DK175493B1 - Særlige kemoluminiscerende acridiniumderivater og deres anvendelse til luminiscensimmunassay - Google Patents

Description

I DK 175493 B1 I

I I

I Den foreliggende opfindelse angår kemolumine&dé'rende I

I acridiniumderivater, fremgangsmåder til fremstilling deraf I

I og deres anvendelse til luminescensimmunassays. I

I Luminescerende forbindelser har allerede en alsidig I

I 5 anvendelse. De anvendes som indikatorer ved bioanalyser, I

I enzymimmunbestemmelser og luminescensimmunbestemmelser, I

I jvf. W.P. Collins "Alternative Immunoassays", Verlag John “ I

I Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985, men anvendes også til I

I nucleinsyre-hybridiseringsanalyser, jvf. J.A. Matthews et I

I 10 al. "Analytical Biochemistry", 151, 205-209, 1985. Desuden I

I anvendes kemoluminescerende forbindelser ved "flow injection I

I analysis", i post-søjledetektorer i væskechromatografi, ved I

I forskning vedrørende strømningsforhold og i artificielle I

I lyskilder. I

I 15 I forbindelse med kemoluminescensimmunbestemmelserne I

I har især to strukturtyper af kemoluminescerende mærkestoffer I

I fået en større betydning. Det drejer sig herved på den ene ' I

I side om luminol- eller isoluminolderivateme, som er be- I

I skrevet i H.R. Schroeder et al., "Methods in Enzymology", I

I 20 Academic Press Inc., New York, bd. LVII, 1978, 424 ff, samt I

I i GB 2.008.247 og 2.041.920, DE 2.618.419 og 2.618.511, I

I samt i EP-ansøgning 135.071. Et overblik over den praktiske I

I anvendelse af isoluminolforbindelserne som luminescensindi- I

I katorer findes hos W.G. Wood, J. Clin. Biochem. 22, 1984, I

I 25 905-918. I

I På den anden side har acridiniumesterforbindelser I

I ligeledes fundet anvendelse som kemoluminescerende mærke- I

I stoffer. Sådanne acridiniumestre er kendt fra US 3.352.791, · I

I GB 1.316.363 og 1.461.877 samt fra EP-ansøgning 82.636. I

I 30 Tilvendelsen af acridiniumestrene som mærkestoffer til immun- I

I bestemmelser er beskrevet hos Weeks et al., Clin. Chem. I

I 29/8 (1983), 1474-1479. Ligeledes er anvendelsen af phenan- I

I thridiniumestre som mærkestof til luminescensimmunbestemmel- I

I ser allerede kendt fra EP ansøgning 170.415,. I

I 35 Kemoluminescensen af acridiniumestere kan startes I

I ved tilsætning af basisk Η202-opløsning. Vedrørende mekanis- I

I I

2 DK 175493 B1 men for kemoluminescens har F. McCapra, Acc. Chem. Res. 9, 201, 1976 givet en overbevisende forklaring. I den sarrenenhæng er afgangsgruppens art både for lyskvanteudbyttet og for den hydrolytiske stabilitet tydeligvis afgørende.

5 De hidtil anerkendte acridiniumestre har i forhold til luminol- og isoluminolforbindelserne den fordel, at de giver et højere lyskvanteudbytte, som heller ikke nedsættes gennem de til indikatoren bundne proteiner, jvf. Weeks et al., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1474-1479.

10 Selv om de fra EP ansøgning 82.636 kendte acridinium- phenylestre ved stimulering af kemoluminescens ved milde oxidationsmidler udmærker sig ved en høj analysefølsomhed, har de til praktisk anvendelse forstyrrende ulemper. Frem for alt er phenylesterbindingen i vandige systemer allerede 15 ved stuetemperatur særdeles labil. Hertil kommer, at acridi-niumphenylestrene har en lysemission under de der angivne oxidationsbetingelser, som først efter ca. 10 sekunders forløb i vid udstrækning, dvs. for over 95%'s vedkommende, er klinget af. I sammenligning med det fås der ved andre 20 ikke-isotopiske analysemetoder langt kortere måletider, og derved muliggøres en større prøve-kapacitet.

Man har allerede foreslået anvendelse af kemolumines-cerende acridiniumderivater, som i forbindelse med højt lyskvanteudbytte har en hurtigere reaktionskinetik og derved 25 muliggør korte måletider for en luminescensimmunbestemmelse, jvf. DE P 36 28 573.0. Det drejer sig herved om acridiniumderivater med formlen A θ

R Αθ D

O = C R

hvori rA er hydrogen, en alkyl-, alkenyl- eller alkynylgruppe 35 med 1-10 C-atomer, en benzyl- eller arylgruppe, R® og R*- er hydrogen, en alkylgruppe med 1-4 C-atomer, en substitueret

I DK 175493 B1 I

I 3 I

I eller usubstitueret aminogruppe, en carboxy-, alkoxy-, I

I cyano-, nitrogruppe eller halogen, R^ er en gruppe, hvori I

I en sulfonamidgruppe er direkte bundet til carbonylgruppen I

I via nitrogenatomet, eller en thioalkyl- eller thioarylgruppe I

I 5 med formlen I

I - s - y - re I

I idet Y er en forgrenet eller uforgrenet, aliphatisk eller I

I en aromatisk gruppe, som ligeledes kan indeholde heteroato- , I

I 10 mer, RE er en reaktiv gruppe, som selektivt kan indgå en I

I binding med amino-, carboxy-, thipl- eller andre funktionelle I

I grupper i stoffer af biologisk interesse under skånende I

I betingelser, og A® er en anion, som ikke hæmmer kemolumine- I

I scensen. I

I 15 Det har nu vist sig, at specielle acridiniumderiva- I

I ter er særligt egnede til anvendelse som kemoluminescerende I

I forbindelser på grund af deres fremragende stabilitet og I

I deres uventet høje analysefølsomhed. I

I Opfindelsen angår følgelig kemoluminescerende acridi- I

I 20 niumderivater med formlen I

I n* A' I

rCCO~rs (-> I

I 0=0-1¾ I

I hvori R]_, R2, R3, R4 og A® har følgende betydninger: I

I R]_: hydrogen I

I 30 en alkyl-, alkenyl- eller alkynylgruppe I

I med højst 10 carbonatomer I

I en benzyl- eller arylgruppe; I

I R2 og R3: hydrogen I

I 35 en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer I

I en substitueret eller usubstitueret aminogruppe I

4 DK 175493 B1 en carboxy-, alkoxy-, cyano- eller nitrogruppe eller halogen;

R4: en gruppe med formlen II eller III

5 Λ

—N

S02—X—1¾ (") 10 X-Rs (III) S02—Fts 15 R5: en reaktiv gruppe, som under skånsomme betingelser selektivt kan indgå en binding med amino-, carboxy-, thiol-eller andre funktionelle grupper i stoffer af biologisk interesse; 20

Rg: en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer eller en phenylgruppe, der kan være susbt i tueret med højst 3 alkyl- eller alkoxygrupper med hver især 1-4 carbonatomer 25 med en -(-0-CH2-CH2-)n-OR gruppe, hvor n er 0 til 8, og R er en morpholinoethyl- eller en N,N-di-methylaminoethyl- eller en alkoxygruppe med 1-4 carbonatomer, eller med en ethylen- 30 dioxygruppe; og X: en arylgruppe, som er bundet direkte eller over en alkylen-eller oxyalkylengruppe til nitrogen- eller 35 svovlatomet, og er bundet over en alkylen- eller oxy-

I DK 175493 B1 I

i 5 I

I alkylengruppe til gruppen R5, og I

I som også kan være substitueret en eller I

I flere gange med alkyl-, alkenyl-, hydroxy-, I

I amino-, alkoxy- eller aryloxygrupper og/- I

I 5 eller heteroatomer eller I

I betyder en aromatisk naturlig aminosyrerest I

I eller I

I er en phenylengruppe - når R6 er en phenylgrup- I

I pe - som er substitueret én eller flere gange I

I 10 med alkylgrupper med 1-6 carbonatomer og I

I A": en anion, som ikke forringer kemiluminescensen. I

I Ved stofferne af biologisk interesse skal man først I

I og fremmest forstå antigener. Hormoner, steroider, laegemid- I

I 15 ler, lægemiddelmetaboliter, toxiner, alkaloider og ligeledes I

I antistoffer falder eksempelvis ind under dette begreb. I

I Som aminosyrer kan anvendes I

I _l_ I I _|_ I

I 20 i _i~ "Γ L I

ν'1! i®! I

0 1> CO

I 25 H I

I Phenylalanin(Phe) Tyrosin(Tyr)Histidin(His) Tryptophan(Try) I

I Den anion, som ikke hæmmer kemoluminescensen, kan I

I eksempelvis være en tetrafluorborat-, perchlorat-, haloge- I

I nid-, alkylsulfat-, halogensulfonat-, alkylsulfonat- eller I

I 30 arylsulfonat-anion. Man kan ligeledes anvende enhver anden I

I anion, såfremt den ikke ophæver eller svækker kemolumine- I

I scensen. I

I Heteroalkylgrupperne eller de heteocycliske grupper I

I indeholder fortrinsvis heteroatomer, som kan bidrage til en I

I 35 øgning af de her omhandlede forbindelsers vandopløselighed, I

I såsom nitrogen, oxygen, svovl, phosphor, eller kombinationer I

6 DK 175493 B1 ! deraf. Særligt egnede heterocycliske forbindelser er eksempelvis morpholin, piperazin, piperidin, tetrahydrofuran og dioxaner.

Særlig betydning har acridiniumderivater ifølge krav 5 I, og disse derivater er ejendommelige ved, at X er en gruppe med formlen i’»’ H11 hvori R7 er en substituent med formlen -(CH2)n- eller ((CH2)m-0)n-# idet n er 0-4 og m er 1-6, 15 R8 er en substituent i ortho-, meta- eller parastilling til R7 med formlen -{CH2)p-, en polyalkylenoxid-gruppe med formlen -{0-(CH2)m-)p eller -((CH2)m-0-)p, fortrinsvis idet p = 1-6 og m = 1-6, eller er en forgrenet eller uforgrenet car-bonhy dr idgruppe med 1-4 C-atomer, og substituenterne R^-R1! 20 er hydrogen eller ligekædede eller forgrenede carbonhydrid- , grupper med op til 30 C-atomer, idet en eller flere -CH2- | enheder ligeledes kan være erstattet med 0, S, SO, S02, NH eller N-alkyl, og to af disse substituenter kan være forbun- , det til dannelse af en ring.

25 Substituenten R5 er af.særlig betydning for anven delsesmulighederne af de her omhandlede acridiniumderivater.

Ved det egnede valg af denne gruppe får acridiniumderivatet en så høj reaktivitet, at den allerede under milde betingelser selektivt kan indgå en binding med en funktionel gruppe 30 af den biologiske substans, der skal påvises. Egnede reaktive grupper kan ses af den følgende sammenstilling: 35

I DK 175493 B1 I

I 7 I

lo I

I ? I

I c a) -C - O - N

P I

I o .

I o M ( + ) I

I o ; y I

i nr 3

I b) -C - O - N I

I 10 cr Yi+)= H(+), alkalimetalI

I 5 °>ιΛ I

I c) -C - O - N

i

I d) -SO - CH = CH I

I 2 2 I

I 20 I

I (+) I

I e) -SO^-CH^-CH^-N^"^ Halogenid> I

I f) -N = C = S I

I 25 I

I 3 0 I 1

35 I

8 DK 175493 B1 «, ‘0'N3 < + ) (-) NH Halogenid h) -C^ 2

^O-R

> -¾ o clwcl k) -C - O - Cl ciri o l) -c! - O NQ2 o

II M

ro) -C- N , O N Η II2

n) -C - C - CF

3 ? r~\ o) -C-N i

V

s

DK 175493 B1 I

I mange tilfælde har acridiniumderivater ifølge op- I

findelsen, hvori R5 er en gruppe med formlen I

0 I

5 ? I

(v) I

vist sig at være egnede. H

Endvidere har det vist sig, at acridiniumforbindelser I

10 med formlen VI er særligt egnede. I

CH _ I

ν’ I

ΟγΟκ13 r12 i

o j> 0y-, <VI> I

^ S02 - X- - c - o - N I I

20 idet X er en gruppe med formlen VII I

-@-<cv„- (VII> I

25 idet n = 2 eller 4, I

og R12 og R13 uafhængigt af hinanden er hydrogen, en alkyl- I

gruppe, en alkoxygruppe med 1-4 C-atomer, en (-0-CH2-CH2)n- I

OR-gruppe, idet n har betydningen 0-8, og R er en morpholin- I

ethyl- eller en alkylgruppe med 1-4 C-atomer eller en Ν,Ν- I

30 diumethylaminoethyl-gruppe, I

eller tilsammen er en ethylendioxy-gruppe, og A® har de i I

krav 1 angivne betydninger. Disse forbindelser er i vand I

letopløselige produkter. H

Blandt de sidstnævnte forbindelser med formlen VII I

35 foretrækkes atter ganske særligt sådanne, hvori X er en p- I

ethylenphenylgruppe, R12 er H, og R13 er en p-methoxygruppe, I

10 DK 175493 B1 eller R12 er en ortho-methoxy-, og R13 er en para-methoxy-gruppe, eller R12 og R13 er tilsammen en 3,4-ethylendioxy-gruppe, såsom forbindelserne med formlen CH A8 5 oio Λ /©- ^

10 ° \ O

so -(O > -CH -CH - C ^ 2\dJ 2 2 y

Yderligere særligt egnede acridiniumderivater har 15 formlen CH A6 i 3 20 (VIII) ':? · · -p 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 hvori R6 er en alkylgruppe med 1-4 C-atomer eller en phenyl- 2 gruppe, som. kan være substitueret med op til tre alkyl- 3 eller alkoxygrupper med hver gang 1-4 C-atomer, med en 4 -(-0-CH2-CH2)n-OR-gruppe, idet n har betydning 0-8, og R er 5 en morpholinethyl- eller en N,N-dimethylaminoethylgruppe 6 eller alkylgruppe med 1-4 C-atomer, eller med en ethylen- 7 dioxy-gruppe, og X har de i krav 1 eller 2 nævnte betyd 8 ninger, og hvori R6 er en phenylgruppe, som kan være sub 9 stitueret med op til tre alkylgrupper med hver gang 1-4 C- 10 atomer, hvor X er en ortho-, meta- eller para-phenylengruppe.

11

Disse forbindelser er ligeledes i vand let opløselige produkter.

I DK 175493 B1 I

I 11 I

I Det er overraskende, at ved amidnitrogenet sulfonyl- I

I substituerede acridinium-9-carboxamider har en udpræget I

I kemoluminescens med amidnitrogenet, thi det er kendt, at I

I acridinium-9-carboxamider i modsætning til acridinium-9- I

I 5 carboxylsyreestrene på ingen måde viser kemoluminescens, I

I (jvf. P. McCapra i W. Carruthers og J.K. Sutherland: Progress I

I inOrganic Chem., bd. 8, 231-277, 1973, Butterworth, London). I

I En betydelig fordel ved de her omhandlede acridinium- I

I forbindelser i forhold til de fra EP-ansøgning 82.636 kendte I

I 10 acridiniumphenylestre ligger i den væsentligt hurtigere I

I reaktionskinetik af lysemissionen, jvf. DE P 36 28. 573.0. I

I En yderligere fordel fås ved stabiliteten af de ved I

I hjælp af de her omhandlede forbindelser fremstillede spor- I

I stoffer. På tegningen i fig. 1 vises resultatet af en stabi- I

I 15 litetsprøve, ved hvilken intensiteten af det hver gang fore- I

I liggende kemoluminescenssignal er målt efter opbevaring I

I ved forhøjet temperatur (50°C). Kurven 1 drejer sig om det I

I af forbindelsen I

I a) N- (4-methoxyphenyl) -N- [4- (2-succinimidoyloxycarbonyl- I

I 20 ethyl)-benzensulfonyl]-10-methylacridinium-9-carboxylsyre- I

I amid-fluorsulfonat (6) , I

I kurve b) om det af forbindelsen N-(4-methoxyphenyl)-N-[4- I

I (4-succinimidoyloxycarbonylbutyl) -benzensulfonyl] -10-methyl- I

I acridinium-9-carboxylsyreamid-fluorsulfonat (11) og kurve I

I 25 c) om det af forbindelsen 4-(2-succinimidyloxycarbonylethyl) - I

I phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatmethosulfat (EP-ansøg- I

I ning 82.636, side 10) fremstillede sporstof. I

I Det kan tydeligt erkendes, at sporstofferne ifølge I

I opfindelsen ud fra forbindelserne a) og b) er mere stabile I

I 30 end den tilsvarende forbindelse ud fra c). I

I Et lignende resultat får man ved en tilsvarende prøve I

I ved 4 °C. I fig. 2 viser signalintensiteten efter opbevaring I

I ved 4°C. Atter viser det ud fra forbindelsen a) fremstillede I

I sporstof sig at være afgørende mere stabilt end det ud fra H

I 35 forbindelse c) fremstillede. I

I Til fremstilling af de her omhandlede acridiniumsul- I

12 DK 175493 B1' fonamidderivater kan man gå ud fra acridin-9-carboxylsyre-chlorid (IX). Til fremstilling af dette omsættes eksempelvis acridin ifølge den af Lehmstedt und Hundertmark i Ber. 63, 1229 (1930) angivne fremgangsmåde i ethanol/iseddike med 5 kaliumcyanid til dannelse af 9-cyanacridin. Heraf fås fortrinsvis efter omkrystallisation ved omsætning med svovlsyre og natriumnitrit, svarende til den af Lehmstedt og Wirth i Ber. 61, 2044 (1928) beskrevne fremgangsmåde, acridin-9- carboxylsyren. Ved omsætning af acridin-9-carboxylsyren 10' eksempelvis med thionylchlorid fås forbindelsen med formlen oco C (IX) 0 >

15 O Y

hvori Y er chlor. I stedet for halogen kan man i forbindelsen IX i stedet for Y ligeledes indføre en oxycarbonylal-kyl-, oxycarbonylaryl- eller imidazolidgruppe.

20 Syrechloridet IX kan derefter omsættes med en beskyt tet sulfonamidcarboxylsyre med formlen

H O

* 1 1 25 R6 - S02 - N - X - C - OZ (XI)

eller med formlen H

30 I

R6 - N - S02 - X - COOZ (XI) hvori X og R6 har de ovennævnte betydninger, og Z er en gruppe, som beskytter carboxygruppen, og som derefter fra-35 spaltes. Eksempelvis kan man til denne reaktion anvende N-(4-carboxy carbonyl phenyl) -N-4-toluensulfonsyreamidet. Det er fordelagtigt at anvende t-butylesteren, hvis beskyttelsesgruppe under særligt skånende betingelser kan indføres

I DK 175493 B1 I

I 13 I

og atter fraspaltes. Den efter fraspaltning af beskyttel- I

sesgruppen dannede syre omdannes derefter med en egnet for- I

I bindelse, eksempelvis med N-hydroxysuccinimid, til gruppen I

I R^. Deraf fås den kemoluminescerende acridinforbindelse ved I

I 5 alkylering ved nitrogenatomet i 10-stillingen. I

I De tilvejebragte acridiniumforbindelser kan derefter I

I omsættes med et stof af biologisk interesse, eksempelvis et I

I antigen, et antistof, et hormon, et lægemiddel, et lægemid- I

I delmetabolit, et toxin eller et alkaloid, til dannelse af I

I 10 en luminescerende forbindelse. Derved bindes acridinium- I

I derivatet direkte eller via et bromolekyle, såsom eksempelvis I

I aminosyrer, oligo- eller polyaminosyrer, peptider, eller I

I syntetiske polymere, til det biologisk interessante stof I

I under dannelse af et stabilt, immunologisk aktivt konjugat. I

I 15 Dette konjugat betegnes også som sporstof og anvendes i de I

I følgende beskrevne luminescensimmunbestemmelser. Det er til I

I den her omhandlede luminescensimmunbestemmelse til bestem- I

I melse af et antigent stof i en væskeprøve ved en kompetitiv I

I eller en sandwich-fremgangsmåde nødvendigt med mindst en I

I 20 immunologisk aktiv komponent, som er immobiliseret på en I

I fast fase, og desuden det luminescerende sporstof. I

I Efter afslutning af immunreaktionen og eventuelt I

I nødvendige vasketrin udløses lysemissionen ved på hinanden I

I følgende eller samtidig tilsætning af et eller flere reagen- I

I 25 ser, idet mindst et reagens indeholder et oxidationsmiddel I

I i bundet eller ubundet form. Luminescensimmunbestemmelsen I

I kan derefter gennemføres på forskellig måde. I

I En mulighed består i, at man inkuberer det med antige- I

I net specifikt reagerende immubiliserede antistof med en I

30 prøve af den væske, der skal undersøges, og et konjugat af I

antigenet og et kemoluminescerende acridiniumderivat (anti- I

gen-sporstof), adskiller prøven og det ubundne sporstof, I

bringer det bundne sporstof sammen med de nødvendige reagen- I

ser for at fremkalde en lysemission for derefter bestemmer I

35 mængden af tilstedeværende antigen ud fra den målte styrke I

af lysemissionen. I

14 DK 175493 B1

En anden mulighed til gennemførelse af luminescensim-munbestemmelsen består i, at man inkuberer et med antigenet specifikt reagerende, immubiliseret antistof med en prøve af den væske, der skal undersøges, med et konjugat af et andet, , 5 specifikt reagerende antistof og et kemoluminescerende acri-diniumderivat, adskiller prøven og det ubundne, mærkede konjugat, bringer det bundne, mærkede konjugat sammen med de nødvendige reagenser for at fremkalde en lysemission og bestemmer mængden af det tilstedeværende antigen ud fra den 10 målte lysemissionsstyrke.

De ovennævnte luminescensbestemmelser kan ligeledes gennemføres på den måde, at man forud for tilsætning af det mærkede konjugat adskiller den væske, der skal undersøges, fra det immubiliserede antistof.

15 Med andre ifølge opfindelsen gennemførbare lumini- scensimmunbestemmelser er ikke antistoffet, men antigenet immobiliseret. Således kan man inkubere et med antistoffet specifikt reagerende immubiliseret antigen med en prøve af den væske, der skal undersøges, og en opløsning af konjugat 20 ud fra antistoffet og et kemoluminescerende acridiniumderi-vat, derefter adskille prøven og de ubundne mærkede konjugat og derefter bringe det bundne, mærkede konjugat sammen med de nødvendige reagenser. Derefter optræder der en lysemission, og ud fra styrken deraf kan man bestemme mængden af 25 det tilstedeværende antigen.

En yderligere variant består i, at man inkuberer et med antistoffet specifikt reagerende, immobiliseret antigen med en opløsning af et konjugat af antistoffet og et kemoluminescerende acridiniumderivat, fraskiller det uomsatte, 30 mærkede konjugat, tilsætter en prøve af den væske, der skal undersøges, atter fraskiller prøven derefter, bringer det bundne, mærkede konjugat sammen med de nødvendige reagenser j for at fremkalde en lysemission og derefter bestemmer ireengden af det tilstedeværende antigen ud fra denne.

35 Endelig kan man ligeledes gennemføre luminescensimmun- bestemmelsen på den måde, at man inkuberer et med antistoffet

I DK 175493 B1 I

I 15 I

I specifikt reagerende, immobiliseret antigen med en opløsning I

I af et konjugat af antistoffet og et kemoluminescerende acri- I

I diniumderivat, tilsætter en prøve af den væske, der skal I

I undersøges, adskiller prøven og det ubundne konjugat, bringer I

I 5 det bundne, mærkede konjugat sammen med de nødvendige reagen- I

ser, og derefter bestemmer mængden af det tilstedeværende I

I antigen ud fra den målte lysemission. I

I Fremstillingen af de her omhandlede acridiniumforbin- I

delser belyses nærmere ved hjælp af eksemplerne 1-7. I

I 10 I

I Eksempel 1 I

I N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(2-benzyloxycarbonylethyl)- I

I benzensulfonyl]acridin-9-carboxamid (3) I

I “ Η I

I I

A<x n

I Til 17 g 4'-[N-(4-Methoxyphenyl)sulfamido]-3-phenyl- I

I 30 propionsyrebenzylester (1) i 400 ml dichlormethan sættes I

I der 460 mg 4-(N,N-dimethylamino)pyridin og 22,1 ml triethyl- I

I amin, efter 10 minutters forløb tilsætter man 11,12 g acridi- I

I nium-9-carboxylsyrechlorid-hydrochlorid (2) og opvarmer i 6 I

I timer til tilbagesvaling. Den afkølede opløsning røres kort . I

I 35 med 2 N NaOH, den fraskilte organiske fase vaskes med H20, I

I tørres over magnesiumsulfat og inddampes. Remanensen renses 16 DK 175493 B1 ved hjælp af søjlechromatografi.

Udbytte: 60%, Smp.: 130-32°C

NMR (DMSO, '100 MHz): δ = 2,7-3,0 ppm (d,kr'2H)' 5 = 3'0-3'3 ppm (d,br,2H), δ = 3,5 ppm (s,br,3H), δ ** (S'2H)/ 5 δ = 6,5 ppm (d,br,2H), δ = 7,1 ppm (d,brr2H)' 5 = 7,35 PPm (s,5H), δ = 7,5-8,3 ppm (m,12H) N- (4-Methoxypnenyl) -N- [4- (^ fonylj-acridin-9-carboxamid-hydrobromid

4-O^V

O 1 2 3 4 5 6 35 6,3 g (3) opvarmes i 30 ml 33% HBr/iseddike i 2 timer 2 til 60°C, og efter afkøling tilsætter man 60 ml diisopropyl- 3 ether, skiller udfældningen fra ved sugning og tørrer den i 4 vakuum: 5

Udbytte: 90%, smp.: Dekomponerer ved 2370C.

6 NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,7 ppm (d,br,2H), δ = 3,1 ppm' (d,br,2H), δ = 3,5 ppm (s,br,3H), δ =* 6,5 ppm (d,br,2H), δ = 7,0-8,4 ppm (m,15H) N- (4-Methoxypnenyl) -N- [4- (2-succinimidoyloxycarbonyl-ethyl)-benzensulfonyl1acridin-9-carboxamid (5)

I DK 175493 B1 I

I 17 I

I 151 I

I s^N^^^a^CH3 I

° I

I Til 3,1 g (4) i 50 ml tetrahydrofuran sættes der I

I 1,41 ml triethylamin, der afkøles til -20°C, og der tilsættes I

I 20 0,474 ml chlormyresyreethylester. Man efterrører i 20 minut- I

I ter, tilsætter 575 mg N-hydroxysuccinimid, omrører i 3 timer I

I ved -20°C og lader blandingen, kommer op på stuetemperatur I

I efter omrøring natten over. Udfældningen skilles fra ved I

I sugning, filtratet inddampes, remanensen tages op i dichlor-

I 25 methan eller ethylacetat, den resulterende opløsning vaskes I

I med vand, NaHC03-opløsning og vand, og tørres over magnesium- I

I sulfat. Den organiske fase inddampes, og remanensen omkry- I

I stalliseres fra toluen. I

I Udbytte: 50% I

I 30 NMR (DMSO, 100 MHz) δ = 2,8 ppm(s,4H), δ = 3,2 ppm (s,br,4H), I

I δ = 3,5 ppm (s,Br,3H), δ = 6,5 ppm (d,br,2H), δ =7,2 ppm I

I (d,br,2H), δ = 7,6-8,4 ppm (m,12H) I

I IR: 3400 cm-1 (br), 3060, 2930, 1815(w), 1780(w), 1740(s), I

I 1690 (m), 1600 (w), 1510(m), 1370 (m), 1250(m), 1203 (m), I

35 1175(m). I

18 DK 175493 B1 N-(4-Methoxyphenyl)-N-(4(2-succinimidoyloxycarbonyl-ethyl) -benzensulfony 1] -10-methylacridinium-9-carboxamidfluor-sulfonat (6) 5 i”3**»’" & o is 20 Til 1,27 g (5) i 60 ml dichlormethan sættes der ved- 20°C 0,4 ml methylfluorsulfonat. Man lader omrøre i 2 timer ved -20°C og tøer blandingen op natten over til stuetemperatur. Efter tilsætning af toluen udfældes der et fast gult stof, som skilles fra ved sugning og tørres i vakuum.

25 Udbytte 80% NMR (DMSO, 100 MHz);' δ = 2,9 ppm (s,4H), δ = 3,2 ppm (s,br,4H), δ - 3,5 ppm (s,br,3H), 6 = 4,8 ppm (s,br,3H), δ = 6,5 ppm (br, 2H), δ = 7,2 ppm (br,2H), δ = 7,6-9,0 ppm (m, 12H) IR = 3400 cm-1 (br), 3160, 2970, 1810 <w), 1785 (w), 30 1740(a), 1695(m), 1600(w), 1555(w), 1510(m), 1370(m), 1290(m), 1250(m), 1210(m), 1170(m)

Massespektrum: m/Z: 652 M+ (kation).

Eksempel 2 35 Fremstillingen af N-(4-methoxyphenyl)-N-[4- (4-succin- imidoyloxycarbonylbutyl) benzensulfonyl] -10-methylacridinium-

I DK 175493 B1 I

I 19 I

I 9-carboxamid-fluorsulfonat (11) I

g-Λ^—γ yj

I udgående fra 41 [N-(4-methoxyphenyl)sulfamido]-5-phenylva- I

lerianesyrebenzylester (7) og acridin-9-carboxylsyrerechlo- I

I rid'hydrochlorid (2) sker analogt til syntesen af (6). Ud- I

20 bytterne af de enkelte syntesetrin samt den spektroskopiske I

I karakterisering er angivet i det følgende. I

I N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(4-benzyloxycarbonylbutyl)- I

I benzensulfonyl]acridin-9-carboxamid (8) I

I 25 cco h π DK 175493 B1 i 20

Udbytter 40%, sej olie, størkner delvis NMR (CDC13, 100 MHz): 6 = 2,85 (tn, 4H) , δ = 2,45 ppm (t,br,2H), δ = 2,8 ppm (t,br,2H), δ = 3,5 ppm (s,3H), δ = 5,15 ppm (s,2H), δ = 6,3 ppm (d,2H), δ = 6,9 ppm (d,2H), 5 δ = 7,3-8,3 ppm (m,17H).

N- (4-Methoxyphenyl) -N- [4- (4-carboxybutyl) benzensul -fonyl]-acridin-9-carboxamid-hydrobromid (9) 10 [<ί!ίί:νΝγ^!^ ^ ^y°^cn3

15 I

20 o=l— 1 2 3 4 5 6

Udbytte: 95%, smp.: dekomponerer ved 153-155°C.

2 NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 1,7 ppm (s,br,4H), δ =2,3 ppm (t, 3 br,2H), δ = 2,8 ppm (s,br,2H), δ = 3,5 ppm (s,br,3H), δ = 4 6,5 ppm (br,2H), δ = 7,05 ppm (br,2H), δ =7,5-8,5 ppm 5 (m,12H).

6 N- (4-Methoxyphenyl) -N- [4- (4-succinimidoyloxycarbonyl-butyl)-benzensulfonyl)acridin-9-carboxamid (10)

I DK 175493 B1 I

I 21 I

I ιίίί!ί>Ύ^Υ/,%!ί>ι w I

I 5 I

I i

“^O^Yy} I

I 15 I

I Udbytte: 25%, dekomponerer ved 75-80°C I

I NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 1,8 ppm (br,4H), δ = 2,3 ppm I

I (s,2H), δ = 2,85 ppm {s,br,6H), δ = 3,5 ppm (s,br,3H), δ = I

I 20 6,5 ppm (d,br,2H), 6 = 7,05 ppm (d,br,2H), δ = 7,5-8,3 ppm I

I (m,12H) I

I N- {4-Methoxyphenyl) -N- [4- (4-succinimidoyloxycarbonyl- I

I butyl]-10-methylacridinium-9-carboxamidfluorsulfonat (11) I

I Udbytte: 90% I

I 25 NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 1,8 ppm (br,4H), δ = 2,3 ppm I

I (s,br,2H), δ = 2,8 ppm (s,br,6H), δ = 3,5 ppm (s,br,3H), I

I δ = 4,8 ppm (br,3H), δ = 6,5 ppm (br,2H), δ = 7,05 ppm I

I (br,2H), δ > 7,5-9,0 ppm (m,12H) I

I IR: 3340 cm-1 (br), 3060(w), 2930(m), 2870(w), 1810(w), · I

I 30 1785(w), 1740(s), 1695(m), 1600(w), 1550(w), 1510(m), I

I 1460(w), 1370 (m), 12 90 (s), 1250(s), 1205 (s) , 1170 (s) I

I Massespektrum: m/z= 680 M+ (kation) I

I Eksempel 3 I

I 35 Fremstillingen af N-(2,4-dimethoxyphenyl)-N-[4-(2- I

I succinimidoyloxycarbonylethyl) benzensul fonyl]-10-methylacri- I

22 DK 175493 B1 dinium-9-carboxamid-fluorsulfonat (16a) H3<i so,»‘ (16a) i 1 yj O o' udgående fra 4'-[N-(2,4-dimethoxyphenyl)sulfamido]-3-phenyl-propionsyrebenzylester (12a) og acridin-9-carboxylsyrechlo-20 rid hydrochlorid (2) sker analogt til syntesen af (6) . Udbytterne af de enkelte syntesetrin samt den spektroskop!ske karakterisering er angivet i det følgende.

N- (2,4 - D i me t hoxypheny 1) -N- [4- (2-benzyloxycarbonyle-thyl)-benzensulfony1]acridin-9-carboxamid (13a)

/γνχ M

30 N:h3

Γ J

35 ^I

0 s

DK 175493 B1 I

23 I

Udbytte: 50%, smp.: 74°C. I

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 ppm (d,br,2H), δ = 3,1 ppm I

(d,br,2H), δ = 3,3 ppm (s,3H), δ = 3,4 ppm (s,3H), δ = 5,1 I

ppm (s,2H), δ = 5,9-6,2 ppm (m,2H), δ = 7,0 ppm (d,lH), δ = I

5 7,35 ppm (s,5H), δ = 7,5-8,2 ppm (m,12H) I

N-(2,4-Dimethoxyphenyl)-N-(2-carboxyethyl)benzensul- I

fonyl]-acridin-9-carboxamid-hydrobromid (14a) I

10 rYY^i Maj i 15 Η3(^0'|^γ'0'^Η3 i

20 I

o I

25 Udbytte: 95% I

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,75 ppm (d,br,2H), 6 = 3,05 ppm I

(d,br,2H), δ = 3,3 ppm (s,3H), δ = 3,5 ppm (s,3H), δ = 5,95- I

-6,3 ppm (m,2H), δ = 7,05 ppm (d,lH), δ = 7,6-8,6 ppm I

(m,12H), δ = 9,2 ppm (s,br,2H). I

30 N-(2,4-Dimethoxyphenyl)-N-[4-{succinimidoyloxycar-

bonylethyl)-benzensulfonyl]acridin-9-carboxamid (15a) I

24 DK 175493 B1

(l 5aJ

i5 (y

Udbytte: 45%, smp.: dekomponerer ved 105°C

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 ppm (s,4H), 6=3 ppm (br,2H), 6 = 3,2 ppm (s, 3H) , δ = 3,4 ppm (s, 3H) , δ = 5,9-6,3 ppm 20 (m,2H), δ = 7,0 ppm (d,IH), b = 7,5-8,4 ppm {m,12H) IR (KBr- presselegeme): 3440 cm-1 (br), 3060 (w), 2930(w), 2850(w), 1815(w), 1785(w), 1740(s), 1695(m), 1600(w), 1510(m), 1460(w), 1440(w), 1365(m), 1320(w), 1290(w), 1240(m), 1210(s), 1165(m), 1085(m) 25 N-(2,4-Dimethoxyphenyl)-N-[4-(2-succinimidoyloxycar- bonylethyl) benzensulfonyl] -10 -methylacridinium-9-carboxamid-fluorsulfonat (16a)

Udbytte: 80%, smp.: dekomponerer ved ca. 135°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 ppm (s, 4H), δ = 2,95-4,2 pp 30 (m,10H), δ = 4,8-5,0 ppm (s,s,3H), δ = 6,05-6,25 ppm (m,IH), δ = 7,6-9,0 ppm (m,14H) IR (KBr-Presselegeme): 3430 cm"l(m), 2950(w), 2870(w), 2825(w), 1810(w), 1780(m), 1750(s), 1695(m), 1610(m), 1555(w), 1510(m), 1555(w), 1510(m), 1465(m), 1380(m), 35 1285(m), 1250(m), 1210(s), 1170(m)

DK 175493 B1 I

25 I

Eksempel 4 I

Syntesen af N-(3,4-ethylendioxyphenyl)-N-[4-(2-suc- I

cinimidoyloxycarbonylethyl)benzensulfonylj-10-methylacridi- I

nium-9-carboxamid-fluorsulfonat (16b) I

H3(j+io>T- M I

i« 000?^] I

xx .

" ΧΧχ 20

udgående fra 4[N-(3,4-ethylendioxyphenyl) sulfamido]-3- I

phenylpropionsyrebenzylester (12b) og acridin-9-carboxyl- I

syrechlorid-hydrochlorid (2) sker analogt til eksempel 1. I

Udbytterne af de enkelte trin samt den spektroskopiske karak- H

25 terisering er angivet i det følgende. I

N- (3,4-Ethylendioxyphenyl) -N- [4- (2-benzyloxycarbonyl- I

ethyl)-benzensulfonyl]acridin-9-carboxamid (13b) H

30 I 1 26 DK 175493 B1 ;

Udbytte: 50%, smp.: 91,5°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 ppm (d,br,2H), δ = 3,1 ppm 20 (d,br,2H), δ = 4,0 ppm (s,Br,4H), δ = 5,1 ppm (s,2H), δ = 6,3-6,8 ppm (m, 3H) , δ = 7,3 ppm (s,5H), δ = 7,6-8,3 ppm (m,12H).

N- (3,4-Ethylendioxyphenyl) -N- [4- (2-carbonyloxyethyl)-benzensulfonyl]acridin-9-carboxamid-hydrobromid (14b) 25 30 J-γ0 i-Ο^γ·

DK 175493 B1 I

27 I

Udbytte: 95%, smp.: > 200°C I

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,1 ppm (m,2H), δ = 3,05 ppm (m,2H), I

6 = 4,0 ppm {s,br,4H), δ = 6,3-6,8 ppm (m,3H), δ = 7,5-8,6 I

ppm (m,12H), δ =9,6 ppm (s,br,2H). I

5 N- (3,4-Ethylendioxyphenyl) -N- [4- (succinimidoyloxycar- I

bonylethyl)benzensulfonyl]acridin-9-carboxylsyreamid (15b) I

" OOOj^ I

Udbytte: 45%, smp.: dekomponerer ved 140°C NMR (DMSO, 100 I

MHz): δ = 2,7-2,9 ppm (d,s, overlejret, 6H) , δ = 3,0 ppm I

25 (d,2H), δ = 4,0 ppm (s,br,4H), δ = 6,3-6,8 ppm (m,3H) , δ = I

7,5-8,4 ppm (m,12H) I

IR(KBr-Presselegeme): 3420 cm-1 (br), 3060(m), 2980(m), I

2930 (m) , 1810(w), 1790 (w), 17490(m) , 1695 (s), 1590 (m), I

1460(w), 1430(w), 1410(w), 1370(m), 1300(m), 1225(s), 30 1175 (s) .

N- (3,4-Ethylendioxyphenyl) -N- [4- (succinimidoyloxycar- I

bonylethyl) benzensulfonyl] -10-methylacridinium-9-carboxyl- I

syreamid-fluorsulfonat (16b) I

Udbytte: 80%, smp.: dekomponerer ved ca. 110°C, I

35 NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,85 ppm (s,4H), δ = 3,0-3,3 ppm I

(s,s,br,4H), δ = 3,8-4,5 ppm (m,br,4H), δ = 4,75-5,1 ppm I

28 DK 175493 B1 (s,br med skuldre, 3H), 6 = 6,3-9,0 ppm (m,15H).

Eksempel 5 N-(4-Carboxyphenyl)-4-toluensulfonsyreamid (5-1) 5 10 CSSs^//^i- . [^Xj

Til en blanding af 252 g (3 mol) natriumhydrogencar-bonat og 139,1 g (1 mol) 4-aminobenzoesyre i 2,5 liter vand sætter man dråbevis ved 20-30°C en blanding af 190,5 (1 20 mol) 4-toluensulfonchlorid i 300 ml i-propylether. Man omrører intensivt i 2-4 timer, indtil sulfochloridet er opbrugt.

Den fraskilte vandige opløsning indstiller man til en pH-værdi på et ved hjælp af koncentreret saltsyre og tager udfældningen op i propylacetat. Ekstrakten vasker man to 25 gange med 2 n-saltsyre, en gang med vand, tørrer over natriumsulfat og inddamper. Man får 240 g/82,5% af teorien.

N-(4-carboxyphenyl)-4-toluensulfonsyreamid 1H-NMR (DMSO dg): δ = 2,3 (s; CH3); 7,1 (d, aromat, 2H) 7,3 (d, aromat, 2H) ; 7,6-7,9 (m, aromat, 4H) / 10,75 (bred); 30 12,7 (bred).

N-(4-Benzyloxycarbonylphenyl) - 4-toluensulfonsyreamid (5-2) 1

29 I

DK 175493 B1 I

H3CV^S X I

kp, I

“ ^ I

En opløsning af 11,64 g {40 mmol) N- (4 - carboxyphenyl) - I

4-toluensulfonsyreamid, 5,06 g (40 mmol) benzylchlorid, I

5,20 g {44 mmol) di-i-propyl-ethylamin i 100 ml dimethylform- I

amid opvarmes i 4 timer til 140°C. Efter afsluttet reaktion I

15 inddamper man i vakuum, tager op i propylacetat, vasker to I

gange med 2 n-saltsyre, to gange med mættet natriumhydrogen-

carbonat-opløsning, tørrer over natriumsulfat og inddamper. I

Man får 11,8 g {78% af teorien) N- {4 - benzyl oxycarbonylphe- I

nyl)-4-toluensulfonsyreamid, som omkrystalliseres fra metha- I

20 nol. I

^H-NMR (DMSO dg): δ = 2,3 {s; CH3); 5,3 (s, CH2) 7,1-7,3 I

(dd, 4 aromat. H) ,· 7,4 (s, C5H5) ; 7,7-7,9 (dd, 4 aromat. I

H) ; 10,8 (bred, NH). I

N- (4 - Benzyl oxycarbonylphenyl) -N- (4-toluensul fonyl) - I

25 acridin-9-carboxamid (5-3) I

30 DK 175493 B1

Til opløsningen af 1,5 g (4 mmoi) N-(4-benzyloxycar-bonylphenyl)-4-toluensulfonsyreamid, 1,23 g (4,4 mmol) acri-dinsyrechlorid-hydrochlorid og 0,02 g dimethylaminopyridin i 20 ml vandfri tetrahydrofuran sætter man dråbevis ved 5 25°C 2,1 ml (15 mmol) triethylamin i 10 ml tetrahydrofuran.

Temperaturen øges til 60°C.

Det udkrystalliserende produkt røres efter afsluttet reaktion sammen med methanol, skilles fra ved sugning og omkrystalliseres fra ethylacetat.

10 Udbytte: 1,57 g (67,0% af teorien) 1H-NMR (CDC13) : δ = 2,5 (s, CH3) ; 5,2 (s, CH2) ; 7,3 (s, C5H5), 7,0-8,2 (m, 16 aromat. H).

N- (4 -Carboxyphenyl) -N- (4-toluensulfonyl) -acridin-9-carboxamidhydrobromid (5-4).

15 0= ιΎ/η 1 2 3 4 5 6 ® 2 1,17 g (2 mmol) N- (4-benzyloxycarbonylphenyl) -N- (4- 3 toluensulfonyl)-acridin-9-carboxylsyreamid opvarmes med 10 4 ml 33 hydrogenbromid-iseddikeopløsning under omrøring i 4 5 timer til 60°C. Efter afkøling skiller man udfældningen fra 6 ved sugning og tørrer i vakuum. Udbytte: 1,00 g (87% af teorien).

I DK 175493 B1 I

I 31 I

I ^H-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, CH3) ; 7,3-8,6 (m, 16 aroma t. Η) ; I

I 11,65 (S, NH); MS:496 (M+). I

I N-(4-Succinimidoyloxycarbonylphenyl)-N-(4-toluensul- I

I fonyl)-acridin-9-carboxamid (5-5). I

I I

'cW^O.,

I 20 u I

I Til en opløsning af 0,57 g (1 mmol) N-(4-carboxyphe- I

I nyl) -N-4 - toluensul fonyl) -acridin-9-carboxamid-hydrobromid I

I og 0,21 g (2 mmol) triethylamin i 25 ml vandfri tetrahydro- I

I furan sætter man under omrøring ved -15°C 0,11 g (1 mmol) I

I 25 chlormyresyreethylester. Man omrører i 1 time ved samme I

I temperatur og tilsætter derefter 0,12 g (1 mmol) N-hydroxy- I

I succinimid. Efter yderligere 1 times forløb lader man bian- I

I dingen henstå ved stuetemperatur i 24 timer. Man inddamper I

I i vakuum, tager op i ethylacetat, vasker med vand, natrium- I

I 30 hydrogencarbonat-opløsning og vand, og tørrer over natrium- I

I sulfat. Efter inddampningen får man 0,42 g (70,8% af teorien) I

I af målproduktet. I

I ^-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, CH3) , 3,1 (s, CH2-CH2) , 7,0-8,6 I

I (m, 16 aromat, Η). I

I 35 N-(4-Succinimidoyloxycarbonylphenyl)-N-(4-toluensul- I

I fonyl)-sO-methylacridinium-9-carboxamid-fluorsulfonat (5-6). I

32 j DK 175493 B1 ch3

rvJJ-'XX

L / Y ^^ch3 - Λ a

Til en opløsning af 0,59 g (1 mmol) N-succinimidoyl-oxycarbonylphenyl)-N-(4-toluensulfonyl)-acridin-9-carboxyl-syreamid i 30 ml 1,2 dichlorethan sætter man under omrøring 20 ved 25°C 0,85 g (7,5 mmol) fluorsulfonsyremethylester. Reaktionsproduktet udfældes i løbet af 4 timer. Efter fraskil-lelse ved sugning og tørring får man 0,43 g (60,8% af teorien) af målproduktet.

1H-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, Ar-CH3); 3,1 (s, CH2-CH2) ; 4,9 25 (s, N-CH3); 7,3-8,8 (m, 16 arom. H).

Eksempel 6 På samme måde som i eksempel 5 får man ud fra N- (4-carboxymethylphenyl)-4-toluen-sulfonsyreamid N-(4-succin-30 imidoyloxycarbonylmethylphenyl) -N- (4 - toluensul fonyl) -10- methylacridinium-9-carboxamid-fluorsulfonat i N-(4-Carboxymethylphenyl)-4-toluensulfonsyreamid (6- 1) 1

I DK 175493 B1 I

I 33 I

‘ "‘"O . ΛΎ

I 1H-NMR (DMSO) : δ = 2,3 (s, CH3) ; 3,5 (s, CH2) ; 7,0 (AB, I

I CgH4); 7,3-7,6 (AB; CgH4); 10,2 (s, NH). I

I 15 H- (4-Benzyloxycarbonylmethylphenyl) -4-toluensulfon- I

I syreamid (6-2) I

I o I

I 20 h3c. ft. I

I γη S>

" Y

I Udbytte: 35% af teorien I

I 1H-NMR (DMSO): δ = 2,3 (s, CH3) ; 3,6 (s, COCH2) ; 5,1 (s, I

I 30 0CH2); 6,9-7,7 (m, 13 aromat. H); 10,2 (s, NH) . I

I N- (4-Benzyloxycarbonylmethylphenyl) -N- (4-toluensul- I

I fonyl)-acridin-9-carboxamid (6-3) I

I 35 I

34 DK 175493 B1 5 I ' 1 II /V^i .v^ ^X3

15 O

Udbytte: 35% af teorien 1H-NMR (CDCH3); δ = 2,55 (s, CH3) ; 3,3 {s, COCH2) ; 5,0 (s, 20 0-CH2), 6,7-8,2 (m, 21 aromat. H).

N-(4-Carboxymethylphenyl)-N-(4-toluensulfonyl)-acri-din-9-carboxamidhydrobromid (6-4) 25 m 30 ^== zsA/ 1 ^yxx„, i

I DK 175493 B1 I

I 35 I

I Udbytte: 95% af teorien I

I 1H-NMR (TFA); δ = 2,65 (s, CH3); 3,55 (s,CH2); 6,8-8,6 (m, I

I 16 aromat. Η) I

I N-(4-Succinimidoyloxycarbonylmethylphenyl)-N-(4-tolu- I

I 5 ensulfonyl)-acridin-9-carboxamid (6-5) I

I /VV\ I

I 10 i O X' ^CH3

I 20 O I

I Udbytte: 71% af teorien I

I ^-H-NMR (TFA): δ = 2,65 (s, toluen-CH3) ; 3,0 (s, CH2-CH2); I

I 3,6 (bred, COCH2); 6,9-8,5 (m, aromat) I

I 25 N-(4-Succinimidoyloxycarbonylmethylphenyl)-N-(4-tolu- I

I ensulfonyl)-10-methylacridinium-9-carboxamidfluorsulfonat I

I (6-6) I

I 35 I

30 I

36 DK 175493 B1 rVviJ οτχ 1

Udbytte: 80% af teorien ^H-NMR (TFA) : δ = 2,6 (s, toluen-CHj) ; 2,9 (s, CH2-CH2); 20 3,6 (bred, COCH2); 4,9 (s, N-CH3) ; 6,8-8,9 (m, aromat)

Eksempel 7 På samme måde som i eksempel 5 får man ud fra N-[4-(2-carboxyethyl) -phenyl] -4-toluensulfonsyreamid N-[4-(2-25 succinimidoyloxycarbonylethyl) -phenyl) -N- (4-toluensulfonyl) - 10-methyl-acridinium-9-carboxamidfluorsulfonat.

N-[4-(2-Carboxyethyl)-phenyl)-4-toluensulfonsyreamid (7-1)

M

30 Øy i I DK 175493 B1

I 37 I

I Udbytte: 44% af teorien I

I 1H-NMR (DMSO) : 6 =2,3 (s, CH3); 2,4-2,8 (m, CH2-CH2) ; 7,0 I

I (AB, 4H); 7,2-7,8 (AB, 4H); 10,1 (s, NH). I

I N-[4-(2-benzyloxycarbonylethyl)-phenyl]-4-toluensul- I

I 5 fonsyreamid (7-2) . I

I M I

I 0 3Cn ° f^r^°\ I i) I 15 i

I Udbytte: 78% af teorien I

I 1H-NMR (CDC13) : δ = 2,35 (s, CH3) ; 2,4-3,0 (m, CH2-CH2) ; I

I 5,1 (s, 0-CH2); 7,0-7,8 (13 aromat. H, NH). I

I 20 N-[4-(2-benzyloxycarbonylethyl)-phenyl]-N-(4-toluen- I

sulfonyl)-acridin-9-earboxamid (7-3). I

I 25 I

Λ^Ο^Ο,,

I 35 I

38 i DK 175493 B1

Udbytte: 77% af teorien 1H-NMR (CDC13) : δ = 2,2-2,8 (m, 7H) ; 5,0 (s, CH2); 6,65-7,0 (AB, 4 aromat. H); 7,3-8,3 (m, 17 aromat. H), N- [4-(2-Carboxyethyl) -phenyl] -N-(4-toluensulfonyl)-5 acridin-9-carboxamidhydrobromid (7-4).

10 20 °

Udbytte: 65% af teorien 1H-NMR (CD3OD) : 5 = 2,1-2,8 (m, CH2-CH2); 2,5 (s, CH3) ; 6,7-8,5 (16 aromat. H) i 25 N- (4- (2-Succinimidoyloxycarbonylethyl) -phenyl) -N- (4- toluensulfonyl)-acridin-9-carboxamid (7-5). 1 35

I DK 175493 B1 I

I 39 I

I (75' I

I io o i rW-t^^Ok

Ly y v^„3 15 o

I Udbytte: 90% af teorien I

I iH-NMR (CDC13) : δ = 2,6 (s, CH3) ; 2,7 (bred, CH2CH2); 2,8 I

I 20 (s, CH2-CH2); 6,6-8,3 (16 aromat. Η) I

I N- [4-(2-Succinimidoyloxycarbonylethyl) -phenyl] -N(4- I

I toluensul fonyl)- 10-methyl-acridinium- 9-carboxamidf luorsul - I

I fonat (7-6). I

I 25 I

I 30 I

I 35 I

40 DK 175493 B1 m c^x5o o=

O

ίο O

rVyJJ ^Τχ

„ X T

Udbytte: 84% af teorien •^-H-NMR (TFA) ·. 6 = 2,6 (s, CH3); 2,3-3,3 (bred baggrund, HH, S, 3,1); 4,9 (s, N-CH3); 6,7-8,8 (16 aromat. H) .

20

Eksempel 7a På analog måde som i de ovenfor angivne eksempler får man N-[4-(N-methylmorpholino-N-2-ethoxy)-phenyl]-N-[4-(2-succinimidoyl-carboxyethyl) -phenylsulfonyl] -10-methylacri-25 din-9-carboxamid-'diium-di-fluorsulfonat. Afvigende fremgangsmådetrin er beskrevet i de følgende reaktionstrin.

3 - (4 -Chlorsulf onyl -phenyl) -propionsyre-tert.butyl-ester (7-al) (7-al) 30 ' · 0 j-v CHo ΛΛ C!-S-P y-V o--CH3 •! 1 \=/ W k

I DK 175493 B1 I

I 41 I

I ' 25 g {0,1 mol) (4-chlorsulfonyl)-2-phenylpropionsyre, I

I 12 ml tert.butanol, 60 ml i-buten og 3 ml koncentreret svovl- I

syre forenes ved -15°C og omrøres intensivt i en autoklave I

I ved stuetemperatur i 24 timer. Den atter til -15° afkølede I

I '5 reaktionsblanding røres i overskydende natriumhydrogencar- I

I bonatopløsning, ekstraheres med methylenchlorid og inddampes I

I til sidst under vakuum. I

I Udbytte: 20,4 g (67% af teorien). Produktet omkrystalliseres I

I fra hexan. I

I 10 ^-H-NMR (CDC13) : δ = 1,4 (s); 2,6 (m) ; 3,0 (t) ; 7,4 (m) ; I

I 7,95 (m) . I

I m I

MS: - = 305 (M+H) I

2 I

I 15 3-(4-Chlorsulfonyl-phenyl) -propionsyre fremstillet på I

I kendt måde ud fra 2-phenylpropionsyre og chlorsulfonsyre. I

| 4-(morpholino-N-2-ethoxy)anilin (7-a2) |

I 20 \-> I

. Λ o

I 30 · I

I NH2 I

I 25 g {0,1 M) 4-(Morpholino-N-2-ethoxy)-nitrobenzen I

I koges med 75 g tingranulat i 400 ml halvkoncentreret saltsyre I

I i 4 timer under tilbagesvaling. Efter afkøling hæves blandin- I

I 35 gen i 400 ml 33%'s saltsyre, den ekstraheres med isopropyl- I

I ether, og den organiske fase inddampes efter tørring. Man I

I får 20 g (90% af teorien) af må1produktet. I

DK 175493 B1 42 ! 1H-NMR (CDC13): δ = 2,5 (t); 2,7 (t); 3,5 (bred); 3,7 (t); 4,0 (t) ; 6,6 (m) m MS: - = 222 (M+) 5 2

Det samme produkt får man ved hydrogenering af nitro- i forbindelsen i methanol over palladium-benkul. j

Nitroforbindelsen fremstilles ifølge Bull. Soc. chim. i

France 1955, 1353-62.

10 N- [4- (Morpholino-N-2-ethoxy) -phenyl) -N- [4- (2-t-butoxy- carbonylethyl)-phenylsulfonamid] (7-a3) (7-a3) O ,JLpw p=h,

Den klare opløsning af 9,3 g (30 mmol) 4-chlorsul-25 fonyl-phenylpropionsyre-t-butylester, 6,9 g 4 -(morpholino-N-2-ethoxy)-anilin og 0,3 g dimethylaminopyridin i 150 ml methylenchlorid udvaskes efter 10 timers henstand ved stuetemperatur med mættet natriumhydrogencarbonat-opløsning, inddampes til 1/3 rumfang og chromatograferes over en kiesel-30 gursøjle med en blanding af 90% methylenchlorid og 10% methanol. Hovedfraktionen af eluatet inddampes.

Udbytte: 9 g (61,2% af teorien).

1H-NMR (CDCI3) : δ = 1,35 (s) ; 2,5 (m) ; 2,7-3,0 (m) ; 3,7 (m); 4,0 (t) ; 6,7-7,0 (m) ; 7,2-7,7 (m) 35 m MS: - = 491 (M+H) 2 I DK 175493 B1

I 43 I

I N- [4-(Morpholino-N-2-ethoxy) -phenyl] -N- [4-(2-t-butoxy- I

I carbonylethyl)-phenylsulfonyl]-9-acridincarboxamid (7-a4) I

I ’ l,-“'

I 10 I

I C.i \ cHs

I v v N—"—(' y—v o--ch3 I

I ffY Γ'—'νζΤΓ 44 DK 175493 B1 ^γΝ·γΧ (7-a5; “ο^Οτλ-λ °» I 1 o is 0,7 g (1 mmol) N-[4-(Morpholino-2-ethoxy)-phenyl]-N-[4- (2-t-butoxycarbonylethyl) -phenylsulfonyl] -9-acridincarbox-amid opløses i 5 ml trifluoreddikesyre og henstår natten 20 over ved stuetemperatur. Man inddamper med vandstrålepum-petryk, opløser i vand og indstiller den filtrerede opløsning til en pH-værdi på 4 med natriumacetat. Det dannede produkt ekstraheres med methylenchlorid, tørres over natriumsulfat og inddampes.

25 Udbytte: 0,6 g (94% af teorien) 1H-NMR (DMSO): δ = 2,6-3,0 (m); 3,0-3,3 (m); 3,6-4,0 (m); 4,0-4,4 (m); 5,8-6,6 (m); 6,8-7,0 (m); 7,3-8,4 (m). m MS: - = 639 (M+) 30 2 N- [4 - (Morpholino-N-2 -ethoxy) -phenyl] -N- [4- (2-suc-cinimidoylcarboxyethyl)-phenylsulfonyl]-9-acridincarboxamid (7-a6) 35

DK 175493 B1 I

7-36 I

- O "Wv, ~b (YY ^

15 ° I

Udbytte: 95% af teorien I

1H-NMR (CDC13): a = 2,3-2,7 (m); 2,8 (s); 2,9-3,4 <m); 3,5- I

20 3,9 (m) ; 3,9-4,3 (tn); 6,2-7,0 (m) ; 7,3-8,3 (m) . I

MS: 736 (M+) I

N- [4- (N-methylmorpholino-N-2-ethoxy) -phenyl] -N- [4- I

(2-succinimidoyl-carboxyethyl)-phenyl-sulfonyl]-10-methyla- I

cridin-9-carboxamidiium-di-fluorsulfonat (7-a7) I

25 I 1

35 I

DK 175493 B1 i 46

D

5 ucu J n o

U-/X, o-JS

•ys^Y ^ 15

Udbytte: 84% af teorien

Forbindelsen opløses i vand til dannelse af én klar opløsning med gul farve.

20 1H-NMR (DMSO) : δ = 2,85 (s); 3,1 (s); 3,2-4,4 (m) ; 4,75 (s); 6,4-8,3 (m)

Eksempel 8

Sporstof-fremstilling til TSH-kemoluminescensimmumbe-25 stemmeisen 91 μΐ antistof (100 μg) 20 μΙ^βΓ af det ifølge eksempel 1 fremstillede acridiniumderivat (forbindelse (6)) (1 mg/ml i acetonitril) og 600 μΐ^ετ konjugationspuffer (0,01 ! M phosphat, pH-værdi = 8,0) inkuberes i 15 minutter. Derefter 30 tilsættes der 200 μliter lysin (10 mg/ml i konjugationspuffer) , og der inkuberes i yderligere 15 minutter. Denne blanding sættes til en "PD 10"-kolonne ("Sephadex" G 25 medium, (kugleformet tværbundet dextrangel, producent firmaet Pharmacia, Sverige)), og elueres med 0,1 M phosphat, pH-værdi = 35 6,3, som elueringsmiddel. Der opsamles 10 dråber pr. frak tion. De enkelte fraktioner afprøves efter egnet fortynding

I DK 175493 B1 I

I 47 I

I med hensyn til deres kemiluminescensaktivitet (350 μΐ oxida- I

I tionsmiddel: 0,1% hydrogenperoxid i 0,1 N natriumhydroxid- I

I opløsning). Sporstoffraktionerne (1. aktivitettop) "forenes" I

I og opbevares ved 4°C. Det brugsfærdige sporstof til h-TSH- I

I 5 kemoluminescensimmunbestemmelsen fremstilles ved egnet for- I

I tynding med en phosphatpuffer (0,1 M phosphat, pH-værdi = I

I 6,3, 1% "Tween" 20, (Polyethylensorbitanmonolaureat, produ-. I

I cent eksempelvis ICI American Inc., USA), 0,1% okseserumal- I

I bumin, 0,1 M NaCl, 0,02% Na^) . I

I 10 I

I Eksempel 9 I

I Gennemføring af h-TSH-kemoluminescensimmunbestemmelsen I

I 50 μΐΐίετ standard/prøve og 200 μΙ^εΓ sporstof omrys- I

I tes ved stuetemperatur i med monoklonale anti-TSH-antistoffer I

I 15 belagte prøverør. Derefter vaskes der 3 gange med l ml puffer I

I eller destilleret vand. Lysemissionen sker ved tilsætning I

I af hver gang 300 μΐ aktiveringsreagens (pH 1-puffer, 0,5% I

I hydrogenperoxid og 300 μϋίεΓ startreagens (0,2 N natrium- I

I hydroxid-opløsning)) lige 2 dispensorer i luminometeret i I

I 20 prøverørene. Måletiden er 1 sekund. I

I På fig. 3 er vist det typiske forløb af en standard- I

I kurve for en ikke immuno-kemiluminometrisk bestemmelse (ICMA) I

I for det humane thyreoidea-stimulerende hormon (h-TSH). I 1

25 I

Claims (21)

1. 48 DK 175493 B1
2. 1. Kemiluminescerende acridiniumderivater med formlen I ' · <$> . 0=C—R4 10 hvori , , "R3 , R4 °9 Αθ har følgende betydriinger: : hydrogen en alkyl-, alkenyl- eller alkynylgruppe med højst 10 carbonatomer en benzyl- eller arylgruppe; 15 R2 og R3: hydrogen en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer en substitueret eller usubstitueret aminogruppe en carboxy-, alkoxy-, cyano- eller nitrogruppe 20 eller halogen; R4: en gruppe med formlen II eller· III Re 25 —N S02—X—R5 (II) X-Rs 3 0 —N (Hl) S02—Re R5: en reaktiv gruppe, som under skånsomme betingelser selektivt kan 35 indgå en binding med amino-, carboxy-, thiol- eller andre funktionelle grupper i stoffer af I DK 175493 B1 I I 49 I I biologisk interesse; I I Rg: en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer eller I I en phenylgruppe, der kan være susbtitueret med I I 5 højst 3 alkyl- eller alkoxygrupper med hver især I I 1-4 carbonatomer I I med en -(-0-CH2-CH2-)n-0R gruppe, hvor I I n er 0 til 8, og I I R er en morpholinoethyl- eller en N,N-di- I I 10 methylaminoethyl- eller en alkoxygruppe I I med 1-4 carbonatomer, eller med en ethylen- I I dioxygruppe; og I I X: en arylgruppe, som I I 15 er bundet direkte eller over en alkylen- I I eller oxyalkylengruppe til nitrogen- eller I I svovlatomet, I og er bundet over en alkylen- eller oxy I I alkylengruppe til gruppen R5, og I I 20 som også kan være substitueret en eller I flere gange med alkyl-, alkenyl-, hydroxy-, I I amino-, alkoxy- eller aryloxygrupper og/- I I eller heteroatomer eller I I betyder en aromatisk naturlig aminosyrerest I I 25 eller I I er en phenylengruppe - når R^ er en phenylgrup- I I pe - som er substitueret én eller flere gange I I med alkylgrupper med 1-6 carbonatomer og I I 30 A": en anion, som ikke forringer kemiluminescensen. I
3. 2. Acridiniumderivater ifølge krav 1,kendetegnet I I ved, at X er en gruppe med formlen IV I DK 175493 B1 50 (>V) 5 hvori R7 er en substituent med formlen -(CH2)n- eller ((CH2)m-10 O-)n-, hvori n = 0-4 og m = 1-6; R8 er en substituent med formlen -{CH2)p-, - (0- {CH2)m-)p eller - ({(¾)m-O)p, hvori p = 1-6 og m = 1-6 i ortho-, meta- eller parastilling til 15 R7 eller en forgrenet eller uforgrenet carbonhydridgruppe med 1-4 carbonatomer; og R9 til er hydrogen, ligekædede eller forgrenede carbon- 20 hydridgrupper med højst 30 arbonatomer, idet én eller flere -CH2-enheder kan være ombyttet med O, S, SO, NH eller N-alkyl, og to af disse substituenter kan være bundet sammen til en ring. 25
4. 3. Acridiniumderivater ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at R5, er en gruppe med formlen V: O 30 °4 y~\ C-O-N (V) ' Γ 35 I DK 175493 B1 I I 51 I
5. 4. Acridiniumderivater ifølge kravene 1-3, kendete g- I I net ved formlen VI I I ^ A- I I (V,) - I I I I 10 ^-x-c?o-NM I lo i I hvori X er en gruppe med formlen VII I I 15 I I —ζ~\~ (°^)n- (Vil) I I hvori I I 20 n = 2 eller 4 og I I R12 og Ri3 uafhængigt af hinanden er hydrogen, en alkylgrup- I I pe, en alkoxygruppe med 1-4 carbonatomer, en -(0-CH2"CH2- I I )n-OR gruppe-, idet I I n er 0-8, og I I 25 R er en morpholinoethyl- eller en N,N-dimethylaminoethyl- I I eller en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer I I eller sammen er en ethylendioxygruppe; og I A" har den i krav 1 angivne betydning. I I 30 I
6. 5. Acridiniumderivat ifølge krav 4,kendetegnet I I ved, at I R er en morpholinoethyl- eller en Ν,Ν-dimethyl- I I 35 aminoethylgruppe, I I samt de kvaternære ammoniumforbindelser. I 52 DK 175493 B1
7. 6. Acridiniumdrivat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at X er en p-ethylenphenylgruppe og R-j_2 er et hydrogenatom og R33 er en p-methoxygruppe, 5 eller R12 er en o-methoxygruppe og R33 er en p-methoxygrup pe, eller R^2 og R^3 sammen er en 3,4-ethylendioxygruppe.
8. 7. Acridiniumderivat ifølg mindst et af kravene 1-2, ken detegnet med formlen VIII CH3 A- (ΝΛΙΙ) 15 9 </C V* C'°^NC3 SOrRe f O 20 hvori X har-den i krav 1 eller 2 angivne betydning, og r6 er en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer eller en phenylgruppe, som kan være substitueret med højst 3 alkyl-eller alkoxygrupper med hver især 1-4 carbon- 25 atomer, med en -(-0-CH2‘CH2-)n-0R gruppe, idet n er 0-8, og R er en morpholinoethyl- eller en N,N-dimethyl-aminoethyl- eller en alkylgruppe med 1-4 carbon-30 atomer, eller kan være substitueret med en ethylendioxygruppe; eller hvori X er en o-, m- eller p-phenylengruppe, og R6 er en phenylgruppe, som kan være susbtitueret 35 med højst 3 alkylgrupper med hver især 1-4 car bonatomer. DK 175493 B1 I
9. 53 I
10. 8. Acridiniumderivat ifølge krav 7,kendetegnet I ved, I R er en morpholinoethyl- eller en Ν,Ν-dimethyl- I aminoethylgruppe, I 5 samt de kvaternære amoniumforbindelser. I
11. 9. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser ifølge et I af kravene 1-8, kendetegnet ved, man omsætter en I forbindelse-med formlen IX I 10 i^VNv^ I UOQ (ix) I C I 15 s \ i O y I med en beskyttet sulfonamidcarboxylsyre med. formlen X I Η O I 2o i ii I Re-SOjN-X-C- ej (X) I eller med foonlen XI I
12. 25. I Re - N - S02 -X -COOZ (XI) i hvilke formler: Y betyder halogen, en- oxycarbonyl alkyl -, I 30 oxycarbonylaryl- eller imidazolidgruppe, X og Rg har de i I krav 1 anførte betydninger, og Z betyder en gruppe, som I beskytter carboxygruppen, og som efterfølgende fraspaltes, I og den derved dannede syrer omsættes til det ønskede acri- I diniumderivat, som indeholder gruppen R5, og som derefter I 35 kvaternæriseres ved nitrogenatomet i acridinskellettet. I 54 DK 175493 B1
13. 10. Luminescensforbindelse, kendetegnet ved, et acridiniumderivat ifølge et af kravene 1-9 er bundet direkte eller over et bromolekyle til et protein, et polypeptid eller til et andet stof af biologisk interesse under dannelse 5 af et stabilt, immunologisk aktivt konjugat.
14. 11. Luminescensimmunoassay til bestemmelse af et antigent stof i en væskeprøve, ved hvilken i en kompetitiv- eller sandwich-metode mindst en immunologisk aktiv komponent im- 10 mobiliseres på en fast fase, og mindst en anden komponent, traceren, repræsenterer en luminescensforbindelse ifølge krav 10.
15. 12. Luminescensimmunoassay ifølge krav li, kendete g-15 net ved, at man a) inkuberer et med et antigen specifikt reagerende, immobiliseret antistof med en prøve af den væske, som skal undersøges, og et konjugat af antigenet og et kemiluminescerende acridiniumderivat ifølge krav 20 l; b) adskiller prøven og det ikke-bundne, markerede konjugat; 25 c) sammenbringer det bundne, markerede konjugat suc cessivt eller samtidigt med ét eller flere reagenser til frembringelse af en lysemmision og d) bestemmer mængden af det tilstedeværende antigen 30 ud fra den målte styrke af lysemmisionen. 1 Luminescensimmunoassay ifølge krav 12, kendetegnet ved, at væsken, som skal undersøges, adskilles fra det immobiliserede antistof, inden tilsætningen af konjugatet 35 med markør. I DK 175493 B1 I I 55 I
16. 14. Luminescensimmunoassay ifølge krav 11, k e n d e t e g- I I net ved, at man I I a) inkuberer et med antigenet specifikt reagerende, I I immobiliseret antistof med en prøve af den væske, I I 5 som skal undersøges, og et konjugat af et andet, I I specifikt reagerende antistof og et kemiluminescerende I I acridiniumderivat ifølge krav l; I I b) adskiller prøven og det ikke-bundne, markerede I I 10 konjugat; I I c) sammenbringer det bundne, markerede konjugat sue- I I cessivt eller samtidigt med ét eller flere reagenser I I til frembringelse af en lysemmision, og I I 15 I I d) bestemmer mængden af det tilstedeværende antigen I I ud fra den målte styrke af lysemissionen. I
17. 15. Luminescensimmunoassay ifølge krav 14,kendete g- I I 20 n e t ved, at væsken, som skal undersøges, isoleres fra I I det immobiliserede antistof, inden tilsætning af det mar- I I kerede konjugat. I
18. 16. Luminescensimmunoassay ifølge krav 11, kendete g- I I 25 n e t ved, at man I I a) inkuberer et med antistoffet specifikt reagerende, I I immobiliserede antigen med en prøve af den væske, I I som skal undersøges, og en opløsning af et konjugat I I af antistoffet og et kemiluminescerende acridinium- I I 30 derivat ifølge krav 1; I I b) adskiller prøven og det ikke-bundne, markerede I I konjugat; I I 35 c) sammenbringer det bundne, markerede konjugat sue- I I cessivt eller samtidigt med et eller flere reagenser I 56 DK 175493 B1 til fremkaldelse af en lysemission, og d) bestemmer mængden af det tilstedeværende antigen ud fra den målte styrke af lysemissionen. 5
19. 17. Luminescensimmunoassay ifølge krav 11,'ke ndet egne t ved, at man a) inkuberer et med antistoffet specifikt reagerende, immobiliseret antigen med en opløsning af et konjugat 10 af antistoffet og et kemi liimine seer ende acridinium- derivat ifølge krav 1; b) fraskiller det uomsatte, markerede konjugat, 15 c) tilsætter en prøve af væsken, som skal undersøges, d) fraskiller derefter atter prøven, e) sammenbringer det bundne, markerede konjugat suc- 20 cessivt eller samtidigt med et eller flere reagenser til fremkaldelse af en lysemission, f) bestemmer mængden af det tilstedeværende antigen ud fra den målte styrke af lysemissionen. 25
20. 18. Luminescerensimmunoassay ifølge krav 11, kendetegnet ved, at man a) inkuberer et med antistoffet specifikt reagerende immobiliseret antigen med en opløsning af et konjugat 30 af antistoffet og et kemiluminescerende acridinium- derivat ifølge krav l; b) tilsætter en prøve af den væske, som skal undersøges, 35 c) adskiller prøven og det ikke-bundne konjugat; DK 175493 B1 I
21. 57 I d) sammenbringer det bundne, markerede konjugat sue- fl cessivt eller samtidigt med ét eller flere reagenser I til frembringelse af en lysemission, og I 5 e) bestemmer mængden af det tilstedeværende antigen I ud fra den målte styrke af lysemisionen. I