JPH0625763B2 - アンフェタミンおよびメタンフェタミンの蛍光偏光イムノアッセイ法 - Google Patents

アンフェタミンおよびメタンフェタミンの蛍光偏光イムノアッセイ法

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JPH0625763B2
JPH0625763B2 JP63024879A JP2487988A JPH0625763B2 JP H0625763 B2 JPH0625763 B2 JP H0625763B2 JP 63024879 A JP63024879 A JP 63024879A JP 2487988 A JP2487988 A JP 2487988A JP H0625763 B2 JPH0625763 B2 JP H0625763B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は一般に蛍光偏光イムノアッセイ法およびそれに
使用する試薬に関し、とりわけアンフェタミンおよびメ
タンフェタミンのアッセイ法に関する。本発明の方法
は、β−ヒドロキシアミン類に対する交差反応性を取り
除くのに有効な前インキュベーション工程を提供するも
のである。
［従来技術］ アンフェタミンおよびメタンフェタミンは、中枢神経系
興奮作用を有する交感神経興奮性フェネチルアミン誘導
体である。これらの薬剤は肥満、ナルコレプシーおよび
低血圧の治療に用いられている。これらは興奮作用を有
するので、一般に密売され濫用されている。非常に多量
のアンフェタミンおよびメタンフェタミンを消化するこ
とにしばしば伴う生理学的な兆候としては、高血圧、瞳
孔の拡張、高熱、痙攣および急性アンフェタミン精神病
が挙げられる。
最もしばしば試験される生物学的流体は尿である。他の
生物学的流体は、アンフェタミンおよびメタンフェタミ
ンの検出用アッセイに使用するものとしてはそれほど広
く研究されていない。過去においては、アンフェタミン
は多くの方法によって検出されていた。これらの方法に
は薄層クロマトグラフィー(TLC)、ガスクロマトグラフ
ィー(GC)および高速液体クロマトグラフィー(HPLC)など
が含まれるが、これらの方法は一般に薬剤の化学抽出の
工程が含まれており、これは高度の熟練者と長期のアッ
セイ期間を要する複雑な工程である。
一般に競合的結合イムノアッセイ法が、ＧＣやＨＰＬＣ
のような化学的方法に代わる好ましい方法として提唱さ
れている。概して競合的結合イムノアッセイ法は、試験
試料中のリガンドを測定するのに用いられる。一般に
「リガンド」とは競合的結合イムノアッセイにより定量
的に測定さるべき生物学的物質である。リガンドは、標
識試薬または「リガンド類似物」または「トレーサー」
と、該リガンドおよびリガンド類似物に特異的な抗体上
の限られた数のレセプター結合部位について競合する。
試料中のリガンドの濃度により抗体に結合するリガンド
類似物の量が決定される。すなわち、リガンドおよびリ
ガンド類似物はそれぞれ各濃度に比例して抗体に結合す
るので、抗体に結合するリガンド類似物の量は試料中の
リガンドの量に反比例することになる。
正確で信用性のあるイムノアッセイには、抗体の「交差
反応性」（所望のリガンド以外の化合物の認識）が最小
となることが必要である。アンフェタミンおよびメタン
フェタミンのアッセイの場合には、β−ヒドロキシフェ
ネチルアミンのようなβ−フェネチルアミンの誘導体が
深刻な干渉物であることが知られている。そのようなβ
−ヒドロキシフェネチルアミンの一つである薬のフェニ
ルプロパラミンは、店頭で売られている充血除去剤にし
ばしば含まれている。米国特許第3,856,469号明細書に
は、試料を８．０より大きいpHで過ヨウ素酸水溶液のあ
る量と水酸化アンモニウムの存在下で処理することによ
り、アンフェタミンもしくはメタンフェタミンの分析用
の試料から干渉物であるβ−ヒドロキシフェネチルアミ
ンを取り除く方法が開示されている。試料を塩基性のpH
で処理する必要があることに加えて上記米国特許におけ
る水性の事前処理は、薄層クロマトグラフィー、ラジオ
イムノアッセイによるイムノアッセイ、電子スピン共鳴
法もしくは酵素法により試料を評価するのに先立って用
いる場合にのみ有用であることを示唆している。
蛍光偏光法は、競合的結合イムノアッセイで生じたトレ
ーサー・抗体結合体の量を測定するための別の定量的も
しくは定性的手段を提供するものである。蛍光偏光法
は、蛍光標識化合物が平面偏光により励起したときに、
その回転度とは逆の関係にある偏光の度合を有する蛍光
を放射するという原理に基づいている。したがって、蛍
光標識を有するトレーサー・抗体結合体が平面偏光によ
り励起すると、蛍光担体は光が吸収され放射される間は
回転することが抑えられるので、放射した光は高度に偏
光したままである。これとは対照的に、未結合トレーサ
ーが平面偏光により励起したときはその回転は対応する
トレーサー・対抗結合体よりもはるかに速くなり、励起
した分子の集団は一層速く無作為化する。その結果、未
結合トレーサー分子から放射された光は偏光がなくな
る。
現在までのところ、単独のアッセイでアンフェタミンお
よび／またはメタンフェタミンを測定するための蛍光偏
光アッセイは開示されていない。
このようなことから、尿のような生物学的流体中のアン
フェタミンとメタンフェタミンの両方について信頼性が
あって正確な蛍光偏光アッセイを行うための方法および
試薬を提供する必要がある。さらに、塩基のようなpHを
上昇させる成分を加えることなく、アンフェタミンおよ
び／またはメタンフェタミンについて試験しようとする
尿試料を過ヨウ素酸水溶液で前処理する必要がある。
［発明の構成および効果］ 本発明は、蛍光偏光法を利用したアンフェタミンおよび
メタンフェタミンの測定法に関する。とりわけ本発明の
方法は、試料のpHをアルカリ条件に調節することなく、
アンフェタミンおよび／またはメタンフェタミンについ
て試験しようとする尿試料を前インキュベーションに供
することによるものである。特に試料をpH約４．０〜
７．５の過ヨウ素酸水溶液単独で処理し、アンフェタミ
ンやメタンフェタミンおよびリガンド類似物に特異的な
抗体と交差反応する有害な化合物を取り除くことに特徴
がある。すなわち本発明は、(1)蛍光偏光アッセイ法に
よる生物学的流体の試験試料中のフェネチルアミンの測
定法において、β−ヒドロキシフェネチルアミン交差反
応物を取り除くに充分な時間、該試験試料をpH約４．０
〜約７．５の過ヨウ素酸水溶液の有効量で前以て処理す
ることを特徴とする方法、 (2)(a)アンフェタミンおよびメタンフェタミンに対する
β−ヒドロキシフェネチルアミン交差反応物を取り除く
に充分な時間、生物学的流体の試験試料をpH約４．０〜
約７．５の過ヨウ素酸水溶液の有効量で前以て処理し、 (b)該前以て処理した試料を式 （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、ＴはＳＯ２、ＮＨ、ＮＨ（ＣＨ２）３Ｏ、ＣＯＣＨ
２、ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ、ＨＮ（ＣＨ２）２およ
びＨＮ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２よりなる群から選ば
れた連結基を表す）で表される第１のトレーサー、式 （式中、ＱおよびＴは前記と同じ）で表される第２のト
レーサー、アンフェタミンと該第１のトレーサーを特異
的に認識し結合することのできる第１抗体、およびメタ
ンフェタミンと該第２のトレーサーを特異的に認識し結
合することのできる第２抗体と混合し、ついで 蛍光偏光法により該試験試料中のアンフェタミンおよび
メタンフェタミンの量を測定することによって、該第１
抗体および第２抗体に結合した各トレーサーの量を決定
する ことを特徴とする、生物学的流体の試験試料中のアンフ
ェタミンおよびメタンフェタミンの測定法、 (3)(a)β−ヒドロキシフェネチルアミン交差反応物を取
り除くに充分な時間、生物学的流体の試験試料をpH約
４．０〜約７．５の過ヨウ素酸水溶液の有効量を用いて
前以て処理してβ−ヒドロキシフェネチルアミン交差反
応性を取り除き、 (b)該前以て処理した試料を式 （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、ＴはＳＯ２、ＮＨ、ＮＨ（ＣＨ２）３Ｏ、ＣＯＣＨ
２、ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ、ＨＮ（ＣＨ２）２およ
びＨＮ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２よりなる群から選ば
れた連結基を表す）で表される第１のトレーサーおよび
式 （式中、ＱおよびＴは前記と同じ）で表される第２のト
レーサーの塩、アンフェタミンと該第１のトレーサーを
特異的に認識し結合することのできる第１抗体、および
メタンフェタミンと該第２のトレーサーを特異的に認識
し結合することのできる第２抗体と混合し、 蛍光偏光法により該試験試料中のアンフェタミンおよび
メタンフェタミンの量を測定することによって、該第１
抗体および第２抗体に結合した各トレーサーの量を決定
し、ついで (d)試料および試薬分配手段を０．１〜０．２５モルの
過ヨウ素酸水溶液中で洗浄して試料の該分配手段への付
着を最小限に抑える ことを特徴とする、試料おび試薬分配手段を有する自動
アッセイ装置を利用した蛍光偏光アッセイによる生物学
的流体の試験試料中のアンフェタミンおよびメタンフェ
タミンの測定法、およびそれらの方法に使用する試薬に
関するものである。
処理した試料は、ついでアンフェタミンのリガンド類似
物に結合した第１のフルオレセインもしくはフルオレセ
イン誘導体トレーサー化合物、アンフェタミンのリガン
ド類似物に結合した第２のフルオレセインもしくはフル
オレセイン誘導体トレーサー化合物、アンフェタミンお
よび第１のトレーサー化合物を特異的に認識し結合する
ことのできる第１抗体、およびメタンフェタミンおよび
第２のトレーサー化合物を特異的に認識し結合すること
のできる第２抗体からなる組成物と混合する。第１およ
び第２の抗体とそれぞれ結合する第１および第２のトレ
ーサー化合物の量は、試料中のアンフェタミンおよびメ
タンフェタミンの量の測定手段としての蛍光偏光法によ
って決定される。
第１のトレーサー化合物は下記式 で表される化合物であるのが好ましく、第２のトレーサ
ー化合物は下記式 で表される化合物であるのが好ましい。上記式中、Ｑは
フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体、好ましく
はカルボキシフルオレセインもしくは４′−アミノメチ
ルフルオレセイン、ＴはＳＯ２、ＮＨ、ＮＨ（ＣＨ２）
３Ｏ、ＣＯＣＨ２、ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ、ＨＮ
（ＣＨ２）２およびＨＮ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２よ
りなる群から選ばれた連結基を表す。
アッセイに用いたアンフェタミンおよびメタンフェタミ
ンに対する抗体は、タンパク質キャリヤー（好ましくは
ウシ血清アルブミン）に結合したアンフェタミンおよび
メタンフェタミン誘導体に対する応答の結果として生成
される。
本発明はさらに単独のアッセイでアンフェタミンおよび
メタンフェタミンを測定するのに有用な安定化試薬キッ
トにも関し、このキットは上記方法に試薬として有用な
式（Ｉ）および(II)の両トレーサーおよびそれらの塩を
有する新規な蛍光試薬を含む。本発明による試薬キット
の他の成分は、β−ヒドロキシフェネチルアミンに対す
る有害な交差反応を取り除くのに有効な量の過ヨウ素酸
を含有する前処理水溶液、およびアンフェタミンを特異
的に認識し結合することのできる第１抗体とメタンフェ
タミンを特異的に認識し結合することのできる第２抗体
とからなる成分の抗体試薬である。ピペットのような自
動分配手段を利用した自動蛍光偏光アッセイの場合に
は、尿が分配手段に付着することに起因する試料の取り
残しを最小限にくい止めるために過ヨウ素酸水溶液で分
配手段を洗浄することを本発明で行う。好ましい洗浄水
溶液の濃度は過ヨウ素酸ナトリウムが０．１〜０．２５
モルである。
定義 本明細書において「リガンド」なる語は、レセプターや
抗体のような結合タンパク質を取得もしくは生成し得る
分子をいう。本発明の対象とするリガンドはフェネチル
アミン、さらに詳しくはアンフェタミンおよびメタンフ
ェタミンである。そのようなリガンドはタンパク質が結
合しておらず一般に低分子量であり、動物体内に注入し
たときに抗体生成を引き起こさないが抗体に反応性であ
る。キャリヤータンパク質に結合させるために化学的に
修飾したリガンドはハプテンと呼ばれる。一般にハプテ
ンに対する抗体は、まずハプテンをキャリヤータンパク
質に結合させ、ついで結合生成物を動物体内に注入する
ことにより生成される。こうして得られた抗体は、よく
知られた通常の抗体単離法により単離される。
「リガンド類似物」なる語は、一価もしくは多価のラデ
ィカルで、その実質的な部分がリガンドと同一の空間的
および極性的構造を有してレセプターの結合部位につい
てリガンドと競合し得る１個もしくは２個以上の決定基
もしくはエピトープ部位を形成するものをいう。そのよ
うなリガンド類似物の特徴は、抗体により認識さるべき
リガンドと充分な構造的類似性を有していることであ
る。たいていの場合、リガンド類似物は分子表面の有意
部分において対象とするリガンド（本発明の目的におい
てはアンフェタミンおよびメタンフェタミン）と同一も
しくは実質的に同一の構造および電荷分布（空間的およ
び極性的構造）を有する。抗体産生のための抗原を製造
する場合のハプテンの連結部位は、しばしば、リガンド
に連結させるためのトレーサーに使用するものと同じで
あり、抗体に対する鋳型を提供するリガンド類似物の同
じ部分がトレーサー中のリガンド類似物によってもたら
される。
本発明はフルオレセインおよびその誘導体の使用を包含
する。本発明においてトレーサー化合物として使用する
ために必要なフルオレセインおよびその誘導体の性質は
蛍光性である。フルオレセインは環境の酸の濃度(pH)に
従って下記式で示される２種の互変異体のいずれかで存
在する。
開環体（酸）では多くの二重結合が存在し、これはこの
体のフルオレセイン（およびフルオレセイン残基を含む
化合物）が約４ナノ秒の励起状態寿命の後、青色の光を
吸収し緑色の蛍光を放射するようになる。開環体および
閉環体が共存するときは、開環体および閉環体分子の相
対濃度はpH値を調節することによって容易に変えること
ができる。一般に本発明のトレーサー化合物は溶液中で
はナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などの塩
の形で存在するので本発明の分析法に用いたときに開環
の蛍光体として存在することができる。溶液中に存在す
る特定の塩は、pH値を調節するために用いたバッファー
に依存する。たとえば、リン酸ナトリウムバッファーの
存在下では本発明の化合物はナトリウム塩として開環体
で存在する。
本明細書において「フルオレセイン」の語は、単独の化
合物としてであれより大きな化合物の成分としてであ
れ、蛍光に関する場合を除いて、それが特定の分子とし
て存在するのであれば開環体および閉環体の両方を含む
ものとする。蛍光を発生するには開環体であることが必
要である。
フルオレセイン分子上の炭素原子の番号づけは、開環体
と閉環体のいずれを考慮しているかによって異なる。し
たがって、フルオレセインおよびその化合物に関する文
献は炭素原子の番号づけについては一様ではない。開環
体においてはフェニル環上のカルボキシル基に対しパラ
の位置にある炭素原子は番号が５である。本開示の目的
においては閉環体の番号づけを採用することにする。と
いうのは、合成に用いられる出発物質はその番号づけを
することが最も一般的であるからである。それゆえ本発
明の開示の目的においてはカルボキシル基に対してパラ
の位置にあるフルオレセインおよびその誘導体の炭素原
子は番号が６となる。
抗体と複合していない溶液中のトレーサーは、吸光し蛍
光を再び放射するのに必要な時間よりも短い間、自由に
回転することができる。その結果、再び放射される光は
比較的でたらめな方向となるので、抗体に複合していな
いトレーサーの蛍光偏光は低く０に近付く。特定の抗体
と複合すると、こうして形成されたトレーサー・抗体複
合体は、比較的小さなトレーサー分子よりも抗体分子の
回転度合が小さくなり、それゆえ偏光の増大が観察され
る。したがってリガンドが抗体部位のトレーサーと競合
するときは、遊離のトレーサーとトレーサー・抗体複合
体との混合物から観察される蛍光の偏光は、トレーサー
の偏光とトレーサー・抗体複合体の偏光と中間値とな
る。試料が高濃度のリガンドを含んでいると観察される
偏光値は遊離のトレーサーの値に近付く、すなわち低く
なる。一方、試験試料が低濃度のリガンドを含んでいる
と偏光値は結合トレーサーの値に近付く、すなわち高く
なる。垂直方向および水平方向に偏光した光でイムノア
ッセイ用反応混合物を連続的に励起させ放射光の垂直成
分のみを分析することによって反応混合物の蛍光偏光を
正確に決定することができる。測定しようとするリガン
ド濃度と偏光との正確な関係性は、既知の濃度を有する
目盛り標準の偏光値を測定することによって確立するこ
とができる。リガンド濃度は、こうして作成した標準曲
線から算出することができる。
本発明に従って生成した特定のトレーサーは、以下に述
べるように驚くほど優れたアッセイ結果を示した。
試薬 蛍光偏光イムノアッセイを設計する目的は、抗体の認識
部位に対して所望のフェネチルアミンとトレーサーとの
間で競合を起こさせることである。この目的を達成する
ために、ハプテンおよびトレーサーの構造を広範囲にわ
たり変化させることができる。本発明の目的に即せば、
「ハプテン」は免疫原もしくはトレーサーに前駆体であ
り、一般に置換フェネチルアミン誘導体およびキャリヤ
ータンパク質もしくはフルオレセイン化合物への連結基
からなる。
(1)前処理試薬 本発明の重要な側面は、過ヨウ素酸水溶液の有効量で試
験試料を前以て処理することによって、蛍光偏光アッセ
イにおいてβ−ヒドロキシフェネチルアミンに対する交
差反応性を取り除くことができることである。すなわち
過ヨウ素酸水溶液は、α−炭素原子に結合した水酸基が
あるときにα−炭素とβ−炭素との間の側鎖を開裂させ
る。それゆえ、そのような化合物はもはや結合部位で競
合しない。
本発明の試薬キットによる前処理試薬は、pH約４〜７．
５の過ヨウ素酸水溶液が含む。前処理溶液は、約４．０
〜５．０の範囲のpHの過ヨウ素酸ナトリウム０．２５モ
ルを含むのが好ましい。過ヨウ素酸ナトリウム溶液は、
約０．１２５モルの過ヨウ素酸ナトリウムを含みpHが約
４．５であるのが最も好ましい。驚くべきことに、水酸
化物のような化合物で試験試料のpHをアルカリ条件に調
整する必要なしに試験試料の前処理を行うことができる
ことがわかった。
(2)トレーサー (a)トレーサーの構造 本発明に使用できるトレーサーは、広範囲のフェネチル
アミン誘導体から製造することができる。本発明のトレ
ーサーは前記一般式(I)で表される構造を有する。
トレーサーは、たとえばアミド基、アミジノ基、トリア
ジニルアミノ基、カルバミド基、チオカルバミド基、カ
ルバモイル基、チオカルバモイル基またはスルホニルカ
ルバモイル基によってフルオレセイン誘導体に連結され
たフェネチルアミン誘導体である。トレーサーは以下の
合成法および実施例で述べるように、アミノ基、カルボ
キシル基、水酸基、イミド基、ヒドラジド基、イソシア
ネート基、チオイソシアネート基、クロロホルメート
基、クロロチオホルメート基、クロロスルホニル基など
を含有するフェネチルアミン誘導体に適当なフルオレセ
イン誘導体を連結することによって製造することができ
る。
例として以下のフルオレセイン誘導体のいずれをも使用
することができる。
F1-NH2 フルオレセインアミン F1-CO2H カルボキシルフルオレセイン F1-NHCOCH2I α−ヨードアセトアミドフルオレセイ
ン F1-CH2NH2 アミノメチルフルオレセイン ２，４−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル
アミノ−フルオレセイン(DTAF) ４−クロロ−６−メトキシ−１，３，５−トリアジン−
２−イルアミノフルオレセイン（メトキシＤＴＡＦ） F1-NCS フルオレセインイソチオシア
ネート 本発明による好ましいトレーサーは、前記式(I)および
(II)で表される化合物である。最も好ましくは、式(II
I)： より具体的には下記式(III′)： および式(IV) より具体的には下記式(IV′)： で表される化合物であり、それぞれカルボキシフルオレ
セインおよび４′−アミノメチルフルオレセインがアン
フェタミンおよびメタンフェタミンに連結した構造を有
する。
(b)トレーサーの合成 本発明のトレーサーは、式（Ｖ）： （式中、ＸはＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＮＯＲ、ＯＨまたは
ＳＯ２Ｃ１、ＺはＨまたはＣＨ３を表す）で表される化
合物にフルオレセイン残基またはフルオレセイン誘導体
を結合させることによって製造することができる。
フルオレセイン残基は、下記式で示されるように、アミ
ド結合、アミジン結合、尿素結合、チオ尿素結合、カル
バメート結合、チオカルバメート結合、トリアジニルア
ミノ結合、スルホンアミド結合またはスルホニルカルバ
メート結合によってアミノ、カルボキシル、クロロスル
ホニル、イミドまたはアルコキシ官能基に連結すること
ができる。
-NH-CO-F1 (VI-4) -CO-NH-F1 (VI-5) -NH-CO-NH-F1 (VI-6) -NH-CS-NH-F1 (VI-7) -O-CO-NH-F1 (VI-8) -O-CS-NH-FI (VI-9) -SO2-NH-F1 (VI-10) -O-CO-NH-SO2-NHF1 (VI-11) アンフェタミンについて現在までのところ好ましい実施
態様は、フルオレセイン誘導体が５−カルボキシフルオ
レセインであって、これが式(V)のトレーサー前駆体に
結合しているものである。５−カルボキシフルオレセイ
ンは、まず５−カルボキシフルオレセインの活性エステ
ルを形成することによって４−（３−アミノプロポキ
シ）−アンフェタミン（ｔ−ブトキシカルボニル基によ
りフェネチルアミンの窒素原子が保護されている）と結
合される。好ましい活性エステルはＮ−ヒドロキシスク
シンイミド活性エステルであり、その好ましい製造法は
乾燥ピリジン中でＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジ
イミドを経由するものである。他の活性基、たとえば１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノー
ル、イミダゾールなども使用できるし、他の溶媒、たと
えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなど
も使用することができる。反応物は、アミド結合を形成
する条件下で反応させることが好ましく、また活性エス
テル法を用いることが最も好ましい。ついでＮ−ＢＯＣ
基は、およそ１：１のＣＦ３ＣＯ２ＨとＣＨ２Ｃｌ２の
溶液に短時間さらすことによって取り除くことができ
る。
メタンフェタミントレーサーの好ましい実施態様は式(I
V′)で表される化合物であり、ここではフルオレセイン
誘導体は４′−アミノメチルフルオレセインとなってお
り、これが式(V)で表される前駆体と結合する。
メタンフェタミン誘導体はその活性エステル体に変えら
れる。好ましい活性エステルは、ウッドワード試薬Ｋと
しても知られる２−エチル−５−フェニルイソオキサゾ
リウム−３′−スルホネートの誘導体である。他の活性
基、たとえば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−
ニトロフェノール、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドなども使用することができる
し、他の溶媒、たとえばジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシドなども使用することができる。好ましい
溶媒はジメチルホルムアミドとトリエチルアミンとの混
合溶媒である。ピリジンやジメチルスルホキシドのよう
な他の溶媒も使用することができる。反応物は、アミド
結合を形成する条件下で反応させることが好ましく、ま
た活性エステル法を用いることが最も好ましい。ついで
Ｎ−ＢＯＣ基は、およそ１：１のＣＦ３ＣＯ２ＨとＣＨ
２Ｃｌ２の溶液に短時間さらすことによって取り除くこ
とができる。
使用可能なトレーサーは種々のフェニルエチルアミン誘
導体から製造することができる。
アミノ基、ヒドラジニル基、ヒドラジド基などの末端ア
ミノ基を有するフェニルエチルアミン誘導体はすべて、
活性エステル法または混合無水物法によりカルボキシフ
ルオレセインに結合させることができ、また溶液中で２
種の物質を単に混合させることによってフルオレセイン
イソチオシアネート、ＤＴＡＦもしくはアルコキシＤＴ
ＡＦに結合させることができる。アミノ基は、それぞれ
ホスゲンおよびチオホスゲンと反応させることによって
イソシアネート基およびチオイソシアネート基に変える
ことができる。ついでこれらをフルオレセインアミンま
たは４′−アミノメチルフルオレセインと縮合させてト
レーサーを生成する。
末端クロロスルホニル基を有するフェニルエチルミン誘
導体はすべて、溶液中で２種の物質を単に混合させ、生
じた酸を塩基を用いて取り除くことによって４′−アミ
ノメチルフルオレセインまたはフルオレセインアミンに
結合させることができる。
カルボキシル基、（アミノヒドロキシ）アルキルカルボ
キシル基などの末端カルボキシル基を有するフェニルエ
チルアミン誘導体はすべて、活性エステル法により４′
−アミノメチルフルオレセインまたはアミノフルオレセ
インに結合させることができる。
(c)トレーサーの組合わせ 本発明に従えば好ましいトレーサー試薬は、第１のトレ
ーサーおよび第２のトレーサーの塩からなる組成物であ
る。一般に第１のトレーサーはアンフェタミンに対する
リガンド類似物の塩であり、第２のトレーサーはメタン
フェタミンに対するリガンド類似物の塩である。アンフ
ェタミンおよびメタンフェタミンに対する個々のトレー
サーを組合わせることによって、高い特異性、低い交差
反応性、高い感度および正確さを保持しながら両方の薬
剤（アンフェタミン／メタンフェタミン）を検出できる
という利点が得られる。上記手順により得られたアンフ
ェタミンとメタンフェタミンの組合わせは数多くある。
第１および第２のトレーサーはナトリウム、カリウム、
アンモニウムなどの塩であるのが好ましい。第１および
第２のトレーサーが試薬溶液中にナトリウム塩として存
在し、第１のトレーサーが式(III)で表されるアンフェ
タミンのリガンド類似物であって第２のトレーサーが式
(IV)で表されるメタンフェタミンのリガンド類似物であ
るのが最も好ましい。現在のところ好ましいトレーサー
の調合は、pH７．５のリン酸ナトリウムバッファー０．
１モル、０．１％アジ化ナトリウムおよび０．０１ウシ
ガンマグロブリン中に混合トレーサー約１５０ナノモル
である。
（３）抗体 本発明の抗体は、以下で述べる免疫原に対し動物中で応
答させることによって製造することができる。免疫原は
当業者によく知られた方法で一連の注射によりウサギや
ヒツジのような動物に投与する。
(a)免疫原の構造 使用可能な抗体は、種々のフェニルエチルアミン誘導体
から製造することができる。式(I)で表されるパラ位を
官能化したフェニルエチルアミン化合物から得られた免
疫原は動物中で抗体を産生する。そのような抗体は、適
当なトレーサーと組合わせると本発明のフェニルエチル
アミン類のアッセイに有用である。
本発明の免疫原は式(I)で表される一般構造を有し、以
下に合成法および実施例で述べるように、式(I)で示さ
れるフェニルエチルアミン化合物にタンパク質もしくは
タンパク質誘導体を結合させることによって製造するこ
とができる。式(I)で表される構造式が好ましいのは、
環が側鎖から最も遠い位置（すなわちパラ位）で置換さ
れているときに所望のフェニルエチルアミン化合物の認
識が最もよく起こるからである。
本発明の好ましい態様では、免疫原は上記置換フェニル
エチルアミン化合物にウシ血清アルブミンを結合させる
ことによって製造することができる。他のタンパク質キ
ャリヤーたとえばキーホールリンペットヘモシアニン、
卵アルブミン、ウシガンマグロブリン、サイロキシン結
合グロブリンなども有利に用いることができる。また
は、アンフェタミンもしくはメタンフェタミンハプテン
に反応性の官能基を有する他の合成もしくは天然ポリマ
ー物質を用いることができるように、利用できるアミノ
基の数が充分な合成ポリ（アミノ酸）も用いることがで
きる。本発明による最も好ましい免疫原は、式(VII) および式(VIII) で表されるものである。
(b)免疫原の合成 本発明の免疫原は、一般に式(I)で示されるようにアン
フェタミンもしくはメタンフェタミン誘導体にポリ（ア
ミノ酸）を結合することによって製造される。
本発明の好ましい態様において、ポリ（アミノ酸）がウ
シ血清アルブミン(BSA)であり、ハプテンは以下の式(IX
-a)〜(IX-e)の典型的構造の一つから選ぶことができ
る。
これらの反応物は、通常アミド結合、スルホンアミド結
合、尿素結合およびアルキルアミン結合を生成する条件
下で結合させるのが好ましく、そのような条件は当業者
にはよく知られたものである。活性エステル法を用いた
結合反応においてカルボキシル基を一方に用いることが
最も好ましい。それは、これらが所望のアミド結合を生
成する上で最も有効であるからである。
ハプテンをポリ（アミノ酸）に結合させる前に、側鎖側
のアミンを保護する。保護基としてたとえばトリフルオ
ロアセチルまたはＢＯＣを当業者によく知られた条件下
で加える。
免疫原は、フェニルエチルアミノ基が保護されパラ位に
−ＮＨ２、−ＣＯ２、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮＯＲ、
−ＣＨＯ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ，−ＯＣ
ＯＣｌ、ＳＯ２Ｃｌもしくは−ＯＣＳＣｌ基を有するハ
プテンをポリ（アミノ酸）に結合させることによって製
造する。−ＮＨ２は、アミンをコハク酸と反応させ、得
られるカルボキシル基を活性化し、これをポリ（アミノ
酸）に加えることによって、またはポリアミノ酸上のカ
ルボキシル基を−ＮＨ２基の存在下で活性化させること
によって結合させることができる。
ポリ（アミノ酸）上のカルボキシル基の活性化は、ハプ
テンおよびポリ（アミノ酸）を１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDC)、Ｎ，
Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、１−シク
ロヘキシル−３−（２−モリホリノエチル）カルボジイ
ミドメチル−ｐ−トルエンスルホネートなどと混合する
ことによって行うことができる。−ＣＯ２Ｈの場合にも
前記のトレーサー合成で述べたように活性化法(EDC)ま
たは活性エステル法により結合することができる。−Ｂ
ｒおよび−Ｉの場合もまたポリ（アミノ酸）上にアルキ
ル化アミンを生成することができるが、この場合はポリ
（アミノ酸）上のアミンヘのハロゲン化アルキルの直接
結合による。スルホニルクロリド、イソシアネート（−
ＮＣＯ）、チオイソシアネート（−ＮＣＯ）、クロロホ
ルメート（−ＯＣＯＣｌ）およびクロロチオホルメート
（−ＯＣＳＣｌ）の場合にもそれぞれスルホンアミド、
尿素、チオ尿素、カルバメートおよびチオカルバメート
結合を生じる。これはハプテンのポリ（アミノ酸）への
直接結合により行なわれる。
側鎖アミンの保護されたハプテンをタンパク質に結合し
たのち、保護基を取り除いて遊離のアミンもしくは塩の
形のアミンが得られる。用いた保護基がトリフルオロア
セチル基であるときは、塩基水溶液で処理するか、水酸
化ホウ素ナトリウムにさらすか、当業者に知られた他の
条件で処理することによって取り除くことができる。保
護基がＢＯＣ（ｔ−ブチルカルバメート）であるとき
は、酸水溶液、非水性酸、または当業者に知られた他の
手順で処理することによって取り除くことができる。
上記ハプテンの合成は、非常に似た方法で行うことがで
きる（式(V)は本発明の方法の好ましい実施態様による
免疫原を示す）。典型的な出発物質は、アンフェタミン
やメタンフェタミンのようなフェニルエチルアミンであ
る。Ｘ残基がＳＯ２Ｃｌであるときは、側鎖アミンの官
能性は保護基により不活性にしておく。ＸがＢｒＣＨ２
ＣＯＮＨ、ＩＣＨ２ＣＯＮＨ、ＣｌＣＯＮＨ、ＯＣＮＨ
またはＨ２Ｎであるときは、保護基はニトロ化反応の前
または後に導入することができる。後者のグループのハ
プテンのニトロ化は、保護したもしくは保護していない
フェニルエチルアミンを冷発煙硝酸にさらすことによっ
て行う。ニトロ基を接触還元してアミノ基に変えた後、
無水コハク酸、臭化ブロモアセチルまたはホスゲン（も
しくはホスゲンと同等のもの）と縮合する。カルボキシ
ル基を含有するハプテンは上述した方法で活性化する。
ブロモアセトアミド誘導体は、ヨウ化カリウムもしくは
ヨウ化ナトリウム水溶液の存在下でタンパク質に結合さ
せる。ＸがＳＯ２Ｃｌである場合は、タンパク質の結合
はタンパク質の水溶液または水−有機溶液をクロロスル
ホニルフェニルエチルアミン誘導体にさらすことによっ
て行う。結合後、保護基を当業者に知られた方法により
取り除き、免疫原をサイズ排除クロマトグラフィーかま
たは透析により精製する。
(c)抗体の組合わせ 本発明によれば好ましい抗体試薬は、上述の免疫原に対
する応答の結果として産生されアンフェタミンを認識し
結合することができる第１抗体、およびメタンフェタミ
ンを認識し結合することができる第２抗体からなる組成
物である。上述の手順に従ってアンフェタミンもしくは
メタンフェタミン免疫原に対する応答の結果として産生
された抗体の組合わせは数多くある。ただし、抗体はア
ンフェタミンおよび／またはメタンフェタミンに特異的
でなければならない。抗体試薬は、式(XII)で表される
免疫原により産生された抗体の所定量、および式(VIII)
で表される免疫原により産生された抗体の所定量を含む
のが最も好ましい。
ウサギ、ヒツジもしくは他の動物の血清は、抗体試薬の
抗体原とすることができる。好ましい抗血清の調合は、
pH７．５のリン酸ナトリウムバッファー０．１モルで希
釈したウサギ血清、０．１％アジ化ナトリウム、０．０
１％ウシガンマグロブリン、および２％エチレングリコ
ール(v／v)からなる。
(4)洗浄試薬 驚くべきことに、フェニルエチルアミンフルオレセイン
アッセイ用キットに過ヨウ素酸水溶液試薬を用いること
によってアッセイの信頼性と正確さが向上することがわ
かった。特に、洗浄溶液を約０．１〜０．２５Ｍの過ヨ
ウ素酸水溶液とするとプローブ、ピペットもしくはスポ
イトのような分配手段に尿が付着するのを除くことがで
きることがわかった。分配手段に尿が付着すると試料が
汚染されて、フェニルエチルアミン含有試料に引き続い
て試験した試料の試験結果が正の方向に誤差を生じたも
のとなることを理解しておく必要がある。高度に自動化
されたアッセイ装置の場合、たとえばＡＢＢＯＴ ＴＤ
ｘでは多数の試料を連続的に試験するものであるが、こ
のようなものでは試料間の尿の「持ち越し」を除くこと
はとりわけ望まれる。試薬キットには約０．１２５Ｍの
過ヨウ素酸ナトリウムを含む洗浄水溶液を備えることが
好ましい。
アッセイ法 本発明の特定のトレーサーおよび抗体は、所望のフェニ
ルエチルアミンの蛍光偏光アッセイに優れた結果を示す
ことがわかった。フェニルエチルアミンの一般構造は式
(X) （式中、ＺはＣＨ３またはＨ） で示されるものであり、本発明に従って定量的および／
または定性的に決定することができる。たとえば本発明
の一つのアッセイ法によれば従来法によるよりも一層速
くて正確なアンフェタミン／メタンフェタミンのアッセ
イ法となるが、これは本発明の方法では分析前に試料を
処理する必要がなく、またアンフェタミン様化合物に対
する交差反応性が最小であるためである。
本発明の好ましい実施態様の分析法によれば、アンフェ
タミン／メタンフェタミンアッセイでは、アンフェタミ
ンおよび／またはメタンフェタミンを含有するか含有す
ると思われる尿試料を、有害な交差反応性を取り除くに
充分な時間、pH約４〜７．５の過ヨウ素酸水溶液の有効
量で前以て処理する。０．１〜０．２５モルの過ヨウ素
酸ナトリウム水溶液で約１〜９分間試料を前以て処理す
るのが好ましく、約３１〜３６℃の温度で４〜５分間処
理するのが最も好ましい。
ついで前処理した試料はトレーサー、およびアンフェタ
ミンおよびメタンフェタミンに特異的な抗体試薬と混合
する。アンフェタミンもしくはメタンフェタミンとトレ
ーサーは限られた抗体部位に対して競合し、その結果、
抗体・リガンド複合体を生成する。トレーサーと抗体の
濃度を一定にすることにより、インキュベーションで生
成したトレーサー・抗体複合体に対する抗体複合体の比
は、試料中のアンフェタミンおよび／またはメタンフェ
タミンの量に正比例するものとなる。それゆえ、混合物
を平面偏光で励起させトレーサーもしくはトレーサー・
抗体複合体により放射された蛍光の偏光度を測定するこ
とにより、試料中のアンフェタミンおよび／またはメタ
ンフェタミンの量を定量的または定性的に測定すること
ができる。
その結果は正味のミリ偏光ユニット(net millipolariza
tion units)、スパン（ミリ偏光ユニット内での）およ
び相対強度により定量化することができる。ミリ偏光ユ
ニットを測定すると、アンフェタミンもしくはメタンフ
ェタミンが存在せず最大量のトレーサーが抗体に結合し
ているときに偏光が最大となることが示される。抗体に
結合したトレーサーの量は正味のミリ偏光に正比例す
る。本発明の目的のためには１９０よりも大きい正味の
ミリ偏光値が理想的であるが、約１５０〜約２２０の範
囲であっても構わない。スパンは、抗体に結合したトレ
ーサーの最大量および最小量の点での正味のミリ偏光の
違いを示す表示度数である。スパンが大きいほどデータ
の定量分析が一層良好となる。本発明の目的のために
は、少なくとも約６０ミリ偏光ユニットのスパンである
ことが好ましい。強度は、バックグラウンド蛍光を越え
る蛍光シグナルの大きさの測定単位である。それゆえ、
強度が大きいほど測定が正確となる。強度は本発明の好
ましいトレーサーについて、垂直偏光強度と水平偏光強
度の２倍との和として測定される。強度は、トレーサー
や他のアッセイ変数の濃度に依存して、バックグラウン
ドノイズの約３倍〜約３０倍の範囲のシグナルであって
よい。本発明の目的のためには、バックグラウンドノイ
ズの少なくとも８倍〜１０倍の強度であることが好まし
い。
第１表には本発明の式(VII)と(VIII)の免疫原および式
(III′)と式(IV′)のトレーサー化合物により産生した
好ましい抗体について得られた結果をスパン、ミリ偏光
ユニットおよび強度により示している。第１表のデータ
から分かるように式(III′)のトレーサーと組み合わせ
て式(VII)の免疫原から生成する抗体を用いてアッセイ
するとアンフェタミンのアッセイについて優れた結果が
得られる。メタンフェタミンのアッセイについては、式
(VIII)の免疫原に由来する抗血清と式(IV′)のトレーサ
ーとを組み合わせると優れた結果が得られる。
本発明で独特な一つの側面は、式(VII)および(VIII)の
免疫原から産生した抗血清と式(III′)および(IV′)の
トレーサーとの組合わせであり、アンフェタミンかメタ
ンフェタミンのどちらでも２１０の正味の偏光、７０を
越えるスパンのアッセイが得られる。これはアッセイで
は最も好ましい数値である。
本発明の方法を行うときのpHは、トレーサーのフルオレ
セイン残基が開環体で存在するに充分なものでなければ
ならない。pHの範囲は約３〜１２、より普通には約５〜
１０、最も好ましくは約６〜８である。アッセイ操作中
に上記pH値を達成し維持するために種々のバッファーを
用いることができる。代表的なバッファーとしては、ホ
ウ酸バッファー、リン酸バッファー、炭酸バッファー、
トリスバッファー、バルビタールバッファーなどが挙げ
られる。いかなるバッファーを用いるかは本発明にとっ
て重要なことではないが、リン酸バッファーが好まし
い。バッファーのカチオン部分が一般に溶液中のトレー
サー塩のカチオン部分を決定する。
本発明のアッセイの好ましい方法は、実施例５で詳しく
述べる。本アッセイは「均一アッセイ」であり、この意
味は結合トレーサーが未結合トレーサーから分離されて
いない溶液から最終の偏光の読み取りが行なわれるとい
うことである。このことは、結合トレーサーを未結合ト
レーサーから分離しなければならない不均一イムノアッ
セイに対するまぎれもない利点である。
既に述べたように、本発明の蛍光偏光アッセイのための
試薬は、アンフェタミンおよびメタンフェタミンに特異
的な抗体、アンフェタミンおよびメタンフェタミンのフ
ルオレセイントレーサー類似物、および過ヨウ素酸前処
理溶液からなる。さらに希薄バッファーを含む通常のア
ンフェタミン／メタンフェタミンアッセイ溶液、d,l−
アンフェタミン度盛り測定器およびd,l−アンフェタミ
ン制御器を調製するのが好ましい。
好ましい手順は特にアボットＴＤｘアナライザー（アボ
ット・ラボラトリーズ、アービング、テキサスから入手
可能）と連合して使用するように設計されている。この
アボットＴＤｘアナライザーを用いたときは、アッセイ
は前処理から最終の読み取りにいたるまで完全に自動化
されることを理解する必要がある。しかしながら、手動
のアッセイを行うこともできる。自動および手動アッセ
イの場合、試料を希釈バッファー中の前処理溶液と混合
しバックグラウンドを読み取る。ついでトレーサーをア
ッセイに混合する。ついで最後に抗体を試験溶液中に混
合する。インキュベーション後、蛍光偏光を読み取り結
果を分析する。自動および手動の両方の場合において本
発明の方法は試料のpHを調節する必要がない。
つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ （メタンフェタミン免疫原の調製） (1)Ｄ，Ｌ−メタンフェタミン−Ｎ−トリフルオロアセ
トアミド 各４６０mlのＤ−およびＬ−メタンフェタミンを２５ml
の丸底フラスコ中で混合し、ついでこれを氷−水浴中で
冷やした。１５分かけてトリフルオロ酢酸８mlをアミン
の攪拌溶液中に２mlずつ徐々に加えた。その溶液を０℃
でさらに１時間攪拌した後、冷浴を除き薄黄色の溶液を
室温で２０時間攪拌した。その後、その溶液を約５０mg
の氷の上に注ぎ、得られた二層溶液をジエチルエーテル
５０mlで分液漏斗中へ希釈した。水層を除き、有機層を
水５０mlで２回、酢酸ナトリウムの飽和水溶液で１回、
再び水５０mlで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した
後、ジエチルエーテルを蒸発させると薄黄色の油状物
１．４６ｇが得られた。分析試料をプレパラティブ薄層
クロマトグラフィー(TCL)で単離した。粗製生物３１０m
gを３本のシリカゲルプレート（厚さ１mm、２０×２０c
m）上で酢酸エチルを用いて溶出した。Ｒｆ０．７８の
上方暗バンドを集めて薄黄色の液体２４４mgを得た。
(2)４′−クロロスルホニル−Ｄ，Ｌ−メタンフェタミ
ン−Ｎ−トリフルオロアセトアミド Ｄ，Ｌ−メタンフェタミン−Ｎ−トリフルオロアセトア
ミド２４４mgを２５mlの丸底フラスコ中でクロロホルム
３mlに溶解し、ついで氷−水浴中で冷却した。ついでク
ロロスルホン酸３mlを５分間かけて攪拌溶液に滴下し
た。この温度でさらに４時間攪拌した後、薄黄色の溶液
を氷５０mgに分液漏斗で滴下した。その冷水溶液をクロ
ロホルム３０mlで２回抽出した。有機抽出物を集め、硫
酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて薄黄色の油状物３１
５mgを得た。
(3)４′−スルホニル−Ｄ，Ｌ−メタンフェタミン免疫
原の調製 ウシ血清アルブミン(BSA)１３４mgを０．１Ｍリン酸水
素二ナトリウム(pH８．０）４．４mlに溶解した。５分
後、ジメチルホルムアミド(DMF)０．７mlをそのタンパ
ク質溶液に加えた。４′−クロロスルホニル−Ｄ，Ｌ−
メタンフェタミン−Ｎ−トリフルオロアセトアミド５２
mgをＤＭＦ５００μに溶解し、これを一度にＢＳＡの
水溶液に加えた。最初の濁りは室温で短時間攪拌すると
消えた。この温度で全部で２０時間結合を続けた。その
溶液を透析バッグに移した後、脱イオン水を５回取り替
えて透析した（各取り替え毎に４で６時間）。透析バ
ッグの中身を集め、メタノール２mlおよびピペリジン
１．８mlで希釈し、室温で１８時間放置した。この加水
分解溶液のpHは約１２であった。上記透析を再び行い、
ついで凍結乾燥して綿毛状の白色物質９１mgを得た。ピ
クリルスルホン酸を用いた滴定を行うことによって３１
％のハプテンがＢＳＡ中に組み込まれていることがわか
った。
実施例２ （アンフェタミン免疫原の調製） (1)４−ニトロ−Ｄ，Ｌ−アンフェタミン−ＨＣｌ 発煙硝酸３０mlを−３５℃に冷却した。Ｄ，Ｌ−アンフ
ェタミン硫酸塩５．０ｇを２５分かけてゆっくり攪拌し
ながら加えた。その反応混合物（赤色）をこの温度で２
時間攪拌し、ついでそのまま放置して−１５℃まで温め
（溶液の色は赤から黄色に変わった）、−１５℃で３０
分間攪拌した。ついでその溶液を氷水１２５ml中に注
ぎ、ベンゼン１２５mlで抽出した。その水性抽出物を６
Ｍ ＮａＯＨを用いて塩基性(pH＝１１）にし、ベンゼ
ン１５０mlで３回抽出した。有機抽出物を集め、硫酸マ
グネシウムで乾燥し、濾過した。その濾液をメタノール
２５０mlに加え、ついでＨＣｌガスを溶液のpHが３にな
るまでその攪拌溶液中に吹き込んだ。溶媒を真空下で除
き、粗製生物をエタノール−ジエチルエーテルから再結
晶させて薄黄色の粉末３．０５ｇを得た。
(2)４′−ニトロ−Ｄ，Ｌ−アンフェタミン−Ｎ−トリ
フルオロアセトアミド ４′−ニトロ−Ｄ，Ｌ−アンフェタミン・ＨＣｌ３．０
ｇをピリジン４０mlに溶解し、０℃に冷却し、無水トリ
フルオロ酢酸９．８mlを加えた。その溶液を０℃で２時
間攪拌し、ついで氷−水２００ml中に注いだ。得られた
析出物を濾過により単離し、残った溶媒を真空下で除い
て黄褐色の粉末３．４６ｇを得た。
(3)４′−アミノ−Ｄ，Ｌ−アンフェタミン−Ｎ−トリ
フルオロアセトアミド ４′−ニトロ−Ｄ，Ｌ−アンフェタミン−Ｎ−トリフル
オロアセトアミド６００mgを無水エタノール５０mlに溶
解し、５％パラジウム−炭素３００mlを加え、その混合
物をパー水素化器中、水素２１psi、室温で２時間水素
化した。触媒を濾過により除き、溶媒を真空下で除いて
薄黄色の油状物４２１mgを得た。
(4)４′−ヘミスクシンアミド−Ｄ，Ｌ−アンフェタミ
ン−Ｎ−トリフルオロアセトアミド ４′−アミノ−Ｄ，Ｌ−アンフェタミン−Ｎ−トリフル
オロアセトアミド１．００ｇをクロロホルム７．０mlに
溶解し、無水コハク酸６１４mgを加え、ついでトリエチ
ルアミン０．６２３mlを加えた。その反応混合物を窒素
雰囲気下、室温で２．５時間攪拌した。ついで水７５ml
で希釈し、１ＭＨＣｌでpH４に調節し、酢酸エチル１０
０mlで３回抽出した。その酢酸エチル分画を集め、硫酸
マグネシウムで乾燥し、溶媒を真空下で除いてオフホワ
イトの固体１．３１ｇを得た。
(5)４′−スクシンアミド−Ｄ，Ｌ−アンフェタミン免
疫原 ４′−ヘミスクシンアミド−Ｄ，Ｌ−アンフェタミン−
Ｎ−トリフルオロアセトアミド５０mgおよびＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド２０mgを無水ジエチルホルムアミド
０．５００mlに溶解した。ジシクロカルボジイミド３６
mgを加え、その反応混合物を攪拌し、０．１Ｍリン酸ナ
トリウム(pH＝７．５）および１，４−ジオキサン１．
３５ml中に溶解したウシ血清アルブミン１２５mgの溶液
に滴下した。得られた濁った溶液を室温で１６時間攪拌
し、ついで透析管に移して０．１Ｍリン酸ナトリウム
（pH＝７．５）４に対し２時間、ついで脱イオン水
（各４で２回取り替え）に対して透析した。その混合
物をついで遠心分離し、上澄みを凍結攪拌して綿毛状の
白色粉末１０５mgを得た。生成物の一部（４５mg）をピ
ペラジン２．５ml、メタノール５mlおよび水２０mlから
なる溶液に溶解した。室温で４５分間攪拌した後、その
溶液を透析管に移し、脱イオン水（各２で３回取り替
え）に対して透析し、凍結乾燥して綿毛状の白色固体３
４mgを得た。
実施例３ （アンフェタミントレーサーの調製） (1)４−ヒドロキシフェニルアセトン 臭化水素酸（４８％）２５０mlを約１２０℃に加熱し
た。２分間かけて試料の４−メトキシフェニルアセトン
９．８５ｇを滴下した。１５分後、その反応混合物を３
０℃まで冷却し、蒸留水で５００mlまで希釈した。得ら
れた混合物をジエチルエーテル２５０mlで２回抽出し
た。有機抽出物を集めて食塩水で洗浄し、硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、溶媒を真空下で除いた。得られた油状物
を４０％酢酸エチルおよび６０％ヘキサンを用いてシリ
カゲル上のカラムクロマトグラフィーで直ちに精製し
た。適当な分画をプールし、溶媒を真空下で除いて濃厚
な黄色油状物を得た。
(2)４−（３−クロロプロポキシ）フェニルアセトン 上記工程(1)で得たｐ−ヒドロキシフェニルアセトン
４．５０ｇを乾燥窒素雰囲気下で無水ジメチルホルムア
ミド８０mlに溶解した。この溶液に攪拌しながら水素化
ナトリウム１．２６ｇ（油状物中に６０％の分散物とし
て）を加えた。３分後、１−クロロ−３−ヨードプロパ
ンをすばやく加えた。約１８時間攪拌した後、その反応
混合物をヘキサン３００mlおよびジエチルエーテル１０
０mlで希釈した。その反応混合物を蒸留水、５％水酸化
ナトリウム溶液および食塩水で洗浄した。残った有機層
を乾燥し、真空下で蒸発乾固させた。その黄色油状物を
酢酸エチル２２％およびヘキサン７８％を用いてシリカ
ゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製した。適当な
分画をプールし、溶媒を真空下で除いて黄色油状物３．
０６ｇを得た。
(3)４−（３−クロロプロポキシ）−１−（２−アミノ
プロピル）ベンゼン 上記工程(2)で得た試料の４−（３−クロロプロポキ
シ）フェニルアセトン１．３６ｇをメタノール２００ml
に溶解した。これに酢酸アンモニウム７．７１ｇを加
え、ついでシアノホウ素水素化ナトリウム(sodium cyan
oborohydride)０．７６ｇを攪拌しながら加えた。５時
間後、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をジエチルエーテ
ル１５０mlおよび１Ｎ塩酸２００mlの溶液に溶解した。
その水層を分離し、ジエチルエーテルで洗浄し、６Ｎ水
酸化ナトリウムでpH１０〜１２の塩基性にし、ジエチル
エーテル１００mlで３回抽出した。その塩基性エーテル
抽出物を集め、乾燥し、真空下で蒸発乾固して黄色油状
物１．１１ｇを得た。
(4)４−（３−クロロプロポキシ）−１−（２−Ｎ−ｔ
−ブチルオキシカルボニル）アミノプロピル）ベンゼン 上記工程(3)で得た試料の４−（３−クロロプロポキ
シ）−１−（２−アミノプロピル）ベンゼン１．０ｇを
ジクロロメタン５０mlに溶解した。これにジ−ｔ−ブチ
ルジカーボネート１．９２ｇを加えた。室温で１８時間
攪拌した後、溶媒を真空下で除き、残渣をジエチルエー
テル３５mlおよび５％炭酸ナトリウム１５mlに溶解し、
ついで２時間攪拌した。その有機層を分離し、食塩水で
洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、真空下で
蒸発乾固した。得られた黄色油状物を酢酸エチル２０％
およびヘキサン８０％を用いてシリカゲル上のカラムク
ロマトグラフィーで精製した。適当な分画をプールし、
溶媒を真空下で除いて白色固体１．７４ｇを得た。
(5)４−（３−ヨードプロポキシ）−１−（２−（Ｎ−
ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノプロピル）ベンゼ
ン 無水２−ブタノン４０ml中の４−（３−クロロプロポキ
シ）−１−（２−（Ｎ−ブチルオキシカルボニル）アミ
ノプロピル）ベンゼン１．３０ｇの溶液を調製した。こ
れにヨウ化ナトリウム１．８０ｇを加えた。得られた混
合物を２４時間還流し、室温に冷却し、ジエチルエーテ
ル２００mlで希釈した。その混合物を５％チオ硫酸ナト
リウム溶液で、ついで食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネ
シウムで乾燥し、濾過し、真空下で蒸発乾固して白色固
体１．１４ｇを得た。
(6)４−（３−アミノプロポキシ）−１−（２−（Ｎ−
ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノプロピル）ベンゼ
ン 上記工程(5)で得た４−（３−ヨードプロポキシ）−１
−（２−（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノプ
ロピル）ベンゼン０．７０ｇを無水ジエチルエーテル１
０mlに溶解した。このエーテル溶液をついで冷飽和アン
モニア／エタノール溶液（４℃）に加えた。
その反応混合物を攪拌し、放置して室温まで温めた。そ
の混合物を１日に１回２日間アンモニアで再飽和した。
まる３日間の後、溶媒を真空下で除き、残渣をジエチル
エーテル９０mlおよびジクロロメタン３０mlに懸濁し
た。その混合物を５％炭酸カリウム(pH１２）で、つい
で食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、真空下で蒸発乾固した。その残渣をジクロロメタン
８４．５％、メタノール１５％および酢酸０．５％を用
いてシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製し
た。適当な分画をプールし、溶媒を真空下で除いて濃厚
な無色油状物０．４４ｇを得た。
(7)４−［３−（５−カルボキシフルオレセインアミド
プロポキシ）］−１−２−（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカル
ボニル）アミノプロポキシ）ベンゼン ５−カルボキシフルオレセイン１１９mgおよびＮ−ヒド
ロキシスクシインミド３８mgを無色ジエチルホルムアミ
ド２mlに溶解し、これにＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド６８mgを加えた。３時間攪拌した後、その
反応混合物に４−（３−アミノプロポキシ）−１−（２
−（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノプロピ
ル）ベンゼン１００mg、無水ジエチルホルムアミド１ml
およびトリエチルアミン１００μの混合物を加えた。
１８時間攪拌した後、溶媒を真空下で除いてオレンジ色
の固体を得た。その生成物をメタノール６９．５％、蒸
留水３０．０％および酢酸０．５％で展開した４本の
１．０mmC１８逆層プレパラティブ薄層クロマトグラフ
ィープレート上で精製した。Ｒｆが０．１４のバンドを
集め、メタノールで溶出してオレンジ色の固体１１５mg
を得た。
(8)４−［３−（５−カルボキシフルオレセインアミド
プロポキシ）］−１−（２−アミノプロピル）ベンゼン 実施例２の生成物の全収量１１５mgをジクロロメタン３
mlに溶解した。攪拌しながらトリフルオロ酢酸２１mlを
滴下した。約１０分後、溶媒を真空下で除き、残渣をメ
タノール５mlおよびトリエチルアミン１００μに溶解
し、溶媒を再び真空下で除いた。残渣をメタノール２．
５mlに懸濁し、固体が完全に溶解するまでトリエチルア
ミンを加えた。その生成物をついでメタノール６９．５
％、蒸留水３０．０％および酢酸０．５％で展開した４
本の１．０mmC１８逆層プレパラティブ薄層クロマトグ
ラフィープレート上で精製した。Ｒｆが０．６９のバン
ドを集め、メタノールで溶出して黄色の生成物を得た。
実施例４ （メタンフェタミントレーサーの調製） (1)ジメチルｐ−フェニレンジアセテート １，４−フェニレンジ酢酸１９．４２ｇをメタノール２
００mlに懸濁した。これにトリメチルオルトホルメート
２０mlおよび塩化水素で飽和したメタノール１６mlを加
えた。室温で３時間攪拌した後、溶媒を真空下で除い
た。残渣をヘキサン１．５とともに攪拌し、飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液４００mlと混合し、分離漏斗中に
デカントして未溶解固体を残した。その２層を分離し、
その有機層を第２の飽和炭酸水素ナトリウム４００ml
で、ついで食塩水２００mlで洗浄した。得られた有機層
を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、真空下で蒸発乾
固して白色固体を得た。
(2)メチル４−カルボキシメチルフェニルアセテート 上記工程(1)で得たジメチルｐ−フェニレンジアセテー
ト８ｇをメタノール１２０mlに溶解した。これに１Ｍ水
酸化ナトリウム水溶液２８．８mlを加え、室温で３時間
攪拌した。ついでその反応混合物に酢酸８mlを加えて反
応を停止させ、真空下で蒸発乾固した。残渣を飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液８００mlで希釈し、ヘキサン４０
０mlで２回洗浄した。残った水層をpH１まで酸性にし、
ジクロロメタン２００mlで３回抽出した。有機層を集め
て食塩水を洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、真空下で蒸発乾固して白色固体３７１ｇを得た。
(3)４−（カルボメトキシメチル）フェニルアセチルク
ロライド 上記工程(2)で得たメチル４−カルボキシメチルフェニ
ルアセテート３．０４ｇを無水テトラヒドロフラン５０
mlに溶解した。塩化オキサリル２．５mlを加えた後、そ
の混合物を４時間混合した。フラスコを４５℃に温めな
がら乾燥窒素流下で溶媒を蒸発させた。ついで残ったす
べての溶媒（塩化オキサリル）を高真空下で除き、生成
物をさらに精製することなく用いた。
(4)メチル４−（２−オキソプロピル）フェニルアセテ
ート ヨウ化銅(I)の試料を１２０℃で２時間加熱し、ついで
真空デシケーター中で室温まで冷却した。乾燥窒素雰囲
気下でそのヨウ化銅８．３５ｇに無水テトラヒドロフラ
ン５０mlを加えた。その懸濁液を−１０℃まで冷却し、
ついでエーテル中の１．７Ｍメチルリチウム５２mlをす
ばやく滴下した。４−（カルボメトキシメチル）フェニ
ル酢酸クロライドの全収量を無水テトラヒドロフラン２
０mlに溶解し、温度を−７８℃まで下げながらその反応
混合物にすばやく加えた。３０分後、メタノール５mlを
加えて反応を停止させ、室温まで温め、メタノール１５
mlで希釈し、ついでジエチルエーテルで１まで希釈し
た。反応混合物を飽和塩化アンモニウムおよび水酸化ア
ンモニウムで、１０％塩化アンモニウムおよび水酸化ア
ンモニウムで、および食塩水で１回洗浄した。その有機
層を乾燥し、真空下で蒸発乾固した。残渣を酢酸エチル
３０％およびヘキサン７０％を用いたシリカゲル上のカ
ラムクロマトグラフィーで精製した。適当な分画をプー
ルし、真空下で溶媒を除いて生成物０．６０ｇを得た。
(5)メチル４−（２−メチルアミノプロピル）フェニル
アセテート メタノール２５mlに上記工程(4)で得たメチル４−（２
−オキソプロピル）フェニルアセテート０．５９ｇを加
えて溶解した。ついで攪拌しながらつぎのものを加え
た。メチルアミン塩酸塩２．０ｇ、シアノホウ素水素化
ナトリウム０．３ｇおよびトリエチルアミン０．３ml。
約１２時間後、その混合物にさらに０．１ｇのシアノホ
ウ素水素化ナトリウムを加えた。さらに３時間後、その
反応混合物を０．１Ｍ塩酸１００mlで希釈し、ジエチル
エーテルで洗浄し得られた水層に１Ｎ水酸化ナトリウム
溶液５mlを加えてpH１２まで塩基性にした。これをジエ
チルエーテル１００mlで３回抽出し、抽出物を集めて食
塩水で洗浄し乾燥させた。溶媒を真空下で除いて薄黄色
の油状物０．４４ｇを得た。
(6)メチル４−［２−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル）
−Ｎ−メチルアミノプロピル］フェニルアセテート 上記工程(5)で得たメチル４−（２−メチルアミノプロ
ピル）フェニルアセテート０．４４ｇを塩化メチレン２
０mlに溶解した。この溶液にジ−ｔ−ブチルジカーボネ
ート２．０ｇおよびトリエチルアミン０．４５mlを加え
た。１４時間後、反応混合物をジエチルエーテル１００
mlで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液４０mlとと
もに攪拌した。３時間後、ジエチルエーテルをさらに１
００ml加え、ついで有機層を分離して食塩水５０mlで２
回洗浄した。得られた有機層を乾燥し真空下で蒸発させ
た。得られた黄色油状物を酢酸エチル３５％およびヘキ
サン６５％を用いたシリカゲル上のカラムクロマトグラ
フィーで精製した。適当な分画をプールし、溶媒を真空
下で蒸発させて粘性の油状物０．３９ｇを得た。
(7)４−［２−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−
メチルアミノプロピル］フェニル酢酸 上記工程(6)で得たメチル４−［２−（Ｎ−ｔ−ブトキ
シカルボニル）−Ｎ−メチルアミノプロピル］フェニル
アセテート３２０mgをジオキサン６mlに溶解した。これ
に１Ｎ水酸化ナトリウム溶液３mlを加えた。約１０分間
攪拌した後、その混合物に酢酸３mlを加え、ついでジエ
チルエーテル１００mlを加えた。これを食塩水５０mlで
１回洗浄し、その食塩水洗浄液を同じ容量のジクロロメ
タンで抽出した。エーテルおよびジクロロメタン抽出物
を集め、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、真空下で
蒸発乾固してさらっとした油状物３６０mgを得た。
(8)Ｎ−（メチルフルオレセイニル）−４−［２−（Ｎ
−ｔ−ブトキシカルボニル）メチルアミノプロピル］フ
ェニルアセトアミド 上記工程(7)で得た４−［２−（Ｎ−ｔ−ブトキシカル
ボニル）メチルアミノプロピル］フェニル酢酸１０４mg
およびウッドワード試薬Ｋ９４mgを無水ジエチルホルム
アミド３mlおよびトリエチルアミン０．０５mlに溶解し
た。室温で１時間攪拌した後、４′−アミノメチルフル
オレセイン２塩酸塩１３４mgおよびトリエチルアミン
０．１mlを加えた。その混合物を室温で２時間攪拌し、
ついで冷凍室に一夜貯蔵した。その混合物をついで温
め、室温で３時間攪拌した後溶媒を真空下で除いた。得
られたオレンジ色の固体をメタノール７４．５％、蒸留
水２５％および酢酸０．５％で展開した４本の１．０mm
C１８逆層プレパラティブ薄層クロマトグラフィープレ
ートで精製した。Ｒｆが０．２１のバンドを集めメタノ
ールで溶出して生成物を得た。
(9)Ｎ−（メチルフルオレセイニル）−ｐ−２−メチル
アミノプロピルフェニルアセトアミド 上記工程(8)で得た生成物の全収量をジクロロメタン４m
lに溶解した。その溶液に攪拌しながらトリフルオロ酢
酸２mlを加え、５分後、溶媒を真空下で除いた。攪拌し
ながら残渣をメタノール２５mlに溶解し、暗いオレンジ
色となるまでトリエチルアミンを滴下した。溶媒を真空
下で再び除き残渣をメタノールに溶解した。得られた生
成物をメタノール６４．５％、蒸留水３５％および酢酸
０．５％で展開した４本の１．０mmC１８逆層プレパラ
ティブ薄層クロマトグラフィープレートで精製した。Ｒ
ｆが０．５０のバンドを集めメタノールで溶出して生成
物を得た。
実施例５ （アンフェタミン／メタンフェタミンのアッセイ） (A)試薬 (1)前処理溶液：約０．１２５モルの過ヨウ素酸ナトリ
ウムを含有する溶液(pH４．５） (2)トレーサー：実施例４で調製した化合物Ｉおよび実
施例３で調製した化合物IIからなる。各化合物は、０．
０１％(w／v)ウシガンマグロブリンおよび０．１％(w／
v)アジ化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウ
ムバッファー(pH７．５）中溶液として用いる。
(3)抗体：０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、０．
１％アジ化ナトリウムおよび２％エチレングリコール中
に適当に希釈したアンフェタミンおよびメタンフェタミ
ンに対し産生された抗血清からなるウサギまたはヒツジ
抗血清。
(4)希釈バッファー：０．１Ｍリン酸ナトリウム(pH７．
５）、０．１％ウシガンマグロブリンおよび０．１％ア
ジ化ナトリウム。
(5)検量用標準：活性炭処理したヒトの尿（０．１％ナ
トリウムアジドで防腐）、以下の濃度のd,l−アンフェ
タミンを含有する：０．００、０．２３、０．３８、
０．８３、１．５８、３．０８μｇ／ml。
(6)コントロール： 活性炭処理したヒトの尿（０．１
％ナトリウムアジドで防腐）、０．６８または２．０８
μｇ／mlのd,l−アンフェタミンを含有する。
(7)洗浄液：約０．１２５Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムを
含有する。
すべての蛍光偏光測定は、アボットＴＤｘアナライザー
を用いて行った。
(B)アッセイ手順 (1)未知試料および前処理溶液の等量をピペットにて前
希釈ウエルに入れる。充分な量の希釈バッファーを加え
て容積を５００μにする。この混合物を４〜６分間イ
ンキュベートする。
(2)前希釈ウエルからの試料および抗体２５μをピペ
ットにてキュベットに入れる。バックグラウンド強度の
読み取りを行う。
(3)各２５μのトレーサーおよび抗体、および前希釈
ウエルからの試料をキュベットに加える。充分な希釈バ
ッファーを加えて最終の容積を２．０mlにする。
(4)混合物の最終偏光蛍光強度からバックグラウンドの
偏光蛍光強度を差し引くことによって、抗体に結合した
トレーサーによる蛍光偏光を得る。
(5)得られた偏光値は各試料中のアンフェタミンおよび
／またはメタンフェタミンの濃度に反比例する。
(6)試料について得られた偏光値を、既知の濃度のアン
フェタミンまたはメタンフェタミンの検量用標準を用い
て作成した標準曲線と比較する。
実施例６ （過ヨウ素酸ナトリウムでの前処理） エフェドリン５０μｇ／mlおよび１００μｇ／mlをそれ
ぞれ含有する試料を、実施例５Ｂに記載した前インキュ
ベーション処理行った場合と行わなかった場合のアッセ
イをアボットＴＤｘアナライザーを用いて行った。この
アッセイでは上述のアンフェタミン／メタンフェタミン
トレーサーおよび抗体を用いた。その結果を第２表に示
す。
上記の結果から、塩基のようなpH上昇成分を加えずに試
料を過ヨウ素酸ナトリウムで処理してもβ−ヒドロキシ
フェネチルアミン交差反応性を有効に除くことができ、
アンフェタミン／メタンフェタミンの蛍光偏光アッセイ
の目的に有用であることがわかる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ケンワード・シァウ・ヴァウアン アメリカ合衆国カルフォルニア 92008、 カールスバッド、ラグラン・ビア 2805番 (72)発明者 キャサリーン・エム・スミス アメリカ合衆国カルフォルニア 92008、 カールスバッド、オアキド・ウェイ 907 番 (56)参考文献 特開 昭56−125666（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−155094（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−225190（ＪＰ，Ａ) 特開 昭49−62192（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−214856（ＪＰ，Ａ)

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】蛍光偏光アッセイ法による生物学的流体の
    試験試料中のフェネチルアミンの測定法において、β−
    ヒドロキシフェネチルアミン交差反応物を取り除くため
    に、該試験試料をpH約４．０〜約７．５の過ヨウ素酸水
    溶液の有効量で約１〜約１０分間前以て処理することを
    特徴とする方法。
  2. 【請求項２】該過ヨウ素酸水溶液が約０．１〜約０．２
    ５モルの過ヨウ素酸ナトリウムを含む特許請求の範囲第
    (1)項記載の方法。
  3. 【請求項３】該試験試料を約４〜約５分間前以て処理す
    る特許請求の範囲第(1)項記載の方法。
  4. 【請求項４】該前処理を約３１〜約３６℃の範囲の温度
    で行う特許請求の範囲第(1)項記載の方法。
  5. 【請求項５】(a)アンフェタミンおよびメタンフェタミ
    ンに対するβ−ヒドロキシフェネチルアミン交差反応物
    を取り除くために、生物学的流体の試験試料をpH約４．
    ０〜約７．５の過ヨウ素酸水溶液の有効量で約１〜約１
    ０分間前以て処理し、 (b)該前以て処理した試料を式 （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
    体、ＴはＳＯ２、ＮＨ、ＮＨ（ＣＨ２）３Ｏ、ＣＯＣＨ
    ２、ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ、ＨＮ（ＣＨ２）２およ
    びＨＮ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２よりなる群から選ば
    れた連結基を表す）で表される第１のトレーサー、式 （式中、ＱおよびＴは前記と同じ）で表される第２のト
    レーサー、アンフェタミンと該第１のトレーサーを特異
    的に認識し結合することのできる第１抗体、およびメタ
    ンフェタミンと該第２のトレーサーを特異的に認識し結
    合することのできる第２抗体と混合し、ついで (c)蛍光偏光法により該試験試料中のアンフェタミンお
    よびメタンフェタミンの量を測定することによって、該
    第１抗体および第２抗体に結合した各トレーサーの量を
    決定する ことを特徴とする、生物学的流体の試験試料中のアンフ
    ェタミンおよびメタンフェタミンの測定法。
  6. 【請求項６】該第１のトレーサーの該フルオレセイン誘
    導体がカルボキシフルオレセインであり、該第２のトレ
    ーサーの該フルオレセイン誘導体が４′−アミノメチル
    フルオレセインである特許請求の範囲第(5)項記載の測
    定法。
  7. 【請求項７】該第１のトレーサーが式 を有する化合物である特許請求の範囲第(5)項記載の測
    定法。
  8. 【請求項８】該第２のトレーサーが式 を有する化合物である特許請求の範囲第(5)項記載の測
    定法。
  9. 【請求項９】式 （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
    体、ＴはＳＯ２、ＮＨ、ＮＨ（ＣＨ２）３Ｏ、ＣＯＣＨ
    ２、ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ、ＨＮ（ＣＨ２）２およ
    びＨＮ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２よりなる群から選ば
    れた連結基を表す）で表される第１のトレーサーおよび
    式 （式中、ＱおよびＴは前記と同じ）で表される第２のト
    レーサーからなり、該第１のトレーサーはアンフェタミ
    ンに対する抗体により特異的に認識されることができる
    ものであり、該第２のトレーサーはメタンフェタミンに
    対する抗体により特異的に認識されることができるもの
    である、フェネチルアミン測定のための蛍光偏光イムノ
    アッセイに有用なトレーサー試薬。
  10. 【請求項１０】該第１のトレーサーが式 で表される化合物であり、該第２のトレーサーが式 で表される化合物である特許請求の範囲第(9)項記載の
    トレーサー試薬。
  11. 【請求項１１】(a)β−ヒドロキシフェネチルアミン交
    差反応性を取り除くために、生物学的流体の試験試料を
    pH約４．０〜約７．５の過ヨウ素酸水溶液の有効量を用
    いて前以て約１〜約１０分間処理してβ−ヒドロキシフ
    ェネチルアミン交差反応性を取り除き、 (b)該前以て処理した試料を式 （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
    体、ＴはＳＯ２、ＮＨ、ＮＨ（ＣＨ２）３Ｏ、ＣＯＣＨ
    ２、ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ、ＨＮ（ＣＨ２）２およ
    びＨＮ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２よりなる群から選ば
    れた連結基を表す）で表される第１のトレーサーおよび
    式 （式中、ＱおよびＴは前記と同じ）で表される第２のト
    レーサーの塩、アンフェタミンと該第１のトレーサーを
    特異的に認識し結合することのできる第１抗体、および
    メタンフェタミンと該第２のトレーサーを特異的に認識
    し結合することのできる第２抗体と混合し、 (c)蛍光偏光法により該試験試料中のアンフェタミンお
    よびメタンフェタミンの量を測定することによって、該
    第１抗体および第２抗体に結合した各トレーサーの量を
    決定し、ついで (d)試料および試薬分配手段を０．１〜０．２５モルの
    過ヨウ素酸水溶液中で洗浄して試料の該分配手段への付
    着を最小限に抑える ことを特徴とする、試料および試薬の分配手段を有する
    自動アッセイ装置を利用した蛍光偏光アッセイによる生
    物学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよびメタン
    フェタミンの測定法。
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