JPH01272967A

JPH01272967A - 免疫的検出法

Info

Publication number: JPH01272967A
Application number: JP10302588A
Authority: JP
Inventors: Noboru Motoyama; 昇本山; Kimimasa Miyazaki; 仁誠宮崎
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1988-04-26
Publication date: 1989-10-31

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、主として臨床検査における病原体、あるいは
疾病マーカー等の検出、さらには広〈産業上の極微量検
出に用いることのできる免疫的検出法に関する。

従来の技術天然に存在する、あるいは人工的に作製した抗体を用い
た検出法は、高特異性及び高感度の点に特徴を有し、極
微量の存在割合の目的物質を検出する目的で現在用いら
れている。この様な目的には、例えは、血液中から病原
体、あるいは腫瘍、心筋梗塞、脳血栓なとの疾病時に特
異的に分泌されているいわゆる疾患マーカーなとの臨床
検査業務や、大気中から極微量の物質を検出する目的な
とがある。近年この様な目的で、例えば石川栄冶河合忠
、宮井潔著「酵素免疫測定法第３版」　（医学書院１９
８７年、３１−５４頁）に記載されているように多くの
種類の免疫測定法が開発されている。この方法は、検出
物質が高分子（タンパク質）か低分子（ハブテン）かに
よって２分される。

本発明では主としてハプテン系を対象としており、この
ための代表例である、Ｅｌ、ＩＳＡ法の実験手順を段階
を追って説明する。

（Ａ）抗原のコーティングキャリアー蛋白、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
に、検出物質あるいはこれに官能記を導入した誘導体を
結合したコンジュゲートをバッファーに溶解して抗原溶
液とする。

マイクロプレート（塩化ビニル或はポリスレン製９６ウ
エルプレート）に抗原を１００μＬ／ウエル注入し、２
０℃で１夜保存する。

（Ｂ）ブロッキングＢＳＡのバッファー溶液を２５０７１１／ウエル注入し
、０．５−２時間室温で放置する。その後、バッファー
または純水で３−５回洗浄する。

（Ｃ’）抗体の反応検出物質溶液を注入し、振とうしながら抗体溶液をざら
に加える。常温で３−５時間保存した後、アスピレータ
で抗体溶液を除去し、バッファーまたは純水で３−５回
洗浄する。

（Ｄ）第２抗体の反応酵素、例えはベルオキシダーセで標識した抗体に対する
抗体（第２抗体）の溶液を注入し、常温で０．５−２時
間放置する。その後、バッファーまたは純水で３−５回
洗浄する。

（Ｅ）基質の反応と停止発色剤、例えば０−フェニレンジアミン（セレン検出用
）をバッファーに溶解し、直前に３日過酸化水素水を加
えた溶液（基質溶液）を注入し、室温で発色反応を行う
。５−２０分後、硫酸で反応を停止Ｊ二する。

（Ｆ）測定マイクロプレート用吸光光度系を用いて４９２ｎｍの吸
光度を測定する。最終的に検出物質が多いほど吸光度が
弱いことから、物質の検出を行う。

発明が解決しようとする課題前項で記載したように、従来の免疫的検出方法は、抗原
抗体反応物と未反応物とを分離操作する工程など多くの
手順を必要とし、また反応が同相と液相の共存する不均
一系で進行、最終的な検出に酵素反応を用いているため
、本質的に長時間、通常５時間程度を要していた。

本発明は、全反応が均一系で行われ、抗原抗体反応物と
未反応物の分離操作を含まず、また抗原抗体反応による
抗体の蛍光の直接的な変化乞こ基ずく免疫的検出法を提
供するものである。

課題を解決するための手段被検出物質と特異的に結合し、かつ、抗原抗体反応によ
り蛍光が増強する抗体を用い、その抗体と前記被検出物
質との抗原抗体反応に伴う蛍光の増強から前記被検出物
質の存在量を測定する。

作用発明者らは、抗体が、メタンフェタミン、アンフェタミ
ンあるいはエフェドリン等、それ自身蛍光性も、蛍光消
光性も有していない物質と水溶液中で結合した際、抗体
自身が本質的に有している蛍光が増強する事実を発見し
、この原理を検出方法に適用したものである。

上記の手段をとることにより、反応がすべて均一系（？
ａ相）で進行し、さらに酵素反応も用いないため検出時
間の箸しい短縮を行うことが可能となる。

実施例一般的に抗体は２８０ｎｍの励起で３４０ｎｍ付近に蛍
光を発する。この蛍光は、構成アミノ酸の一つであるＬ
−）リブトファン等に由来するものであるが、この蛍光
の性質は、抗原が結合することによって変化する事があ
る。例えばニトロベンゼン等では蛍光が消光されること
は古くから知られていた。

本発明で対象としているメタンフェタミン、アンフェタ
ミンあるいはエフェドリン等は、この蛍光消光作用は有
していないが、代わりに蛍光の増強作用を有しているこ
とが発明者らによって見いだされた。この変化は抗原が
結合することによって抗体の構造が変化し、１．−トリ
プトファン残基のまわりの環境が変化したためと思われ
る。したがって抗体によっては変化しないものも存在し
、実際、他のモノクローナル抗体（αＭＡＭＡＢ２）で
は、約１０％しか蛍光は増強しないものもあったが、お
おむね−船釣な現象として蛍光増強作用はみられた。し
たがってモノクローナル化の際、特に顕著な蛍光増強作
用がある抗体を選択した。本実施例で用いた抗体は、発
明者らによって作製された抗メタンフエタミンモノクロ
ーナル抗体（αＭＡＭＡＰＩ）である。この抗体はメタ
ンフェタミン（ＭＡ）に対し、約１０７のアフィニティ
ーを有していた。また、抗原が結合することによって蛍
光の性質が大きく変化するものであった。以下、実験的
な検出の方法について手順を述へる。

１）バッファー（Ｉ）　Ｈ７のリン酸バッファーを０．
４５ノｚのフィルターに通したもの）でαＭＡＭＡＢ１
を溶解して２ＸｌＯ−”Ｍの濃度とした。この溶液３８
０７１１、を蛍光測定用ミクロセル波長２８０ｎｍ　（
バンドパス５ｎｍ）の励起光、蛍光波長３４０ｎｍ　（
バンドパスｌＯｎｍ）、測定温度２５℃で強度約６１（
ＰＬＯ）の蛍光を発した（第１図、ａ部分）。

２）上記の溶液にＭＡの２　Ｘ　１０−”Ｍバッファー
溶液２０ノＩＬ（最終濃度Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍ）を加え
ると、抗体とＭＡが結合し、その結果蛍光強度が約９６
（ＦＬｘ）に増大した。この反応は約３０秒で平衡に達
した。　（第１図、ｌ）部分）以上記載のように、抗体溶液にＭＡを導入し、蛍光強度
の増大からＭＡを検出することができた。

この実験条件での検出感度を確かめるため、２）で各濃
度のＭＡを用いたときの蛍光強度の変化を第２図に示す
。なお、第２図でＭＡＷ度は最終濃度で示した。縦軸はＦＬｍａｘ−ＰＬＯで示した。

第２図の結果から約１０−６”Ｍの濃度のＭＡが本発明
の方法により検出てきたことが証明された。

また、蛍光測定温度を１０℃とすると、反応速度は若干
遅くなったが、抗体の蛍光強度は低温では大きいので、
精度よく測定することができる。

以上、主としてＭＡの検出を例にとって本発明の説明を
行ったが、もぢろんその他の化学物質すへでに応用可能
な一般的方法である。

発明の効果本発明によれは、従来５時間以上用していた免疫的検出
を１分以下に短縮することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明を実施した際の抗体の蛍光強度の時間
的変化を示すグラフ、第２図は各ＭＡａ度における蛍光
増大の変化を示したグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）被検出物質と特異的に結合し、かつ、抗原抗体反
応により蛍光が増強する抗体を用い、その抗体と前記被
検出物質との抗原抗体反応に伴う蛍光の増強から前記被
検出物質の存在量を測定することを特徴とする免疫的検
出法。
（２）被検出物質が、メタンフェタミン、アンフェタミ
ンあるいはエフェドリンである特許請求の範囲第１項記
載の免疫的検出法。
（３）測定が、均一溶液中での反応で、抗体自身の蛍光
を直接測定することによって行われることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の免疫的検出法。
（４）測定が、恒温環境下で行われることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の免疫的検出法。