FI90537B - Kemiluminesoivia arkidiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immuunimäärityksissä - Google Patents

Description

1 90537

Kemiluminesoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistuts ja niiden käyttö luminesenssi-immuunimäärityksissä Tämä keksintö koskee kemiluminesoivia akridiinijoh-5 dannaisia, menetelmää niiden valmistamiseksi ja niiden käyttöä luminesenssiin perustuvissa immunologisissa määrityksissä.

Luminesoivilla yhdisteillä on jo monenlaista käyttöä. Niitä käytetään indikaattoreina biologisissa määri-10 tyksissä, entsymaattisissa immuunimäärityksissä ja lu-minesenssiimmuunimäärityksissä (ks. W.P. Collins, Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985) mutta myös nukleiinihappohybridisaatiomäärityksissä [ks. J.A. Matthews et al., Analytical Biochemisty 151 15 (1985) 205-209]. Lisäksi kemiluminesoivia yhdisteitä käy tetään "virtausinjektioanalyysissä", pylväänjälkeisissä detektoreissa nestekromatografiässä, virtaustutkimuksessa ja keinovalonlähteissä.

Erityisesti kaksi kemiluminesoivien merkkiaineiden 20 rakennetyyppiä on saavuttanut suurempaa merkitystä kemilu- minesenssi-immuunimäärityksissä. Kysymyksessä ovat ensinnäkin luminoli- ja isoluminolijohdannaiset, joita on kuvattu artikkelissa H.R. Schroeder et ai., Methods in Enzy-mology 57 (1978) 424 (Academic Press Inc., New York) sekä 25 GB-patenttijulkaisuissa 2 008 247 ja 2 041 920, DE-patent-tijulkaisuissa 2 618 419 ja 2 618 511 ja EP-hakemusjulkaisussa 135 071. Katsaus isoluminoliyhdisteiden käyttöön luminesenssi-indikaattoreina käytännössä löytyy artikke-lista W.G. Wood, J. Clin, Chem. Clin. Biochem. 22 (1984) • 30 905-918.

Toisaalta myös akridiniumesteriyhdisteitä on käytetty kemiluminesoivina merkkiaineina. Sellaisia akridi-niumestereitä tunnetaan US-patenttijulkaisu 3 352 791, GB-patenttijulkaisujen 1 316 363 ja 1 461 877 sekä EP-hake-35 musjulkaisun 82 636 perusteella. Akridiniumestereiden 2 90537 käyttöä merkkiaineina immunologisissa määrityksissä kuvaavat Weeks et ai., elin Chem. 29/8 (1983) 1474-1479. Myös fenantridiniumestereiden käyttö merkkiaineina luminenssi-immuunimäärityksissä on jo tunnettua EP-hakemusjulkaisun 5 170 415 perusteella.

Akridiniumestereiden kemiluminenssi voidaan käynnistää emäksistä H202-liuosta lisäämällä. Kemiluminesenssin mekanismin on selittänyt vakuuttavasti F. McCapra, Acc. Chem. Res. 9 (1976) 201. Irtoavien ryhmien laatu on siinä 10 ilmeisesti ratkaiseva sekä valokvanttituoton että hydro- lyyttisen stabiilisuuden kannalta.

Jo tätä ennen tunnettujen akridiniumestereiden etuna luminoli ja isoluminoliyhdisteisiin nähden on syntyvien valokvanttien suurempi määrä, jota indikaattoriin sitoutu-15 neet proteiinitkaan eivät pienennä [ks. Weeks et ai., Clin. Chem. 29/8 (,983) 1474 - 1479].

Vaikka EP-hakemusjulkaisun 82 636 perusteella tunnetuille akridiniumfenyyliestereille on heikoilla hapetti-milla tapahtuvassa kemiluminesenssin eksitaatiossa ominai-20 sta suuri detektioherkkyys, niillä on niiden käyttämistä käytännössä häiritseviä puutteita. Ennen kaikkea fenyy-liesteriyhdiste on vettä sisältävissä systeemeissä erittäin labiili jo huoneenlämpötilassa. Sen lisäksi akri-diniumfenyyliestereillä esiintyy siinä ilmoitetuissa hape-25 tusolosuhteissa valonemissiota, joka lakkaa suurimmaksi osaksi, so. yli 95-%:isesti, vasta noin 10 sekunnin kuluttua. Lisäksi muissa ei-isotooppimääritysmenetelmissä mittausajat ovat suhteessa paljon lyhyempiä, ja ne mahdollistavat siten suuremman näytemäärän läpikulun.

30 On jo ehdotettu sellaisten kemiluminesoivien akri- diniumjohdannaisten käyttöä, joilla reaktiokinetiikka on nopeampi valokvanttituoton ollessa suuri ja jotka tekevät siten lyhyet mittausajat mahdollisiksi luminesenssi-im- ____ muunimäärityksessä (ks. DE-hakemusjulkaisu P 3 628 573.0).

35 Kysymyksessä ovat akridiniumjohdannaiset, joiden kaava on 3 90537 rA αθ rb -CT rc

5 D

O = C R

jossa Ra on vety, alkyyli-, alkenyyli- tai alkynyyliryhmä, joka sisältää 1-10 hiiliatomia, tai bentsyyli- tai aryyli-ryhmä; R1* ja Rc ovat kumpikin erikseen vety, 1-4 hiiliato-10 mia sisältävä alkyyliryhmä, substituoitu tai substituoima-ton aminoryhmä,karboksyyli-, alkoksyyli-, syaani- tai nit-roryhmä tai halogeeni; RD on ryhmä, jossa sulfonamidiryhmä on sitoutunut typen välityksellä suoraan karbonyyliryh-mään, tai tioalkyyli- tai tioaryyliryhmä, jonka kaava on 15 —S-Y—re, jossa Y on haaroittunut tai haarautumaton alifaattinen tai aromaattinen ryhmä, joka voi sisältää myös heteroatomeja, 20 ja Re on reaktiivinen ryhmä, joka miedoissa olosuhteissa pystyy selektiivisesti muodostamaan sidoksen biologisesti kiinnostavissa aineissa esiintyvien amino-, karboksyyli-tai tioliryhmien tai muiden funktionaalisten ryhmien kanssa; ja fp on anioni, joka ei vaikuta haitallisesti kemilu-25 minesenssiin.

Nyt on käynyt ilmi, että määrätyt akridiniumjohdannaiset soveltuvat erinomaisen stabiilisuutensa ja odottamattoman suuren detektioherkkyytensä vuoksi erityisen hyvin käytettäviksi kemiluminesoivina yhdisteinä. Sen mukai-30 sesti keksintö koskee kaavan (I) mukaisia kemiluminesoivia akridiniumjohdannaisia, 4 90537 R A® 5 1 (I) 1 4

o = C - R

jossa R1 on vety tai alkyyliryhmM, joka sisältää 1-10 hiiliatomia, R4 on ryhmä, jolla on kaava (II) tai (III) 10 6

R

/

5 (ID

SO -X-R 2 15 5 -t

X-R

'N\ 6 i111» SO -R 2 20 joissa R5 on ryhmä, jolla on kaava V: 0 °*_ 25 «

- C - 0 - N

J-J <V>

O

R6 on fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu 1-4 C-atomia 30 sisältävillä alkyyli-, tai alkoksyyliryhmillä tai morfo- lino(C1-C4)-alkoksiryhmällä, X on fenyyliryhmä, joka on sitoutunut suoraan typpi- tai rikkiatomiin ja CM-alkyyliryhmän välityksellä ryhmään R5, ja /P on anioni, joka ei vaikuta haitallisesti kemilumi-35 nointiin.

1, 5 9G537

Aineilla, joilla on biologisesti mielenkiintoa, tarkoitetaan ennen kaikkea antigeenejä. Tämän käsitteen piiriin kuuluvat esimerkiksi hormonit, steroidit, lääkeaineet, lääkeaineiden metaboliitit, toksiinit, alkaloidit ja 5 myös vasta-aineet.

Aminokarboksyylihapoiksi soveltuvat esimerkiksi glysiini, alaniini, seriini, fenyylialaniini, histidiini, α-aminovoihappo, metioniini, väliini, norvaliini, leusii-ni, isoleusiini, norleusiini, asparagiinihappo, glutamii-10 nihappo, 4-aminobentsoehappo, 4-aminofenyylietikkahappo, 4aminobentsoehappo, 4-aminofenyylietikkahappo, 4-aminofe-noksietikkahappo ja 3-(4-amino)fenyylipropionihappo.

Anionina, joka ei vaikuta haitallieesti kemilumi-nesenssiin, voi olla esimerkiksi tetrafluoriboraatti-, 15 perkloraatti-, halogenidi-, alkyylisulfaatti-, halogeeni- sulfonaatti-, alkyylisulfonaatti- tai aryylisulfonaatti-anioni. Voidaan myös käyttää mitä tahansa muuta anionia, kunhan se ei tukahduta tai heikennä kemiluminesenssia.

Heteroalkyyliryhmät tai heterosykliset ryhmät si-20 sältävät edullisesti heteroatomeja, jotka myötävaikuttavat keksinnön mukaisten yhdisteiden vesiliukoisuuden paranemiseen, kuten esimerkiksi typpeä, happea, rikkiä, fosforia tai niiden yhdistelmiä. Erityisen sopivia heterosyklisiä renkaita ovat esimerkiksi morfOliini, piperatsiini, pipe-25 ridiini, tetrahydrofuraani, dioksaani jne.

Erityisen merkittäviä ovat patenttivaatimuksen 1 mukaiset akridiniumjohdannaiset, joille on tunnusomaista, että X on ryhmä, jolla on kaava IV

30 -R7-^Ö^> (IV) jossa R7 on substituentti, jonka kaava on -(CH2)n, jossa n on 0-4.

6 90537

Erityisen tärkeä keksinnön mukaisten akridiniumjohdannaisten käyttömahdollisuuksia ajatellen on substituent-ti R5. Valitsemallla tämä ryhmä sopivasti tulee akridinium-johdannaisen raktiivisuus niin suureksi, että se pystyy jo 5 miedoissa olosuhteissa muodostamaan selektiivisesti sidoksen jonkin sen määrittävän biologisen aineen funktionaalisen ryhmän kanssa. Keksinnön mukaisessa yhdisteissä R5 on:

O

0 V-,

Il /

10 -C - O - N

(v) o

Lisäksi erityisen sopiviksi ovat osoittautuneet akridiniumyhdisteet, jotka vastaavat kaavaa VI. Kaavassa

15 VI

CH _ '.3 A® R^ ^2 20 a ASf1 on N—f o (vi)

2 yJ

O

25 X on ryhmä, joka vastaa kaavaa VII, -<S>-<CVn- <VII) jossa n on 2 tai 4, 30 R12 ja R13 ovat kumpikin itsenäisesti vety, alkyyli- tai al- koksyyliryhmä, joka sisältää 1-4 C-atomia, tai morfolino-(C,-C4) -alkoksiryhmä, ja /ftlla on patenttivaatimuksessa 1 mainittu merkitys. Nämä yhdisteet ovat helposti veteen liukenevia tuotteita.

tl 7 90537

Viimeksi mainituista yhdisteistä, jotka vastaavat kaavaa VI, aivan erityisen edullisia ovat puolestaan sellaiset, joissa X on p-etyleenifenyyliryhmä, R12 on H ja R13 on p-metoksyyliryhmä tai R12 on o-metoksyyliryhmä ja R13 on 5 p-metoksyyliryhmä, kuten esimerkiksi yhdisteet, joiden kaava on CH Αθ

«rL

10 λ /sy

ON . O

\ nr\ s 0 SO -CH -C ^_ 2 2 2 \ r-

O - N

15 0^

Lisäksi erityisen sopivia ovat akridiniumjohdannai-set, joilla on kaava VIII

,n CH Αθ 20 I 3 oco I o //\ /X~ ‘ c\ λ~| (VIII)

C 25 0 \ 6 ° - VJ

SO - R ry 2 jossa R6 on fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu korkeintaan kolmella alkyyli- tai alkoksiryhmällä tai morfo-. 30 lini (C,-C4)-alkoksiryhmällä, ja X:llä on patenttivaatimuk sessa 1 tai 2 mainittu merkitys tai R6 on fenyyliryhmä, joka voi olla korkeintaan kolmella Cj^-alkyyliryhmällä substituoitu, ja X on o-, m tai p-fenyleeniryhmä. Nämäkin yhdisteet ovat helposti veteen liukenevia tuotteita.

8 90537

On yllättävää, että amiditypessä sulfonyylisubsti-tuentin sisältävällä akridinium-9-karboksyylihappoamidilla ilmenee erinomaista kemiluminesenssia, sillä tiedetään, ettei akridinium-9-karboksyylihappoamideilla päinvastoin 5 kuin akridinium-9-karboksyylihappoestereillä esiinny minkäänlaista kemiluminesenssia (ks. F. McCapra teoksessa W. Carruthers ja J.K. Sutherland, Progress in Organic Chemistry, osa 8, Butterworth, Lontoo, 1973, s. 231-277).

Eräs keksinnön mukaisten akridiniumyhdisteiden mer-10 kittävä etu EP-hakemusjulkaisusta 82 636 tunnettuihin ak-ridiniumfenyyliestereihin verrattuna on huomattavasti nopeampi valonemissioon liittyvä reaktiokinetiikka (ks. DE-hakemusjulkaisu P 3 628 573.0).

Toisen edun tarjoaa keksinnön mukaisten yhdisteiden 15 avulla valmistetun merkkiaineen stabiilisuus. Kuviossa 1 on esitetty stabiilisuuskokeen, jossa mitattiin kulloisenkin kemiluminesenssisignaalin intensiteetti korotetussa lämpötilassa (50 °C) säilytyksen jälkeen, tulokset. Käyrä a liittyy yhdisteestä N-(4-metoksifenyyli)-N-[4-(2-suk-20 kinimidoyloksikarbonyylietyyli)bentseenisulfonyyli]-10- metyylikridinium-9-karboksyylihappoamidifluorisulfonaatti (6), käyrä b yhdisteestä N-(4-metoksifenyyli)-N-[4-(4-suk-kinimidoyloksikarbonyylibutyyli) bentseenisulfonyyli]-10-metyyliakridinium-9-karboksyylihappoamidifluorisulfonaat-25 ti (11) ja käyrä c yhdisteestä 4-(2-sukkinimidoyloksikar-bonyy li etyyli) fenyyli-10-metyyliakridinium-9-karboksylaat-timetosulfaatti (EP-hakemusjulkaisu 82 636, s. 10) valmistettuun merkkiaineeseen.

On selvästi havaittavissa, että keksinnön mukaiset, --- 30 yhdisteistä a ja b saatavat merkkiaineet ovat stabiilimpia kuin vastaava c:stä saatava yhdiste.

Samankaltaisia tuloksia saavutetaan vastaavassa kokeessa 4 °C:ssa. Kuviossa 2 on esitetty signaalin intensiteetti 4 °:ssa säilytyksen jälkeen. Taaskin yhdisteestä . 35 a valmistettu merkkiaine näyttää ratkaisevasti stabiilimmalta kuin yhdisteestä c valmistettu.

li 9 90 537

Keksinnön mukaisten akridiniumsulfonamidi johdannaisten valmistuksessa voidaan käyttää lähtöaineena akridii-ni-9-karboksyylihappokloridia (IX). Tämän yhdisteen valmistamiseksi annetaan esimerkiksi akridiinin reagoida Leh-5 mstedtin ja Hundertmarkin esittämän menetelmän [Ber. 63 (1930) 1229] mukaisesti kaliumsyanidin kanssa etanolietik-kahapposeoksessa, jolloin muodostuu 9-syaaniakridiini. Siitä saadaan edullisesti uudelleenkiteytyksen jälkeen Lehmtedtin ja Wirthin esittämän menetelmän [Ber. 61 (1928) 10 2044] reaktiolla rikkihapon ja natriumnitriitin kanssa ak- ridiini-9-karboksyylihappo. Antamalla akridiini-9-karbok-syylihapon reagoida esimerkiksi tionyylikloridin kanssa saadaan yhdiste, joka vastaa kaavaa IX, 15 coo (IX) # \

O Y

20 jossa Y tarkoittaa klooria. Y voi yhdisteessä IX olla halogeenin sijasta myös oksikarbonyylialkyyli-, oksikarbo-nyyliaryyli- tai imidatsolidiryhmä.

Happokloridin (IX) voidaan sitten antaa reagoida suojatun sulfonamidikarboksyylihapon kanssa, joka vastaa ... 25 kaavaa X

HO

. 1 li R-S02-N—X—C-OZ (X) 30 tai kaavaa XI,

H

R6-N-S02-X-C00Z

... · 35 joissa kaavoissa X:llä ja R6:lla on edellä mainitut roerki- 10 90537 tykset ja Z on karboksyyliryhmää suojaava ryhmä, joka myöhemmin poistetaan. Tässä reaktiossa voidaan käyttää esi-merkiksiN-(4-bentsoksikarbonyylifenyyli)-N-4-tolueenisul-fonihappoamidia. Edullisesti käytetään t-butyyliesteriä, 5 jonka suojausryhmä voidaan tuoda molekyyliin ja taas poistaa siitä erityisen miedoissa olosuhteissa.

Suojausryhmän poiston jälkeen syntyvä happoryhmä muunnetaan sitten sopivalla yhdisteellä, esimerkiksi N-hydroksisukkinimidillä, ryhmäksi R5. Tästä yhdisteestä saa-10 daan kemiluminesoiva akridiiniyhdiste alkyloimalla 10-ase-massa sijaiseva typpi.

Saatavat akridiniumyhdisteet voidaan sitten panna reagoimaan jonkin biologista mielenkiintoa omaavan aineen, esimerkiksi antigeenin, vasta-aineen, hormonin, lääkeai-15 neen, lääkeaineen metaboliitin, toksiinin tai alkaloidin, kanssa luminesoivan yhdisteen aikaansaamiseksi. Tällöin akridiniumjohdannainen sitoutuu joko suoraan tai siltamo-lekyylin, kuten esimekriksi aminohapon, oligo- tai poly-aminohapon, peptidin tai synteettisen polymeerin, välityk-20 sellä biologisesti kiinnostavaan aineeseen, jolloin muodostuu stabiili, immunologisesti aktiivinen konjugaatti. Tätä konjugaattia kutsutaan myös merkkiaineeksi (tracer) ja käytetään jäljempänä kuvatuissa luminesenssi-immuuni-määrityksissä. Antigeenisen aineen määrittämiseksi nes-25 tenäytteestä kompetitiivisella tai kerrosmenetelmällä keksinnön mukaista luminesenssi-immuunimääritystä varten tarvitaan ainakin yksi immunologisesti aktiivinen komponentti, joka on immobilisoitu kiinteälle faasille, sekä lisäksi luminesoiva merkkiaine.

30 Immuunireaktion päättymisen ja mahdollisesti tar vittavien pesuvaiheiden jälkeen valonemissio laukaistaan lisäämällä perätysten tai yhtäaikaisesti yhtä tai useampaa reagenssia ainakin yhden reagenssin sisältäessä jotakin hapetinta sidotussa tai sitomattomassa muodossa. Lumine-35 senssi-immuunimääritys voidaan sitten toteuttaa eri tavoin.

l! 11 90537

Eräs mahdollisuus on se, että antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua vasta-ainetta inku-boidaan tutkittavasta nesteestä otetun näytteen ja antigeenistä jakemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta 5 koostuvan konjugaatin (antigeenimerkkiaineen) kanssa, näyte ja sitoutumaton merkkiaine erotetaan, sitoutunut merkkiaine saatetaan kosketuksiin tarvittavien reagenssien kanssa valonemission aikaansaamiseksi ja sen jälkeen määritetään läsnä olevan antigeenin määrä mitatusta valonemi-10 ssion voimakkuudesta.

Toinen mahdollisuus luminesenssi-immuunimääritysten toteuttamiseksi on se, että antigeenin kanssa spefisesti reagoivaa immonilisoitua vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavasta nesteestä otetun näytteen ja toisesta spesifisesti 15 reagoivasta vasta-aineesta ja kemiluminesoivasta akridii-nijohdannaisesta koostuvan konjugaatin kanssa, näyte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan, sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan kosketuksiin tarvittavien reagenssien kanssa valonemission aikaansaamiseksi ja mää-20 ritetään läsnä olevan antigeenin määrä mitatusta valonemi ssion voimakkuudesta.

Edellä mainitut luminesenssi-immuunimääritykset voidaan toteuttaa myös siten, että ennen merkityn konjugaatin lisäystä tutkittava neste erotetaan immobilisoidus- .25 ta vasta-aineesta.

Toisissa keksinnön mukaisesti tehtävissä luminesen-ssi-immuunimäärityksissä ei immobilisoida vasta-ainetta vaan antigeeni. Silloin vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immonilisoitua antigeeniä inkuboidaan tutkitta-30 vasta nesteestä otetun näytteen ja vasta-aineesta ja kemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa, sen jälkeen näyte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan ja sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan sitten kosketuksiin tarvittavien rea- 35 genssien kanssa. Silloin ilmenee valonemissiota, jonka 12 90537 voimakkuuden perusteella voidaan määrittää läsnä olevan antigeenin määrä.

Vielä yksi vaihtoehto on se, että vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua antigeeniä 5 inkuboidaan vasta-aineesta ja kemiluminesoivasta akri-diniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa, reagoimaton merkitty konjugaatti erotetaan, lisätään tutkittavasta nesteestä otettu näyte, joka sitten taas erotetaan, sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan kos-10 ketukseen tarvittavien reagenssien kanssa valonemission aikaansaamiseksi ja emission voimakkuudesta määritetään sitten läsnä olevan antigeenin määrä.

Luminesenssi-immuunimääritys voidaan vielä tehdä myös niin, että vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa 15 immobilisoitua antigeeniä inkuboidaan vasta-aineesta ja kemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa, lisätään tutkittavasta nesteestä otettu näyte, näyte ja sitoutumaton konjugaatti erotetaan, sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan kosketuksiin 20 tarvittavien reagenssien kanssa ja sen jälkeen määritetään mitatusta valonemissiosta läsnä olevan antigeenin määrä.

Keksinnön mukaisten akridiniumyhdisteiden valmistusta valaisevat tarkemmin esimerkit 1-7.

Esimerkki 1 . ' 25 N- (4-metoksifenvvli) -4-Γ4 - (2-bentsvloksikarbonvvlietvvli) - bentseenisulfonyylilakridiini-9-karboksyylihappoamidi (3)

Liuokseen, joka sisältää 17 g 4'-[N-(4-metoksife-nyyli)sulfonamido]-3-fenyylipropionihaponbentsyyliesteriä (1) 400 ml:ssa dikloorimetaanissa, sekoitetaan 460 mg 4-30 (Ν,Ν-dimetyyliamino)pyridiiniä ja 22,1 ml trietyyliamii-nia, 10 minuuttia myöhemmin lisätään 11,12 g akridiini-9-karboksyylihappokloridihydrokloridia (2), ja seosta ref-luksoidaan 6 tuntia. Jäähdytettyä liuosta sekoitetaan lyhyesti 2 N NaOHrn kanssa, ja erotettu orgaaninen faasi 35 pestään vedellä, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja väke- 13 90 537 vöidään. Jäännös puhdistetaan pylväskromatografiän avulla. Saanto: 60 %

Sulamispiste: 130-132 °C

NMR (DMSO, 100 MHz); S = 2,7-3,0 (d, leveä, 2H); 3,0-3,3 5 (d,leveä, 2H); 3,5 (s, leveä, 3 H); 5,1 (s, 2H); 6,5 (d, leveä, 2H) ; 7,1 (d, leveä, 2 H); 7,35 (s, 5 H); 7,5-8,3 (m, 12 H) ppm N-(4-metoksifenvvli)-N-Γ4-(2-karboksietvvli)bentseenisul-fonvvlilakridiini-9-karboksvvlihappoamidihvdrobromidi (4) 10 6,3 g:n erää yhdistettä 3 kuumennetaan 30 ml:ssa seosta, joka sisältää 33 % HBr:a jääetikassa, 60 0:ssa 2 tuntia, ja jäähdytyksen jälkeen lisätään 60 ml di-isopro-pyylieetteriä ja sakka erotetaan imusuodattamalla ja kuivataan alipaineessa.

15 Saanto: 90 %

Sulamispiste: 237 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz); S- 2,7 (d, leveä, 2 H); 3,1 (d, leveä, 2 H); 3,5 (s, leveä, 3 H); 6,5 (d, leveä, 2 H); 7,0-8,4 (m, 15 H )ppm 20 N-(4-metoksifenvvli)-Ν-Γ4-f2-sukkinimidovloksikarbonvvli- etvvli) bentseenisulfonvvli 1 akridiini-9-karboksvvlihappo-amidi (5)

Liuokseen, joka sisältää 3,1 g yhdistettä 4 50 ml:ssa tetrahydrofuraania, sekoitetaan 1,41 ml trietyylia-25 miinia, seos jäähdytetään -20 °C:seen ja siihen lisätään 0,474 ml kloorimuurahaishapon etyyliesteriä. Seosta jäl-kisekoitetaan 20 minuuttia, siihen lisätään 575 mg N-hyd-roksisukkinimidiä, tätä seosta sekoitetaan -20 °C:ssa 3 tuntia, ja sen annetaan lämmetä yön aikana huoneen lämpö-30 tilaan sekoittaen sitä samalla. Sakka erotetaan imusuodat tamalla, suodos väkevöidään, jäännös liuotetaan dikloori-metaaniin tai etyyliasetaattiin ja tulokseksi saatava liuos pestään vedellä, NaHC03-liuoksella ja vedellä ja kuivataan MgS04:llä. Orgaaninen faasi väkevöidään ja jäännös ki--35 teytetään uudelleen tolueenista.

14 90537

Saanto: 50 % NMR (DMSO, 100 MHz): 5 = 2,8 (s, 4 H); 3,2 (s, leveä, 4 H); 3,5 (s, leveä, 3 H); 6,5 (d, leveä, 2 H,; 7,2 (d, leveä, 2 H); 7,6-8,4 (m, 12 H) ppm 5 IR: 3400 (leveä), 3060, 2930, 1815 (w) , 1780 (w) , 1740 (s) , 1690 (m) , 1600 (w) , 1510 (n) , 1370 (m) , 1250 (m) , 1203 (m), 1175 (m) cm1 N-(4-metoksifenvvlil-N-Γ 4-f2-sukkinimidovloksikarbonvvli-etvvlil bentseenisulfonyvli1-10-metvvliakridinium-9-karbok-10 svvlihappoamidifluorisulfonaattl (6)

Liuokseen, joka sisältää 1,27 g yhdistettä 5 60 ml:ssa dikloorimetaania, sekoitetaan -20 °C:ssa 0,4 ml metyylifluorisulfonaattia. Seosta sekoitetaan -20 °C:ssa 2 tuntia, ja sen annetaan lämmetä yön aikana huoneen lämpö-15 tilaan. Tolueenin lisäyksen jälkeen saostuu keltaista kiinteätä ainetta, joka erotetaan imusuodattamalla ja kuivataan alipaineessa.

Saanto: 80 % NMR (DMSO, 100 MHz): <S= 2,9 (s, 4 H) ; 3,2 (s, leveä, 4 H); 20 3,5 (s, leveä, 3 H); 4,8 (s, leveä, 3 H); 6,5 (leveä, 2 H); 7,2 (leveä, 2 H); 7,6-9,0 (m, 12 H) ppm IR: 3400 (leveä), 3160, 2970, 1810 (w) , 1785 (w) , 1740 (S), 1695 (m), 1600 (W) , 1555 (w) , 1510 (m), 1370 (m), 1290 (m) , 1250 (m) , 1219 (m) , 1170 (m) cm'1 25 Massaspektri (m/z): 652 (M*, kationi)

Esimerkki 2 N-f 4-metoksifenvvli)-N-Γ 4-(4-sukkinimidovloksikar-bonvvlibutvvlilbentseenisulfonvylil-10-metvvliakridinium-9-karboksvvlihappoamidifluorisulfonaatin (11) valmistus 30 4'—[N-(4-metoksifenyyli)sulfamido]-5-fenyylivaleriaanaha— pon bentsyyliesteristä (7) ja akridiini-9-karboksyylihap-pokloridihydrokloridista (2) tapahtuu vastaavalla tavalla kuin yhdisteen 6 syntetisointi. Eri synteesivaiheiden saannot sekä karakteristiset spektritiedotonesitetty alla.

I; is 90537 N- (4-metoksifenvvli) -N-f 4- (4-bentsyloksikarbonyylibutvv-lil bentseenisulfonvvlilakridiini-9-karboksvvlihappoamidi (8)

Saanto: 40 % (viskoosi öljy, jähmettyy osaksi) 5 NMR (CDClj 100 MHz): S = 2,85 (m, 4 H); 2,45 (t, leveä, 2 H); 2,8 (6, leveä, 2 H); 3,5 (s, 3 H); 5,15 (s, 2 H); 6,3 (d, 2 H): 6,9 (d, 2 H); 7,3-8,3 (m,17 H) ppm N-(4-metoksifenvvlil-N-f 4-ri-karboksibutvvli)bentseeni-sulfonvvlilakridiini-9-karboksvvlihappoainidihvdrobromidi 10 (9)

Saanto: 95 %

Sulamispiste: 153-155 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 1,7 (s, leveä, 4 H; 2,3 (t, leveä, 2 H); 2,8 (s, leveä, 2 H); 3,5 (s, leveä, 3 H); 6,5 (le- 15 veä, 2 H); 7,05 (leveä, 2 H); 7,5-8,5 (m, 12 H) ppm N-(4-ffletoksifenvvlil-Ν-Γ4-(4-sukkinimidovloksikarbonvvli-butvvli)bentseenisulfonvvli1akridiini-9-karboksvvlihappo-amidi (10)

Saanto: 25 % 20 Sulamispiste: 75-80 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHZ): δ = 1,8 (leveä, 4 H), 2,3 (s, 2 H); 2,85 (s, leveä, 6 H); 3,5 (s, leveä, 3 H); 6,5 (d,leveä, 2 H); 7,05 (d, leveä, 2 H); 7,5p8,3 (m, 12 H) ppm N-(4-metoksifenvvlil-N-Γ4-(4-sukkinimidovloksikarbonvvli-25 butyyli^ bentseenisulfonvvlil -l0-metvvliakridinium-9-kar- boksvvlihappoamidifluorisulfonaatti (11)

Saanto: 90 % NMR (DMSO, 100 MHz); δ = 1,8 leveä, 4 H); 2,3 (s, leveä, 2 H); 2,8 (s, leveä, 6 H); 3,5 (s, leveä, 3 H); 4,8 (leveä, .30 3 H); 6,5 (leveä, 2 H); 7,05 (leveä, 2 H); 7,5-9,0 (m, 12 H) ppm IR: 3340 (leveä), 3060 (w), 2930 (m), 2870 (w), 1810 (w), 1785 (w) , 1740 (s) , 1695 (m), 1600 (w) , 1550 (w) , 1510 (m), 1460 (w), 1370 (m), 1290 (s), 1250 (s), 1205 (s),1170 35 (s) cm Massaspektri (m/z): 680 (M+, kationi) 16 9 0 537

Esimerkki 3 N-(2.4-dimetoksifenvvlil-Ν-Γ 4-(2-sukkinimidovloksi-karbonvvlietvvli^ bentseenisulfonvvlil-lO-metvvliakridini-um-9-karboksvvlihaPDoamidifluorisulfonaatin (16a) valmis-5 tus 4'-[N-(2,4-dimetoksifenyyli)sulfamido]-3-fenyylipropioni-hapon bentsyyliesteristä (12a) ja akridiini-9-karboksyy-lihappokloridihydrokloridista (2) tapahtuu vastaavalla tavalla kuin yhdisteen 6 syntetistointi. Eri synteesivaihei- 10 den saannot sekä karakteristiset spektiritiedot on esitet ty alla.

N- (2.4-dimetoksifenvvli) -N- Γ 4- (2-bentsvloksikarbonvvlie-tvvli) bentseenisulfonvvlilakridiini-9-karboksvylihappoami-di 15 (13a)

Saanto: 50 %

Sulamispiste: 74 °C

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 (d, leveä, 2 H); 3,1 (d leveä, 2 H); 3,3 (s, 3H); 3,4 (s, 3H); 5,1 (s, 2H); 5,9-6,2 20 (m,2 H); 7,0 (d, 1 H); 7,35 (s, 5 H); 7,5-8,2 (m, 12 H) ppm N- (2.4-dimetoksifenwlil -N-Γ4-f2-karboksietvvli}bentseeni-sulfonYylilakridiini-9-karboksvvlihappoamidihvdrobromidi (14a) . 25 Saanto: 95 % NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,75 (d, leveä, 2 H); 3,05 (d, leveä, 2 H); 3,3 (s, 3 H); 3,5 (s, 3H); 5,95-6,3 (m, 2 H); 7,05 (d, 1 H); 7,6-8,6 (m, 12 H); 9,2 (s, leveä, 2 H)ppm N-(2.4-dimetoksifenvvli)-4-f 4-(2-sukkinimidovloksikarbo-30 nvvlietyvlil bentseenisulfonyyli 1 akridiini-9-karboksvvli- happpoamidi (15a)

Saanto: 45 %

Sulamispiste: n. 105 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 (s, 4 H) ; 3 (leveä, 2 H); 3,2 .35 (s, 3 H); 3,4 (s, 3 H); 5,9-6,3 (m, 2 H); 7,0 (d, 1 H); 17 9 G 5 3 7 7,5-8,4 (m, 12 H) ppm IR (KBr-tabletti): 3440 (leveä), 3060 (w), 2930 (w), 2850(w), 1815(w), 1785(w), 1740(s), 1695(m), 1600(w), 1510(m), 1460(w), 1440(w), 1365(m), 1320(w), 1290(w), 5 1240 (m), 1210 (s), 1165 (m), 1085 (m) cm'1 N- f2.4-dimetoksifenvvlil -N- f 4-(2-sukkinimidovloksikarbo-nvvlietvvlilbentseenisulfonvylil-lO-roetvvliakridinium-9-karboksvvlihappoamidifluorisulfonaatti (16a)

Saanto: 80 % 10 Sulamispiste: n. 135 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz); δ = 2,9 (s, 4 H); 2,95-4,2 (m, 10 H); 4,8-5,0 (s, s, 3 H); 6,05-6,25 (m, 1 H); 7,6-9,0 (m, 14 H) ppm IR (KBr-tabletti: 3430 (m), 2950(w), 2870(w), 2825(w), 15 1810(w), 1780(m), 1750(s). 1695(m), 1610(m), 1555(w), 1510(m 1465(m), 1380(m), 1285(m), 1250(m), 1210(s), 1170 (m) cm'1

Esimerkki 4 (ei keksinnön mukainen yhdiste) N-(3.4-etvleenidioksifenvvli)-Ν-Γ 4-(2-sukkinimido-20 vloksikarbonvvlietvvli)bentseenisulfonvvli1-10-metvvliak- r id in ium- 9 -karboks wl ihappoamid i f luor isu 1 f onaat in (16b) valmistus 4’-[N-(3,4-etyleenidioksifenyyli)sulfamido]-3-fenyylipropionihapon bentsyyliesteristä (12b) ja akridii-ni-9-karboksyylihappokloridihydrokloridista (2) tapahtuu 25 esimekin 1 mukaisesti. Eri vaiheiden saannot ja karakteristiset spektritiedoton esitetty alla.

N- (3.4-etyleenidioksifenvvlil -N- Γ4- (2-bentsvloksikarbonyv-lietvvli) bentseenisulfonwlilakridiini-9-karboksvvlihappo-amidi (13b) 30 Saanto: 50 %

Sulamispsite: 91,5 °C

NMR (DMSO, 100 MHz); S = 2,9 (d, leveä, 2H); 3,2 d, leveä, 2 H); 4,0 (s, leveä, 4 H); 5,1 (s, 2 H); 6,3-6,8 (m, 3 H); (s, 5 H); 7,6-8,3 (m, 12 H) ppm is 90537 N- (3.4-etvleenidioksifenvvli) -Ν-Γ4- (2-karbonvloksietvvli) -bentseenisulfonvvli1akridiini-9-karboksvvlihappoamidihvd-robromidi (14b)

Saanto: 95 %

5 Sulamispiste: >200 °C

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,7 (m, 2 H), 3,05 (m, 2 H); 4,0 (s, leveä, 4 H); 6,3-6,8 (m, 3 H); 7,5-8,6 (m, 12 H); 9,6 (s, leveä, 2 H) ppm N-(3.4-etvleenidioksifenvvli)-N-Γ 4 — fsukkinimidovloksikar-10 bonvylietvvli^ bentseenisulfonvvli 1 akridiini-9-karboksvvli- happoamidi (15b)

Saanto: 45 %

Sulamispiste: 140 °c (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz) δ = 2,7-2,9 (d, s, päällekkäisiä, 6 15 H); 3,0 (d, 2 H); 4,0 (s, leveä, 4 H); 6,3-6,8 (m, 3 H); 7,5-8,4 (m, 12 H) ppm IR (KBr-tabletti): 3420 (leveä), 3060 (m)3060(m), 2980(m), 2 9 3 0(m) , 1810(w) , 1790(w), 1740(m). 1695(s), 1590(m), 1460(w), 1430(w), 1410(w), 1370(m), 1300(m), 1225(s), 20 1175(S).

N-(3.4-etvleenidioksifenvvli)-N-Γ4-(sukkinimidovloksikar-bonvvlietvvli^ bentseenisulfonvvlil -10-metvvliakridinium-9-karboksvvlihappoamidifluorisulfonaatti (16b)

Saanto: 80 % 25 Sulamispiste: n. 110 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,85 (s, 4 H); 3,0-3,3 (s, s leveä, 4 H); 3,8-4,5 (m, leveä, 4 H); 4,75-5,1 (s, leveä olkapäiden kera, 3 H); 6,3-9,0 (m, 15 H) ppm Esimerkki 5 ·. 30 N- (4-karboksifenvvlil -4-tolueenisulfonihappoamidi

Seokseen, joka sisältää 252 g (3 mol) natriumvety-karbonaattia ja 139,1 g (1 mol) 4-aminobentsoehappoa 2,5 litrassa vettä, lisätään pisaroittain 20-30 °C:ssa 190,5 g .. · (1 mol) tolueenisulfokloridia 300 ml:ssa i-propyylieette- ...· 35 riä. Seosta sekoitetaan voimakkaasti 2-4 tuntia, kunnes li 19 90 537 sulfokloridi on kulunut. Erotetun vesiliuoksen pH säädetään väkevällä suolahapolla arvoon 1, ja sakka liuotetaan propyyliasetaattiin. Uute pestään kahdesti 2 N suolahapolla ja kerran vedellä, kuivataan natriumsulfaatilla ja hai-5 hdutetaan. Saadaan 240 g (82,5 % teoreettisesta) N-(4-kar-boksifenyyli)-4-tolueenisulfonihappoamidia.

'H-NMR (DMSO-d6) : S = 2,3 (s, CH3) ; 7,1 (d, 2 aromaattista H: ä); 7,3 (d, 2 arom. H:ä); 7,6-7,9 (m, 4 arom. H:ä); 10,75 (leveä); 12,7 (leveä) 10 N- f 4-bentsvloksikarbonvvlifenvvli) -4-tolueenisulfonihap-poamidi

Liuosta, joka sisältää 11,64 g (40 mmol) N-(4-kar-boksifenyyli)-4-tolueenisulfonihappoamidia, 5,06 g (40 mmol) bentsyylikloridia ja 5,20 g (44 mmol) di-isopropyy-15 lietyyliamiinia 100 m;ssa dimetyyliformamidia, kuumennetaan 4 tuntia 140 °C:ssa. Reaktion päätyttyä seos haihdutetaan alipaineessa, jäännös liuotetaan propyyliasetaattiin, ja liuos pestään kahdesti 2 N suolahapolla ja kahdesti kylläisellä NaHC03-liuoksella, kuivataan natriumsul-20 faatilla ja haihdutetaan. Saadaan 11,8 g (78 % teoreettisesta) N-(4-bentsyloksikarbonyylifenyyli)-4-tolueenisul— fonihappoamidia, joka kiteytetään uudelleen metanolista. 'H-NMR (DMSO-d6) : S = 2,3 (s, CH3) ; 5,3 (s, CH2) ; 7,1-7,3 (dd, 4 arom. H:ä); 7,4 (s, C^j) ; 7,7-7,9 (dd, 4 arom.

25 H:ä); 10,8 (leveä, NH) N-(4-bentsvloksikarbonvvlifenvvli)-N-(4-tolueenisulfonvv-li)akridiini-9-karboksvvlihappoamidi

Liuokseen, joka sisältää 1,5 g (4 mmol) N-(4-bent-syloksikarbonyylifenyyli)-4-tolueenisulfonihappoamidia, 30 1,23 g (4,4 mmol) akridiinihappokloridihydrokloridia ja 0,02 g dimetyyliaminopyridiiniä 20 ml:ssa vedetöntä tetra-hydrofuraania, lisätään pisaroittain 25 °C:ssa 2,1 ml (15 mmol) trietyyliamiinia 10 ml:ssa tetrahydrofuraania. Lämpötila nostetaan 60 °C:ksi. Kiteytyvää tuotetta sekoite-35 taan reaktion päätyttyä metanolin kanssa, se erotetaan 20 90537 imusuodattamalla ja kiteytetään uudelleen etyyliasetaatista.

Saanto: 1,57 g (67,0 % teoreettisesta) lH-NMR (CDClj) : δ = 2,5 (s, CH3) ; 5,2 (s, CH2) ; (s, C6H5) ; 5 7,0-8,2 (m, 16 arom. H:ä) N- (4-karboksifenvvlil -N- (4-tolueenisulfonvvlil akridiini-9-karboksyvlihappoamidihvdrobromidi 1,17 g:n (2 mmol) erää N-(4-bentsyloksikarbonyyli-fenyli) -N- (4-tolueenisulfonyyli) akridiini-9-karboksyyli-10 happoamidia kuumennetaan 10 ml:ssa 33-%:ista vetybromidia jääetikkaliusota 4 tuntia 60 °C:ssa samalla sekoittaen. Jäähdytyksen jälkeen sakka erotetaan imusuodattamalla ja kuivataan alipaineessa.

Saanto: 1,00 g (87 % teoreettisesta) 15 ’H-NMR (TFA) : S = 2,6 (s, CH3) ; 7,3-8,6 (m, 16 arom. H:ä) ; 11,65 (s, NH) MS: 496 (M+) N- (4-sukkinimidovloksikarbonvvlifenyylil -N- (4-tolueenisul-fonvvlilakridiini-9-karboksvvlihappoamidi . 20 Liuokseen, joka sisältää 0,57 g (1 mmol) N-(4-kar- boksifenyyli)-N-(4-tolueenisulfonyyli)akridiini-9-karbok-syylihappoamidihydrobromidia ja 0,21 g (2 mmol) trietyy-liamiinia 25 ml:ssa vedetöntä tetrahydrofuraania, lisätään -15 °C:ssa ja samalla sekoittaen 0,11 g (1 mmol) kloori-• 25 muurahaishapon etyyliesteriä. Seosta sekoitetaan samassa lämpötilassa 1 tunti, jonka jälkeen lisätään 0,12 g (1 mmol) N-hydroksisukkinimidiä. Vielä yhden tunnin kuluttua seoksen annetaan seisoa huoneen lämpötilassa 15 tuntia. Seos haihdutetaan alipaineessa, jäännös liuotetaan etyy-30 liasetaattiin, liuos pestään natriumvetykarbonaattiliuoksella ja vedellä ja kuivataan natriumsulfaatilla. Haihdutuksen jälkeen saadaan 0,42 g (70,8 % teoreettisesta) haluttua tuotetta.

'H-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, CH3) ? 3,1 (s, CH2-CH2) ; 7,0-35 8,6 (m, 16 arom. H:ä) 21 90537 N-(4-sukkinimidovloksikarbonvvlifenvvli) -N- C4-tolueenisul-fonvvlil -lO-metvvliakridinium-9-karboksvvlihappoamidi-fluorisulfonaatti

Liuokseen, joka sisältää 0,59 g (1 mmol) N-(4-suk-5 kinimidoyloksikarbonyylifenyyli)-N-(4-tolueenisulfonyy- li)akridiini-9-karboksyylihappoamidia 30 ml:ssa 1,2-di-kloorietaania, lisätään 25 °C:ssa ja samalla sekoittaen 0,85 g (7,5 mmol) fluorisulfonihapon metyyliesteriä. Reaktiotuote saostuu 4 tunnin kuluessa. Imusuodatuserotuksen 10 ja kuivauksen jälkeen saadaan 0,43 g (60,8 % teoreettisesta) haluttua tuotetta.

‘H-NMR (TFA) : <S = 2,6 (s, Ar-CH3) ; 3,1 (s, CH2-CH2) ; 4.9 (s, N-CHj) ; 7,3-8,8 (m, 16 arom. H:ä)

Esimerkki 6 15 Samalla tavoin kuin esimerkissä 5 saadaan N-(4-kar- boksimetyylifenyyli)-4-tolueenisulfonihappoamidista N-(4-sukkinimidoyloksikarbonyylimetyylifenyyli)-N-(4-tolueeni-sulfonyyli)-lO-metyyliakridinium-9-karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaattia . 20 N- (4-karboksimetyylifenyyli) -4-tolueenisulfonihappoamidi *H-NMR (DMSO) : δ = 2,3 (s, CH3) ; 3,5 (s, CH2) ; 7,0 AB, C6H4) ; 7,3-7,6 (AB, C6H4) ; 10,2 (s, NH) N- (4-bentsyloksikarbonyylimetyylifenyyli) -4-tolueenisul-fonihappoamidi 25 Saanto: 35 % teoreettisesta 'H-NMR (DMSO): S = 2,3 (s, CH3) ; 3,6 (s, COCH2) ; (s, 0CH2) ; 6.9 - 7,7 (m, 13 arom. H:ä); 10,2 (s, NH)

Saanto: 35 % teoreettisesta 'H-NMR (CDC13) : δ = 2,55 (s, CH3) ; 3,3 (s, COCH2) ; 5,0 30 (s, OCH2) ; 6,7 - 8,2 (m, 21 arom. H:ä) N- (4-karboksimetyylif enyyli) -N-(4-tolueenisulfonyyli)ak- ridiini-9-karboksyylihappoamidihydrobromidi

Saanto: 95 % teoreettisesta ..... 'H-NMR (TFA): S = 2,65 (s, CH3) ; 3,55 (s, CH2) ; 6,8-8,6 (m, 35 16 arom. H:ä) 22 90537 N- (4-sukkinimidoyloksikarbonyylimetyylifenyyli) -N- (4-tolu-eenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi Saanto: 71 % teoreettisesta lH-NMR (TFA) : 6 = 2,65 (s, tolueenin CH3) ; 3,0 (s, CH2-5 CH2) ; 3,6 (keveä, COCH2) ; 6,9-8,5 (m, arom) .

N- (4-sukkinimidoyloksikarbonyylimetyylif enyyli) -N- (4-to-lueenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9-karboksyylihappo-amidifluorisulfonaatti Saanto: 80 % teoreettisesta 10 'H-NMR (TFA) : 6= 2,6 (s, tolueenin CH3) ; 2,9 (s, CH2-CH2) ; 3,6 (leveä, COCH2) ; 4,9 (s, N-CH3) ; 6,8-8,9 (m, arom). Esimerkki 7

Samalla tavalla kuin esimerkissä 5 saadaan N-[4-(2-karboksietyyli)fenyyli]-4-tolueenisulfonihappoamidista N-15 [ 4- (2 -sukkinimidoy loksikarbonyy 1 ietyy 1 i) f enyy 1 i ] -N-4-tolu- eenisulfonyyli) -10-metyyliakridinium-9-karboksyylihappo-amidifluorisulfonaattia.

N- [ 4 - (2 -karboks ietyy li) f enyyli] -4-tolueenisulf onihappoami- di 20 Saanto: 44 % teoreettisesta *H-NMR (DMSO) : δ = 2,3 (s, CH3) ; 2,4-2,8 (m, CH2-CH2) ; 7.0 (AB, 4 H); 7,2-7,8 (AB, 4 H); 10,1 (s, NH) N- [4-(2-bentsy loksikarbonyy lietyyli) f enyyli ]-4-tolueenisulf onihappoamidi 25 Saanto: 78 % teoreettisesta ‘H-NMR (CDC13) : S = 2,35 (s, CH3) ; 2,4-3,0 (m, CH2-CH2) ; 5.1 (s, OCH2) ; 7,0-7,8 (13 arom. H:ä, NH) N-[4-(2-bentsyloksikarbonyylietyyli)fenyyli]-N-(4-tolueenisulf onyyli)akridiin i-9-karboksyy1ihappoamid i 30 Saanto: 77 % teoreettisesta 'H-NMR (CDClj) : δ = 2,2-2,8 (m, 7 H); 5,0 (s, CH2) ; 6,65-7,0 (AB, 4 arom. H:ä); 7,3-8,3 (m, 17 arom. H:ä) N-(4-(2-karboksietyyli)fenyyli]-N-(4-tolueenisulfonyyli)-akridiini-9-karboksyylihappoamidihydrobromidi 35 Saanto: 65 % teoreettisesta l! 23 90537 1H-NMR (CD3OD) : δ = 2,1-2,8 (m, CH2-CH2); 2,5 (s, CH3) ; 6,7-8,5 (16 arom. H:ä) N-[4-( 2-sukkinimidoyloksikarbonyylietyyli )fenyyli] -N( 4-to-lueenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi 5 Saanto: 90 % teoreettisesta 1H-NMR (CDCI3): δ = 2,6 (s, CH3); 2,7 (leveä, CH2-CH2); 2,8 (s, CH2-CH2); 6,6-8,3 (16 aro. H:ä) 4- [4-( 2-sukkinimidoyloksikarbonyy lie tyyli ) fenyyli] -N- ( 4-tolueenisulfonyyli )-10-metyyliakridinium-9-karboksyylihap-10 poamidifluorisulfonaatti

Saanto: 84 % teoreettisesta 1H-NMR (TFA): 6 = 2,6 (s, CH3); 2,3-3,3 (leveä tausta, 11 H; s kohdassa 3,1); 4,9 (s, N-CH3); 6,7-8,8 (16 arom. H: ä ).

15 Esimerkki 7a

Vastaavalla tavalla kuin edellisissä esimerkeissä saadaanN- Γ4- (N-metvvlimorfolino-N-2-etoksi ) fenwlil -N- Γ4-(2-sukkinimidowlikarboksietwli )fenyvlisulfonwli~l -10-me-twliakridiini-9-karbokswlihappoamidiumdif luorisulfonaat-20 ti. Poikkeavat menettelyt on esitetty seuraavissa reaktio-vaiheissa.

(4-kloorisulfonyyli)-2-fenyylipropionihapon t-butyylies-teri 25 g (0,1 mol) (4-kloorisulfonyyli)-2-fenyylipro-25 pionihappoa, 12 ml t-butanolia, 60 ml isobuteenia ja 3 ml väkevää rikkihappoa yhdistetään -15 °C:ssa ja niitä sekoitetaan autoklaavissa huoneen lämpötilassa voimakkaasti 24 tuntia. Uudelleen -15 °C:seen jäähdytetty reaktioseos sekoitetaan natriumvetykarbonaattiliuokseen, jota on ylimää-30 rin, ja seos uutetaan metyleenikloridilla ja haihdutetaan lopuksi alipaineessa.

Saanto: 20,4 g (67 % teoreettisesta). Tuote kiteytetään uudelleen heksaanista.

XH-NMR (CDC13): δ = 1,4 (s); 2,6 (m) 3,0 (t); (m); 35 7,95 (m) MS (m/z); 305 (M*H) 24 9 0 537 (4-kloorisulfonyyli)-2-fenyylipropionihappovalmis-tettiin tunnetulla tavalla 2-fenyylipropionihaposta ja kloorisulfonihaposta.

4-(morfolino-N-2-etoksi)aniliini 5 25 g:n (0,1 mol) 4-(morfolino-N-2-etoksi)nitrobent- seeniä annetaan kiehua 75 g:n kanssa tinarakeita 400 ml-:ssa puoleksi väkevöityä suolahappoa palautusjäähdyttäjän alla 4 tuntia. Jäähdytyksen jälkeen seos kaadetaan 400 ml: aan 33-%:ista suolahappoa ja uutetaan isopropyylieette-10 rillä ja orgaaninen faasi haihdutetaan kuivauksen jälkeen. Saadaan 20 g (90 % teoreettisesta) haluttua tuotetta. H-NMR (CDC13) : δ = 2,5 (t) ; 2,7 (7); 3,5 (leveä); 3,7 (t) ; 4,0 (t); 6,6 (m) MS (m/z): 222 (M+) 15 Sama tuote saadaan hydraamalla nitroyhdiste metano- lissa katalysaattorin, joka sisältää palladiumia hiilikan-toaineella, ollessa mukana. Typpiyhdiste valmistettiin julkaisun Bull. Soc. Chim. France 1955, 1353-62 mukaisesti .

20 N-Γ4-(morfolino-N-2-etoksii fenvvli Ί-N-Γ4-(2-t-butoksikar- bonvvlietvvli^ fenvvlisulfonamidi1 10-tuntisen huoneen lämpötilassa seisottamisen jälkeen 9,3 g:sta (30 mmol) 4-kloorisulfonyylifenyylipro-pionihapon t-butyyliesteriä, 6,9 g:sta 4-(morfolino-N-2-25 etoksi)aniliinia, 0,3 g:sta dimetyyliaminopyridiiniä ja 150 ml:sta metyleenikloridia saatava kirkas liuos pestään kylläisellä natriumvetykarbonaattiliuoksella, haihdutetaan kolmasosaan tilavuudestaan ja käsitellään kromatografises-ti piimaapylväässä käyttäen eluenttina seosta, joka sisäl-30 tää 90 % metyleenikloridia ja 10 % metanolia. Eluaatin pääjae haihdutetaan.

Saanto: 9 g (61,2 % teoreettisesta) ‘H-NMR (CDCIj) : S = 1,35 (s); 2,5 (m); 2,7-3,0 (m); 3,7 (m); 4,0 (t); 6,7-7,0 (m); 7,2-7,7 (m) MS (m/z); 491 (M+H) 35 N- [ 4- (morf olino-N-2-etoksi) fenyyli ] -N- [ 2-t-butoksikarbo- h 25 90537 nyylietyyli)fenyylisulfonyyli]-9-akridiinikarboksyylihap-poaxnidi

Liuokseen, joka sisältää 2,0 g (4,1 mmol) N-[4-(morfolino-N-2-etoksi)fenyyli]-N-(4-(2-t-butoksikarbonyy-5 lietyyli)fenyylisulfonamidia) 50 mlrssa metyleenikloridia, sekoitetaan perätysten 50 ml 33-%:ista natriumhydroksidia, 30 mg dimetyyliaminopyridiiniä, 1,2 g tetrabutyyliammoni-umkloridia ja 1,55 g (5,6 mmol) 9-akridiinikarboksyylihap-pokloridihydrokloridia samalla voimakkaasti sekoittaen. 6 10 tunnin kuluttua oroaaninen faasi erotetaan, pestään vedellä, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan.

Saanto: 2,8 g (98 % teoreettisesta) ‘H-NMR (CDCIj) : δ = 1,4 (s); 2,3-2,5 (m); 2,5-2,8 (m);

3.0- 3,3 (t) ; 3,6-3,9 (m); 6,3 (d) ; 6,9 (d) ; 7,4-8,3 (m) MS

15 (m/z): 695 )M+) N-Γ 4-(morfolino-N-2-etoksi)fenvvlil-N-f 4-f2-karboksietvv-li)fenvvlisulfonvvlil-9-akridiinikarboksvylihaDPoamidi 0,7 g (1 mmol) N-[4-(morfolino-N-2-etoksi)fenyyli]-N-[4-(2-t-butoksikarbonyylietyyli) fenyylisulfonyyli]-9-ak-. 20 ridiinikarboksyylihappoamidia liuotetaan 5 mitään trifluo-rietikkahappoa, ja liuoksen annetaan seisoa huoneen lämpötilassa yön yli. Liuos haihdutetaan vesisusuihkuoumpun avulla, jäännös liuotetaan veteen, ja suodatetun liuoksen pH säädetään natriumasetaatilla arvoon 4. Saostunut tuote 25 uutetaän metyleenikloridiin, liuos kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan.

Saanto: 0,6 g (94 % teoreettisesta) ‘H-NMR (DMSO): δ = 2,6-3,0 (m); 3,0.3,3 (m); 3,6.4,0 (m) ; 4.0- 4,4 (m); 5,8-6,6 (m); 6,8-7,0,(m); 7,3-8,4 (m).

30 MS: m/2 = 639 (M+) N-[4-morfolino-N-2-etoksi)fenyyli]-N-[4-(2-sukkinimidoyy-likarboksietyyli) fenyylisulfonyyli] -9-akridiinikarboksyy-liamidi

Saanto: 95 % teoreettisesta 26 90 537 1H-NMR (CDC13): 6 = 2,3.2,7 (m); 2,8 (s); 2,9-3,4 (m); 3,5-3,9 (m); 3,9-4,3 (m); 6,2-7,0 (m); 7,3-8,3 (m).

MS: 736 (M*) N-[4-(N-metyylimorfolino-N-2-etoksi)fenyyli]-N-[4-(2-suk-5 kinimidoyylikarboksietyyli)fenyylisulfonyyli]-10-metyy- liakridiini-9-karboksyylihappoamidiumdifluorisulfonaatti Saanto: 85 % teoreettisesta

Yhdiste on väriltään keltaisena selvästi vesiliukoinen. 1H-NMR (DMSO): δ = 2,85 (s); 3,1 (s); 3,2-4,4 (m); 10 4,75 (s); 6,4-8,3 (m)

Esimerkki 8

Merkkiaineen valmistus TSH-kemiluminesenssi-im-muunimääritystä varten

Vasta-ainetta (91 μΐ, 100 ug), esimerkin 1 mukai-15 sesti valmistettua akridiniumjohdannaista (yhdiste 6; 20 μΐ, 1 mg/ml asetonitriilissä ja konjugaatiopuskuria (0,01 M fosfaattipuskuri, pH 8; 600 μΐ) inkuboidaan 15 minuuttia. Senjälkeen lisätään 200 μΐ lysiiniä (10 mg/ml konju-gaatiopuskurissa) ja inkubointia jatketaan 15 minuuttia. 20 Tämä seos laitetaan PD 20 pylvääseen [SelphadexR G 25 -täy te (pallomainen poikittaissilloitettu dekstraanigeeli, valmistajayhtiö Pharmacia, Ruotsi)] ja eluoidaan käyttäen eluenttina 0,1 M fosfaattia, pH 6,3. Yksittäisten jakeiden kemiluminesenssiaktiivisuus testataan sopivan laimennuksen 25 jälkeen (350 μΐ hapetinta: 0,1 % H202:ta 0,1 N Na0H:ssa).

Merkkiainejakeet (1.aktiivisuushuippu) yhdistetään, ja niitä säilytetään 4 °C:ssa. h-TSH-kemiluminesenssimääri-tyksessä käytettäväksi valmis merkkiaine valmistetaan sopivasti fosfaattipuskurilla [0,1 M fosfaatti, pH 6,3, 1 % 30 Tween* 20:tä (polyetyleenisorbitaanimonolauraatti, valmis taja esim. ICI American Inc., USA), 0,1 % naudan seeru-mialbumiinia, 0,1 M NaCl, 0,01 % NaN3:a/ laimentamalla.

27 90537

Esimerkki 9 h-TSH-kemiluminesenssi-immuunimääritysten toteutus

Standardia/näytettä (50 μΐ) ja merkkiainetta (200 μΐ) ravistetaan 2 tuntia huoneenlämpötilassa monoklonaali-5 silla anti-TSH-vasta-aineilla päällystetyissä putkissa.

Sen jälkeen suoritetaan kolmesti pesu 1 ml :11a puskuria tai tislattua vettä. Valonemissio saadaan aikaan lisäämällä putkiin kuhunkin 300 μΐ aktivointireagenssia (puskuri, pH 1, 0,5 % H202:ta) ja 300 μΐ käynnistysreagenssia (0,2 N 10 NaOH) luminesenssimittarissa olevien kahden jakelulaitteen kautta. Mittausaika on 1 s.

Kuvio 3 esittää ihmisen kilpirauhasta stimuloivan hormoninen (h-TSH) immunologisten kemiluminometristen mää-ristysten (ICMA) standardikäyrän tyypillistä kulkua.

Claims (15)

28 9Π537

1. Kaavan (I) mukaisia kemiluminesoivia akridinium-johdannaisia, 5 ^ A® (i) I 4

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tun nettu siitä, että X on ryhmä, jolla on kaava IV -r7-<o) (IV) 10 jossa R7 on substituentti, jonka kaava on -(CH2)n, jossa n on 0-4.

3. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että sillä on kaava VI 15 CH_ A’ o3d „ I p 1 2 A . (VI) \ * )- SO. -X — C - 0 - N o 25 jossa X on ryhmä, jolla on kaava VII, O-(CH ) - <VII> 2 n 30 jossa n on 2 tai 4, R12 ja R13 ovat kumpikin itsenäisesti vety, alkyyli- tai al-koksyyliryhmä, joka sisältää 1-4 C-atomia, tai morfolino-(C,-C4) -alkoksiryhmä ja Ailia on patenttivaatimuksessa 1 35 kuvattu merkitys. 30 9 Π 5 3 7

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että X on p-etyleenifenyyliryhmä, R12 on H ja R13 on p-metoksyyliryhmä tai R12 on o-metoksyyliryhmä ja R13 on p-metoksyyliryhmä.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että sillä on kaava VIII CH A9 10 (VIII) ' o .c x- - c V-. ON 0 - N \ 6 VJ SO -R o'/ 15 jossa X:llä on patenttivaatimuksessa 1 tai 2 kuvattu merkitys ja R6 on fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu korkeintaan kolmella alkyyli- tai alkoksyyliryhmällä, jotka kukin sisältävät 1-4 C-atomia, tai morfolino (C,-C4)-20 alkoksiryhmällä, ja X on o-, m- tai p-fenyleeniryhmä.

6 I * R - S02 - N - X - C - OZ (X) 35 3i 90537 tai kaava XI H R6 - N - S02 - X - COOZ (XI) 5 joissa kaavoissa Y on halogeeni tai oksikarbonyylialkyy-li-; oksikarbonyyliaryyli- tai imidatsolidiryhmä, X:llä ja R6:lla on patenttivaatimuksessa 1 kuvatut merkitykset ja Z on karboksyylisuojaryhmä, joka myöhemmin poistetaan, ja tällöin saatu happo muutetaan halutuksi, ryhmän R5 sisälle) täväksi akridiniumjohdannaiseksi, jonka akridiinirunkoon kuuluva typpi sitten vielä kvaternisoidaan.

6. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdisteen, jolla on kaava IX, oco c (IX) // \

0 Y 30 annetaan reagoida suojatun sulfonamidikarboksyylihapon kanssa, jolla on kaava X H O

7. Menetelmä luminesoivan yhdisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen kaavaa I vastaava akridiniumjohdannainen sidotaan 15 suoraan tai siltamolekyylin välityksellä proteiiniin, po-lypeptidiin tai johonkin muuhun biologiseen aineeseen, jolloin muodostuu stabiili, immunologisesti aktiivinen konjugaatti.

8. Luminesenssi-immuunimääritys antigeenisen aineen 20 määrittämiseksi nestenäytteestä, tunnettu siitä, että toteutettaessa se kompetitiivisella tai sandwich-me-netelmällä ainakin yksi immunologisesti aktiivinen komponentti on immobilisoitu kiinteälle faasille ja ainakin yksi muu komponentti, merkkiaine, on patenttivaatimuksen 7 25 mukaisesti valmistettavissa oleva luminesoiva yhdiste.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi-immuunimääritys, tunnettu siitä, a) antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavasta nesteestä otetun 30 näytteen ja antigeenistä ja patenttivaatimuksen 1 mukaisesta, kemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin kanssa; b) näyte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan peräkkäin tai 35 samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja 32 90537 d) mitatusta valonemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen luminesenssiim- muunimääritys, tunnettu siitä, että ennen merki- 5 tyn konjugaatin lisäystä tutkittava neste erotetaan immo-bilisoidusta vasta-aineesta.

10 O = C - R jossa R1 on vety tai alkyyliryhmä, joka sisältää 1-10 hiiliatomia, R4 on ryhmä, jolla on kaava (II) tai (III) 15 6 R -N^ (II) \ 5 SO -X-R 2 ,:.20 5 X-R \ 6 (111) SO -R 2 25 joissa R5 on ryhmä, jolla on kaava V: 0 o y—

30. C - 0 - N (V) R6 on fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu 1-4 C-atomia sisältävillä alkyyli-, tai alkoksyyliryhmillä tai morfo-35 lino (C]-C4)-alkoksiryhmällä, I; 29 90 537 X on fenyyliryhmä, joka on sitoutunut suoraan typpi- tai rikkiatomiin ja C^-alkyyliryhmän välityksellä ryhmään R5, ja A' on anioni, joka ei vaikuta haitallisesti kemilumi-nointiin.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim- muunimääritys, tunnettu siitä, että a) antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua 10 vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavasta nesteestä otetun näytteen ja toisesta spesifisesti reagoivasta vasta-aineesta sekä patenttivaatimuksen 1 mukaisesta, kemilumines-oivasta akridiniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin kanssa; 15 b) näyte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan peräkkäin tai samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja d) mitatusta valonemission voimakkuudesta määritetään läs- 20 nä olevan antigeenin määrä.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen luminesenssi-immuunimääritys, tunnettu siitä, että ennen merkityn konjugaatin lisäystä tutkittava neste erotetaan im-mobilisoidusta vasta-aineesta.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim- muunimääritys, tunnettu siitä, että a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua antigeeniä inkuboidaan tutkittavasta nesteestä otetun näytteen ja vasta-aineesta ja patenttivaatimuksen 1 mukai- 30 sesta, kemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta koostu van konjugaatin liuoksen kanssa; b) näyte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan peräkkäin tai samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin 35 kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja l· 33 90537 d) mitatusta valonemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.

14. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim-muunimääritys, tunnettu siitä, että 5 a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoi-tua antigeeniä inkuboidaan vasta-aineesta ja patenttivaatimuksen 1 mukaisesta, kemiluminesoivasta akridiniumjoh-dannaisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa; b) reagoimaton merkitty konjugaatti erotetaan; 10 c) lisätään tutkittavasta nesteestä otettu näyte; d) sitten näyte erotetaan taas; e) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan peräkkäin tai samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja 15 f) mitatusta valonemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.

15. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim-muunimääritys, tunnettu siitä, että a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoi-20 tua antigeeniä inkuboidaan vasta-aineesta ja patentti-vaatimuksen 1 mukaisesta, kemilunesoivasta arkidiniumjohdan-naisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa; b) lisätään tutkittavasta nesteestä otettu näyte; c) näyte ja sitoutumaton konjugaatti erotetaan; 25 d) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan peräkkäin tai samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja e) mitatusta valonemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä. 3« 90537