. Erityisen usein kMytetaan sen vuoksi keksinnOn mukaisia akridiniumyhdis-teita, jotka vastaavat kaavaa IV
10 CH-3
\J
\ |T I I A© 15 X o Vi (IV) 20 joissa A:lla ja X:lia on edelia mainitut merkitykset.
Kun keksinnOn mukaisissa akridiniumjohdannaisissa tahde R4 on sulfoniamiditéhde, silloin se voi vastata ensisi jaisesti kaavaa V
. ; 25 ^ x-R5 -N<^ (V) s°2-r6
tai kaavaa VI
i 30 /R6 -N (VI) >VnSsso2-x-r5 35 joissa X:lia ja R5:lia on edelia mainitut merkitykset ja 6 90542 R6 on kaavassa V fenyyliryhmS, jossa voi mytts olla subs-tituenttina alkoksi, jossa on 1 - 4 hiiliatomia.
Tanrån keksinnOn mukaisen akridiniumjohdannaisluo-kan tyypilliset edustajat vastaavat kaavaa VII 5 CH, ^ ll i 1 αθ 10 Ϊ h
0 N-X-C-O-N
\ ^ s°nf3 15 '- jossa A:11a ja X:lia on edelia mainitut merkitykset.
Taman keksinnon mydta saadaan siis kaytettavaksi kaksl uutta akridiniumyhdisteiden luokkaa, jolloin toi-selle luokalle on ominaista tioliesteriryhmittyma ja toi-20 selle sulfoniamidirakenne. Akridiniumasyylisulfoniamidi-johdannaisten stabiilisuus on suurempl, tioliesterien ki-netiikka on nopeampi kuin tahan saakka tunnettujen akri-diniumfenyyliesteriyhdisteiden. Molemmilla yhdisteluokil-la on sen lisaksi suurempi valontuotto.
25 KeksinnSn mukaisten akridiniumyhdisteiden, joissa on tioliesteripitoisia poistuvia ryhmia, merkittavMna etuna on EP-patenttihakemuksen 82 636 perusteella tunnet-tuihin akridiniumfenyyliestereihin verrattuna valoemis-sion oleellisesti nopeampi reaktiokinetiikka, Siten esi-30 merkin 1 mukaisesti valmistettu keksinnOn mukainen akri-diniumtioesteri (yhdiste 6) yhden sekunnin mittausaikana antaa 10 kertaa suuremman valontuoton samoissa hapetus-olosuhteissa. TamS suuri valontuotos samanaikaisten ly-hyiden mittausaikojen ohella mahdollistaa oleellisesti 35 suuremman nSytelSpSisyn luminometrisså.
l! 7 90542
Siten kuvio 1 esittaa esimerkin 1 mukaisesti val-mistetun akridiniumtioesterin (yhdiste 6) vasta-ainekon-jugaatin valoemission kinetiikkaa ja kuvio 2 4-(2-sukkii-ni-imidyyli-oksikarbonyylietyyli)fenyyli-10-metyyliakri-5 dinium-9-karboksylaatti-metosulfaatin (EP-patenttihakemus 82 636, sivu 10) vasta-ainekonjugaatin valoemission kinetiikkaa. 100 μ1:η suuruisten kulloinkin kyseesså olevien merkkiaineliuosten kemiluminointi heratetaan lisaamaiia 350 μΐ 0,05-mol. KCl/NaOH-puskuria pH 13 + 0,1 % H202 ja 10 tallennetaan 10 sekunnin ajanjaksoin.
Kuviossa 1 maksimi valoemissio saavutetaan jo 0,66 sekunnin kuluttua ja on pudonnut 0,88 sekunnin kuluttua jo jaileen puoleen. Sita vastoin kuviossa 2 maksimi valoemissio saavutetaan vasta 1,77 sekunnin kuluttua ja on 15 pudonnut vasta 2,88 sekunnin kuluttua jalleen puoleen.
Kuvioista 1 ja 2 ilmenee, etta keksinnOn mukaisil-la tioalkyyliesterityyppisilia yhdisteilia on selvSsti lyhyempi valoemissioaika kuin laheisimmilia tekniikan ta-sosta tunnetuilla yhdisteilia (EP-A 82 636). Kuvioista la 20 ja 2a puolestaan ilmenee, etta myOs keksinnon mukaisilla asyylisulfonamidityyppisilia yhdisteilia on sama tekninen teho. Naissa kuvioissa on verrattu keksinnOn mukaisten asyylisulfonamidityyppisten yhdisteiden (ASAM) ja tunnet-tujen fenyyliesterityyppisten yhdisteiden (AE) valoemis-25 siokinetiikkaa keskenSån. Tuloksista havaitaan, etta kek-sinnOn mukaiset asyylisulfonamidityyppiset yhdisteet osoittavat vaiittOmasti mittauksen alettua huomattavasti korkeamman signaalin kuin tunnetut fenyyliesterityyppiset yhdisteet. Taten kaikilla keksinnOn mukaisilla yhdisteil-30 la on sama tekninen teho.
T3ysin odottamatonta on, etta amidityppeen sulfo-nyylisubstituoidulla akridinium-9-karboksyylihappoamidil-la on erinomainen kemiluminointi, silia tunnettua on, etta akridinium-9-karboksyylihappoamidilla painvastoin kuin 35 akridinium-9-karboksyylihappoestereilia ei esiinny min- 8 90542 kaanlaista kemiluminointia (vrt. F. McCapra, W.
Carruthers ja J.K. Sutherland: Progress in Organic Chem., Vol. 8, 231 - 277, 1973, Butterworth, Lontoo).
KeksinnOn mukaisia akridinium-9-karboksyylihappo-5 tioestereita voidaan valmistaa seuraavaa tieta:
Akridiinin annetaan reagoida Lehmstedt'in ja Hundertmark'in julkaisussa Ber. 63, 1229 (1930) esittaman menetelman mukaisesti etanoli/jaaetikassa ja kaliumsyani-din låsna ollessa 9-syaaniakridiiniksi. Tasta saadaan 10 uudelleen kiteyttamisen jaikeen antamalla reaktion tapah-tua rikkihapon ja natriumnitriitin kanssa Lehmstedt'in ja Wirth'in julkaisussa Ber. 61, 2044 (1928) selostaman menetelman mukaisesti akridiini-9-karboksyylihappoa. Antamalla akridiini-9-karboksyylihapon reagoida tionyylik- 15 loridin kanssa, saadaan kaavan VIII mukaista yhdistetta r2-^O^r3 I (VIII)
A
20 0 Y
jossa Y merkitsee klooria. Halogeenin asemesta Y:n pai-kalle yhdisteeseen VIII voidaan sijoittaa myiSs oksikarbo-nyyli-C1.5-alkyyli-, oksikarbonyyliaryyli- tai imidatsoli-diryhma.
25 Happokloridin (VIII) annetaan sitten reagoida kaa van IX mukaisen tiolikarboksyylihapon, HS-X-COOH (IX) 30 esim. 2-merkaptobentsoehapon kanssa alkalisissa olosuh-teissa tioliesterikarboksyylihapoksi, joka sen jaikeen esterOidaan tahteen R5 valmistamiseen soveltuvan yhdis-teen, esimerkiksi N-hydroksisukkiini-imidin kanssa. Taman jaikeen akridiiniyhdisteen 10-asema alkyloidaan kirjalli- 9 90542 suuden tuntemien menetelmien mukaisesti. Metylointiin so-veltuu ennen kaikkea trimetyylioksoniumtetrafluoriboraat-ti, joskin my5s dimetyylisulfaatin, metyylifluorisulfonaa-tin, tolueenisulfonihappometyyliesterin tai trifluorime-5 taanisulfonihappometyyliesterin kanssa saadaan hyviå kemi-luminoivan akridiumyhdisteen saantoja.
Keksinnon mukaisten akridinium-sulfoniamidijohdan-naisten valmistamiseksi lahdetHSn my8s akridiini-9-karbok-syylihappokloridista (VIII). Taman yhdisteen annetaan sit-10 ten reagoida primaarisen tai sekundaarisen sulfoniamidin, ensisijaisesti suojatun kaavan X mukaisen sulfoniamidi-karboksyylihapon H 0 15 R6 - S02 - N - X - C - OZ (X) tai kaavan XI mukaisen suojatun sulfoniamidikarboksyyli-hapon
20 H
R6 - N - S02 - X - COOZ (XI) kanssa, joissa kaavoissa X:lla ja R^:lla on edellH maini-tut merkitykset ja Z on karboksiryhmaa suojaava tahde, 25 joka sen jålkeen lohkaistaan pois. Tata reaktiota vårten suojaryhmana voidaan kåyttåå esimerkiksi N-bentseenisulfo-nyyliglysiinibentsyyliesteriS. Suojaryhman lohkaisemisen jalkeen syntyva happo muutetaan sitten sopivan, esimerkiksi N-hydroksisukkiini-imidin kanssa, tåhteeksi R^. Tastå 30 saadaan kemiluminoivaa akridiniumyhdistetta kirjallisuu-den tuntemin menetelmin alkyloimalla 10-asemassa oleva typpi.
Saadut akridiniumyhdisteet voivat sitten reagoida biologisesti mielenkiintoisen aineen, esim. antigeenin, 35 vasta-aineen, hormonin, laåkeaineen, lMakeainemetaboliit-tien, toksiinin tai alkaloidin kanssa luminoivaksi yhdis- 10 90 542 teeksi. Tålldin akridiniumjohdannainen sitoutuu joko suo-raan tai siltamolekyylin, kuten polylysiinin, polyglutamii-nihapon tai polyvinyyliamiinin vålityksellå biologisesti mielenkiintoiseen aineeseen muodostaen stabiilin, immuno-5 logisesti aktiivisen konjugaatin. Tåtå konjugaattia nimi-tetaan myds merkkiaineeksi ja sitå kåytetåån seuraavassa selostetuissa luminesenssi-immunoanalyyseisså. KeksinnSn mukaista luminesenssi-immunoanalyysiå vårten, antigeenin måårittåmiseksi nestenåytteesså asianmukaisen tai Sandwich-10 menetelmån mukaisesti, tarvitaan ainakin yksi immunologi-sesti aktiivinen komponentti, joka on kiinnittyneena kiin-teaan faasiin ja lisaksi luminoivaa merkkiainetta. Lumi-nesenssi-immunoanalyysi voidaan sitten suorittaa eri ta-voin.
15 Eråana mahdollisuutena on se, etta antigeenin kans- sa spesifisesti reagoivia kiinnitettyja vasta-aineita inku-boidaan tutkittavan nesteen nåytteen ja antigeenin ja ke-miluminoivan akridiniumjohdannaisen (antigeenimerkkiaine) konjugaatin kanssa, nSyte ja sitoutumaton merkkiaine ero-20 tetaan, sitoutunut merkkiaine saatetaan hapetusaineen yh-teyteen valoemission aiheuttamiseksi ja sitten mitatusta valoemission voimakkuudesta maaritetaan låsna olevan antigeenin måårå.
Toisena mahdollisuutena aluminesenssi-immunoanalyy-25 sin suorittamiseksi on se, etta antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa kiinnitettyå vasta-ainetta tutkittavan nesteen nåytteen kanssa inkuboidaan toisen, spesifisesti reagoivan vasta-aineen ja kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin kanssa, nåyte ja sitoutumaton, merkit-30 ty konjugaatti erotetaan, sitoutunut, merkitty konjugaat-ti saatetaan hapetusaineen yhteyteen, valoemission aiheuttamiseksi ja mitatusta valoemission voimakkuudesta mååri-tetåån låsnå olevan antigeenin måårå.
Edellå mainitut luminesenssi-immunoanalyysit voi-35 daan suorittaa my5s siten, ettå tutkittava neste erotetaan t! 11 90542 kiinnittyneestå vasta-aineesta ennen merkityn konjugaatin lisååmistå.
Toisissa keksinnfin mukaisesti suoritettavissa ole-vissa luminesenssi-immunoanalyyseisså kiinnitettyna ei ole 5 vasta-aine, vaan antigeeni.
Siten vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa kiinnitettyå antigeeniå voidaan inkuboida tutkittavan nes-teen nåytteen ja vasta-aineen ja kemiluminoivan akridi-niumjohdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, sitten nåyte 10 ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan ja sen jal-keen sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan yhteen ha-petusaineen kanssa. Talloin tapahtuu valoemissiota, jonka voimakkuudesta voidaan måårittåå låsnå olevan antigeenin måårå.
15 Eras muu muunnelma perustuu siihen, ettå vasta-ai neen kanssa spesifisesti reagoivaa, kiinnitettya antigeeniå inkuboidaan vasta-aineen ja kemiluminoivan akridinium-johdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, reagoitumaton, merkitty konjugaatti erotetaan, lisatåan nåytetta tutkit-20 tavasta nesteestå, sen jålkeen nayte erotetaan uudelleen, sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan yhteen hapetus-aineen kanssa valoemission aiheuttamiseksi ja tasta måa-ritetåan sitten låsna olevan antigeenin måarå.
Lopuksi luminesenssi-immunoanalyysi voidaan suorit-25 taa myds sillå tavalla, ettå vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa kiinnitettyå antigeeniå inkuboidaan vasta-aineen ja kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, lisåtåån nåyte tutkittavasta nes-teestå, nåyte ja sitoutumaton konjugaatti erotetaan, si-30 toutunut, merkitty konjugaatti saatetaan yhteen hapetusai-neen kanssa ja sitten mitatusta valoemissiosta måårite-tåån låsnå olevan antigeenin måårå.
Keksinnbn mukaisten akridiniumyhdisteiden valmis-tus esitetåån esimerkein 1-3.
12 90 542
Esimerkki 1 9-syaaniakridiini (1)
Akridiiniin (10 g), joka on 45 ml:ssa etanolia, lisåtåån 3,3 ml jååetikkaa ja tiputtamalla liuos, jossa on 5 5,25 g kaliumsyanidia 8 ml:ssa vettå, reaktioseosta låm ini tetåån kiehuttaen kaksi tuntia, jååhdytetåån ja haihtu-vat osat imetåån pois vakuumissa. JåånnSstå sekoitetaan 30 ml:n kanssa 2-norm. NaOH, suodatetaan ja kahteen ker-taan 2 norm. NaOH:11a ja vedellå pesemisen jålkeen tuot-10 teen annetaan olla jonkin aikaa kosteana ilmassa. Raaka-tuotetta sekoitetaan metyleeniklorissa, liukenematon aine suodatetaan erilleen ja peståån metyleenikloridilla, yh-distetyt orgaaniset faasit haihdutetaan kuiviin ja raaka syaaniakridiini kiteytetåån uudelleen n-butyyliasetaa-15 tista.
Saanto: 50 %. Sulamispiste: 183 - 5°C.
IR: 2230 cm-1
Akridiini-9-karboksyylihappo (2) 9-syaaniakridiini (5 g) lisåtåån hitaasti annoksit-20 tain 40 ml:aan våkevåå H2SO^ ja seosta låmmitetåån kaksi tuntia 90 - 95°C:ssa; sen jålkeen kun on lisåtty 8,5 g NaN02 sekoitetaan edelleen kaksi tuntia tåsså låmpotilas-sa. Kuuma liuos lisåtåån nopeasti sekoittaen 620 ml:aan ... jååvettå, sakka suodatetaan erilleen ja liuotetaan mahdol- 25 lisimman pieneen mååråån 2-norm. NaOH. Liuos suodatetaan ja tehdåån happameksi 50-%:isella Η2δ0^:1ΐ3, erilleen laskenut akridiini-9-karboksyylihappo suodatetaan eril-leen ja kuivataan vakuumissa.
Saanto: 95 %. Sulamispiste: 288 - 9°C.
·. 30 IR: 3440 (br), 3 200 (br), 2600-2500 (br), 1980; 1650; 1605; 1420 cm"1
Akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridi (3)
Akridiini-9-karboksyylihappo (5 g) lisåtåån annok-sittain 50 ml:aan vastatislattua SOCI2 ja låmmitetåån kie-35 huttaen viisi tuntia; kirkas liuos konsentroidaan tislaa-malla, kunnes aikaa muodostua sakkaa, saostuminen tåyden- i, 13 90542 netaan lisaåmållå sykloheksaania ja jååhdyttamålla. Suo-dattamalla sakka erilleen ja kuivaamalla vakuumissa saa-daan akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridia. Saanto: 90 %. Sulamispiste: 223°C.
5 Alkuaineanalyysi (laskettu yhdisteelle C^^H^CINO x HC1) Laskettu: C 60,5 H 2,8 H 5,0 Cl 25,5 Saatu: C 59,4 H 3,3 N 5,0 Cl 25,2 (Fenyyli-21-karboksyylihappo)akridiini-9-tiokarbok-sylaatti (4) 10 Akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridi (30 g) suspendoidaan 720 ml:aan metyleenikloridia, lisataan tiosalisyylihappoa (17,7 g) ja 50 ml trietyyliamii-nia, sen jalkeen kirkastuvaa liuosta sekoitetaan 10 mi-nuuttia huoneen låmpotilassa. Sen jalkeen kun liuotin on 15 imetty pois, jåånndkseen lisataan 35 g soodaa ja 1 400 ml vetta, saatua liuosta konsentroidaan, kunnes ilmestyy sak-kaa, tama suodatetaan erilleen. Suodos kyllastetåan NaCl:lla ja mydskin talloin alas laskenut sakka suodatetaan erilleen. Yhdistettyjen sakkojen vesiliuos tehdaån 20 80°C:ssa happameksi jaåetikkahapolla, alas laskenut sakka suodatetaan erilleen ja kuivataan vakuumissa.
Saanto: 80 %. Sulamispiste: 261 - 5°C.
NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 7,6-8,4 ppm, kompleksinen multipletti IR: 1680 cm-1 (s), 1720 (m) 1260 (s) 25 21 -(sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli)fenyyliakri-diini-9-tiokarboksylaatti (5)
Suspensioon, jossa on 10 g tioliesterikarboksyyli-happoa 190 ml:ssa kuivaa tetrahydrofuraania, lisataan 30 0°C:ssa 3,2 g N-hydroksisukkiini-imidia, sitten -20°C:ssa 6,9 g disykloheksyylikarbodi-imidia (DCC) ja sen jalkeen sekoitetaan -20°C:ssa kaksi tuntia, sitten yon ajan huoneen lampotilassa. Sen jalkeen kun on lisåtty 0,28 ml jaa-' : etikkaa, sekoitetaan tunnin ajan, sitten lisataan etyyli- 35 asetaattia (25 ml) ja sakka suodatetaan erilleen. Suodos haihdutetaan kuiviin ja klooribentseenistå uudelleen- 14 90 542 kiteyttåmisen jalkeen saadaan vaaleankeltaista 2'-(sukkii-ni-imidoyylioksikarbonyyli)fenyyliakridiini-9-tiokarboksy-laattia.
Saanto: 80 %. Sulamispiste: 198 - 200°C.
5 IR: 1810 cm"1, 1780, 1745, 1225, 1205 NMR (DMSO), 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s, 4H), 7,7-8,4 ppm (m, 12H) 21 -(sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli)fenyyli-10-10 metyyliakridinium-9-tiokarboksylaatti-tetrafluori- boraatti (6) 3 g N-hydroksisukkiini-imidiesteria (5) lanvmitetaan 7,8 g:n kanssa trimetyylioksoniumtetrafluoriboraattia 40 ml:ssa 1,2-dikloorietaania kahdeksan tuntia 80°C:ssa 15 ja sen jalkeen sekoitetaan yon ajan huoneen lampotilassa. Sakka suodatetaan erilleen ja kiehautetaan 1,2-dikloori-etaanin kanssa. Yhdistetyt orgaaniset faasit haihdutetaan kuiviin ja kiteytetaan uudelleen asetoni-di-isopropyyli-eetteriseoksesta.
20 Saanto: 40 %. Sulamispiste: 245°C.
IR: 3440 cm"1 (br), 1800, 1780, 1740(s), 1670, 1065(a) :-. NMR (DMSO, 100 MHz); 5= 3,0 ppm (s, 4H), 4,95 ppm (s, hie- man leventyn.3H), 7,9-8,6 (m, 10H), 9,9 ppm (d, 2H) 25
Esimerkki 2
Sukkiini-imidoyylioksikarbonyylimetyyli-10-metyy-liakridinium-9-tiokarboksylaatti-tetrafluoriboraatin valmistus, lahtemalla happokloridista (3) ja tioglykoli-30 haposta, tapahtuu yhdisteen (6) synteesin mukaisesti. Yk--- sityisten synteesivaiheiden saannot samoin kuin tuotteiden (7) - (9) spektroskooppiset ominaisuudet on esitetty seu-raavassa:
Karboksimetyyliakridiini-9-tiokarboksylaatti (7) ...: 35 Saanto: 60 %. Sulamispiste: 218°C (hajoten) .
is 90542 IR: 3440 cm-1 (br) , 2400(br), 1950(br), 1710(m), 1660(s), 1070(m) NMR (DMSO, 100 MHz): δ= 4,25 ppm (s, 2H); 7,6-8,4 (m, 8H) 5 Sukkiini-imidoyylioksikarbonyylimetyyliakridiini-9- tiokarboksylaatti (8)
Saanto: 80 %.
IR: 3440 cm-1 (br), 2930, 1820, 1785, 1740(a), 1205, 1165 NMR (DMSO, 100 MHz); 6= 2,95 ppm (s, 4H), 4,77 ppm (s, 2H), 10 7,6-8,3 ppm (m, 8H)
Sukkiini-iInidoyylioksikarbonyyl·imetyyli-10-metyyli-akridinium-9-tiokarboksylaatti-tetrafluoriboraat-ti (9) 15 Saanto: 40 %. Sulamispiste: 250°C.
IR: 3440 cm"1 (br) , 1810, 1780, 1735(a), 1538, 1350, 1060 NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,9 ppm (s, 4H), 4,8 (s, 2H), 4,9 ppm, (s, 3H), 7,7-9,0 (m, 8H) 20
Esimerkki 3 N-bentseenisulfonyyli-N-(bentsyylioksikarbonyyli-metyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi (10) 3,3 g:aan N-bentseenisulfonyyliglysiinibentsyyli-25 esteriå, joka on 110 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisataan 130 mg 4-(dimetyyliamino)pyridiinia ja 6 ml trietyyli-amiinia, 10 minuutin kuluttua lisataan 3 g akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridia ja muodostunutta suspensiota låmmitetåan kuusi tuntia kiehuttaen. Sakka 30 suodatetaan erilleen, liuotin imetåan pois, jaannos liuo-tetaan metyleenikloridiin ja sekoitetaan lyhyt aika 2-norm. NaOH:n kanssa. MgSO^tlla kuivaamisen jalkeen orgaaninen faasi haihdutetaan kuiviin ja saatu jaannos kiteytetaan uudelleen tolueeni/heptaaniseoksesta.
35 Saanto: 70 %. Sulamispiste: 58°C.
16 90542 IR: 3440 cm-1 (br), 1735, 1680, 1357, 1165 NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 5,2 ppm (s, 2H), 5,3 ppm (s, 2H), 7,0-8,4 ppm (m, 18H ) 5 N-bentseenisulfonyyli-N-(karboksimetyyli)akridiini- 9-karboksyylihappoamidi (11) I g N-bentseenisulfonyyli-N-(bentsyylioksikarbo-nyylimetyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidia hydrataan 60 ml:ssa jaaetikkaa lisåamalla 2 ml våkevaå HC1 ja Pd/C:ta 10 (10 %) huoneen lampotilassa ja normaalipaineessa; reaktion paatyttya katalyytti suodatetaan pois, suodoksesta saa-daan kuiviin haihduttamalla karboksyylihappoa keltaisena kiinteåna aineena.
NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 5,0 ppm (s, 2H), 7,1-8,5 ppm (m, 1 3H) 15
Yhdisteen (11) annetaan reagoida N-hydroksisukkii-ni-imidin kanssa samalla tavalla kuin valmistettaessa yh-distettå (5), N-bentseenisulfonyyli-N-(sukkiini-imidoyyli-oksikarbonyylimetyyliakridiini-9-karboksyylihappoamidiksi 20 (12). (12) kvaternoidaan (6):n yhteydesså selostetulla ta valla N-bentseenisulfonyyli-N-(sukkiini-imidoyylioksikar-bonyylimetyyli)-10-metyyliakridinium-9-karboksyylihappo-amidi-tetrafluoriboraatiksi (13) .
Esimerkki 4 25 N-fenyyli-N-(4-bentsyylioksikarbonyylibentseeni- sulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi (14) II g:aan 4-(N-fenyylisulfamido)bentsoehappobentsyy-liesteria, joka on 300 ml:ssa metyleenikloridia, lisatåån 360 mg 4-(dimetyyliamino)pyridiiniå ja 16,6 ml trietyyli- 30 amiinia, 10 minuutin kuluttua lisataån 8,34 g akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridia (3) ja låmmite-taan kiehuttaen 16 tuntia. Jaahdytettya liuosta sekoite-taan lyhyen ajan 2-norm. NaOH:n kanssa. erotettu orgaa-“ ninen faasi pestaan vedellå, kuivataan Na2S0^:lla ja haih- 35 dutetaan kuiviin. Jåannos kiteytetaan uudelleen tolueeni/ heptaaniseoksesta.
I: 17 90542
Saanto: 70 %. Sulamispiste: 161 - 163°C.
NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 5,5 ppm (s,2H), 6= 6,8-8,6 ppm (m,22H) N-fenyyli-N-(4-karboksibentseenisulfonyyli)akridii-5 ni-9-karboksyylihappoamidi-hydrobromidi (15) 8,58 g N-fenyyli-N-(4-bentsyylioksikarbonyylibent-seenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidia (14) låmmitetåån 30 ml:ssa 33-%:ista HBr:n jaåetikkaliuosta kak-si tuntia 60°C:ssa, jaahdyttamisen jålkeen siihen lisatåan 10 60 ml di-isopropyylieetteriå, sakka suodatetaan imussa erilleen ja kuivataan vakuumissa.
Saanto: 95 %. Sulamispiste: 255°C.
NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 6,8-9 ppm (m) 15 N-fenyyli-N-(4-sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli- bentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoami-di (16) 5,63 g:aan N-fenyyli-N-(4-karboksibentseenisulfonyyli) akridiini-9-karboksyylihappoamidi-hydrobromidia (15), 20 joka on 250 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisataån 2,8 ml trietyyliamiinia, jååhdytetåån -15°C:seen ja lisataån 0,96 ml kloorimuurahaishappoetyyliesteria. Sekoitetaan 20 minuuttia, lisatåan 1,15 g N-hydroksisukkiini-imidia, sekoitetaan kolme tuntia -15°C:ssa, annetaan låmmetå huo-25 neen låmpotilaan ja sen jålkeen sekoitetaan yon ajan. Sakka suodatetaan pois, suodos haihdutetaan kuiviin, jåån-nQs liuotetaan metyleenikloridiin, saatu liuos peståån vedellå, NaHCO^-liuoksella ja vedellå ja kuivataan Na2S04:lla. Orgaaninen faasi haihdutetaan kuiviin ja 30 jåånnos kiteytetåån uudelleen tolueenista.
Saanto: 50 %. Sulamispiste 226°C (hajoten).
: NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6= 6,8-8,7 ppm (m,17H) 18 90542 N-fenyyli-N-(4-sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli-bentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9-karb-oksyylihappoamidi-fluorisulfonaatti (17) 1,16 g N-fenyyli-N-(4-sukkiini-imidoyylioksikarbo-5 nyylibentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoami-dia (16) sekoitetaan 60 ml:ssa 1,2-dikloorietaania 0,3 ml:n kanssa metyylifluorisulfonaattia 24 tuntia huoneen låmpdtilassa, alas laskeutunut sakka suodatetaan erilleen ja kuivataan vakuumissa.
10 Saanto: 65 %.
IR: 3420 cm"1 (br), 3100(br), 1805(w), 1770(m) 1745(a), 1700(m), 1385(m), 1280(m), 1255(a), 1230(s), 1205(a), NMR(DMS0, 100 MHz): 5= 2,95 ppm (s,4H), 6= 4,75 ppm (s,br, 3H), 6= 7,0-9,0 ppm (m,17H) 15
Massaspektri: m/z = 594 : M+ (kationi)
Esimerkki 5 N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9-20 karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatin (21) valmistus låhtemallS 4-/14- (4 '-metoksifenyyli) sulfamido_/bentsoehappo-bentsyyliesterista ja akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridista (3) tapahtuu yhdisteen (17) synteesin mu-kaisesti (ks. esimerkkia 4). Yksityisten synteesivaiheiden i 25 saannot samoin kuin spektroskooppiset ominaisuudet on esi-tetty seuraavassa.
N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-bentsyylioksikarbonyyli-bentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappo-amidi (18) 30 Saanto: 70 %. Sulamispiste: 182 - 183°C.
: NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6= 5,5 ppm (a,2H), 6= 6,35-6,63 ppm (d,br,2H), 6= 7,05-7,2 ppm (d,br,2H), 6= 7,35-3,5 ppm (m,17H) ti 19 90542 N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-karboksibentseenisulfo-nyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi-hydrobro-midi (19)
Saanto: 95 %. Sulamispiste: 273°C (hajoten).
5 NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6= 6,4-6,6 ppm (d,br, 2H), δ= 7,05-7,2 ppm (d,br,2H), 6 = 7,7-8,5 ppm (m,12H) N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)akridiini-9-karbok-10 syylihappoamidi (20)
Saanto: 50 %. Sulamispiste: 232 - 234°C.
NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6 = 3,5 ppm (s,3H), 6= 6,4-6,6 ppm (d,br,2H), 6*7,05-7,25 ppm (d,br,2H), 6= 7,8-8,6 ppm (m,12H) IR: 3050 cm-1 1305(w), 1730(m), 15 1740(b), 1700(m), 1505(m), 1370(m), 1250(a), 1200(b), 1185 N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridi-20 nium-9-karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatti (21)
Aine ei saostu erilleen reaktion aikana, se saadaan talteen haihduttamalla liuos kuiviin ja sekoittamalla jaånnosta di-isopropyylieetterin kanssa.
.*·. Saanto: 80 %.
. .·. 25 NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), δ= 3,5 ppm (s,3H), : 6= 4,8 ppm (s,br,3H), 6= 6,45-6,7 ppm (d,br,2H), 6= 7,2-7,4 ppm (d,br,2H), 6= 7,7-9 ppm (m,12H)
Massaspektri: m/z = 624 M+ (kationi) 30 IR; 3440 cm"1 (br), 3100, 2950, 1805(w), 1775(m), 1740(b), 1695(m), 161 0(m), 1505(m), 1375(m), 1280(m), 1250(b), 1205(b).
Esimerkki 6 35 N-(4-metoksifenyyli)-N-(3-sukkiini-imidoyylioksi- karbonyyli-bentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9- 20 90 5 42 karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatin (25) valmistus låhtemallå 3-/N-(4'-metoksifenyyli)sulfamidojbentsoehappo-bentsyyliesteristå ja akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridista (3) tapahtuu yhdisteen (17) synteesin mu-5 kaisesti (ks. esimerkkiå 4). Yksityisten synteesivaiheiden saanto samoin kuin spektroskooppiset ominaisuudet on esi-tetty seuraavassa.
N- (4-metoksifenyyli)-N-(3-bentsyylioksikarbonyyli-bentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappo-10 amidi (22)
Saanto: 70 %. Sulamispiste 168 - 170°C.
NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6 = 5.45 ppm (s,2H), 6= 6,5 ppm (s,br,2H), 6= 7,1 ppm (br,2H), 6= 7,3-3,8 ppm (m,17H ) 15 N- (4-metoksifenyyli)-N-(3-karboksibentseenisulfo-nyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi-hydrobro-midi (23)
Saanto: 90 %. Sulamispiste: 264 C.
20 NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6= 6.4-6,6 ppm (d,br,2H), 6= 7,0-7,2 ppm (d,br,2H), 6= 7,6-8,8 ppm (m,12H) N-(4-metoksifenyyli)-N-(3-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)akridiini-9-karbok-25 syylihappoamidi (24)
Saanto: 50 %. Sulamispiste: 223 - 225°C.
NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (a,4H), 6= 3,5 ppm (s,3H), 5=6,4-6,6 ppm (d,br,2H), 6= 7,0-7,2 ppm (d,br,2H), 6= 7,4- 8,9 ppm (m,12H) 30 ir. 3500 cm"1 (br), 3060, 2950, 2840, 1805(w), 1785(m), 1740(a), 1700(m), 1510(m), 1380(m), 1250(m), 1205(m), 1165(m) 2i 90 542 N- (4-metoksifenyyli) -N- (3-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridi-nium-9-karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatti (25) Saanto: 90 %.
5 NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6= 3,55 ppm (s,3H), 6= 4,8 ppm (s,br,3H), 6 = 6,45-6,7 (d,br,2H), δ= 7,05-7,3 ppm (d,br,2H), 6= 7,5-8,9 ppm (m,12H) IR: 3500 cm"1 (br), 3080, 2950, 1805(w), 1780(m), 1740(s),35 1700(m), 1610(m), 1510(m), 1380(m), 1250(s), 1205(s), 1170(s) 10
Esimerkki 7
Merkkiaineen valmistus x-fetoproteiini-kemilumine-senssi-immunoanalyysia vårten 100 ^,ul vasta-ainetta (1 mg/ml), 11,5 ^ul esimer-15 kin 1 mukaisesti valmistettua akridiniumtioesteriå (yh-diste 6) (1 mg/ml DMGO:ssa) ja 600 ^ul konjugaatiopusku- ria (0,01-mol. fosfaattia, pH 8,0) inkuboidaan 15 minuut-tia. Sen jalkeen lisåtåån 200 ^ul lysiinia (10 mg/ml) ja inkuboidaan edelleen 15 minuuttia. Tama era siirretaan 20 PD-10-pylvååseen (Sephadex G 25 Medium, 0,1-mol. fosfaattia, pH 6,3, liuottimena). Kootaan 10 pisaran fraktioita. Yksityisista fraktioista testataan sopivan laimennuksen :jSlkeen niiden kemiluminesenssiaktiivisuus (350 ^ul hape-. tinta: 0,1 % Η£θ2^3 0,1-nomr. NaOHrssa). Merkkiainefrak- . .·. 25 tiot (1. aktiivisuuspiikki) yhdistetaan ja varastoidaan 4°C:ssa.
Esimerkki 8 . o^-fetoproteiinin kemiluminesenssi-immunoanalyysin suorittaminen 30 50 ^ul standardi/naytettå ja 150 ^ul puskuria (fos- : faatti? 0,1-mol., pH 6,3, 1 % Tween 20, 0,1 % naudanseeru- ; mialbumiinia, 0,1-mol. NaCl, 0,01 % NaN^) ravistellaan 15 minuuttia monoklonaalisella anti-AFF-vasta-aineella pin-noitetuissa pienisså putkissa. Sen jalkeen pestaan kaksi 35 kertaa 1 ml :11a puskuria.
22 90542
Sopivana laimennuksena lisåtåån 200 ^ul merkkiai-netta ja ravistellaanl5 minuuttia. Peståån uudelleen kak-si kertaa 1 ml :11a puskuria. Kemiluminointimittaus aloite-taan 350 ^ul:lla hapetinta (0,1 % H2°2 0»l-norm· NaOH:ssa, 5 kahden sekunnin mittausaika).
Kuvio 3 esittåå tyypillistå immuuni-kemiluminomet-risen analyysin (ICMA) standardikåyrån kulkua oi-fetopro-teiinin (AFP) osalta.
t:
Claims (15)
1. Kaavan (I) mukainen, kemiluminoiva akridinium-johdannainen 5 R1 iT T i A® (i) io y 0=C-R4 jossa R1 on vety tai 1-10 hiiliatomia sisaltåva alkyy-15 liryhmé, R4 on kaavan (V) mukainen substituoitu sulfonamid i ryhmM ,X-R5 -Νγ (V) 20 ^v"S02-R6 tai kaavan (VI) mukainen substituoitu sulfonamidiryhmå 25 -N ^ (VI) ^so2-x-r5 tai kaavan (II) mukainen tioalkyyli- tai tioaryyliryhma
30 -S - X - R5 (II ) jolloin X on haaroittunut tai suora C^-Cj-alkyleeniryhma tai orto-, meta- tai parafenyleeniryhma, R5 on kaavan III mukainen ryhma 24 ? ' 5 4 2
0 V-] II 7 -C-O-N (III) 5 R6 on fenyyliryhma, joka voi olla substituoitu 1-4 hii-liatomia sisåltavalia alkoksilla, ja fP on anioni, jolla ei ole haitallista vaikutusta kemiluminointiin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen akridiniumjoh-10 dannainen, tunnettu siita, etta X on metyleeni-, etyleeni-, propyleeni- tai orto-, meta- tai para-fenylee-niryhmå.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen akridiniumjoh-dannainen, tunnettu siita, etta silia on kaava IV
15 CH, r^rr”V^ I A© 20. o V-, <iv) ^ \ II /
0 S-X-C-O-N o jossa A:lla ja X:lia on patenttivaatimuksessa 1 kuvatut 25 merkitykset.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen akridiniumjoh-dannainen, tunnettu siita, etta silia on kaava Vil ch3 UyU αθ y\ ? }-] ,vin
35. N-X-c-O-N \ ^ S02\3 25 9Γ: S42 jossa A:11a ja X:llå on patenttivaatimuksessa 1 kuvatut merkitykset.
5. Menetelmå patenttivaatimuksen 1 mukaisten akri-diniumjohdannaisten valmistamiseksi, tunnettu 5 siitå, etta kaavan VIII mukaisen akridiiniyhdisteen ^ ^ (VIII) 10
0 Y jossa Y merkitsee halogeenia, oksikarbonyyli-C^j-alkyy- li-, oksikarbonyyliaryyli- tai imidatsolidiryhmaa, anne-15 taan ensin reagoida primaarisen tai sekundaarisen sulfon-amidin tai kaavan IX mukaisen tiolikarboksyylihapon kans-sa, HS - X - COOH (IX) 20 jossa kaavassa X:lia on patenttivaatimuksessa 1 kuvatut merkitykset, ja sitten saatu happo muutetaan ryhman R5 sisåltavåksi, halutuksi akridiinijohdannaiseksi, jonka akridiinirungon typpiatomi sen jålkeen vielå kvaternoi-25 daan.
6. Menetelmå patenttivaatimuksen 1 mukaisten, kaa van (V) mukaisia substituoituja sulfonamidiryhmiå sisål-tåvien yhdisteiden valmistamiseksi, tunnettu sii- tå, ettå kaavan VIII mukaisen yhdisteen annetaan reagoida 30 suojatun sulfonamidi-karboksyylihapon kanssa, jolla on kaava X H 0 6 1 1' R - S02 -N-X-C-OZ (X) tai kaava XI 35
26 S:r' 5 42 Η 6 * R - N - S02 - X - COOZ (XI) 5 joissa X:11S ja R6:lla on patenttivaatimuksessa 4 kuvatut merkitykset ja Z on karboksiryhnrån suojaryhmå, joka loh-kaistaan sen jalkeen pois, ja tailbin muodostunut happo muutetaan ryhmån R5 sisSltåvåksi halutuksi akridiniumjoh-dannaiseksi, jonka akridiinirungon typpiatomi sitten vie- 10 18 kvaternoidaan.
7. Luminoiva yhdiste, tunnettu siita, et-ta patenttivaatlmuksen 1 mukainen akridiniumjohdannainen on immobilisoitu suoraan tai siltamolekyylin vålityksellå proteiiniin, polypeptidiin tai muuhun biologiseen ainee- 15 seen muodostaen stabiilin, immunologisesti aktiivisen konjugaatin.
8. Luminesenssi-immunoanalyysi antigeenisen aineen maarittamiseksi nestenaytteessa, jonka yhteydessa kompe-titiivisessa tai Sandwich-menetelmassa ainakin yksi immu- 20 nologisesti aktiivinen komponentti on immobilisoitu kiin- teaan faasiin ja ainakin yksi muu komponentti, merkkiai-ne, merkitsee patenttivaatimuksen 7 mukaista luminoivaa yhdistetta.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim- 25 munoanalyysi, tunnettu siita, etta a) antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa, immo-bilisoitua vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavan nesteen naytteen ja antigeenin ja patenttivaatimuksen 1 mukai-sen, kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin 30 kanssa; b) nayte ja sitoutumaton, merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kos-ketukseen hapettimen kanssa, valoemission aiheuttamiseksi 35 ja (i 27 9.1542 d) mitatusta valoemission voimakkuudesta måårite-tåån låsna olevan antigeenin måårå.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitå, ettå ennen mer- 5 kityn konjugaatin lisååmistå tutkittava neste erotetaan immobilisoidusta vasta-aineesta.
11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitå, ettå a) antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa immo-10 bilisoitua vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavan nesteen nåytteen ja toisen, spesifisesti reagoivan vasta-aineen ja patenttivaatimuksen 1 mukaisen, kemiluminoivan akridi-niumjohdannaisen konjugaatin kanssa; b) nåyte ja sitoutumaton, merkitty konjugaatti 15 erotetaan; c) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kos-ketukseen hapettimen kanssa, valoemission aiheuttamiseksi ja d) mitatusta valoemission voimakkuudesta måårite-20 tåån låsnå olevan antigeenin måårå.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitå, ettå ennen merki-tyn konjugaatin lisåystå tutkittava neste erotetaan immobilisoidusta vasta-aineesta.
13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi- immunoanalyysi, tunnettu siitå, ettå a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa, im-mobilisoitua antigeeniå inkuboidaan tutkittavan nesteen nåytteen ja vasta-aineen ja patenttivaatimuksen 1 mukai- 30 sen, kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa; b) nåyte ja sitoutumaton, merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kos- 35 ketukseen hapettimen kanssa, valoemission aiheuttamiseksi Ja o n: c ,ι o 28 - > t £- d) mitatusta valoemission voimakkuudesta måårite-tåån låsnå olevan antigeenin måårå.
14. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitå, ettå 5 a) vasta-alneen kanssa spesifisestl reagoivaa, im- mobilisoitua antigeenia inkuboidaan vasta-aineen ja patenttivaatimuksen 1 mukalsen, kemiluminoivan akridinium-johdannaisen konjugaatin lluoksen kanssa, b) reagoimaton, merkitty konjugaatti erotetaan, 10 c) lisataan tutklttavan nesteen nåyte, d) sen jaikeen nayte erotetaan jalleen, e) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kos-ketukseen hapettimen kanssa valoemission aiheuttamiseksi ja 15 f) mitatusta valoemission voimakkuudesta måårite- taan låsnå olevan antigeenin måarå.
15. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitå, ettå a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa, im-20 mobilisoitua antigeenia inkuboidaan vasta-aineen ja patenttivaatimuksen 1 mukaisen, kemiluminoivan akridinium-johdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, b) lisåtåån tutkittavan nesteen nåyte, c) nåyte ja sitoutumaton konjugaatti erotetaan, 25 d) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kos- ketukseen hapettimen kanssa valoemission aiheuttamiseksi ja e) mitatusta valoemission voimakkuudesta måårite-tåån låsnå olevan antigeenin måårå. ti 29 >·. 5 42
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3628573 | 1986-08-22 | ||
| DE3628573A DE3628573C2 (de) | 1986-08-22 | 1986-08-22 | Chemilumineszierende Acridinderivate, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung in Lumineszenzimmunoassays |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI873609A0 FI873609A0 (fi) | 1987-08-20 |
| FI873609A FI873609A (fi) | 1988-02-23 |
| FI90542B FI90542B (fi) | 1993-11-15 |
| FI90542C true FI90542C (fi) | 1994-02-25 |
Family
ID=6307971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI873609A FI90542C (fi) | 1986-08-22 | 1987-08-20 | Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0647628B1 (fi) |
| JP (2) | JPH0699401B2 (fi) |
| AT (2) | ATE132490T1 (fi) |
| CA (1) | CA1341402C (fi) |
| DE (4) | DE3645292C2 (fi) |
| DK (1) | DK171437B1 (fi) |
| ES (2) | ES2182835T3 (fi) |
| FI (1) | FI90542C (fi) |
| GR (1) | GR3019470T3 (fi) |
| IE (1) | IE74678B1 (fi) |
| NO (1) | NO171725C (fi) |
| PT (1) | PT85563B (fi) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0082636B2 (en) * | 1981-12-11 | 2006-10-18 | The Welsh National School of Medicine | Luminescent labelling materials and procedures |
| US4745181A (en) * | 1986-10-06 | 1988-05-17 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Polysubstituted aryl acridinium esters |
| ATE111083T1 (de) * | 1986-10-22 | 1994-09-15 | Abbott Lab | Chemilumineszierende acridinium- und phenantridiniumsalze. |
| FR2625565A1 (fr) * | 1987-12-31 | 1989-07-07 | London Diagnostics Inc | Esters, thioesters et amides chimioluminescents perfectionnes, et analyses les utilisant |
| NZ227506A (en) * | 1987-12-31 | 1992-06-25 | London Diagnostics Inc | Specific binding assays using chemiluminescent compounds |
| DE3844954C2 (de) * | 1988-02-20 | 1998-07-16 | Hoechst Ag | Spezielle chemilumineszierende Acridinderivate und ihre Verwendung in Lumineszenzimmunoassays |
| US6002007A (en) * | 1988-02-20 | 1999-12-14 | Dade Behring Marburg Gmbh | Special chemiluminescent acridine derivatives and the use thereof in luminescence immunoassays |
| US4950613A (en) * | 1988-02-26 | 1990-08-21 | Gen-Probe Incorporated | Proteted chemiluminescent labels |
| US5227489A (en) * | 1988-08-01 | 1993-07-13 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Stable hydrophilic acridinium esters suitable for liposome encapsulation |
| AU634716B2 (en) * | 1988-08-01 | 1993-03-04 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Method for detection of an analyte using acridinium esters and liposomes |
| US5241070A (en) * | 1988-09-26 | 1993-08-31 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium esters and uses thereof |
| US5663074A (en) * | 1988-09-26 | 1997-09-02 | Chiron Diagnostics Corporation | Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium ester conjugates and syntheses thereof |
| WO1992009580A1 (en) * | 1990-11-21 | 1992-06-11 | Beckman Instruments, Inc. | Chemiluminescent compounds |
| DE4041080A1 (de) | 1990-12-21 | 1992-06-25 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung eines analyten |
| DE4228839A1 (de) | 1992-08-29 | 1994-03-03 | Behringwerke Ag | Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren |
| US5491072A (en) * | 1993-05-17 | 1996-02-13 | Lumigen, Inc. | N-alkylacridan carboxyl derivatives useful for chemiluminescent detection |
| BE1008216A4 (fr) * | 1994-01-25 | 1996-02-20 | Biocode Sa | Derives chemoluminescents heterocycliques. |
| US6010868A (en) * | 1994-06-24 | 2000-01-04 | Behring Diagnostics Gmbh | Method for stabilizing hydrolysis-sensitive molecules or molecular moieties |
| EP0774121A1 (en) * | 1994-07-15 | 1997-05-21 | Abbott Laboratories | Chemiluminescent signal enhancement |
| WO1996027785A1 (en) * | 1995-03-03 | 1996-09-12 | Abbott Laboratories | Article and method for conducting chemiluminescent reaction |
| US5731148A (en) * | 1995-06-07 | 1998-03-24 | Gen-Probe Incorporated | Adduct protection assay |
| EP0761652A1 (en) * | 1995-08-01 | 1997-03-12 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Acridinium compound having a plurality of luminescent groups and binding groups, and conjugate thereof |
| KR100259761B1 (ko) * | 1996-03-15 | 2000-07-01 | 타이도 나오카타 | 에스에이치기 표지용시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법 |
| CA2261032C (en) * | 1996-07-16 | 2003-11-25 | De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur | Dibenzodihydropyridinecarboxylic esters and their use in chemiluminescent assay methods |
| BE1011206A4 (fr) * | 1997-06-11 | 1999-06-01 | Biocode Sa | Derives chimioluminescents heterocycliques. |
| EP1496050A1 (en) | 2003-07-08 | 2005-01-12 | Roche Diagnostics GmbH | Novel chemiluminescent compounds and their use |
| ATE471513T1 (de) | 2003-07-30 | 2010-07-15 | Hoffmann La Roche | Neue chemilumineszenzverbindungen und ihre verwendung |
| EP1658495A1 (en) | 2003-07-30 | 2006-05-24 | Roche Diagnostics GmbH | Novel chemiluminescent compounds and their use |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1461877A (en) * | 1974-02-12 | 1977-01-19 | Wellcome Found | Assay method utilizing chemiluminescence |
| GB2008247B (en) * | 1977-11-17 | 1982-12-15 | Welsh Nat School Med | Detecting or quantifying substances using labelling techniques |
| EP0082636B2 (en) * | 1981-12-11 | 2006-10-18 | The Welsh National School of Medicine | Luminescent labelling materials and procedures |
-
1986
- 1986-08-22 DE DE3645292A patent/DE3645292C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-22 DE DE3628573A patent/DE3628573C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-08-19 EP EP94119395A patent/EP0647628B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 AT AT87112022T patent/ATE132490T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-08-19 EP EP87112022A patent/EP0257541B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 DE DE3751659T patent/DE3751659D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 ES ES94119395T patent/ES2182835T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 DE DE3752357T patent/DE3752357D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 AT AT94119395T patent/ATE223903T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-08-19 ES ES87112022T patent/ES2083949T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-20 FI FI873609A patent/FI90542C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-08-20 PT PT85563A patent/PT85563B/pt unknown
- 1987-08-20 NO NO873520A patent/NO171725C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-08-21 JP JP62206622A patent/JPH0699401B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-21 CA CA000545036A patent/CA1341402C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-21 DK DK437187A patent/DK171437B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-08-21 IE IE224587A patent/IE74678B1/en not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-06-14 JP JP6131617A patent/JP2766780B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-29 GR GR960400849T patent/GR3019470T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0699401B2 (ja) | 1994-12-07 |
| PT85563A (de) | 1987-09-01 |
| JP2766780B2 (ja) | 1998-06-18 |
| ES2083949T3 (es) | 1996-05-01 |
| FI873609A (fi) | 1988-02-23 |
| DK171437B1 (da) | 1996-10-28 |
| DE3628573C2 (de) | 1994-10-13 |
| DE3751659D1 (de) | 1996-02-15 |
| EP0257541A2 (de) | 1988-03-02 |
| ATE223903T1 (de) | 2002-09-15 |
| DE3752357D1 (de) | 2002-10-17 |
| NO873520D0 (no) | 1987-08-20 |
| DE3628573A1 (de) | 1988-02-25 |
| NO171725C (no) | 1993-04-28 |
| NO171725B (no) | 1993-01-18 |
| PT85563B (pt) | 1990-05-31 |
| GR3019470T3 (en) | 1996-06-30 |
| EP0257541A3 (en) | 1988-11-30 |
| IE960911L (en) | 1988-02-22 |
| DE3645292C2 (de) | 1997-12-11 |
| CA1341402C (en) | 2002-11-26 |
| FI873609A0 (fi) | 1987-08-20 |
| JPH07179428A (ja) | 1995-07-18 |
| JPS6357572A (ja) | 1988-03-12 |
| ES2182835T3 (es) | 2003-03-16 |
| EP0257541B1 (de) | 1996-01-03 |
| EP0647628B1 (de) | 2002-09-11 |
| ATE132490T1 (de) | 1996-01-15 |
| DK437187A (da) | 1988-02-23 |
| DK437187D0 (da) | 1987-08-21 |
| FI90542B (fi) | 1993-11-15 |
| IE74678B1 (en) | 1997-07-30 |
| EP0647628A1 (de) | 1995-04-12 |
| IE872245L (en) | 1988-02-22 |
| NO873520L (no) | 1988-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI90542C (fi) | Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä | |
| US5532171A (en) | Phenothiazine derivatives, their production and use | |
| US5545739A (en) | Chemiluminescent phenanthridinium salts | |
| EP1928822A1 (en) | Violet laser excitable dyes and their method of use | |
| US4687747A (en) | Phenanthridinium ester as a labelling compound in luminometric immunoassay | |
| DK175493B1 (da) | Særlige kemoluminiscerende acridiniumderivater og deres anvendelse til luminiscensimmunassay | |
| US5066426A (en) | Fluorescence polarization immunoassay utilizing substituted carboxyfluoresceins | |
| US4952691A (en) | Fluorescence polarization immunoassay | |
| US6002007A (en) | Special chemiluminescent acridine derivatives and the use thereof in luminescence immunoassays | |
| JP3248628B2 (ja) | 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法 | |
| JP2526359B2 (ja) | ノルトリプチリン測定方法および測定用試薬抗体 | |
| JP3325370B2 (ja) | 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法 | |
| DK173875B1 (da) | Luminescerende forbindelse og luminescensimmunanalyse, hvor den anvendes | |
| DK173972B1 (da) | Luminescensforbindelse indeholdende kemoluminescerende acridiniumderivat samt luminescensimmunbestemmelse ved anvendelse af forbindelsen | |
| DE3805318C2 (de) | Spezielle chemilumineszierende Acridinderivate und ihre Verwendung in Lumineszenzimmunoassays | |
| IE83772B1 (en) | Acridinium derivatives and their use in luminescence immunoassays | |
| IE19960911A1 (en) | Acridinium derivatives and their use in luminescence immunoassays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: DADE BEHRING MARBURG GMBH |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: DADE BEHRING MARBURG GMBH |
|
| MA | Patent expired |