FI90537C

FI90537C - Kemiluminesoivia arkidiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immuunimäärityksissä

Info

Publication number: FI90537C
Application number: FI890754A
Authority: FI
Inventors: Tonio Kinkel; Peter Molz; Erwin Schmidt; Gerd Schnorr; Heinz Juergen Skrzipczyk
Original assignee: Dade Behring Marburg Gmbh
Priority date: 1988-02-20
Filing date: 1989-02-16
Publication date: 1994-02-25
Also published as: NO173237B; DK175493B1; GR3034888T3; FI90537B; NO173237C; JPH01261461A; PT89759B; EP0330050A3; CA1339390C; DE58909877D1; ATE195757T1; FI890754A; NO890689L; EP0330050B1; FI890754A0; DE3844954C2; ES2151474T3; DK74289D0; PT89759A; EP0330050A2

Description

Kemiluminesoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistuts ja niiden kayttd luminesenssi-immuunimåarityksisså 1 90537

Tama keksinto koskee kemiluminesoivia akridiinijoh-5 dannaisia, menetelmaa niiden valmistamiseksi ja niiden kayttoa luminesenssiin perustuvissa immunologisissa maa-rityksissa.

Luminesoivilla yhdisteilla on jo monenlaista kayttoa. Niita kaytetaan indikaattoreina biologisissa mååri-10 tyksisså, entsymaattisissa immuunimaarityksissa ja lu-minesenssiimmuunimåårityksisså (ks. W.P. Collins, Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985) mutta myos nukleiinihappohybridisaatiomåårityksisså [ks. J.A. Matthews et al., Analytical Biochemisty 151 15 (1985) 205-209]. Lisåksi kemiluminesoivia yhdisteita kay tetaan "virtausinjektioanalyysisså", pylvåanjalkeisissa detektoreissa nestekromatografiassa, virtaustutkimuksessa ja keinovalonlåhteisså.

Erityisesti kaksi kemiluminesoivien merkkiaineiden 20 rakennetyyppia on saavuttanut suurempaa merkitystå kemilu- minesenssi-immuunimaarityksisså. Kysymyksessa ovat ensin-nakin luminoli- ja isoluminolijohdannaiset, joita on ku-vattu artikkelissa H.R. Schroeder et al., Methods in Enzy-mology 57 (1978) 424 (Academic Press Inc., New York) seka 25 GB-patenttijulkaisuissa 2 008 247 ja 2 041 920, DE-patent-tijulkaisuissa 2 618 419 ja 2 618 511 ja EP-hakemusjulkai-sussa 135 071. Katsaus isoluminoliyhdisteiden kayttoon luminesenssi-indikaattoreina kaytannossa loytyy artikke-lista W.G. Wood, J. Clin, Chem. Clin. Biochem. 22 (1984) • 30 905-918.

Toisaalta myos akridiniumesteriyhdisteita on kay-tetty kemiluminesoivina merkkiaineina. Sellaisia akridi-niumestereita tunnetaan US-patenttijulkaisu 3 352 791, GB-patenttijulkaisujen 1 316 363 ja 1 461 877 sekå EP-hake-35 musjulkaisun 82 636 perusteella. Akridiniumestereiden 2 90537 kayttoa merkkiaineina immunologisissa maarityksissa kuvaa-vat Weeks et al., Clin Chem. 29/8 (1983) 1474-1479. Myos fenantridiniumestereiden kaytto merkkiaineina luminenssi-immuunimåårityksisså on jo tunnettua EP-hakemusjulkaisun 5 170 415 perusteella.

Akridiniumestereiden kemiluminenssi voidaan kayn-nistaa emåksista H202-liuosta lisååmållå. Kemiluminesenssin mekanismin on selittanyt vakuuttavasti F. McCapra, Acc. Chem. Res. 9 (1976) 201. Irtoavien ryhmien laatu on siina 10 ilmeisesti ratkaiseva seka valokvanttituoton etta hydro- lyyttisen stabiilisuuden kannalta.

Jo tåtå ennen tunnettujen akridiniumestereiden etu-na luminoli ja isoluminoliyhdisteisiin nahden on syntyvien valokvanttien suurempi maara, jota indikaattoriin sitoutu-15 neet proteiinitkaan eivSt pienennS [ks. Weeks et al., Clin. Chem. 29/8 (,983) 1474 - 1479].

Vaikka EP-hakemusjulkaisun 82 636 perusteella tun-netuille akridiniumfenyyliestereille on heikoilla hapetti-milla tapahtuvassa kemiluminesenssin eksitaatiossa ominai-.:. 20 sta suuri detektioherkkyys, niilla on niiden kayttamista kåytånnosså hairitsevia puutteita. Ennen kaikkea fenyy-liesteriyhdiste on vettå sisaltavissa systeemeissS erit-tSin labiili jo huoneenlampotilassa. Sen lisSksi akri-diniumfenyyliestereilla esiintyy siina ilmoitetuissa hape-25 tusolosuhteissa valonemissiota, joka lakkaa suurimmaksi osaksi, so. yli 95-%:isesti, vasta noin 10 sekunnin kulut-tua. Lisaksi muissa ei-isotooppimaaritysmenetelmissa mit-tausajat ovat suhteessa paljon lyhyempia, ja ne mahdollis-tavat siten suuremman naytemaaran lapikulun.

30 On jo ehdotettu sellaisten kemiluminesoivien akri- diniumjohdannaisten kayttoa, joilla reaktiokinetiikka on nopeampi valokvanttituoton ollessa suuri ja jotka tekevat siten lyhyet mittausajat mahdollisiksi luminesenssi-im- ____ muunimaarityksessa (ks. DE-hakemusjulkaisu P 3 628 573.0).

35 Kysymyksessa ovat akridiniumjohdannaiset, joiden kaava on 3 90537 rA αθ rb -CX TY rc

5 D

O = C R

jossa Ra on vety, alkyyli-, alkenyyli- tai alkynyyliryhmå, joka sisaltaå 1-10 hiiliatomia, tai bentsyyli- tai aryyli-ryhmå; R1* ja Rc ovat kumpikin erikseen vety, 1-4 hiiliato-10 mia sisaltavå alkyyliryhmå, substituoitu tai substituoima-ton aminoryhmå,karboksyyli-, alkoksyyli-, syaani- tai nit-roryhma tai halogeeni; R° on ryhma, jossa sulfonamidiryhmå on sitoutunut typen valityksella suoraan karbonyyliryh-maan, tai tioalkyyli- tai tioaryyliryhma, jonka kaava on 15 —S-Y—re, jossa Y on haaroittunut tai haarautumaton alifaattinen tai aromaattinen ryhma, joka voi sisaltaå myos heteroatomeja, 20 ja Re on reaktiivinen ryhma, joka miedoissa olosuhteissa pystyy selektiivisesti muodostamaan sidoksen biologisesti kiinnostavissa aineissa esiintyvien amino-, karboksyyli-tai tioliryhmien tai muiden funktionaalisten ryhmien kans-sa; ja fp on anioni, joka ei vaikuta haitallisesti kemilu-25 minesenssiin.

Nyt on kåynyt ilmi, ettå mååråtyt akridiniumjohdan-naiset soveltuvat erinomaisen stabiilisuutensa ja odotta-mattoman suuren detektioherkkyytenså vuoksi erityisen hy-vin kåytettåviksi kemiluminesoivina yhdisteinå. Sen mukai-30 sesti keksinto koskee kaavan (I) mukaisia kemiluminesoivia akridiniumjohdannaisia, 4 90537 R A® 5 1 (I) 1 4

ο = C - R

jossa R1 on vety tai alkyyliryhmM, joka sisaltaM 1-10 hii-liatomia, R4 on ryhmå, jolla on kaava (II) tai (III) 10 6

R

/

5 (ID

SO -X-R 2 15 5 -t

X-R

-NC 6 <!«> SO -R 2 .:. 20 joissa R5 on ryhmå, jolla on kaava V: 0 °*_ 25 «

- C - 0 - N

J-J <V> 0 R6 on fenyyliryhma, joka voi olla substituoitu 1-4 C-atomia 30 sisåltåvillå alkyyli-, tai alkoksyyliryhmilla tai morfo- lino(C1-C4)-alkoksiryhmållå, X on fenyyliryhmå, joka on sitoutunut suoraan typpi- tai rikkiatomiin ja CM-alkyyliryhmån vålityksellå ryhmåån R5, ja /P on anioni, joka ei vaikuta haitallisesti kemilumi-35 nointiin.

1, 5 9G537

Aineilla, joilla on biologisesti mielenkiintoa, tarkoitetaan ennen kaikkea antigeeneja. Tainan kasitteen piiriin kuuluvat esimerkiksi hormonit, steroidit, laakeai-neet, laakeaineiden metaboliitit, toksiinit, alkaloidit ja 5 myos vasta-aineet.

Aminokarboksyylihapoiksi soveltuvat esimerkiksi glysiini, alaniini, seriini, fenyylialaniini, histidiini, α-aminovoihappo, metioniini, valiini, norvaliini, leusii-ni, isoleusiini, norleusiini, asparagiinihappo, glutamii-10 nihappo, 4-aminobentsoehappo, 4-aminofenyylietikkahappo, 4aminobentsoehappo, 4-aminofenyylietikkahappo, 4-aminofe-noksietikkahappo ja 3-(4-amino)fenyylipropionihappo.

Anionina, joka ei vaikuta haitallieesti kemilumi-nesenssiin, voi olla esimerkiksi tetrafluoriboraatti-, 15 perkloraatti-, halogenidi-, alkyylisulfaatti-, halogeeni- sulfonaatti-, alkyylisulfonaatti- tai aryylisulfonaatti-anioni. Voidaan myos kayttaa mita tahansa muuta anionia, kunhan se ei tukahduta tai heikennå kemiluminesenssia.

Heteroalkyyliryhmat tai heterosykliset ryhmat si-20 saltavat edullisesti heteroatomeja, jotka myotavaikuttavat keksinnon mukaisten yhdisteiden vesiliukoisuuden paranemi-seen, kuten esimerkiksi typpea, happea, rikkiå, fosforia tai niiden yhdistelmia. Erityisen sopivia heterosyklisia renkaita ovat esimerkiksi morfoliini, piperatsiini, pipe-25 ridiini, tetrahydrofuraani, dioksaani jne.

Erityisen merkittavia ovat patenttivaatimuksen 1 mukaiset akridiniumjohdannaiset, joille on tunnusomaista, etta X on ryhmå, jolla on kaava IV

30 -R7-^0^> (IV) jossa R7 on substituentti, jonka kaava on -(CH2)n, jossa n on 0-4.

6 90537

Erityisen tårkeå keksinnon mukaisten akridiniumjoh-dannaisten kayttomahdollisuuksia ajatellen on substituent-ti R5. Valitsemallla tama ryhntå sopivasti tulee akridinium-johdannaisen raktiivisuus niin suureksi, etta se pystyy jo 5 miedoissa olosuhteissa rouodostamaan selektiivisesti sidok-sen jonkin sen maarittavan biologisen aineen funktionaali-sen ryhman kanssa. Keksinnon mukaisessa yhdisteissa R5 on: 0

0 >—I

10 -C - 0 - N

(v) 0

Lisaksi erityisen sopiviksi ovat osoittautuneet akridiniumyhdisteet, jotka vastaavat kaavaa VI. Kaavassa

15 VI

CH _ 1.3 A® R^ on >—t o (vi)

SsSO-X--C-0-N

2 yJ

0 25 X on ryhma, joka vastaa kaavaa VII, -<Q>-(CH2>n- (VII) jossa n on 2 tai 4, 30 R12 ja R13 ovat kumpikin itsenaisesti vety, alkyyli- tai al- koksyyliryhma, joka sisaltåa 1-4 C-atomia, tai morfolino-(C,-C4)-alkoksiryhma, ja /ft 11a on patenttivaatimuksessa 1 mainittu merkitys. Nama yhdisteet ovat helposti veteen liukenevia tuotteita.

tl 7 90537

Viimeksi mainituista yhdisteistå, jotka vastaavat kaavaa VI, aivan erityisen edullisia ovat puolestaan sel-laiset, joissa X on p-etyleenifenyyliryhma, R12 on H ja R13 on p-metoksyyliryhmM tai R12 on o-metoksyyliryhma ja R13 on 5 p-metoksyyliryhma, kuten esimerkiksi yhdisteet, joiden kaava on CH Αθ 10 a Asy ^

O N . O

\ /ZT\ s 0 SO -CH -C ^_ 2 2 2 \ r-

O - N

15 y

Lisaksi erityisen sopivia ovat akridiniumjohdannai-set, joilla on kaava VIII

,n CH Αθ 20 I 3 cco I o //\ AX~ ~ C\ λ~| (vin)

C 25 0 \ 6 ° - VJ

SO - R ry 2 jossa R6 on fenyyliryhmå, joka voi olla substituoitu kor-keintaan kolmella alkyyli- tai alkoksiryhmalla tai morfo-. 30 lini (C,-C4)-alkoksiryhmalla, ja X:llå on patenttivaatimuk- sessa 1 tax 2 mainittu merkitys tai R6 on fenyyliryhmå, joka voi olla korkeintaan kolmella Cj^-alkyyliryhmalla substituoitu, ja X on o-, m tai p-fenyleeniryhma. Namakin yhdisteet ovat helposti veteen liukenevia tuotteita.

8 90537

On yllMttavåS, etta amiditypesså sulfonyylisubsti-tuentin sisaltSvalla akridinium-9-karboksyylihappoamidilla ilmenee erinomaista kemiluminesenssia, silla tiedetMSn, ettei akridinium-9-karboksyylihappoamideilla painvastoin 5 kuin akridinium-9-karboksyylihappoestereillå esiinny min-kaanlaista kemiluminesenssia (ks. F. McCapra teoksessa W. Carruthers ja J.K. Sutherland, Progress in Organic Chemistry, osa 8, Butterworth, Lontoo, 1973, s. 231-277).

Eras keksinnon mukaisten akridiniumyhdisteiden mer-10 kittava etu EP-hakemusjulkaisusta 82 636 tunnettuihin ak-ridiniumfenyyliestereihin verrattuna on huomattavasti no-peampi valonemissioon liittyva reaktiokinetiikka (ks. DE-hakemusjulkaisu P 3 628 573.0).

Toisen edun tarjoaa keksinnon mukaisten yhdisteiden 15 avulla valmistetun merkkiaineen stabiilisuus. Kuviossa 1 on esitetty stabiilisuuskokeen, jossa mitattiin kulloisen-kin kemiluminesenssisignaalin intensiteetti korotetussa lampotilassa (50 °C) sailytyksen jalkeen, tulokset. KayrS a liittyy yhdisteesta N-(4-metoksifenyyli)-N-[4-(2-suk-20 kinimidoyloksikarbonyylietyyli)bentseenisulfonyyli]-10- metyylikridinium-9-karboksyylihappoamidifluorisulfonaatti (6), kayra b yhdisteesta N-(4-metoksifenyyli)-N-[4-(4-suk-kinimidoyloksikarbonyylibutyyli)bentseenisulfonyyli]-10-metyyliakridinium-9-karboksyylihappoamidifluorisulfonaat-25 ti (11) ja kayra c yhdisteesta 4-(2-sukkinimidoyloksikar- bonyylietyyli) fenyyli-10-metyyliakridinium-9-karboksylaat-timetosulfaatti (EP-hakemusjulkaisu 82 636, s. 10) valmis-tettuun merkkiaineeseen.

On selvasti havaittavissa, etta keksinnon mukaiset, --- 30 yhdisteista a ja b saatavat merkkiaineet ovat stabiilimpia kuin vastaava c:sta saatava yhdiste.

Samankaltaisia tuloksia saavutetaan vastaavassa kokeessa 4 °C:ssa. Kuviossa 2 on esitetty signaalin intensiteetti 4 °:ssa sailytyksen jalkeen. Taaskin yhdisteestM . 35 a valmistettu merkkiaine nayttaa ratkaisevasti stabiilim-malta kuin yhdisteesta c valmistettu.

li 9 90 537

Keksinnon mukaisten akridiniumsulfonamidijohdannai-sten valmistuksessa voidaan kayttaa låhtoaineena akridii-ni-9-karboksyylihappokloridia (IX). Taman yhdisteen val-mistamiseksi annetaan esimerkiksi akridiinin reagoida Leh-5 mstedtin ja Hundertmarkin esittaman menetelman [Ber. 63 (1930) 1229] mukaisesti kaliumsyanidin kanssa etanolietik-kahapposeoksessa, jolloin muodostuu 9-syaaniakridiini. Siita saadaan edullisesti uudelleenkiteytyksen jalkeen Lehmtedtin ja Wirthin esittaman menetelman [Ber. 61 (1928) 10 2044] reaktiolla rikkihapon ja natriumnitriitin kanssa ak- ridiini-9-karboksyylihappo. Antamalla akridiini-9-karbok-syylihapon reagoida esimerkiksi tionyylikloridin kanssa saadaan yhdiste, joka vastaa kaavaa IX, 15 coo (IX)

O Y

20 jossa Y tarkoittaa klooria. Y voi yhdisteessa IX olla ha-logeenin sijasta myds oksikarbonyylialkyyli-, oksikarbo-nyyliaryyli- tai imidatsolidiryhmå.

Happokloridin (IX) voidaan sitten antaa reagoida suojatun sulfonamidikarboksyylihapon kanssa, joka vastaa ... 25 kaavaa X

H O

. 1 li R-S02-N-X-C-0Z (X) 30 tai kaavaa XI,

H

R6-N-S02-X-C00Z

... · 35 joissa kaavoissa X:lla ja R6:lla on edella mainitut roerki- 10 90537 tykset ja Z on karboksyyliryhmåå suojaava ryhmå, joka myo-hemmin poistetaan. Tassa reaktiossa voidaan kayttaa esi-merkiksiN-(4-bentsoksikarbonyylifenyyli)-N-4-tolueenisul-fonihappoamidia. Edullisesti kåytetåån t-butyyliesteriå, 5 jonka suojausryhmå voidaan tuoda molekyyliin ja taas pois-taa siitå erityisen miedoissa olosuhteissa.

Suojausryhmån poiston jålkeen syntyva happoryhmå inuunnetaan sitten sopivalla yhdisteellå, esimerkiksi N-hydroksisukkinimidillå, ryhmåksi R5. Tasta yhdisteestå saa-10 daan kemiluminesoiva akridiiniyhdiste alkyloimalla 10-ase-massa sijaiseva typpi.

Saatavat akridiniumyhdisteet voidaan sitten panna reagoimaan jonkin biologista mielenkiintoa omaavan aineen, esimerkiksi antigeenin, vasta-aineen, hormonin, laakeai-15 neen, laakeaineen metaboliitin, toksiinin tai alkaloidin, kanssa luminesoivan yhdisteen aikaansaamiseksi. Talloin akridiniumjohdannainen sitoutuu joko suoraan tai siltamo-lekyylin, kuten esimekriksi aminohapon, oligo- tai poly-aminohapon, peptidin tai synteettisen polymeerin, valityk-20 sella biologisesti kiinnostavaan aineeseen, jolloin muo-dostuu stabiili, immunologisesti aktiivinen konjugaatti. Tatå konjugaattia kutsutaan myos merkkiaineeksi (tracer) ja kaytetaan jaljempanå kuvatuissa luminesenssi-immuuni-maårityksissa. Antigeenisen aineen maarittåmiseksi nes-25 tenaytteestå kompetitiivisella tai kerrosmenete linål lå kek-sinnon mukaista luminesenssi-immuunimååritystå vårten tar-vitaan ainakin yksi immunologisesti aktiivinen komponentti, joka on immobilisoitu kiinteålle faasille, sekå lisåk-si luminesoiva merkkiaine.

30 Immuunireaktion pååttymisen ja mahdollisesti tar- vittavien pesuvaiheiden jålkeen valonemissio laukaistaan lisååmållå peråtysten tai yhtåaikaisesti yhtå tai useampaa reagenssia ainakin yhden reagenssin sisåltåesså jotakin hapetinta sidotussa tai sitomattomassa muodossa. Lumine-35 senssi-immuunimååritys voidaan sitten toteuttaa eri tavo-in.

l! 11 90537

Eras mahdollisuus on se, etta antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua vasta-ainetta inku-boidaan tutkittavasta nesteesta otetun nåytteen ja anti-geenista jakemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta 5 koostuvan konjugaatin (antigeenimerkkiaineen) kanssa, nayte ja sitoutumaton inerkkiaine erotetaan, sitoutunut merkkiaine saatetaan kosketuksiin tarvittavien reagenssien kanssa valonemission aikaansaamiseksi ja sen jalkeen måå-ritetaan låsnå olevan antigeenin måara mitatusta valonemi-10 ssion voimakkuudesta.

Toinen mahdollisuus luminesenssi-immuunimååritysten toteuttamiseksi on se, etta antigeenin kanssa spefisesti reagoivaa immonilisoitua vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavasta nesteesta otetun nåytteen ja toisesta spesifisesti 15 reagoivasta vasta-aineesta ja kemiluminesoivasta akridii-nijohdannaisesta koostuvan konjugaatin kanssa, nayte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan, sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan kosketuksiin tarvittavien reagenssien kanssa valonemission aikaansaamiseksi ja måå-20 ritetåån låsnå olevan antigeenin måårå mitatusta valonemi ssion voimakkuudesta.

Edellå mainitut luminesenssi-immuunimååritykset voidaan toteuttaa myos siten, ettå ennen merkityn konjugaatin lisaystå tutkittava neste erotetaan immobilisoidus- .25 ta vasta-aineesta.

Toisissa keksinnon mukaisesti tehtåvisså luminesen-ssi-immuunimåårityksisså ei immobilisoida vasta-ainetta vaan antigeeni. Silloin vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immonilisoitua antigeenia inkuboidaan tutkitta--· 30 vasta nesteestå otetun nåytteen ja vasta-aineesta ja kemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa, sen jålkeen nåyte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan ja sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan sitten kosketuksiin tarvittavien rea- 35 genssien kanssa. Silloin ilmenee valonemissiota, jonka 12 90537 voimakkuuden perusteella voidaan måårittåå lasna olevan antigeenin måårå.

Viela yksi vaihtoehto on se, etta vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua antigeenia 5 inkuboidaan vasta-aineesta ja kemiluminesoivasta akri-diniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa, reagoimaton merkitty konjugaatti erotetaan, lisåtaan tutkittavasta nesteestå otettu nayte, joka sitten taas erotetaan, sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan kos-10 ketukseen tarvittavien reagenssien kanssa valonemission aikaansaamiseksi ja emission voimakkuudesta maaritetåan sitten lasna olevan antigeenin måårå.

Luminesenssi-immuunimååritys voidaan viela tehdå myos niin, etta vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa 15 immobilisoitua antigeenia inkuboidaan vasta-aineesta ja kemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa, lisataan tutkittavasta nesteestå otettu nayte, nayte ja sitoutumaton konjugaatti erotetaan, sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan kosketuksiin 20 tarvittavien reagenssien kanssa ja sen jålkeen maaritetaan mitatusta valonemissiosta lasna olevan antigeenin maara.

Keksinnon mukaisten akridiniumyhdisteiden valmis-tusta valaisevat tarkemmin esimerkit 1-7.

Esimerkki 1 . ' 25 N- (4-metoksifenvvli) -4-Γ4 - (2-bentsvloksikarbonvvlietvvli) - bentseenisulfonyylilakridiini-9-karboksyylihappoamidi (3)

Liuokseen, joka sisaltaa 17 g 4'-[N-(4-metoksife-nyyli)sulfonamido]-3-fenyylipropionihaponbentsyyliesteria (1) 400 ml:ssa dikloorimetaanissa, sekoitetaan 460 mg 4-:·. 30 (Ν,Ν-dimetyyliamino)pyridiinia ja 22,1 ml trietyyliamii-nia, 10 minuuttia myohemmin lisåtaan 11,12 g akridiini-9-karboksyylihappokloridihydrokloridia (2), ja seosta ref-luksoidaan 6 tuntia. Jååhdytettyå liuosta sekoitetaan ly-hyesti 2 N NaOHrn kanssa, ja erotettu orgaaninen faasi 35 peståån vedellå, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja våke- 13 90 537 voidåån. Jåånnos puhdistetaan pylvåskromatografian avulla. Saanto: 60 %

Sulamispiste: 130-132 °C

NMR (DMSO, 100 MHz); S = 2,7-3,0 (d, leveå, 2H); 3,0-3,3 5 (d,levea, 2H); 3,5 (s, leveå, 3 H); 5,1 (s, 2H); 6,5 (d, leveå, 2H) ; 7,1 (d, leveå, 2 H) ; 7,35 (s, 5 H) ; 7,5-8,3 (m, 12 H) ppm N-(4-metoksifenvvli)-N-Γ4-(2-karboksietvvli)bentseenisul-fonvvlilakridiini-9-karboksvvlihappoamidihvdrobromidi (4) 10 6,3 g:n eråå yhdistettå 3 kuumennetaan 30 ml:ssa seosta, joka sisåltåå 33 % HBr:a jååetikassa, 60 0:ssa 2 tuntia, ja jååhdytyksen jålkeen lisåtåån 60 ml di-isopro-pyylieetteriå ja sakka erotetaan imusuodattamalla ja kui-vataan alipaineessa.

15 Saanto: 90 %

Sulamispiste: 237 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz); S- 2,7 (d, leveå, 2 H); 3,1 (d, leveå, 2 H); 3,5 (s, leveå, 3 H); 6,5 (d, leveå, 2 H); 7,0- 8,4 (m, 15 H )ppm 20 N-(4-metoksifenvvli)-Ν-Γ4-f2-sukkinimidovloksikarbonvvli- etvvli) bentseenisulfonvvli 1 akridiini-9-karboksvvlihappo-amidi (5)

Liuokseen, joka sisåltåå 3,1 g yhdistettå 4 50 ml:ssa tetrahydrofuraania, sekoitetaan 1,41 ml trietyylia-25 miinia, seos jååhdytetåån -20 °C:seen ja siihen lisåtåån 0,474 ml kloorimuurahaishapon etyyliesteriå. Seosta jål-kisekoitetaan 20 minuuttia, siihen lisåtåån 575 mg N-hyd-roksisukkinimidiå, tåtå seosta sekoitetaan -20 °C:ssa 3 tuntia, ja sen annetaan låmmetå yon aikana huoneen låmpd-30 tilaan sekoittaen sitå samalla. Sakka erotetaan imusuodat tamalla, suodos våkevoidåån, jåånnos liuotetaan dikloori-metaaniin tai etyyliasetaattiin ja tulokseksi saatava li-uos peståån vedellå, NaHC03-liuoksella ja vedellå ja kuiva-taan MgS04:llå. Orgaaninen faasi våkevoidåån ja jåånnos ki--35 teytetåån uudelleen tolueenista.

14 90537

Saanto: 50 % NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,8 (s, 4 H) ; 3,2 (s, levea, 4 H); 3,5 (s, levea, 3 H); 6,5 (d, levea, 2 H,; 7,2 (d, levea, 2 H); 7,6-8,4 (m, 12 H) ppm 5 IR: 3400 (levea), 3060, 2930, 1815 (w) , 1780 (w) , 1740 (s) , 1690 (m) , 1600 (w) , 1510 (n) , 1370 (m) , 1250 (m) , 1203 (m), 1175 (m) cm1 N-(4-metoksifenvvlil-N-Γ 4-f2-sukkinimidovloksikarbonvvli-etvvlil bentseenisulfonyvlil-lO-metvvliakridinium-9-karbok-10 svvlihappoamidifluorisulfonaattl (6)

Liuokseen, joka sisaltaa 1,27 g yhdistetta 5 60 ml:ssa dikloorimetaania, sekoitetaan -20 °C:ssa 0,4 ml metyylifluorisulfonaattia. Seosta sekoitetaan -20 °C:ssa 2 tuntia, ja sen annetaan lammeta yon aikana huoneen lampo-15 tilaan. Tolueenin lisayksen jålkeen saostuu keltaista kii-nteata ainetta, joka erotetaan imusuodattamalla ja kuiva-taan alipaineessa.

Saanto: 80 % NMR (DMSO, 100 MHz): <S= 2,9 (s, 4 H) ; 3,2 (s, levea, 4 H) ; 20 3,5 (s, levea, 3 H); 4,8 (s, levea, 3 H) ; 6,5 (levea, 2 H); 7,2 (levea, 2 H); 7,6-9,0 (m, 12 H) ppm IR: 3400 (levea), 3160, 2970, 1810 (w) , 1785 (w) , 1740 (S) , 1695 (m) , 1600 (W) , 1555 (w) , 1510 (m) , 1370 (m) , 1290 (m) , 1250 (m) , 1219 (m) , 1170 (m) cm'1 25 Massaspektri (m/z): 652 (M*, kationi)

Esimerkki 2 N-f 4-metoksifenvvli)-N-Γ 4-(4-sukkinimidovloksikar-bonvvlibutvvlilbentseenisulfonvylil-10-metvvliakridinium- 9-karboksvvlihappoamidifluorisulfonaatin (11) valmistus 30 4'—[N-(4-metoksifenyyli) sulfamido]-5-fenyylivaleriaanaha— pon bentsyyliesterista (7) ja akridiini-9-karboksyylihap-pokloridihydrokloridista (2) tapahtuu vastaavalla tavalla kuin yhdisteen 6 syntetisointi. Eri synteesivaiheiden saannot seka karakteristiset spektritiedotonesitetty alia.

I; is 90537 N- f 4-metoksifenvvli) -N-f 4- (4-bentsyloksikarbonyylibutvv-li) bentseenisulfonvvlilakridiini-9-karboksvvlihappoamidi (8)

Saanto: 40 % (viskoosi oljy, jåhmettyy osaksi) 5 NMR (CDClj 100 MHz): S = 2,85 (m, 4 H); 2,45 (t, levea, 2 H) ; 2,8 (6, levea, 2 H) ; 3,5 (s, 3 H) ; 5,15 (s, 2 H) ; 6,3 (d, 2 H): 6,9 (d, 2 H); 7,3-8,3 (m,17 H) ppm N-f4-metoksifenvvli)-N-f 4-ri-karboksibutvvli)bentseeni-sulfonvvlilakridiini-9-karboksvvlihappoamidihvdrobromidi 10 (9)

Saanto: 95 %

Sulamispiste: 153-155 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 1,7 (s, leveå, 4 H; 2,3 (t, levea, 2 H) ; 2,8 (s, levea, 2 H) ; 3,5 (s, leveå, 3 H) ; 6,5 (le- 15 vea, 2 H); 7,05 (levea, 2 H); 7,5-8,5 (m, 12 H) ppm N-f 4-metoksifenvvli)-Ν-Γ4-(4-sukkinimidovloksikarbonvvli-butvvli)bentseenisulfonvvli1akridiini-9-karboksvvlihappo-amidi (10)

Saanto: 25 % 20 Sulamispiste: 75-80 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHZ): δ = 1,8 (levea, 4 H) , 2,3 (s, 2 H) ; 2,85 (s, leveå, 6 H); 3,5 (s, leveå, 3 H) ; 6,5 (d,leveå, 2 H); 7,05 (d, leveå, 2 H); 7,5p8,3 (m, 12 H) ppm N-f4-metoksifenvvli)-N-Γ4-(4-sukkinimidovloksikarbonvvli-25 butyyli) bentseenisulfonvvlil -l0-metvvliakridinium-9-kar- boksvvlihappoamidifluorisulfonaatti (11)

Saanto: 90 % NMR (DMSO, 100 MHz); δ = 1,8 leveå, 4 H) ; 2,3 (s, leveå, 2 H) ; 2,8 (s, leveå, 6 H); 3,5 (s, leveå, 3 H); 4,8 (leveå, 30 3 H); 6,5 (leveå, 2 H); 7,05 (leveå, 2 H); 7,5-9,0 (m, 12 H) ppm IR: 3340 (leveå), 3060 (w), 2930 (m), 2870 (w), 1810 (w), 1785 (w) , 1740 (s) , 1695 (m) , 1600 (w) , 1550 (w) , 1510 (m), 1460 (w), 1370 (m), 1290 (s), 1250 (s), 1205 (s),1170 35 (s) cm Massaspektri (m/z): 680 (M+, kationi) 16 9 0 537

Esimerkki 3 N-(2.4-dimetoksifenvvlil-N-Γ 4-(2-sukkinimidovloksi-karbonvvlietvvli^ bentseenisulfonvvlil -10-metvvliakridini-um-9-karboksvvlihappoamidifluorisulfonaatin (16a) valmis-5 tus 4'-[N-(2,4-dimetoksifenyyli)sulfamido]-3-fenyylipropioni-hapon bentsyyliesterista (12a) ja akridiini-9-karboksyy-lihappokloridihydrokloridista (2) tapahtuu vastaavalla ta-valla kuin yhdisteen 6 syntetistointi. Eri synteesivaihei- 10 den saannot seka karakteristiset spektiritiedot on esitet- ty alia.

N- (2.4-dimetoksifenvvli) -N- r 4- (2-bentsvloksikarbonvvlie-twli) bentseenisulfonvvlil akridiini-9-karboksvylihappoami-di 15 (13a)

Saanto: 50 %

Sulamispiste: 74 °C

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 (d, leveå, 2 H); 3,1 (d le-vea, 2 H); 3,3 (s, 3H); 3,4 (s, 3H); 5,1 (s, 2H); 5,9-6,2 20 (m, 2 H) ; 7,0 (d, 1 H) ; 7,35 (s, 5 H) ; 7,5-8,2 (m, 12 H) ppm N- (2.4-dimetoksifenwlil -N-Γ4-f2-karboksietvvli}bentseeni-sulfonYylilakridiini-9-karboksvvlihappoamidihvdrobromidi (14a) . 25 Saanto: 95 % NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,75 (d, levea, 2 H) ; 3,05 (d, leveå, 2 H); 3,3 (s, 3 H); 3,5 (s, 3H); 5,95-6,3 (m, 2 H); 7,05 (d, 1 H) ; 7,6-8,6 (m, 12 H) ; 9,2 (s, leveå, 2 H)ppm N-(2.4-dimetoksifenvvli)-4-f 4-(2-sukkinimidovloksikarbo-30 nvvlietyvlil bentseenisulfonyyli 1 akridilni-9-karboksvvli- happpoamidi (15a)

Saanto: 45 %

Sulamispiste: n. 105 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 (s, 4 H) ; 3 (leveå, 2 H); 3,2 . 35 (s, 3 H) ; 3,4 (s, 3 H) ; 5,9-6,3 (m, 2 H) ; 7,0 (d, 1 H) ; 17 9 G 5 3 7 7,5-8,4 (m, 12 H) ppm IR (KBr-tabletti): 3440 (leveå), 3060 (w), 2930 (w), 2850(w), 1815(w), 1785(w), 1740(s), 1695(m), 1600(w), 1510(m), 1460(w), 1440(w), 1365(m), 1320(w), 1290(w), 5 1240 (m), 1210 (s), 1165 (m), 1085 (m) cm'1 N- (2.4-dimetoksifenvvlil -N- r 4-(2-sukkinimidovloksikarbo-nvvlietvvlil bentseenisulfonvylil -10-roetvvliakridinium-9-karbokswlihappoamidifluorisulfonaatti (16a)

Saanto: 80 % 10 Sulamispiste: n. 135 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz); δ = 2,9 (s, 4 H) ; 2,95-4,2 (m, 10 H); 4,8-5,0 (s, s, 3 H); 6,05-6,25 (m, 1 H) ; 7,6-9,0 (m, 14 H) ppm IR (KBr-tabletti: 3430 (m) , 2950(w), 2870(w), 2825(w), 15 1810(w), 1780(m), 1750(s). 1695(m), 1610(m), 1555(w), 1510(m 1465(m), 1380(m), 1285(m), 1250(m), 1210(s), 1170 (m) cm'1

Esimerkki 4 (ei keksinnon mukainen yhdiste) N-(3.4-etvleenidioksifenvvli)-Ν-Γ 4-(2-sukkinimido-20 vloksikarbonvvlietvvli)bentseenisulfonvvli1-10-metvvliak- r id in ium- 9 -karboks wl ihappoamid i f luor isu 1 f onaat in (16b) valmistus 4’-[N-(3,4-etyleenidioksifenyyli)sulfamido]-3-fenyylipropionihapon bentsyyliesterista (12b) ja akridii-ni-9-karboksyylihappokloridihydrokloridista (2) tapahtuu 25 esimekin 1 mukaisesti. Eri vaiheiden saannot ja karakte-ristiset spektritiedoton esitetty alla.

N- (3.4-etyleenidioksifenwlil -N- Γ4- (2-bentsvloksikarbonyv-lietvvli) bentseenisulfonwlilakridiini-9-karboksvvlihappo-amidi (13b) 30 Saanto: 50 %

Sulamispsite: 91,5 °C

NMR (DMSO, 100 MHz); δ = 2,9 (d, levea, 2H); 3,2 d, levea, 2 H); 4,0 (s, levea, 4 H); 5,1 (s, 2 H); 6,3-6,8 (m, 3 H); (s, 5 H); 7,6-8,3 (m, 12 H) ppm is 90537 N- (3.4-etvleenidioksifenvvli) -Ν-Γ4- (2-karbonvloksietvvli) -bentseenisulfonvvli1akridiini-9-karboksvvlihappoamidihvd-robromidi (14b)

Saanto: 95 %

5 Sulamispiste: >200 °C

NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,7 (m, 2 H), 3,05 (m, 2 H); 4,0 (s, levea, 4 H); 6,3-6,8 (m, 3 H); 7,5-8,6 (m, 12 H); 9,6 (s, levea, 2 H) ppm N- (3.4-etvleenidioksifenvvli)-N-Γ 4 — fsukkinimidovloksikar-10 bonvylietvvli^ bentseenisulfonvvli 1 akridiini-9-karboksvvli- happoamidi (15b)

Saanto: 45 %

Sulamispiste: 140 °c (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz) δ = 2,7-2,9 (d, s, paållekkaisia, 6 15 H) ; 3,0 (d, 2 H) ; 4,0 (s, levea, 4 H) ; 6,3-6,8 (m, 3 H) ; 7,5-8,4 (m, 12 H) ppm IR (KBr-tabletti): 3420 (levea), 3060 (m)3060(m), 2980(m), 2 9 3 0(m) , 1810(w) , 1790(w), 1740(m). 1695(s), 1590(m), 1460(w), 1430(w), 1410(w), 1370(m), 1300(m), 1225(s), 20 1175(S).

N-(3.4-etvleenidioksifenvvli)-N-Γ4-(sukkinimidovloksikar-bonwlietvvli^ bentseenisulfonvvlil -10-metvvliakridinium-9-karboksvvlihappoamidifluorisulfonaatti (16b)

Saanto: 80 % 25 Sulamispiste: n. 110 °C (hajoaminen) NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,85 (s, 4 H) ; 3,0-3,3 (s, s levea, 4 H) ; 3,8-4,5 (m, levea, 4 H) ; 4,75-5,1 (s, levea olkapaiden kera, 3 H); 6,3-9,0 (m, 15 H) ppm Esimerkki 5 ·. 30 N- M-karboksifenvvli) -4-tolueenisulfonihappoamidi

Seokseen, joka sisaltaa 252 g (3 mol) natriumvety-karbonaattia ja 139,1 g (1 mol) 4-aminobentsoehappoa 2,5 litrassa vetta, lisåtaån pisaroittain 20-30 °C:ssa 190,5 g .. · (1 mol) tolueenisulfokloridia 300 ml:ssa i-propyylieette- ...· 35 riå. Seosta sekoitetaan voimakkaasti 2-4 tuntia, kunnes li 19 90537 sulfokloridi on kulunut. Erotetun vesiliuoksen pH såade-tåån våkevållå suolahapolla arvoon 1, ja sakka liuotetaan propyyliasetaattiin. Uute pestaan kahdesti 2 N suolahapolla ja kerran vedellå, kuivataan natriumsulfaatilla ja hai-5 hdutetaan. Saadaan 240 g (82,5 % teoreettisesta) N-(4-kar-boksifenyyli)-4-tolueenisulfonihappoamidia.

'H-NMR (DMSO-d6) : S = 2,3 (s, CH3) ; 7,1 (d, 2 aromaattis-ta H:a); 7,3 (d, 2 arom. H:a); 7,6-7,9 (m, 4 arom. H:a); 10,75 (levea); 12,7 (levea) 10 N- f 4-bentsvloksikarbonvvlifenvvli) -4-tolueenisulfonihap-poamidi

Liuosta, joka sisaltaa 11,64 g (40 mmol) N-(4-kar-boksifenyyli)-4-tolueenisulfonihappoamidia, 5,06 g (40 mmol) bentsyylikloridia ja 5,20 g (44 mmol) di-isopropyy-15 lietyyliamiinia 100 m;ssa dimetyyliformamidia, kuumenne-taan 4 tuntia 140 °C:ssa. Reaktion paatyttya seos haihdu-tetaan alipaineessa, jaannds liuotetaan propyyliasetaattiin, ja liuos pestaan kahdesti 2 N suolahapolla ja kahdesti kyllaisella NaHC03-liuoksella, kuivataan natriumsul-20 faatilla ja haihdutetaan. Saadaan 11,8 g (78 % teoreettisesta) N-(4-bentsyloksikarbonyylifenyyli)-4-tolueenisul— fonihappoamidia, joka kiteytetaan uudelleen metanolista. 'H-NMR (DMSO-d6) : S = 2,3 (s, CH3) ; 5,3 (s, CH2) ; 7,1-7,3 (dd, 4 arom. H:a); 7,4 (s, C^j) ; 7,7-7,9 (dd, 4 arom.

25 H:a); 10,8 (levea, NH) N-(4-bentsvloksikarbonvvlifenvvli)-N-(4-tolueenisulfonvv-li)akridiini-9-karboksvvlihappoamidi

Liuokseen, joka sisaltaa 1,5 g (4 mmol) N-(4-bent-syloksikarbonyylifenyyli)-4-tolueenisulfonihappoamidia, 30 1,23 g (4,4 mmol) akridiinihappokloridihydrokloridia ja 0,02 g dimetyyliaminopyridiiniå 20 ml:ssa vedetontå tetra-hydrofuraania, lisataan pisaroittain 25 °C:ssa 2,1 ml (15 mmol) trietyyliamiinia 10 ml:ssa tetrahydrofuraania. Lam-pdtila nostetaan 60 °C:ksi. Kiteytyvåa tuotetta sekoite-35 taan reaktion paatyttya metanolin kanssa, se erotetaan 20 90537 imusuodattamalla ja kiteytetåan uudelleen etyyliasetaatis-ta.

Saanto: 1,57 g (67,0 % teoreettisesta) lH-NMR (CDClj) : δ = 2,5 (s, CH3) ; 5,2 (s, CH2) ; (s, C6H5) ; 5 7,0-8,2 (m, 16 arom. H:a) N- (4-karboksifenvvlil -N- (4-tolueenisulfonvvlil akridiini-9-karboksyvlihappoamidihvdrobromidi 1,17 g:n (2 mmol) eråå N-(4-bentsyloksikarbonyyli-fenyli) -N- (4-tolueenisulfonyyli) akridiini-9-karboksyyli-10 happoamidia kuumennetaan 10 ml:ssa 33-%:ista vetybromidia jaåetikkaliusota 4 tuntia 60 °C:ssa samalla sekoittaen. Jååhdytyksen jalkeen sakka erotetaan imusuodattamalla ja kuivataan alipaineessa.

Saanto: 1,00 g (87 % teoreettisesta) 15 ’H-NMR (TFA): S = 2,6 (s, CH3) ; 7,3-8,6 (m, 16 arom. H:a) ; 11,65 (s, NH) MS: 496 (M+) N- (4-sukkinimidovloksikarbonvvlifenyyli^ -N- (4-tolueenisul-fonvvlilakridiini-9-karboksvvlihappoamidi . 20 Liuokseen, joka sisaltaå 0,57 g (1 mrool) N-(4-kar- boksifenyyli)-N-(4-tolueenisulfonyyli)akridiini-9-karbok-syylihappoamidihydrobromidia ja 0,21 g (2 mmol) trietyy-liamiinia 25 mlrssa vedetonta tetrahydrofuraania, lisataan -15 °C:ssa ja samalla sekoittaen 0,11 g (1 mmol) kloori-• 25 muurahaishapon etyyliesteria. Seosta sekoitetaan samassa lampotilassa 1 tunti, jonka jSlkeen lisataan 0,12 g (1 mmol) N-hydroksisukkinimidiå. Viela yhden tunnin kuluttua seoksen annetaan seisoa huoneen lampotilassa 15 tuntia. Seos haihdutetaan alipaineessa, jaannos liuotetaan etyy-30 liasetaattiin, liuos pestaan natriumvetykarbonaattiliuok- sella ja vedella ja kuivataan natriumsulfaatilla. Haihdu-tuksen jalkeen saadaan 0,42 g (70,8 % teoreettisesta) ha-luttua tuotetta.

'H-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, CH3) ? 3,1 (s, CH2-CH2) ; 7,0-35 8,6 (m, 16 arom. H:a) 21 90537 N-(4-sukkinimidovloksikarbonvvTifenvvli) -N- f4-tolueenisul-fonvvlil -10-metvvliakr idinium-9-kar boks vvlihappoamidi-fluorisulfonaatti

Liuokseen, joka sisåltaa 0,59 g (1 mmol) N-(4-suk-5 kinimidoyloksikarbonyylifenyyli)-N-(4-tolueenisulfonyy- li)akridiini-9-karboksyylihappoamidia 30 ml:ssa 1,2-di-kloorietaania, lisataån 25 °C:ssa ja samalla sekoittaen 0,85 g (7,5 mmol) fluorisulfonihapon metyyliesteria. Reak-tiotuote saostuu 4 tunnin kuluessa. Imusuodatuserotuksen 10 ja kuivauksen jalkeen saadaan 0,43 g (60,8 % teoreettises-ta) haluttua tuotetta.

‘H-NMR (TFA): <S = 2,6 (s, Ar-CH3) ; 3,1 (s, CH2-CH2) ; 4.9 (s, N-CHj) ; 7,3-8,8 (m, 16 arom. H:å)

Esimerkki 6 15 Samalla tavoin kuin esimerkisså 5 saadaan N-(4-kar- boksimetyylifenyyli)-4-tolueenisulfonihappoamidista N-(4-sukkinimidoyloksikarbonyylimetyylifenyyli)-N-(4-tolueeni-sulfonyyli)-lO-metyyliakridinium-9-karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaattia . 20 N- (4-karboksimetyylifenyyli) -4-tolueenisulfonihappoamidi ‘H-NMR (DMSO) : δ = 2,3 (s, CH3) ; 3,5 (s, CH2) ; 7,0 AB, C6H4) ; 7,3-7,6 (AB, C6H4) ; 10,2 (s, NH) N- (4-bentsyloksikarbonyylimetyy lif enyyli) -4-tolueenisul-fonihappoamidi 25 Saanto: 35 % teoreettisesta 'H-NMR (DMSO): S = 2,3 (s, CH3) ; 3,6 (s, COCH2) ; (s, 0CH2) ; 6.9 - 7,7 (m, 13 arom. H:a); 10,2 (s, NH)

Saanto: 35 % teoreettisesta 'H-NMR (CDC13) : δ = 2,55 (s, CH3) ; 3,3 (s, COCH2) ; 5,0 30 (s, OCH2) ; 6,7 - 8,2 (m, 21 arom. H:a) N- (4-karboksimetyylif enyyli) -N-(4-tolueenisulfonyyli)ak- ridiini-9-karboksyylihappoamidihydrobromidi

Saanto: 95 % teoreettisesta ..... 'H-NMR (TFA): δ = 2,65 (s, CH3) ; 3,55 (s, CH2) ; 6,8-8,6 (m, 35 16 arom. H:å) 22 90537 N- (4-sukkinimidoyloksikarbonyylimetyylifenyyli) -N- (4-tolu-eenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi Saanto: 71 % teoreettisesta lH-NMR (TFA): 6 = 2,65 (s, tolueenin CH3) ; 3,0 (s, CH2-5 CH2) ; 3,6 (kevea, COCH2) ; 6,9-8,5 (m, arom).

N- (4-sukkinimidoyloksikarbonyylimetyylif enyyli) -N- (4-tolueenisulf onyyli ) -10-metyyliakridinium-9-karboksyylihappo-amidifluorisulfonaatti Saanto: 80 % teoreettisesta 10 'H-NMR (TFA) : 6= 2,6 (s, tolueenin CH3) ; 2,9 (s, CH2-CH2) ; 3,6 (levea, COCH2) ; 4,9 (s, N-CH3) ; 6,8-8,9 (m, arom). Esimerkki 7

Samalla tavalla kuin esimerkissa 5 saadaan N-[4-(2-karboksietyyli)fenyyli]-4-tolueenisulfonihappoamidista N-15 [ 4- (2 -sukkinimidoy loksikarbonyy 1 ietyy 1 i) f enyy 1 i ] -N-4-tolu- eenisulfonyyli) -10-metyyliakridinium-9-karboksyylihappo-amidifluorisulfonaattia.

N- [ 4 - (2 -karboks ietyy li) f enyyli] -4-tolueenisulf onihappoami- di 20 Saanto: 44 % teoreettisesta *H-NMR (DMSO) : <S = 2,3 (s, CH3) ; 2,4-2,8 (m, CH2-CH2) ; 7.0 (AB, 4 H); 7,2-7,8 (AB, 4 H); 10,1 (s, NH) N-[4-(2-bentsyloksikarbonyylietyyli) fenyyli]-4-tolueenisulf onihappoamidi 25 Saanto: 78 % teoreettisesta ‘H-NMR (CDC13) : S = 2,35 (s, CH3) ; 2,4-3,0 (m, CH2-CH2) ; 5.1 (s, OCH2) ; 7,0-7,8 (13 arom. H:a, NH) N-[4-(2-bentsyloksikarbonyylietyyli)fenyyli]-N-(4-tolueenisulf onyyli)akridiin i-9-karboksyy1ihappoamid i 30 Saanto: 77 % teoreettisesta 'H-NMR (CDClj) : S = 2,2-2,8 (m, 7 H) ; 5,0 (s, CH2) ; 6,65-7,0 (AB, 4 arom. H:a); 7,3-8,3 (m, 17 arom. H:a) N-(4-(2-karboksietyyli)fenyyli]-N-(4-tolueenisulfonyyli)-akridiini-9-karboksyylihappoamidihydrobromidi 35 Saanto: 65 % teoreettisesta l! 23 90537 1H-NMR (CD3OD) : δ = 2,1-2,8 (m, CH2-CH2); 2,5 (s, CH3) ; 6,7-8,5 (16 arom. H:å) N-[4-( 2-sukkinimidoyloksikarbonyylietyyli )fenyyli] -N( 4-to-lueenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi 5 Saanto: 90 % teoreettisesta 1H-NMR (CDCI3): δ = 2,6 (s, CH3); 2,7 (levea, CH2-CH2); 2,8 (s, CH2-CH2); 6,6-8,3 (16 aro. H:a) 4- [4-( 2-sukkinimidoyloksikarbonyylietyyli ) fenyyli] -N- ( 4-tolueenisulfonyyli )-10-metyyliakridinium-9-karboksyylihap-10 poamidifluorisulfonaatti

Saanto: 84 % teoreettisesta 1H-NMR (TFA): 6 = 2,6 (s, CH3); 2,3-3,3 (levea tausta, 11 H; s kohdassa 3,1); 4,9 (s, N-CH3); 6,7-8,8 (16 arom. H:S).

15 Esimerkki 7a

Vastaavalla tavalla kuin edellisissa esimerkeissa saadaanN- Γ4- (N-metyylimorfollno-N-2-etoksi ) fenwlil -N- Γ4-(2-sukklnlmldowlikarboksietwll )fenyvlisulfonwli~l -10-me-twliakrldiini-9-karboksyyllhappoamidiumdif luorisulfonaat-20 ti. Poikkeavat menettelyt on esitetty seuraavissa reaktio-vaiheissa.

(4-kloorisulfonyyli)-2-fenyylipropionihapon t-butyylies-teri 25 g (0,1 mol) (4-kloorisulfonyyli)-2-fenyylipro-25 pionihappoa, 12 ml t-butanolia, 60 ml isobuteenia ja 3 ml vakevaa rikkihappoa yhdistetaan -15 °C:ssa ja niita sekoi-tetaan autoklaavissa huoneen lampOtilassa voimakkaasti 24 tuntia. Uudelleen -15 °C:seen jaahdytetty reaktioseos se-koitetaan natriumvetykarbonaattiliuokseen, jota on ylimaa-30 rin, ja seos uutetaan metyleenikloridilla ja haihdutetaan lopuksi alipaineessa.

Saanto: 20,4 g (67 % teoreettisesta). Tuote kiteytetSån uudelleen heksaanista.

XH-NMR (CDC13): δ = 1,4 (s); 2,6 (m) 3,0 (t); (m); 35 7,95 (m) MS (m/z); 305 (M*H) 24 9 0 537 (4-kloorisulfonyyli)-2-fenyylipropionihappovalmis-tettiin tunnetulla tavalla 2-fenyylipropionihaposta ja kloorisulfonihaposta.

4-(morfolino-N-2-etoksi)aniliini 5 25 g:n (0,1 mol) 4-(morfolino-N-2-etoksi)nitrobent- seeniå annetaan kiehua 75 g:n kanssa tinarakeita 400 ml-:ssa puoleksi våkevoityå suolahappoa palautusjååhdyttajan alla 4 tuntia. Jååhdytyksen jalkeen seos kaadetaan 400 ml:aan 33-%:ista suolahappoa ja uutetaan isopropyylieette-10 rillå ja orgaaninen faasi haihdutetaan kuivauksen jalkeen. Saadaan 20 g (90 % teoreettisesta) haluttua tuotetta. H-NMR (CDClj) : δ = 2,5 (t) ; 2,7 (7); 3,5 (levea); 3,7 (t) ; 4,0 (t); 6,6 (m) MS (m/z): 222 (M+) 15 Sama tuote saadaan hydraamalla nitroyhdiste metano- lissa katalysaattorin, joka sisaltåå palladiumia hiilikan-toaineella, ollessa mukana. Typpiyhdiste valmistettiin julkaisun Bull. Soc. Chim. France 1955, 1353-62 mukaises-ti.

20 N-Γ4-(morfolino-N-2-etoksii fenvvli Ί-N-Γ4-(2-t-butoksikar- bonvvlietvvli^ fenvvlisulfonamidi1 10-tuntisen huoneen låmpotilassa seisottamisen jalkeen 9,3 g:sta (30 mmol) 4-kloorisulfonyylifenyylipro-pionihapon t-butyyliesteria, 6,9 g:sta 4-(morfolino-N-2-25 etoksi)aniliinia, 0,3 g:sta dimetyyliaminopyridiinia ja 150 ml:sta metyleenikloridia saatava kirkas liuos pestaan kyllaisella natriumvetykarbonaattiliuoksella, haihdutetaan kolmasosaan tilavuudestaan ja kasitellaan kromatografises-ti piimaapylvååssa kayttaen eluenttina seosta, joka sisål-30 taa 90 % metyleenikloridia ja 10 % metanolia. Eluaatin paajae haihdutetaan.

Saanto: 9 g (61,2 % teoreettisesta) ‘H-NMR (CDClj) : S = 1,35 (s); 2,5 (m) ; 2,7-3,0 (m) ; 3,7 (m); 4,0 (t); 6,7-7,0 (m); 7,2-7,7 (m) MS (m/z); 491 (M+H) 35 N- [ 4- (morf olino-N-2-etoksi) fenyyli ] -N- [ 2-t-butoksikarbo- h 25 90537 nyylietyyli)fenyylisulfonyyli]-9-akridiinikarboksyylihap-poaxnidi

Liuokseen, joka sisaltaa 2,0 g (4,1 mmol) N-[4-(morfolino-N-2-etoksi)fenyyli]-N-(4-(2-t-butoksikarbonyy-5 lietyyli)fenyylisulfonamidia) 50 ml:ssa metyleenikloridia, sekoitetaan peråtysten 50 ml 33-%:ista natriumhydroksidia, 30 mg dimetyyliaminopyridiiniå, 1,2 g tetrabutyyliammoni-umkloridia ja 1,55 g (5,6 mmol) 9-akridiinikarboksyylihap-pokloridihydrokloridia samalla voimakkaasti sekoittaen. 6 10 tunnin kuluttua oroaaninen faasi erotetaan, peståån vedel-lå, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan.

Saanto: 2,8 g (98 % teoreettisesta) ‘H-NMR (CDCIj) : δ = 1,4 (s); 2,3-2,5 (m) ; 2,5-2,8 (m);

3.0- 3,3 (t) ; 3,6-3,9 (m); 6,3 (d) ; 6,9 (d); 7,4-8,3 (m) MS

15 (m/z): 695 )M+) N-Γ 4-(morfolino-N-2-etoksi)fenvvlil-N-Γ4-(2-karboksietvv-li)fenvvlisulfonvvlil-9-akridiinikarboksvylihaDPoamidi 0,7 g (1 mmol) N-[4-(morfolino-N-2-etoksi)fenyyli]-N-[4-(2-t-butoksikarbonyylietyyli) fenyylisulfonyyli] -9-ak-. 20 ridiinikarboksyylihappoamidia liuotetaan 5 mltaan trifluo-rietikkahappoa, ja liuoksen annetaan seisoa huoneen låmpo-tilassa yon yli. Liuos haihdutetaan vesisusuihkuoumpun avulla, jåånnos liuotetaan veteen, ja suodatetun liuoksen pH saådetaan natriumasetaatilla arvoon 4. Saostunut tuote 25 uutetaån metyleenikloridiin, liuos kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan.

Saanto: 0,6 g (94 % teoreettisesta) ‘H-NMR (DMSO): δ = 2,6-3,0 (m); 3,0.3,3 (m) ; 3,6.4,0 (m) ; 4.0- 4,4 (m); 5,8-6,6 (m); 6,8-7,0,(m); 7,3-8,4 (m).

30 MS: m/2 = 639 (M+) N-[4-morfolino-N-2-etoksi)fenyyli]-N-[4-(2-sukkinimidoyy-likarboksietyyli) fenyylisulfonyyli] -9-akridiinikarboksyy-liamidi

Saanto: 95 % teoreettisesta 26 90 537 1H-NMR (CDC13): 6 = 2,3.2,7 (m); 2,8 (s); 2,9-3,4 (m); 3,5-3,9 (m); 3,9-4,3 (m); 6,2-7,0 (m); 7,3-8,3 (m).

MS: 736 (M*) N-[4-(N-metyylimorfolino-N-2-etoksi)fenyyli]-N-[4-(2-suk-5 kinimidoyylikarboksietyyli)fenyylisulfonyyli]-10-metyy- liakridiini-9-karboksyylihappoamidiumdifluorisulfonaatti Saanto: 85 % teoreettisesta

Yhdiste on variltaan keltaisena selvåsti vesiliukoinen. 1H-NMR (DMSO): δ = 2,85 (s); 3,1 (s); 3,2-4,4 (m); 10 4,75 (s); 6,4-8,3 (m)

Eslmerkkl 8

Merkkiaineen valmistus TSH-kemiluminesenssi-im-muunimaaritystå vårten

Vasta-ainetta (91 μΐ, 100 ug), esimerkin 1 mukai-15 sesti valmistettua akridiniumjohdannaista (yhdiste 6; 20 μΐ, 1 mg/ml asetonitriilissa ja konjugaatiopuskuria (0,01 M fosfaattipuskuri, pH 8; 600 μΐ) inkuboidaan 15 minuut-tia. Senjaikeen lisataan 200 μΐ lysiinia (10 mg/ml konju-gaatiopuskurissa) ja inkubointia jatketaan 15 minuuttia. 20 Tama seos laitetaan PD 20 pylvaaseen [SelphadexR G 25 -tay- te (pallomainen poikittaissilloitettu dekstraanigeeli, valmistajayhtiO Pharmacia, Ruotsi)] ja eluoidaan kayttaen eluenttina 0,1 M fosfaattia, pH 6,3. Yksittaisten jakeiden kemiluminesenssiaktiivisuus testataan sopivan laimennuksen 25 jaikeen (350 μΐ hapetinta: 0,1 % H202:ta 0,1 N Na0H:ssa).

Merkkiainejakeet (1.aktiivisuushuippu) yhdistetaan, ja niita sailytetaan 4 °C:ssa. h-TSH-kemiluminesenssimaari-tyksessa kaytettavaksi valmis merkkiaine valmistetaan so-pivasti fosfaattipuskurilla [0,1 M fosfaatti, pH 6,3, 1 % 30 Tween* 20:ta (polyetyleenisorbitaanimonolauraatti, valmis- taja esim. ICI American Inc., USA), 0,1 % naudan seeru-mialbumiinia, 0,1 M NaCl, 0,01 % NaN3:a/ laimentamalla.

27 90537

Esimerkki 9 h-TSH-kemiluminesenssi-immuunimååritysten toteutus

Standardia/naytettå (50 μΐ) ja merkkiainetta (200 μΐ) ravistetaan 2 tuntia huoneenlåmpotilassa monoklonaali-5 silla anti-TSH-vasta-aineilla påållystetyisså putkissa.

Sen jalkeen suoritetaan kolmesti pesu 1 ml :11a puskuria tai tislattua vettå. Valonemissio saadaan aikaan lisaamal-la putkiin kuhunkin 300 μΐ aktivointireagenssia (puskuri, pH 1, 0,5 % H202:ta) ja 300 μΐ kaynnistysreagenssia (0,2 N 10 NaOH) luminesenssimittarissa olevien kahden jakelulaitteen kautta. Mittausaika on 1 s.

Kuvio 3 esittaå ihmisen kilpirauhasta stimuloivan hormoninen (h-TSH) immunologisten kemiluminometristen maa-ristysten (ICMA) standardikayran tyypillistå kulkua.

Claims

28 9Π537

1. Kaavan (I) mukaisia kemiluminesoivia akridinium-johdannaisia, 5 ^ A® (1) I 4 10 0 = C - R jossa R1 on vety tai alkyyliryhma, joka sisaltaa 1-10 hii-liatomia, R4 on ryhma, jolla on kaava (II) tai (III) 15 6 R -N^ (II) \ 5 SO -X-R 2 .:.20 5 X-R \ 6 (111) SO -R 2 25 joissa R5 on ryhmå, jolla on kaava V: 0 o y—

30. C - 0 - N (V) R6 on fenyyliryhma, joka voi olla substituoitu 1-4 C-atomia sisaltavilla alkyyli-, tai alkoksyyliryhmilla tai morfo-35 lino (C]-C4) -alkoksiryhmalla, I; 29 90 537 X on fenyyliryhmå, joka on sitoutunut suoraan typpi- tai rikkiatomiin ja C^-alkyyliryhmån vålityksellå ryhmaån R5, ja A' on anioni, joka ei vaikuta haitallisesti kemilumi-nointiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, t u n - n e t t u siita, etta X on ryhma, jolla on kaava IV -r7-<o) (IV) 10 jossa R7 on substituentti, jonka kaava on -(CH2)n, jossa n on 0-4.

3. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen yhdiste, tunnettu siita, ettå silla on kaava VI 15 CH_ A’ o3o „ I p 1 2 0./¾ <vi> \ * >- SO. -X — C - 0 - N yJ o 25 jossa X on ryhma, jolla on kaava VII, O-(CH ) - iVII> 2 n 30 jossa n on 2 tai 4, R12 ja R13 ovat kumpikin itsenaisesti vety, alkyyli- tai al-koksyyliryhma, joka sisaltaa 1-4 C-atomia, tai morfolino-(C,-C4)-alkoksiryhma ja A :11a on patenttivaatimuksessa 1 35 kuvattu merkitys. 30 90537

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen yhdiste, tunnet t u siita, ettS X on p-etyleenifenyyliryhma, R12 on H ja R13 on p-metoksyyliryhma tai R12 on o-metoksyyliryhma ja R13 on p-metoksyyliryhma.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen yhdiste, tunnettu siita, etta silla on kaava VIII CH Αθ 10 (VIII) I o .c x- - c V-. o N 0 - N \ 6 VJ S02-R o'f 15 jossa X:lla on patenttivaatimuksessa 1 tai 2 kuvattu mer-kitys ja R6 on fenyyliryhmå, joka voi olla substituoitu korkeintaan kolmella alkyyli- tai alkoksyyliryhmalla, jot-ka kukin sisaltåvåt 1-4 C-atomia, tai morfolino (C,-C4)-20 alkoksiryhmalla, ja X on o-, m- tai p-fenyleeniryhmå.

6. Menetelma patenttivaatimuksen 1 mukaisten yhdis-teiden valmistamiseksi, tunnettu siita, ettå yh-disteen, jolla on kaava IX, OCXi c (IX) // \

0 Y 30 annetaan reagoida suojatun sulfonamidikarboksyylihapon kanssa, jolla on kaava X H O 6 i * R - S02 - N - X - C - OZ (X) 35 3i 90537 tai kaava XI H R6 - N - S02 - X - COOZ (XI) 5 joissa kaavoissa Y on halogeeni tai oksikarbonyylialkyy- li-; oksikarbonyyliaryyli- tai imidatsolidiryhmå, X:lla ja R6:lla on patenttivaatixnuksessa 1 kuvatut merkitykset ja Z on karboksyylisuojaryhmå, joka myohemmin poistetaan, ja talloin saatu happo muutetaan halutuksi, ryhmån R5 sisål-10 tavaksi akridiniumjohdannaiseksi, jonka akridiinirunkoon kuuluva typpi sitten viela kvaternisoidaan.

7. Menetelmå luminesoivan yhdisteen valmistamisek-si, tunnettu siita, etta patenttivaatimuksen 1 mukainen kaavaa I vastaava akridiniumjohdannainen sidotaan 15 suoraan tai siltamolekyylin vålityksellå proteiiniin, po-lypeptidiin tai johonkin muuhun biologiseen aineeseen, jolloin muodostuu stabiili, immunologisesti aktiivinen konjugaatti.

8. Luminesenssi-immuunimååritys antigeenisen aineen 20 mHarittåmiseksi nestenåytteestå, tunnettu siita, etta toteutettaessa se kompetitiivisella tai sandwich-me-netelmalla ainakin yksi immunologisesti aktiivinen komponentti on immobilisoitu kiinteålle faasille ja ainakin yksi muu komponentti, merkkiaine, on patenttivaatimuksen 7 25 mukaisesti valmistettavissa oleva luminesoiva yhdiste.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi-immuunimaåritys, tunnettu siita, a) antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavasta nesteestå otetun 30 nåytteen ja antigeenista ja patenttivaatimuksen 1 mukai-sesta, kemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin kanssa; b) nåyte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan peråkkåin tai 35 samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja 32 90537 d) mitatusta valonemission voimakkuudesta mååritetåån lasna olevan antigeenin måårå.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen luminesenssiim- muunimååritys, tunnettu siitå, ettå ennen merki- 5 tyn konjugaatin lisåystå tutkittava neste erotetaan immo-bilisoidusta vasta-aineesta.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim- muunimååritys, tunnettu siita, ettå a) antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua 10 vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavasta nesteesta otetun naytteen ja toisesta spesifisesti reagoivasta vasta-aineesta seka patenttivaatimuksen 1 mukaisesta, kemilumines-oivasta akridiniumjohdannaisesta koostuvan konjugaatin kanssa; 15 b) nayte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan peråkkain tai samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja d) mitatusta valonemission voimakkuudesta mååritetåån las- 20 na olevan antigeenin maårå.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen luminesenssi-immuunimååritys, tunnettu siita, ettå ennen mer-kityn konjugaatin lisåystå tutkittava neste erotetaan im-mobilisoidusta vasta-aineesta.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim- muunimååritys, tunnettu siita, ettå a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoitua antigeenia inkuboidaan tutkittavasta nesteesta otetun nåytteen ja vasta-aineesta ja patenttivaatimuksen 1 mukai- 30 sesta, kemiluminesoivasta akridiniumjohdannaisesta koostu van konjugaatin liuoksen kanssa; b) nåyte ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan peråkkain tai samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin 35 kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja l· 33 90537 d) mitatusta valonemission voimakkuudesta mååritetåån lasna olevan antigeenin måårå.

14. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim-muunimååritys, tunnettu siitå, etta 5 a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoi-tua antigeenia inkuboidaan vasta-aineesta ja patenttivaatimuksen 1 mukaisesta, kemiluminesoivasta akridiniumjoh-dannaisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa; b) reagoimaton merkitty konjugaatti erotetaan; 10 c) lisåtaån tutkittavasta nesteesta otettu nåyte; d) sitten nåyte erotetaan taas; e) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan perakkain tai samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja 15 f) mitatusta valonemission voimakkuudesta mååritetåån lasna olevan antigeenin maara.

15. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim-muunimååritys, tunnettu siita, etta a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa immobilisoi-20 tua antigeenia inkuboidaan vasta-aineesta ja patentti-vaa- timuksen 1 mukaisesta, kemilunesoivasta arkidiniumjohdan-naisesta koostuvan konjugaatin liuoksen kanssa; b) lisataan tutkittavasta nesteesta otettu nayte; c) nåyte ja sitoutumaton konjugaatti erotetaan; 25 d) sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan perakkain tai samanaikaisesti kosketukseen yhden tai useamman reagenssin kanssa valonemission aikaansaamiseksi; ja e) mitatusta valonemission voimakkuudesta maaritetaan låsnå olevan antigeenin måårå. 34 90537