DE3805318C2

DE3805318C2 - Spezielle chemilumineszierende Acridinderivate und ihre Verwendung in Lumineszenzimmunoassays

Info

Publication number: DE3805318C2
Application number: DE19883805318
Authority: DE
Inventors: Tonio Dr Kinkel; Peter Dr Molz; Erwin Dr Schmidt; Gerd Dr Schnorr; Heinz Juergen Dr Skrzipczyk
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1988-02-20
Filing date: 1988-02-20
Publication date: 1998-07-23
Anticipated expiration: 2008-02-21
Also published as: DE3805318A1

Description

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind chemilumineszierende Acridinderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Lumineszenzimmunoassays.

Lumineszierende Verbindungen finden bereits vielseitige Anwendung. Sie werden als Indikatoren in Bioassays, Enzymimmunoassays und Lumineszenzimmunoassays eingesetzt (vgl. W.P. Collins "Alternative Immunoassays", Verlag John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985), werden aber auch in Nukleinsäure-Hybridisierungsassays verwendet (vgl. J.A. Matthews et al. "Analytical Biochemistry", 151, 205-209, 1985). Außerdem werden chemilumineszierende Verbindungen bei der "flow injection analysis", in post-column-Detektoren in der Flüssigkeitschromatographie, in der Strömungsforschung und in künstlichen Lichtquellen eingesetzt.

Bei den Chemilumineszenzimmunoassays haben insbesondere zwei Strukturtypen von chemilumineszierenden Markierungs substanzen größere Bedeutung erlangt. Es handelt sich hierbei einerseits um die Luminol- bzw. Isoluminolderivate, die bei H.R. Schroeder et al., "Methods in Enzymology", Academic Press Inc., New York, Vol. LVII, 1978, 424 ff sowie in den britischen Patenten 2 008 247 und 2 041 920, den deutschen Patentschriften 26 18 419 und 26 18 511, sowie in der europäischen Patentanmeldung 135 071 beschrieben sind. Einen Überblick über die praktische Anwendung der Isoluminolverbindungen als Lumineszenzindikatoren findet man bei W.G. Wood, J. Clin.Chem. Clin. Biochem. 22, 1984 905-918.

Andererseits haben auch Acridiniumesterverbindungen als chemilumineszierende Markierungssubstanzen Anwendung gefunden. Derartige Acridiniumester sind aus dem US-Patent 3 352 791, den britischen Patenten 1 316 363 und 1 461 877 sowie aus der europäischen Patentanmeldung 82 636 bekannt. Die Anwendung der Acridiniumester als Markierungssubstanzen in Immunoassays ist bei Weeks et al., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1474-1479, beschrieben. Auch die Verwendung von Phenanthridiniumestern als Markierungssubstanz in Lumineszenzimmunoassays ist aus der europäischen Patentanmeldung 170 415 bereits bekannt.

Die Chemilumineszenz von Acridiniumestern kann durch Zugabe von alkalischer H₂O₂-Lösung gestartet werden. Für den Mechanismus der Chemilumineszenz hat F. McCapra, Acc.Chem. Res. 9, 201, 1976, eine überzeugende Erklärung gegeben. Dabei ist offensichtlich die Art der Abgangsgruppe sowohl für die Lichtquantenausbeute als auch für die hydrolytische Stabilität entscheidend.

Die bisher schon bekannten Acridiniumester haben gegenüber den Luminol- und Isoluminolverbindungen den Vorteil einer höheren Lichtquantenausbeute, die auch durch an den Indikator gebundene Proteine nicht beeinträchtigt wird (vgl. Weeks et al., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1474-1479).

Obwohl die aus der europäischen Patentanmeldung 82 636 bekannten Acridiniumphenylester bei Anregung der Chemilumineszenz durch milde Oxidationsmittel sich durch eine hohe Nachweisempfindlichkeit auszeichnen, weisen sie für die praktische Anwendung störende Nachteile auf. Vor allem ist die Phenylesterbindung in wäßrigen Systemen auch schon bei Raumtemperatur sehr labil. Hinzu kommt, daß unter den dort angegebenen Oxidationsbedingungen die Acridiniumphenylester eine Lichtemission zeigen, die erst nach etwa 10 Sekunden weitgehend, d. h. zu über 95%, abgeklungen ist. Im Vergleich dazu haben andere nicht isotopische Assayverfahren weitaus kürzere Meßzeiten und ermöglichen dadurch einen höheren Probendurchsatz.

Es wurde bereits die Verwendung von chemilumizierenden Acridiniumderivaten vorgeschlagen, die bei hoher Lichtquantenausbeute eine schnellere Reaktionskinetik aufweisen und damit kurze Meßzeiten für einen Lumineszenzimmunoassay ermöglichen (vgl. deutsche Patentanmeldung P 36 28 573.0) Es handelt sich dabei um Acridiniumderivate der Formel

in der R^A Wasserstoff, ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Benzyl- oder Arylgruppe ist, R^B und R^C Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe, eine Carboxy-, Alkoxy-, Cyano-, Nitrogruppe oder Halogen sind, R^D einen Rest darstellt, in dem eine Sulfonamidgruppe über den Stickstoff direkt an die Carbonylgruppe gebunden ist oder ein Thioalkyl- oder Thioarylrest der Formel

-S-Y- R^E

ist, wobei Y eine verzweigte oder unverzweigte aliphatische oder eine aromatische Gruppe ist, die auch Heteroatome enthalten kann, und R^E eine reaktive Gruppe ist, die unter schonenden Bedingungen selektiv mit Amino-, Carboxy-, Thiol- oder anderen funktionellen Gruppen in Substanzen von biologischem Interesse eine Bindung eingehen kann, und A^⊖ ein die Chemilumineszenz nicht beeinträchtigendes Anion ist.

Es hat sich nun herausgestellt, daß spezielle Acridiniumderivate sich auf Grund ihrer hervorragenden Stabilität und ihrer unerwartet hohen Nachweisempfindlichkeit besonders für den Einsatz als chemilumineszierende Verbindungen eignen. Erfindungsgegenstand sind demzufolge chemilumineszierende Acridiniumderivate der Formel I

in der R¹ Wasserstoff, ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Benzyl- oder Arylgruppe ist,
R² und R³ Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe, eine Carboxy-, Alkoxy-, Cyano-, Nitrogruppe oder Halogen sind,
R⁴ einen Rest der Formel II oder III darstellt

worin R⁵ eine reaktive Gruppe ist, die unter schonenden Bedingungen selektiv mit Amino-, Carboxy-, Thiol- oder anderen funktionellen Gruppen in Substanzen von biologischem Interesse eine Bindung eingehen kann,
R⁶ Wasserstoff, ein Alkyl-, Alkenyl-oder Alkoxyrest mit 1 bis 10 C-Atomen, eine substituierte Aminogruppe, eine Benzylgruppe, eine Arylgruppe, eine Heteroalkylgruppe oder ein Heterocyclus ist, die auch mit Hydroxy-, Amino-, Alkylamino-, Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxy- mit 1 bis 4 C-Atomen, Polyalkoxy- oder Aryloxy-Gruppen oder einer heterocyclischen Gruppe substituiert sein können, wobei die zuletzt genannten Substituenten ihrerseits mit einer heterocyclischen Verbindung oder einem Amin substituiert sein können oder zusammen einen O- und/oder S- und/oder NH- oder N-Alkyl-aufweisenden Heterocyclus bilden können, und X eine Arylgruppe, die direkt oder über eine Alkyl- oder Oxyalkylgruppe an das Stickstoff- oder Schwefelatom gebunden ist und über eine Alkyl- oder Oxyalkylgruppe an den Rest R⁵ gebunden ist und die auch mit Alkyl-, Alkenyl-, Hydroxy-, Amino-, Alkoxy-, Polyalkoxy- oder Aryloxy-Gruppen und/oder Heteroatomen einfach oder mehrfach substituiert sein kann oder den Rest einer aliphatischen, araliphatischen oder aromatischen, nicht notwendigerweise natürlichen, Aminocarbonsäure, bedeutet
oder eine Phenylengruppe ist, wenn R⁶ eine Phenylgruppe ist, die einfach oder mehrfach mit C₁-C₆-Alkyl substituiert ist.

Unter den Substanzen von biologischem Interesse sind vor allem Antigene zu verstehen. Unter diesen Begriff fallen z. B. Hormone, Steroide, Arzneimittel, Arzneimittelmetabolite Toxine, Alkaloide und auch Antikörper.

Als Aminocarbonsäuren eignen sich z. B. Glycin, Alanin, Serin, Phenylalanin, Histidin, α-Aminobuttersäure, Methionin, Valin, Norvalin, Leucin, iso-Leucin, Norleucin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Aminophenylessigsäure, 4-Aminophenoxyessigsäure und 3-(4-Amino-)phenylpropionsäure.

Das die Chemilumineszenz nicht beeinträchtigende Anion kann z. B. ein Tetrafluoroborat-, Perchlorat-, Halogenid-, Alkylsulfat-, Halosulfonat-, Alkylsulfonat- oder Arylsulfonat-Anion sein. Auch jedes andere Anion kann eingesetzt werden, sofern es die Chemilumineszenz nicht löscht oder abschwächt.

Die Heteroalkylgruppen oder heterocyclischen Gruppen enthalten vorzugsweise Heteroatome, die zu einer Steigerung der Wasserlöslichkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen beitragen können, wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, bzw. deren Kombinationen. Besonders geeignete Heterocyclen sind z. B. Morpholin, Piperazin, Piperidin, Tetrahydrofuran, Dioxane usw.

Besondere Bedeutung haben Acridiniumderivate nach Anspruch 1, die dadurch gekennzeichnet sind, daß X eine Gruppe der Formel IV ist,

in der R⁷ ein Substituent der Formel -(CH₂)_n- oder ((CH₂)_m-O)_n- ist mit n = 0 bis 4 und m = 1 bis 6,
R⁸ ein Substituent in ortho-, meta- oder para-Stellung zu R⁷ der Formel (CH₂)_p-, eine Polyalkylenoxid-Gruppe der Formel -(O-(CH₂)_m-)_p oder -((CH₂)_m-O-)_p bevorzugt mit p = 1-6 und m = 1-6, oder ein verzweigter oder unverzweigter Kohlenwasserstoffrest mit 1-4 C-Atomen, ist und die Substituenten R⁹-R¹¹ Wasserstoff oder geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit bis zu 30 C-Atomen sind, wobei eine oder mehrere -CH₂-Einheiten auch durch O, S, SO, SO₂, NH oder N-Alkyl ersetzt sein können und zwei dieser Substituenten ringförmig verknüpft sein können.

Von besonderer Bedeutung für die Einsatzmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Acridiniumderivate ist der Substituent R⁵. Durch die geeignete Auswahl dieser Gruppe erhält das Acridiniumderivat eine so hohe Reaktivität, daß es schon unter milden Bedingungen selektiv mit einer funktionellen Gruppe der nachzuweisenden biologischen Substanz eine Bindung eingehen kann. Geeignete reaktive Gruppen sind aus der folgenden Zusammenstellung zu ersehen:

d) -SO₂-CH = CH₂

f) -N = C = S

In vielen Fällen haben sich erfindungsgemäße Acridiniumderivate als geeignet erwiesen, bei denen R⁵ eine Gruppe der Formel V

ist.

Weiterhin haben sich Acridiniumverbindungen der Formel VI als besonders geeignet erwiesen. Die Formel VI lautet

in der X eine Gruppe der Formel VII

mit n = 2 oder 4
und R¹² und R¹³ unabhängig voneinander Wasserstoff, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe mit 1-4 C-Atomen, eine (-O-CH₂-CH₂)_n-OR-Gruppe, wobei n die Bedeutung 1-8 hat und R eine Morpholinoethyl oder eine Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen oder eine N,N-Dimethylaminoethyl-Gruppe ist,
oder zusammen eine Ethylendioxy-Gruppe sind und A^⊖ die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen hat.

Unter den zuletzt genannten Verbindungen der Formel VII sind wiederum diejenigen ganz besonders bevorzugt, in denen X eine p-Ethylenphenyl-Gruppe, R¹² = H und R¹³ eine p-Methoxy-Gruppe oder R¹² eine ortho-Methoxy- und R¹³ eine para-Methoxy-Gruppe oder R¹² und R¹³ zusammen eine 3,4-Ethylendioxy-Gruppe sind, wie z. B. die Verbindungen der Formel

Weitere besonders geeignete Acridiniumderivate haben die Formel VIII

in der R⁶ eine Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen oder eine Phenylgruppe ist, die mit bis zu drei Alkyl- oder Alkoxygruppen mit jeweils 1-4 C-Atomen, mit einer -(-O-CH_2-CH₂)_n-OR-Gruppe, wobei n die Bedeutung 1-8 hat und R eine Morpholinoethyl- oder eine N,N-Dimethylaminoethyl- Gruppe oder Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen ist oder mit einer Ethylendioxy-Gruppe substituiert sein kann und X die in Anspruch 1 oder 2 genannten Bedeutungen hat oder in der R⁶ eine Phenylgruppe ist, die mit bis zu drei Alkylgruppen mit jeweils 1-4 C-Atomen substituiert sein kann und X- eine ortho-, meta- oder para-Phenylengruppe ist.

Es ist überraschend, daß am Amidstickstoff Sulfonyl-substituierte Acridinium-9-carbonsäureamide eine ausgezeichnete Chemilumineszenz aufweisen, denn es ist bekannt, daß Acridinium-9-carbonsäureamide im Gegensatz zu den Acridinium-9-carbonsäureestern keinerlei Chemilumineszenz zeigen (vgl. F. McCapra in W. Carruthers und J.K. Sutherland: Progress in Organic Chem., Vol. 8, 231-277, 1973, Butterworth, London).

Ein bedeutender Vorteil der erfindungsgemäßen Acridiniumverbindungen gegenüber den aus der Europäischen Patentanmeldung 82 636 bekannten Acridiniumphenylestern liegt in der wesentliche schnelleren Reaktionskinetik der Lichtemission (vgl. P 36 28 573.0).

Ein weiterer Vorteil ist durch die Stabilität der mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellten Tracer gegeben. Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines Stabilisitätstests, bei dem nach Lagerung bei erhöhter Temperatur (50°C) die Intensität des jeweiligen Chemilumineszenzsignals gemessen wurde. Kurve 1 bezieht sich auf aus der Verbindung

a) N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4(2-succinimidoyloxycarbonylethyl) benzolsulfonyl]-10-methylacridinium-9-carbonsäureamid fluorosulfonat (6),
die Kurve b) auf aus der Verbindung N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(4- succinimidoyloxycarbonylbutyl)benzolsulfonyl]-10-methyl acridinium-9-carbonsäureamid-fluorosulfonat (11)
und die Kurve c) auf aus der Verbindung 4-(2-Succinimidyl oxycarbonylethyl)-phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat methosulfat (europäische Patentanmeldung 82 636, S. 10) dargestellte Tracer.

Es ist deutlich zu erkennen, daß die erfindungsgemäßen Tracer aus den Verbindungen a) und b) stabiler sind als die entsprechende Verbindung aus c).

Ein ähnliches Ergebnis erhält man bei einem entsprechenden Test bei 4°C. Fig. 2 zeigt die Signalintensität nach Lagerung bei 4°C. Wiederum erweist sich der aus der Verbindung a) hergestellte Tracer als entscheidend stabiler als der aus der Verbindung c) hergestellte.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Acridinium- Sulfonamidderivate kann vom Acridin-9-carbonsäurechlorid (IX) ausgegangen werden. Um dieses herzustellen wird z. B. Acridin nach dem von Lehmstedt und Hundertmark in Ber. 63, 1229 (1930) angegebenen Verfahren in Ethanol/Eisessig mit Kaliumcyanid zum 9-Cyanacridin umgesetzt. Hieraus wird vorzugsweise nach Umkristallisation durch Umsetzung mit Schwefelsäure und Natriumnitrit entsprechend dem von Lehmstedt und Wirth in Ber. 61, 2044 (1928) beschriebenen Verfahren die Acridin-9-carbonsäure gewonnen. Durch Umsetzung der Acridin-9-carbonsäure z. B. mit Thionylchlorid wird die Verbindung der Formel IX

gewonnen, in der Y die Bedeutung von Chlor hat. Anstelle eines Halogens kann in die Verbindung IX für Y auch eine Oxycarbonylalkyl-, Oxycarbonylaryl- oder Imidazolidgruppe eingeführt werden.

Das Säurechlorid (IX) läßt sich dann mit einer geschützten Sulfonamidcarbonsäure der Formel X

oder der Formel XI

umsetzen, in denen X und R⁶ die vorstehend genannten Bedeutungen haben und Z ein die Carboxygruppe schützender Rest ist, der anschließend abgespalten wird. Beispielsweise kann für diese Reaktion der N-(4-Benzoxycarbonylphenyl)-N-4- toluolsulfonsäureamid eingesetzt werden. Die nach Abspaltung der Schutzgruppe entstehende Säure wird dann mit einer geeigneten Verbindung beispielsweise mit N-Hydroxysuccinimid, in den Rest R⁵ überführt. Hieraus wird die chemilumineszierende Acridinverbindung durch Alkylierung am Stickstoff in 10-Stellung gewonnen.

Die erhaltenen Acridiniumverbindungen lassen sich dann mit einer Substanz von biologischem Interesse, z. B. einem Antigen, einem Antikörper, einem Hormon, einem Arzneimittel, einem Arzneimittelmetaboliten, einem Toxin oder einem Alkaloid zu einer lumineszierenden Verbindung umsetzen. Dabei wird das Acridiniumderivat entweder direkt oder über ein Brückenmolekül wie z. B. Aminosäuren, Oligo- oder Polyaminosäuren, Peptide oder synthetische Polymere an die biologisch interessante Substanz unter Ausbildung eines stabilen, immunologisch aktiven Konjugates gebunden. Dieses Konjugat wird auch als Tracer bezeichnet und wird in den nachfolgend beschriebenen Lumineszenzimmunoassays eingesetzt. Für den erfindungsgemäßen Lumineszenzimmunoassay zur Bestimmung einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeitsprobe nach einem kompetitiven oder einem Sandwich-Verfahren wird mindestens eine immunologisch aktive Komponente benötigt, die auf einer festen Phase immobilisiert ist und außerdem der lumineszierende Tracer.

Nach Beendigung der Immunreaktion und eventuell benötigten Waschschritten wird die Lichtemission durch sukzessive oder gleichzeitige Zugabe von einem oder mehreren Reagenzien ausgelöst, wobei mindestens ein Reagenz ein Oxidationsmittel in gebundener oder ungebundener Form enthält. Der Lumineszenzimmunoassay kann nun in verschiedener Weise durchgeführt werden.

Eine Möglichkeit besteht darin, daß man den mit dem Antigen spezifisch reagierenden immobilisierten Antikörper mit einer Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit und einem Konjugat aus dem Antigen und einem chemilumineszierenden Acridiniumderivat (Antigen-Tracer) inkubiert, die Probe und den nicht gebundenen Tracer abtrennt, den gebundenen Tracer mit den notwendigen Reagenzien zusammenbringt, um eine Lichtemission hervorzurufen, und dann aus der gemessenen Stärke der Lichtemission die Menge des vorhandenen Antigens bestimmt.

Eine andere Möglichkeit für die Durchführung des Lumineszenzimmunoassays besteht darin, daß man einen mit dem Antigen spezifisch reagierenden immobilisierten Antikörper mit einer Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit mit einem Konjugat aus einem zweiten, spezifisch reagierenden Antikörper und einem chemilumineszierenden Acridinium- Derivat inkubiert, die Probe und das nicht gebundene, markierte Konjugat abtrennt, das gebundene, markierte Konjugat mit den notwendigen Reagenzien zusammenbringt, um eine Lichtemission hervorzurufen, und aus der gemessenen Stärke der Lichtemission die Menge des vorhandenen Antigens bestimmt.

Die vorstehend genannten Lumineszenzimmunoassays können auch in der Weise durchgeführt werden, daß man vor der Zugabe des markierten Konjugats die zu untersuchende Flüssigkeit vom immobilisierten Antikörper abtrennt.

In anderen erfindungsgemäß durchführbaren Lumineszenzimmunoassays ist nicht der Antikörper, sondern das Antigen immobilisiert. So kann ein mit dem Antikörper spezifisch reagierendes immobilisiertes Antigen mit einer Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit und einer Lösung eines Konjugats aus dem Antikörper und einem chemilumineszierenden Acridiniumderivats inkubiert werden, dann die Probe und das nicht gebundene markierte Konjugat abgetrennt und dann das gebundene, markierte Konjugat mit den notwendigen Reagenzien zusammengebracht werden. Dann tritt eine Lichtemission auf, aus deren Stärke die Menge des vorhandenen Antigens bestimmt werden kann.

Eine weitere Variante besteht darin, daß man ein mit dem Antikörper spezifisch reagierendes, immobilisiertes Antigen mit einer Lösung eines Konjugats aus dem Antikörper und einem chemilumineszierenden Acridiniumderivat inkubiert, das nicht umgesetzte, markierte Konjugat abtrennt, eine Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit zufügt, die Probe anschließend wieder abtrennt, das gebundene, markierte Konjugat mit den notwendigen Reagenzien zusammenbringt, um eine Lichtemission hervorzurufen und aus dieser dann die Menge des vorhandenen Antigens bestimmt.

Schließlich ist der Lumineszenzimmunoassay auch in der Weise durchführbar, daß man ein mit dem Antikörper spezifisch reagierendes, immobilisiertes Antigen mit einer Lösung eines Konjugats aus dem Antikörper und einem chemilumineszierenden Acridiniumderivat inkubiert, eine Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit zufügt, die Probe und das nicht gebundene Konjugat abtrennt, das gebundene, markierte Konjugat mit den notwendigen Reagenzien zusammenbringt und dann aus der gemessenen Lichtemission die Menge des vorhandenen Antigens bestimmt.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Acridiniumverbindungen wird durch die Beispiele 1 bis 7 näher erläutert.

Beispiel 1 N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(2-benzyloxycarbonylethyl)- benzolsulfonyl]acridin-9-carbonsäureamid (3)

17 g 4'-[N-(4-Methoxyphenyl)sulfamido]-3-phenylpropion säurebenzylester (1) in 400 ml Dichlormethan werden mit 460 mg 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin und 22,1 ml Triethylamin versetzt, nach 10 min gibt man 11.12 g Acridin-9- carbonsäurechlorid-hydrochlorid (2) zu und erhitzt 6 Stunden zum Rückfluß. Die abgekühlte Lösung wird kurz mit 2 N NaOH verrührt, die abgetrennte organische Phase mit H₂O gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt.
Ausbeute: 60% Schmelzpunkt 130-132°C
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,7-3,0 ppm (d, br, 2H), δ = 3,0-3,3 ppm (d, br, 2H), δ = 3,5 ppm (s, br, 3H), δ = 5,1 ppm (s, 2H), δ = 6,5 ppm (d, br, 2H), δ = 7,1 ppm (d, br, 2H), δ = 7,35 ppm (s, 5H), δ = 7,5-8,3 ppm (m, 12H).

N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(2-carboxyethyl)benzolsulfonyl] acridin-9-carbonsäureamid-hydrobromid (4)

6,3 g (3) werden in 30 ml 33% HBr/Eisessig 2 Stunden auf 60°C erhitzt, nach Abkühlen fügt man 60 ml Diisopropylether hinzu, saugt den Niederschlag ab und trocknet im Vakuum:
Ausbeute: 90% Schmelzpunkt Zersetzung 237°C
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,7 ppm (d, br, 2H), δ = 3,1 ppm (d, br, 2H), δ = 3,5 ppm (s, br, 3H), δ = 6,5 ppm (d, br, 2H), δ = 7,0-8,4 ppm (m, 15H).

N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(2-succinimidoyloxycarbonylethyl)- benzolsulfonyl]acridin-9-carbonsäureamid (5)

3,1 g (4) in 50 ml Tetrahydrofuran werden mit 1,41 ml Triethylamin versetzt, auf -20°C abgekühlt und mit 0,474 ml Chlorameisensäureethylester versetzt. Man rührt 20 min nach, gibt 575 mg N-Hydroxysuccinimid zu, rührt 3 Stunden bei -20°C und läßt über Nacht unter Rühren auf Raumtemperatur kommen. Vom Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan oder Ethylacetat aufgenommen, die resultierende Lösung mit Wasser, NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die organische Phase wird eingeengt und der Rückstand aus Toluol umkristallisiert.
Ausbeute: 50%
NMR (DMSO, 100 MHz) δ = 2.8 ppm (s, 4H), δ = 3,2 ppm (s, br, 4H), δ = 3,5 ppm (s, Br, 3H), δ = 6,5 ppm (d, br, 2H), δ = 7,2 ppm (d, br, 2H), δ = 7,6-8,4 ppm (m, 12H)
IR: 3400 cm⁻¹ (br), 3060, 2930, 1815(w), 1780(w), 1740(s), 1690(m), 1600(w), 1510(m), 1370(m), 1250(m), 1203(m), 1175(m).

N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4(2-succinimidoyloxycarbonylethyl)- benzolsulfonyl]-10-methylacridinium-9-carbonsäureamid fluorosulfonat (6)

1,27 g (5) in 60 ml Dichlormethan werden bei -20°C mit 0,4 ml Methylfluorosulfonat versetzt. Man läßt 2 Stunden bei -20°C rühren und über Nacht auf Raumtemperatur auftauen.

Auf Zusatz von Toluol fällt ein gelber Feststoff aus, der abgesaugt und im Vakuum getrocknet wird.
Ausbeute: 80%
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2.9 ppm (s, 4H), δ = 3,2 ppm (s, br, 4H), δ= 3,5 ppm (s, br, 3H), δ = 4,8 ppm (s, br, 3H), δ = 6,5 ppm (br, 2H), δ = 7,2 ppm (br, 2H), δ = 7,6-9,0 ppm (m, 12H)
IR = 3400 cm⁻¹ (br), 3160, 2970, 1810(w), 1785(w), 1740(s), 1695(m), 1600(w), 1555(w), 1510(m), 1370(m), 1290(m), 1250(m), 1210(m), 1170(m)
Massenspektrum: m/Z: 652 M.⁺ (Kation).

Beispiel 2

Die Darstellung von N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(4-Succinimidoyl oxycarbonylbutyl)benzolsulfonyl]-10-methylacridinium-9- carbonsäureamid-fluorosulfonat (11) ausgehend von 4'-[N-(4- Methoxyphenyl)sulfamido]-5-phenylvaleriansäurebenzylester (7) und Acridin-9-carbonsäurechlorid-hydrochlorid (2) erfolgt analog zur Synthese von (6). Die Ausbeuten der einzelnen Syntheseschritte sowie die spektroskopische Charakterisierung sind nachfolgend angegeben.

N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(4-benzyloxycarbonylbutyl)- benzolsulfonyl]acridin-9-carbonsäureamid (8)

Ausbeute: 40% zähes Öl, erstarrt teilweise
NMR (CDCl₃

, 100 MHz): δ = 2,85 (m, 4H), δ = 2,45 ppm (t, br, 2H), δ = 2,8 ppm (t, br, 2H), δ = 3,5 ppm (s, 3H), δ = 5,15 ppm (s, 2H), δ = 6,3 ppm (d, 2H), δ = 6,9 ppm (d, 2H), δ = 7,3-8,3 ppm (m, 17H).

N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(4-carboxybutyl)benzolsulfonyl] acridin-9-carbonsäureamid-hydrobromid (9)

Ausbeute: 95% Schmelzpunkt Zersetzung 153-5°C
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 1,7 ppm (s, br, 4H), δ = 2,3 ppm (t, br, 2H), δ = 2,8 ppm (s, br, 2H), δ = 3,5 ppm (s, br, 3H), δ = 6,5 ppm (br, 2H), δ = 7,05 ppm (br, 2H), δ = 7,5-8,5 ppm (m, 12H).

N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(4-succinimidoyloxycarbonylbutyl)- benzolsulfonyl]acridin-9-carbonsäureamid (10)

Ausbeute: 25% Schmelzpunkt: Zersetzung 75-80°C
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 1,8 ppm (br, 4H), δ = 2,3 ppm (s, 2H), δ = 2,85 ppm (s, br, 6H), δ = 3,5 ppm (s, br, 3H), δ = 6,5 ppm (d, br, 2H), δ = 7,05 ppm (d, br, 2H), δ = 7,5-8,3 ppm (m, 12H).

N-(4-Methoxyphenyl)-N-[4-(4-succinimidoyloxycarbonylbutyl)- benzolsulfonyl]-10-methylacridinium-9-carbonsäureamid fluorosulfonat (11)

Ausbeute: 90%
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 1,8 ppm (br, 4H), δ = 2,3 ppm (s, br, 2H), δ = 2,8 ppm (s, br, 6H), δ = 3,5 ppm (s, br, 3H), δ = 4,8 ppm (br, 3H), δ = 6,5 ppm (br, 2H), δ = 7,05 ppm (br, 2H), δ = 7,5- 9,0 ppm (m, 12H).
IR: 3340 cm⁻¹

(br), 3060(w), 2930(m), 2870(w), 1810(w), 1785(w), 1740(s), 1695(m), 1600(w), 1550(w), 1510(m), 1460(w), 1370(m), 1290(s), 1250(s), 1205(s), 1170(s)
Massenspektrum: m/z = 680 M.⁺ (Kation).

Beispiel 3

Die Darstellung von N-(2,4-Dimethoxyphenyl)-N-[4-(2- succinimidoyloxycarbonylethyl)benzolsulfonyl]-10-methyl acridinium-9-carbonsäureamid-fluorosulfonat (16a) ausgehend von 4'-[N-(2,4-Dimethoxyphenyl)sulfamido]-3-phenylpropion säurebenzylester (12a) und Acridin-9-carbonsäurechlorid hydrochlorid (2) erfolgt analog zur Synthese von (6). Die Ausbeuten der einzelnen Syntheseschritte sowie die spektroskopische Charakterisierung sind nachfolgend angegeben.

N-(2, 4-Dimethoxyphenyl)-N-[4-(2-benzyloxycarbonylethyl)- benzolsulfonyl]acridin-9-carbonsäureamid (13a)

Ausbeute: 50% Schmelzpunkt: 74°C
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 ppm (d, br, 2H), δ = 3,1 ppm (d, br, 2H), δ = 3,3 ppm (s, 3H), δ = 3,4 ppm (s, 3H), δ = 5,1 ppm (s, 2H), δ = 5,9-6,2 ppm (m, 2H), δ = 7,0 ppm (d, 1H), δ = 7,35 ppm (s, 5H), δ = 7,5-8,2 ppm (m, 12H).

N-(2, 4-Dimethoxyphenyl)-N-(2-carboxyethyl)benzolsulfonyl] acridin-9-carbonsäureamid-hydrobromid (14a)

Ausbeute: 95%
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,75 ppm (d, br, 2H), δ = 3,05 ppm (d, br, 2H), δ = 3,3 ppm (s, 3H), δ = 3,5 ppm (s, 3H), δ = 5,95-6,3 ppm (m, 2H), δ = 7,05 ppm (d, 1H), δ = 7,6-8,6 ppm (m, 12H), δ = 9,2 ppm (s, br, 2H).

N-(2,4-Dimethoxyphenyl)-N-[4-(succinimidoyloxycarbonylethyl)- benzolsulfonyl]acridin-9-carbonsäureamid (15a)

Ausbeute: 45% Schmelzpunkt: ∼ 105°C Zersetzung
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 ppm (s, 4H), δ = 3 ppm (br, 2H), δ = 3,2 ppm (s, 3H), δ = 3,4 ppm (s, 3H), δ = 5,9-6,3 ppm (m, 2H), δ = 7,0 ppm (d, 1H), δ = 7,5-8,4 ppm (m, 12H)
IR (KBr-Pressling): 3440 cm⁻¹

(br), 3060 (w), 2930(w), 2850(w), 1815(w), 1785(w), 1740(s), 1695(m), 1600(w), 1510(m), 1460(w), 1440(w), 1365(m), 1320(w), 1290(w), 1240(m), 1210(s), 1165(m), 1085(m)

N-(2,4-Dimethoxyphenyl)-N-[4-(2-succinimidoyloxy carbonylethyl)benzolsulfonyl]-10-methylacridinium-9- carbonsäureamid-fluorosulfonat (16a)

Ausbeute: 80% Schmelzpunkt: ∼ 135°C Zersetzung
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 ppm (s, 4H), δ = 2,95-4,2 ppm (m, 10H)) δ = 4,8-5,0 ppm (s, s, 3H), δ = 6,05-6,25 ppm (m, 1H), δ = 7,6-9,0 ppm (m, 14H)
IR (KBr-Pressling): 3430 cm⁻¹

(m), 2950(w), 2870(w), 2825(w), 1810(w), 1780(m), 1750(s), 1695(m), 1610(m), 1555(w), 1510(m), 1465(m), 1380(m), 1285(m), 1250(m), 1210(s), 1170(m)

Beispiel 4

Die Synthese von N-(3,4-Ethylendioxyphenyl)-N-[4-(2- succinimidoyloxycarbonylethyl)benzolsulfonyl]-10- methylacridinium-9-carbonsäureamid-fluorosulfonat (16b) ausgehend von 4'-[N-(3,4-Ethylendioxyphenyl)sulfamido]-3- phenylpropionsäurebenzylester (12b) und Acridin-9- carbonsäurechloridhydrochlorid (2) erfolgt analog Beispiel 1. Die Ausbeuten der einzelnen Schritte sowie die spektroskopische Charakterisierung sind nachfolgend angegeben.

N-(3,4-Ethylendioxyphenyl)-N-[4-(2-benzyloxycarbonylethyl)- benzolsulfonyl]acridin-9-carbonsäureamid (13b)

Ausbeute: 50% Schmelzpunkt 91,5°C
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,9 ppm (d, br, 2H), δ = 3,1 ppm (d, br, 2H), δ = 4,0 ppm (s, Br, 4H), δ = 5,1 ppm (s, 2H), δ = 6,3-6,8 ppm (m, 3H), δ = 7,3 ppm (s, 5H), δ = 7,6-8,3 ppm (m, 12H).

N-(3,4-Ethylendioxyphenyl)-N-[4-(2-carbonyloxyethyl)- benzolsulfonyl]acridin-9-carbonsäureamid-hydrobromid (14b)

Ausbeute: 95% Schmelzpunkt: < 200°C
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,7 ppm (m, 2H), δ = 3,05 ppm (m, 2H), δ= 4,0 ppm (s, br, 4H), δ = 6,3-6,8 ppm (m, 3H), δ = 7,5-8,6 ppm (m, 12H), δ = 9,6 ppm (s, br, 2H).

N-(3,4-Ethylendioxyphenyl)-N-[4-(succinimidoyloxycarbonyl ethyl)benzolsulfonyl]acridin-9-carbonsäureamid (15b)

Ausbeute: 45% Schmelzpunkt: 140°C Zersetzung
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,7-2,9 ppm (d, s, überlagert, 6H), δ = 3,0 ppm (d, 2H), δ = 4,0 ppm (s, br, 4H), δ = 6,3-6,8 ppm (m, 3H), δ = 7,5-8,4 ppm (m, 12H)
IR(KBr-Pressling): 3420 cm⁻¹

(br), 3060(m), 2980(m), 2930(m), 1810(w), 1790(w), 1740(m), 1695(s), 1590(m), 1460(w), 1430(w), 1410(w), 1370(m), 1300(m), 1225(s), 1175(s).

N-(3,4-Ethylendioxyphenyl)-N-[4-(succinimidoyloxy carbonylethyl) benzolsulfonyl] -10-methylacridinium-9- carbonsäureamid-fluorosulfonat (16b)

Ausbeute: 80% Schmelzpunkt ∼ 110°C, Zersetzung
NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2,85 ppm (s, 4H), δ = 3,0-3,3 ppm (s, s, br, 4H), δ = 3,8-4,5 ppm (m, br, 4H), δ = 4,75-5,1 ppm (s, br mit Schulter, 3H), δ = 6,3-9,0 ppm (m, 15H).

Beispiel 5 N-(4-Carboxyphenyl)-4-toluolsulfonsäureamid

Zu einer Mischung von 252 g (3 Mol) Natriumhydrogencarbonat und 139,1 g (1 Mol) 4-Aminobenzoesäure in 2,5 l Wasser tropft man bei 20-30°C eine solche von 190,5 (1 Mol) 4-Toluolsulfochlorid in 300 ml i-Propylether. Man rührt intensiv 2-4 Stunden, bis das Sulfochlorid verbraucht ist. Die abgetrennte wäßrige Lösung stellt man mit konz. Salzsäure auf pH 1 und nimmt die Fällung in Propylacetat auf. Den Extract wäscht man 2x mit 2n-Salzsäure, 1x mit Wasser aus, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält 240 g/82,5% d.Th.)

N-(4-Carboxyphenyl)-4-toluolsulfonsäureamid ¹

H-NMR (DMSO d₆

): δ = 2,3 (s; CH₃

); 7,1 (d, Aromat, 2H) 7,3 (d, Aromat, 2H); 7,6-7,9 (m, Aromat, 4H); 10,75 (breit); 12,7 (breit).

N-(4-Benzyloxycarbonylphenyl)-4-toluolsulfonsäureamid

Eine Lösung von 11,64 g (40 mMol) N-(4-Carboxyphenyl)-4- toluolsulfonsäureamid, 5,06 g (40 mMol) Benzylchlorid, 5,20 g (44 mMol) Di-i-propyl-ethylamin in 100 ml Dimethylformamid erhitzt man 4 Stunden auf 140°C. Nach beendeter Reaktion dampft man im Vakuum ein, nimmt auf in Propylacetat, wäscht 2x mit 2n Salzsäure, 2x mit gesättigter NaHCO₃- Lösung, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält 11,8 g (78% d.Th.) N-(4-Benzyloxycarbonylphenyl)-4- toluolsulfonsäureamid, der aus Methanol umkristallisiert wird.
¹H-NMR (DMSO d₆): δ = 2,3 (s; CH₃); 5,3 (s, CH₂); 7,1-7,3 (dd, 4 aromat. H); 7,4 (s, C₆H₅); 7,7-7,9 (dd, 4 aromat. H); 10,8 (breit, NH).

N-(4-Benzyloxycarbonylphenyl)-N-(4-toluolsulfonyl)-acridin-9- carbonsäureamid

Zu der Lösung von 1,5 g (4 mMol) N-(4-Benzyloxycarbonylphenyl)-4- toluolsulfonsäureamid, 1,23 g (4,4 mMol) Acridinsäurechlorid hydrochlorid und 0,02 g Dimethylaminopyridin in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran tropft man bei 25°C 2,1 ml (15 mMol) Triethylamin in 10 ml Tetrahydrofuran. Man steigert die Temperatur auf 60°C.

Das auskristallisierende Produkt wird nach beendeter Reaktion mit Methanol verrührt abgesaugt und aus Ethylacetat umkristallisiert.
Ausbeute: 1,57 (67,0% d.Th.)
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 2,5 (s, CH₃); 5,2 (s, CH₂); 7,3 (s, C₆H₅), 7,0-8,2 (m, 16 aromat. H).

N-(4-Carboxyphenyl)-N-(4-toluolsulfonyl)-acridin-9- carbonsäureamid-hydrobromid

1,17 g (2 mMol) N-(4-Benzyloxycarbonylphenyl)-N-(4-toluol sulfonyl)-acridin-9-carbonsäureamid werden mit 10 ml 33%iger Bromwasserstoff-Eisessiglösung unter Rühren 4 Stunden auf 60°C erwärmt. Nach Abkühlung saugt man die Fällung ab und trocknet i.V. Ausbeute: 1,00 g (87% d.Th.)
¹H-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, CH₃); 7,3-8,6 (m, 16 aromat. H); 11,65 (s, NH); MS: 496 (M.⁺).

N-(4-succinimidoyloxycarbonylphenyl)-N-(4-toluolsulfonyl)- acridin-9-carbonsäureamid

Zu einer Lösung von 0,57 g (1 mMol) N-(4-Carboxyphenyl)-N-(4- toluolsulfonyl)-acridin-9-carbonsäureamid-hydrobromid und 0,21 g (2 mMol) Triethylamin in 25 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gibt man unter Rühren bei -15°C 0,11 g (1 mMol) Chlorameisensäureethylester. Man rührt 1 Stunde bei gleicher Temperatur und setzt dann 0,12 g (1 mMol) N-Hydroxysuccinimid zu. Nach einer weiteren Stunde läßt man den Ansatz bei Raumtemperatur 15 Stunden stehen. Man dampft i.V. ein, nimmt in Ethylacetat auf, wäscht mit Wasser, Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser aus und trocknet über Natriumsulfat. Nach dem Eindampfen erhält man 0,42 g (70,8% d.Th.) des Zielproduktes.
¹H-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, CH₃), 3,1 (s, CH₂-CH₂), 7,0-8,6 (m, 16 aromat. H).

N-(4-Succinimidoyloxycarbonylphenyl)-N-(4-toluolsulfonyl)-10- methylacridinium-9-carbonsäureamid-fluorosulfonat

Zu einer Lösung von 0,59 g (1 mMol) N-(4-Succinimidoyloxy carbonylphenyl)-N-(4-toluolsulfonyl)-acridin-9-carbonsäureamid in 30 ml 1,2-Dichlorethan gibt man unter Rühren bei 25°C 0,85 g (7,5 mMol) Fluorsulfonsäuremethylester. Das Reaktionsprodukt fällt innerhalb von 4 Stunden aus. Nach Absaugen und Trocknen erhält man 0,43 g (60,8% d.Th.) des Zielproduktes.
¹H-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, Ar-CH₃); 3,1 (5, CH₂-CH₂); 4,9 (s, N-CH₃); 7,3-8,8 (m, 16 arom. H).

Beispiel 6

In gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhält man aus
N-(4-Carboxymethylphenyl)-4-toluol-sulfonsäureamid
N-(4-Succinimidoyloxycarbonylmethylphenyl)-N-(4-toluolsulfonyl)- 10-methylacridinium-9-carbonsäureamid-fluorosulfonat
N-(4-Carboxymethylphenyl)-4-toluolsulfonsäureamid
¹H-NMR (DMSO): δ = 2,3 (s, CH₃); 3,5 (s, CH₂); 7,0 (AB, C₆H₄); 7,3-7,6 (AB; C₆H₄); 10.2 (s, NH).
N-(4-Benzyloxycarbonylmethylphenyl)-4-toluolsulfonsäureamid
Ausbeute: 35% d.Th.
¹H-NMR (DMSO): δ = 2,3 (s, CH₃); 3,6 (s, COCH₂); 5,1 (s, OCH₂); 6,9-7,7 (m, 13 aromat. H); 10,2 (s, NH).
N-(4-Benzyloxycarbonylmethylphenyl)-N-(4-toluolsulfonyl) acridin-9-carbonsäureamid
Ausbeute: 35% d.Th.
¹H-NMR (CDCH₃); δ = 2,55 (s, CH₃); 3,3 (s, COCH₂); 5,0 (s, O-CH₂), 6,7-8,2 (m, 21 aromat. H).
N-(4-Carboxymethylphenyl)-N-(4-toluolsulfonyl)-acridin-9- carbonsäureamid-hydrobromid
Ausbeute: 95% d.Th.
¹H-NMR (TFA); δ = 2,65 (s, CH₃); 3,55 (s, CH₂); 6,8-8,6 (m, 16 aromat. H)
N-(4-Succinimidoyloxycarbonylmethylphenyl)-N-(4- toluolsulfonyl)-acridin-9-carbonsäureamid
Ausbeute: 71% d.Th.
¹H-NMR (TFA): δ = 2,65 (s, Toluol-CH₃); 3,0 (s, CH₂-CH₂); 3,6 (breit, COCH₂); 6,9-8,5 (m, Aromat)
N-(4-Succinimidoyloxycarbonylmethylphenyl)-N-(4- toluolsulfonyl)-10-methylacridinium-9-carbonsäureamid fluorosulfonat
Ausbeute: 80% d.Th.
¹H-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, Toluol-CH₃); 2,9 (s, CH₂-CH₂); 3,6 (breit, COCH₂); 4,9 (s, N-CH₃); 6,8-8,9 (m, Aromat)

Beispiel 7

In gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhält man aus
N-[4-(2-Carboxyethyl)-phenyl]-4-toluolsulfonsäureamid
N-[4-(2-Succinimidoyloxycarbonylethyl)-phenyl]-N-(4- toluolsulfonyl)-10-methyl-acridinium-9-carbonsäureamid fluorosulfonat.
N-[4-(2-Carboxyethyl)-phenyl]-4-toluolsulfonsäureamid
Ausbeute: 44% d.Th.
¹H-NMR (DMSO): δ = 2,3 (s, CH₃); 2,4-2,8 (m, CH₂-CH₂); 7,0 (AB, 4H); 7,2-7,8 (AB, 4H); 10,1 (s, NH).
N-[4-(2-Benzyloxycarbonylethyl)-phenyl]-4-toluolsulfonsäureamid
Ausbeute: 78% d.Th.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 2,35 (s, CH₃); 2,4-3,0 (m, CH₂-CH₂); 5,1 (s, O-CH₂); 7,0-7,8 (13 aromat. H, NH)
N-[4-(2-Benzyloxycarbonylethyl)-phenyl]-N-(4-toluolsulfonyl) acridin-9-carbonsäureamid.
Ausbeute: 77% d.Th.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 2,2-2,8 (m, 7H); 5,0 (s, CH₂); 6,65-7,0 (AB, 4 aromat. H); 7,3-8,3 (in, 17 aromat. H),
N-[4-(2-Carboxyethyl)-phenyl]-N-(4-toluolsulfonyl) acridin-9-carbonsäureamid-hydrobromid.
Ausbeute: 65% d.Th.
¹H-NMR (CD₃OD): 6 2,1-2,8 (m, 6,7-8,5 (16 aromat. H) CH₂-CH₂); 2,5 (s, CH₃);
N-(4-(2-Succinimidoyloxycarbonylethyl)-phenyl)-N-(4- toluolsulfonyl)-acridin-9-carbonsäureamid.
Ausbeute: 90% d.Th.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 2,6 (s, CH₃); 2,7 (breit, CH₂-CH₂); 2,8 (s, CH₂-CH₂); 6,6-8,8 (16 aromat. H)
N-[4-(2-Succinimidoyloxycarbonylethyl)-phenyl]-N-(4- toluolsulfonyl)-10-methyl-acridinium-9-carbonsäureamid fluorosulfonat.
Ausbeute: 84% d.Th.
¹H-NMR (TFA): δ = 2,6 (s, CH₃); 2,3-3,3 (breiter Untergrund, 11H; s, 3,1); 4,9 (s, N-CH₃); 6,7-8,8 (16 aromat. H)

Beispiel 8 Tracer-Herstellung für den TSH-Chemilumineszenzimmunoassay

91 µl Antikörper (100 µg), 20 µl des nach Beispiel 1 hergestellten Acridiniumderivats (Verbindung (6)) (1 mg/ml in Acetonitril und 600 µl Konjugationspuffer (0.01 M Phosphat, pH 8,0) werden 15 Minuten inkubiert. Danach werden 200 µl-Lysin (10 mg/ml in Konjugationspuffer) zugefügt und weitere 15 Minuten inkubiert. Dieser Ansatz wird auf eine PD 10-Säule (Sephadex®) G 25 Medium, kugelförmiges quervernetzten Dextrangel, gegeben und mit 0.1 M Phosphat, pH 6.3 als Fließmittel eluiert. 10 Tropfen/Fraktion werden gesammelt. Die einzelnen Fraktionen werden nach geeigneter Verdünnung auf ihre Chemilumineszenaktivität getestet (350 µl Oxidationsmittel: 0.1% H₂O₂ in 0.1 N NaOH). Die Tracerfraktionen (1. Aktivitätspeak) werden "gepoolt" und bei 4°C gelagert. Der gebrauchsfertige Tracer für den h-TSH-Chemilumineszenzimmunoassay wird durch geeignete Verdünnung mit einem Phosphatpuffer (0.1 M Phosphat, pH 6,3, 1% Tween® 20, (Polyethylensorbitanmonolaureat), 0.1% Rinderserumalbumin, 0.1 M NaCl, 0.01% NaN₃) hergestellt.

Beispiel 9 Durchführung des h TSH-Chemilumineszenimmunoassays

50 µl Standard/Probe und 200 µl Tracer wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in mit monoklonalen Anti-TSH-Antikörper beschichteten Röhrchen geschüttelt. Danach wird 3x mit 1 ml Puffer bzw. dest. Wasser gewaschen. Die Lichtemission erfolgt durch Zugabe von jeweils 300 µl Aktivierungsreagenz (pH 1-Puffer, 0.5% H₂O₂ und 300 µl Startreagenz (0.2 N NaOH) über 2 Dispensoren im Luminometer in die Röhrchen. Die Meßzeit beträgt 1 sec.

Fig. 3 zeigt den typischen Verlauf einer Standardkurve eines Immuno-chemiluminometrischen Assays (ICMA) für das humane Thyreoidea-stiinulierende Hormon (h-TSH).

Claims

1. Chemilumineszierende Acridiniumderivate der allgemeinen Formel I
in der R¹ Wasserstoff, ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Benzyl- oder Arylgruppe ist,
R² und R³ Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe, eine Carboxy-, Alkoxy-, Cyano-, Nitrogruppe oder Halogen sind
R⁴ einen Rest der allgemeinen Formel II oder III darstellt
worin R⁵ eine reaktive Gruppe ist, die unter schonenden Bedingungen selektiv mit Amino-, Carboxy-, Thiol- oder anderen funktionellen Gruppen in Substanzen von biologischem Interesse eine Bindung eingehen kann;
R⁶ Wasserstoff ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 10 C-Atomen, eine substituierte Aminogruppe, eine Benzylgruppe, eine Arylgruppe, eine Heteroalkylgruppe oder eine heterocyclische Gruppe ist, die auch mit Hydroxy-, Amino-, Alkylamino-, Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxy mit 1 bis 4 C-Atomen, Polyalkoxy-, Aryloxy-Gruppen oder einer heterocyclischen Gruppe einfach oder mehrfach substituiert sein können, wobei die zuletzt genannten Substituenten ihrerseits mit einer heterocyclischen Verbindung oder einem Amin substituiert sein können oder zusammen einen O und/oder S und/oder NH- oder N-Alkyl-aufweisenden Heterocyclus bilden können und X eine Arylgruppe, die direkt oder über eine Alkylgruppe oder eine Oxyalkylgruppe an das Stickstoff- oder Schwefelatom gebunden ist und über eine Alkylgruppe oder eine Oxyalkylgruppe an den Rest R⁵ gebunden ist und die auch mit Alkyl-, Alkenyl-, Hydroxy-, Amino-, Alkoxy-, oder Aryloxy-Gruppen und/oder Heteroatomen einfach oder mehrfach substituiert sein kann
oder den Rest einer aliphatischen, araliphatischen oder aromatischen, nicht notwendigerweise natürlichen, Aminocarbonsäure bedeutet
oder eine Phenylengruppe ist wenn R⁶ eine Phenylgruppe ist, die einfach oder mehrfach mit (C₁-C₆)-Alkyl substituiert ist.

2. Acridiniumderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Gruppe der allgemeinen Formel IV ist
in der R⁷ ein Substituent der allgemeinen Formel -(CH₂)_n- oder -((CH₂)_m-O)_n- ist mit n = 0 bis 4 und m = 1 bis 6, R⁸ ein Substituent in ortho-, meta- oder para-Stellung zu R⁷ der Formel -(CH₂)_p-, (O-(CH₂)_m-)_p oder -((CH₂)_m-O)_p mit p = 1-6 und m = 1-6, oder ein verzweigter oder unverzweigter Kohlenwasserstoffrest mit 1-4 C-Atomen ist
und die Substituenten R⁹-R¹¹ Wasserstoff, geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit bis zu 30 C-Atomen sind wobei eine oder mehrere -CH₂-Einheiten auch durch O, S, SO, SO₂, NH oder N-Alkyl ersetzt sein können und zwei dieser Substituenten ringförmig verknüpft sein können.

3. Acridiniumderivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ eine Gruppe der Formel V
ist.

4. Acridiniumderivate nach einem oder mehreren der vorausgehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel VI
in der X eine Gruppe der Formel VII
mit n = 2 oder 4
und R¹² und R¹³ unabhängig voneinander Wasserstoff, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe mit 1-4 C-Atomen, eine (-O-CH₂-CH₂)_n-OR-Gruppe, wobei n die Bedeutung 1-8 hat und R eine Morpholinoethyl- oder eine Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen oder eine N,N-Dimethylaminoethyl-Gruppe sind oder zusammen eine Ethylendioxy-Gruppe sind und A^⊖ die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen hat.

5. Acridiniumderivate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß X eine p-Ethylenphenyl-Gruppe, R¹² = H und R¹³ eine p-Methoxy-Gruppe, oder R¹² eine ortho-Methoxy- und R¹³ eine p-Methoxy-Gruppe, oder R¹² und R¹³ zusammen eine 3,4-Ethylendioxy-Gruppe sind.

6. Acridiniumderivat nach den Ansprüchen 1 oder 2, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel VIII
in der X die in Anspruch 1 oder 2 genannten Bedeutungen hat und R⁶ eine Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen oder eine Phenylgruppe ist, die mit bis zu drei Alkyl- oder Alkoxygruppen mit jeweils 1-4 C-Atomen, mit einer (-O-CH₂-CH₂)_n-OR-Gruppe, wobei n die Bedeutung 1-8 hat und R eine Morpholinoethyl- oder eine N,N-Dimethylaminoethyl- Gruppe oder Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen ist oder die mit einer Ethylendioxy-Gruppe substituiert sein kann
oder in der R⁶ eine Phenylgruppe ist, die mit bis zu drei Alkylgruppen mit jeweils 1-4 C-Atomen substituiert sein kann und X- eine ortho-, meta- oder para- Phenylengruppe ist.

7. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel IX
mit einer geschützten Sulfonamid-carbonsäure der allgemeinen Formel X
oder der allgemeinen Formel XI
umsetzt, wobei Y = Halogen, eine Oxycarbonylalkyl-, Oxycarbonylaryl- oder Imidazolidgruppe ist, X und R⁶ die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen haben und Z ein die Carboxygruppe schützender Rest ist, der anschließend abgespalten wird, und die dabei entstehende Säure in das den Rest R⁵ enthaltende gewünschte Acridiniumderivat umgesetzt wird, das dann noch am Stickstoff des Acridingerüstes quaternisiert wird.

8. Lumineszente Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß ein Acridiniumderivat gemäß Anspruch 1 direkt oder über ein Brückenmolekül an ein Protein, ein Polypeptid oder an eine andere Substanz von biologischem Interesse unter Ausbildung eines stabilen, immunologisch aktiven Konjugates gebunden ist.

9. Lumineszenzimmunoassay zur Bestimmung einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeitsprobe, bei dem in einem kompetitiven- oder einem Sandwich-Verfahren mindestens eine immunologisch aktive Komponente auf einer festen Phase immobilisiert ist und mindestens eine weitere Komponente, der Tracer, eine lumineszente Verbindung entsprechend Anspruch 8 darstellt.