PT89759B

PT89759B - Processo para a preparacao de derivados especiais quimiluminescentes de acridina e de meios de ensaio imunoluminescentes que os contem

Info

Publication number: PT89759B
Application number: PT89759A
Authority: PT
Inventors: Tonio Kinkel; Peter Molz; Erwin Schmidt; Gerd Schnorr; Heinz Jurgen Skrzipezyk
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-02-20
Filing date: 1989-02-17
Publication date: 1994-03-31
Also published as: DK175493B1; GR3034888T3; DK74289A; DE58909877D1; PT89759A; CA1339390C; NO173237C; FI90537C; NO890689L; DE3844954C2; ES2151474T3; FI90537B; EP0330050B1; NO173237B; JP2602315B2; EP0330050A3; JPH01261461A; DK74289D0; FI890754A0; ATE195757T1

Description

objectivo da presente invenção sao derivados de acridina quimiluminescentes, processos para a sua pre— paraçao e seu emprego em meios de ensaio imunolumi-nescent es.

Conhece—se ja uma larga aplicaÇao para os com «a postos quimiluminescentes. Sao utilizados como indicadores em ensaios biológicos, imunoenzimáticos e imunoluminescentes (vide W. P. Collins Altemative Immunoassays, ed. John Wi— ley & Sons Ltd., Chichester, 1985)» embora se empreguem também em ensaios de hibridaÇao de ácidos nucleicos (vide J. A. Matthexs et al. Analytical Biochemistry, 151» 205—209, 1985) Utilizam—se ainda compostos quimiluminescentes em análises

flow injection, em detectores pós-coluna na cromatografia líquida, na investigação eléctrica e em fontes de luz artificial.

Nos ensaios imunológicos quimiluminescentes atingiram grande significado em especial dois tipos de estrutura de substancias de marcaçao quimiluminescentes. Trata-se por um lado de derivados do luminol ou do isoluminol, descritos por Μ. P. Schroeder et al. , *^fMethods in Enzymology”, Aca— demic Press Inc., New York, Vol. LVII, 197S» 422 e seg., bem como nas patentes britânicas 2 008 247 e 2 041 920, nas paten tes alemas 26 18 149 e 26 18 511, bem como na patente euro—

M peia 135 071· Pode encontrar—se uma revisão geral sobre a apli * I caÇao pratica dos compostos de isoluminol como indicadores de I luminescência em W. G. Wood, J. Clin. Chem. Clin. Biochem.

22, 1984, 905-918.

Por outro lado tem—se também utilizado ésteres de acridlnio como substâncias de marcaçao quimiluminescen tes. Estes ésteres de acridínio sao conhecidos da patente US— —352791, das patentes britânicas 1 316 363 β 1 46l 877» bem como da patente europeia 82 636. 0 emprego de ésteres de acri dlnio como substâncias de marcaçao em ensaios imunológicos en contra—se descrito por tfeeks et al., Clim. Chem. 29/β (1903), 1474-1479· Conhece—se já também a utilização de ésteres de fe nantridinio como substâncias de marcaçao em ensaios imu-nológi cos luminescentes, da patente europeia 170 415·

A quimiluminescencia dos ésteres de acridínio *» «w pode ser provocada pela adiçao de uma solução alcalina de

H^O^· P. McCapra, Acc· Chem. Res. 9» 201, 1976, propôs uma in *· _Λterpretaçao convincente para o mecanismo da quimiluminescência. Nesse mecanismo é evidente que o tipo de grupo rejeitado é decisivo tanto para o rendimento quântico da luz como para a estabilidade hidrolítica.

Os ésteres de acridínio até agora conhecidos

tem a vantagem» em relaçao aos compostos de luminol e de iso— luminol, de possuirem um maior rendimento quântico luminoso» que também nao e afectado pelas proteínas ligadas ao indicador (vide Weeks et al· » Clim. Chem. 29/8 (19Ô3), 1474-1479)·

Embora os ésteres fenllicos de acridínio, conhecidos da patente europeia 82 636» na excitaÇeo da quimilu— minescencia por meio de oxidantes moderados» se distingam por uma elevada sensibilidade de detecção» apresentam algumas des vantagens perturbadoras para a aplicaçao pratica. Em primeiro lugar o éster fenllico é muito hábil em sistemas aquosos mesmo à temperatura ambiente. Além disso» os ésteres fenllicos de acridínio» nas condições de oxidaÇao mencionadas» apresentam uma emissão luminosa que só após cerca de 10 segundos» is to e ate mais de 95%» se extingue. Em comparaÇao com isto» ou tros processos de ensaio nao isotópicos têm tempos de medição muito menores e possibilitam assim uma maior possibilidade de análise de amostras.

Tinha já sido proposta a utilização de deriva dos de acridínio quimiluminescentes que para além de um eleva do rendimento quântico luminoso possuem uma cinética reaccional mais rápida» possibilitando assim tempos de medição mais curtos para um ensaio imunológico luminescente (vide patente alema P 36 28 573·θ). Trata—se de derivados de acridínio de fórmula

na qual

R^ representa hidrogénio, um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo com 1 a 10 átomos de carbono, um grupo benzilo ou ari lo,

B C

R e R representam hidrogénio, um grupo alquilo com 1 a 4

átomos de carbono, um grupo amino substituído ou nao substituído, um grupo carboxilo, alcooxilo, ciano, nitro ou ha logéneo,

D

R representa um grupo no qual um grupo sulfonamido se encontra ligado pelo átomo de azoto directamente ao grupo carbo nilo, ou um grupo tioalquilo ou tioarilo de fórmula

- S - Y - r^e em que Y ê um grupo alifático ramificado ou nao ramificado ou um grupo aromático, podendo tambám heteroátomos,e R é um gru po reactivo que, em condiçoes adequadas pode formar uma liga— a»

Çao selectiva com um grupo amino, carboxilo, tiol ou outros grupos funcionais em substâncias de interesse biológico, e A© é um artiao nao inconveniente para a luminescência.

Descobriu-se então que derivados de acridinio especiais, devido à sua extraordinária estabilidade e à sua inesperadamente elevada sensibilidade de detecção, sao-parti— ae cularmente apropriados para utilizaÇao como compostos quimilu a» «* minescentes. Deste modo, o objectivo da invenÇao sao derivados de acridinio quimiluminescentes, de fórmula I

R(I) r! é hidrogénio, um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo com 1 a 10 átomos de carbono, um grupo benzilo ou arilo, e R^J sao hidrogénio, um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de «tf carbono, um grupo amino substituído ou nao substituído, um grupo carboxilo, alcooxilo, ciano, nitro ou halogéneo, representa um grupo de fórmula II ou III ^N^_ 5 ^S0 -X-R^J2 (II)

em que **

R e um grupo reactivo que pode formar, em condiçoes apropria «V í das, uma ligaçao eelectiva com os grupos amino, carboxilo, ί tiol ou outros grupos funcionais, em substancias de interesse biológico,

R^ θ hidrogénio, um grupo alquilo, alcenilo ou aicinilo com 1 a 10 átomos de carbono, um grupo amino substituído, um gru po benzilo, um grupo arilo, um grupo heteroalquilo ou ura heterociclo, que pode ainda estar substituido por grupos hidroxilo, amino, alquilamino, alquilo, alcenilo ou alcoo— xilo com 1 a 4 átomos de carbono, polialcooxilo ou ariloxi, ou por um grupo heterocíclico, podendo os últimos substi— tuintes mencionados estarem por seu lado substituidos por um composto heterocíclico ou por uma amina, ou podendo for mar conjuntamente um heterociclo de 0 e/ou S e/ou NH ou N— -alquilo, e

X é um grupo arilo que está directamente ligado ou através de um grupo alquilo ou de um grupo oxialquilo ao átomo de azoto ou de enxofre, o que está ligado ao grupo R^ através de um grupo alquilo ou de um grupo oxialquilo, e que pode também estar mono— ou poli—substituido por grupos alquilo, alcenilo, hidroxilo, amino, alcooxilo ou ariloxi e/ou por heteroátomos, ou é um grupo de um ácido aminocarboxílico alifático, arilalifático ou aromático, nao necessariamente natural, ou é um grupo fenileno quando R^ é um grupo feni— lo, que se encontra mono— ou poli—substituido por alquilo— -(q-Cg).

Por substancias de interesse biológico enten— dem—se principalmente antigenes· Por esta designação abrangem —se por exemplo hormonas, esteroides, medicamentos, metaboli— tos de medicamentos, toxinas, alcaloides e ainda anticorpos·

Como ácidos aminocarboxílicos sao apropriados

- 5 I

po’’ exemplo glicina, alanina, serina, fenílalenina » histidina» ácido C(-aminobutíri co» metionina, valina, norvalina, leucina» ieoleucina, norleucina, ácido aspártico, ácido glut*e mico, áci do 4—aminobenzoico» ácido 4—aminofenilacêtico, ácido 4—amino— fenoxiacêtico e ácido 3—(4amino)fenilpropiónico.

<·* «w aniao nao inconveniente para a quimiluminea

Λ ** cencia pode ser por exemplo um aniao tetrafluoroborato, pei— clorato, halogeneto, alquileulfato, halosulfonato, alquilsul— fonato ou ariieulfonato. Pode também ser usado qualquer outro ** ** Λ aniao desde que nao extinga ou diminua a quirai luminescen cia.

Os grupos heteroalquilo ou os grupos heterocí clicos contém de preferencia heteroátomos que possam contribuir para um aumento da solubilidade em água dos compostos de acordo com a invenÇao, como por exemplo azoto, oxigénio» enxofre» fósforo ou suas combinações. Heterociclos particular— *

mente adequados sao por exemplo morfolina» piperazina, piperi dina, tetrahidrofurano, dioxano, etc.

S«o particularmente significativos os derivados de acridinio de acordo com a reivindicação 1» que se cara cterizam por X ser um grupo de fórmula IV

,8

IC (IV)

P

qual
é um substituinte	de	fórmula -(CH^
n= 0 a 4 e m» 1 a	6,
é um substituinte	na	«V posição orto—,
-7 » çao a Π , de fórmu	la	—(0—(CH ) ) -
	2 m p
preferência com p=	1	a 6 e m= 1 a 6

com m p ju um resíduo de hi— drocarboneto ramificado ou linear com 1 a 4 átomos de car—

ζ\ 11* 9 os substituintes R^z e R sao hidrogénio ou resíduos de hidro carboneto lineares ou ramificados com até 3θ átomos de car bono, podendo também uma ou mais unidades — CH^— estarem substituidas por 0, S, SO, SO,,, NH ou N-alquilo, e dois destes substituintes ligarem—se de modo a formar um anel.

e substituinte ê de significado especial para as possibilidades de aplicaçao dos derivados de acridínio de acordo com a invenção. Através da escolha apropriada deste grupo, o derivado de acridínio adquire uma roactividade

M de tal modo elevada que, mesmo em condiçoes suaves, pode foi— mar uma ligaçao selectiva com um grupo funcional da substancia biológica a identificar. Tais grupos reactivos apropria·» dos sao os apresentados na lista seguinte!

O .B (-) _Y(+)

b) — C — 0 —

_v( + ) _u( + ) * , 1 1 J ( + ) ϊ « Η , metal alcalino

Em muitos casos revelaram-se como apropriados derivados de acridinio de acordo com a invençeo, nos quais P^ é um grupo de fórmula V

(V)

Revelaram—se ainda como particularmente apropriados compostos de acridinio de fórmula VI

na qual

X é um grupo de fórmula VII

-(O)- ^<CH2>„” ^(VII>

com n«= 2 ou 4, β

13 «.

P e R ' , independentemente um do outro, sao hidrogénio, um grupo alquilo, ura grupo alcooxllo com 1 a k átomos de carbono, um grupo (—O—CH —CH ) —OF, em que n significa um número de 0 2 2 n a 8 e R é um grupo morfolinoetilo ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou um grupo N,N—dimetilaminoetilo, ou representam em conjunto um grupo etilenodioxi, e tem os significados mencionados na reivindicação 1. Estes compostos sao produtos facilmente solúveis em água·

De entre cs compostos de formule VII acabados de mencionar, preferem—se mais uma vez em especial aqueles em , ¹² 13 , que X e um grupo p—etilenofenilo, P =H e R e um grupo para

13 —metoxi ou R’ é um grupo orto—metoxi e R ^J é um grupo para—

13 —metoxi, ou R e R representam em conjunto um grupo 3,4— —etilenodioxi, como por exemplo os compostos de fórmula

Outros derivados de acridínio particularmente apropriados sao aqueles que têm a fórmula VIII

(VIII) f I /

R e um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou um grupo fenilo que pode estar substituido por até três grupos alquilo ou alcooxilo com 1 a h átomos de carbono cada, por um grupo —(—O—CH —CH ) —OR, en que n é um número de 0 a 8 e P ê um gru à- ώ Tl * po morfolinoetilo ou N,N—dimetilaminoetilo ou um grupo alquilo com 1 a átomos de carbono, ou por um grupo etilenodioxi, e «w

X tem os significados mencionados nas reivindicações 1 ou 2, ou na qual θ um grupo fenilo que pode estar substituido por até três grupos alquilo com 1 a 4 átomos de carbono cada, e X é um grupo ortc—, meta— ou para-fenileno.

Estes compostos sao também produtos facilmente solúveis em água·

Ê surpreendente que βε amidas de ácido acridí nio—9—carboxílico substituídas por sulfcnilc no azoto amídico apresentem uma notável quimiluminescência> uma vez que se sabe que as amidas de ácido acridínio—9—carboxílico, ao contrário dos ésteres de ácido acridínio—9-carboxí li co* nao apresen tem qualquer quimilumínescência (vide F. McCapra em W. Carru— thers e J. K. Sutherland: Progress in Organic Chemistry> Vol. 8, 231—277» 1973» Butterworth, Londres).

Uma vantagem significativa dos compostos de acridínio de acordo com a invenção, em relaçao aos ésteres fe nilicos de acridínio descritos na patente europeia 82 636, con siste na cinética reaccional da emissão de luz consideravelmente mais rápida (vide P 36 28 573·θ)·

Uma outra vantagem é dada pela estabilidade dos treçadores preparados a partir dos compostos de acordo com a invenção. A figura 1 mostra o resultado de um teste de esta bilidade» no qual se mediu, após armazenamento a temperatura elevada (5°°)» a intensidade dos respectivos sinais de quimi— luminescência. A curva a) refere—se ao traçador preparado a partir do composto fluorosulfonato da amida do ácido N—(4—me— toxi fenil)—N—/5—(2— succinimidoiloxicarboniletil)benzenosulfo— nil7-10—meti la cridinio—9-carboxílico (6)» a curva b) ao traça dor preparado a partir do composto fluorosulfonato da amida do ácido N—(4—metoxifeni1)—N—/5—(4—succinimidciloxicarbonil— butil)benzenosulfonil7—lO-metilacridlnio—9—carboxílico (ll) e a curva c) ao traçador preparado a partir do composto metosul foneto de 4-(2-suecinimidiloxicarboniletil)—fenil—10—metil— acridínio—9-carboxilato (patente europeia 82 636, pág. 10).

Reconhece—se facilmente que os traçadores de acordo com a invenÇac preparados a partir dos compostos a) e

b) sao mais estáveis que os do composto correspondente c).

Obtém—se um resultado análogo num teste idêntico a 4°C. A figura 2 mostra a intensidade doe sinais após

I

ο armazenamento a 4 C. Mais uma vez se verificou que o traçador preparado a partir do composto a) é consideravelmente mais es tável que o preparado a partir do composto c).

Para a preparaçao dos derivados de sulfonamida de acridínio de acordo com a invenção pode partir—se do cio reto do ácido acridina—9—carboxílico (IX). Para preparar este faz—se reagir por exemplo acridina com cianeto de potássio em etanol/ácido acético obtendo—se a 9—cianoacridina, de acordo com o processo de Lehmstedt e Hundertmerk em Ber. 63» 1229 (Ι93θ)· A partir desta prepara—se o ácido acridina 9—carboxí— lico, de preferência de acordo com o processo de Lehmstedt e Wirth em Ber. 6l, 2044 (1928), fazendo—a reagir, apôs recris— talizaçao, com acido sulfurico e nitrito de sodio. Por reacçao do ácido acridina—9-carbox?lico , por exemplo com cloreto de tionilo, obtém—se o composto de fórmula IX.

na qual Y significa cloro. Em vez de um halogéneo pode também introduzir-se no composto IX no lugar de Y um grupo oxicarbo— nilalquilo, oxícarbonilarilo ou imidazolilo.

reagir coro um mula X cloreto de acilo (IX) pode fazer-se então ácido Èuifonamido carboxílico protegido, de fór

H O

I 1'

SO - Ν - X - C - OZ (X) ou de órmula XI ^S°2

X - cooz (XI) nas quais X e R^ têm os significados acima mencionados e Z ê • um grupo protector do grupo carboxilo, que se remove posterior «M . mente. Pode utilizar—se por exemplo para esta reacçao a amida

do ácido N—(4-benzoxicerbonxlfeni1)—N—4—toluenossulfónico. £ vantajoso utilizar o éster butílico cujo grupo protector se pode introduzir e remover em condiçoes particularmente suaves. 0 ácido obtido após remoção de grupo protector faz·—se então reagir com um composto apropriado» por exemplo coa N—hidroxi— succinimida» obtendo—se o grupo R^. Deste modo se obtém o com posto de acridinio quimiluminescente por alquilaçao do azoto na posj çao 10.

Os compostos de acridinio obtidos podem fazer — se então reagir com utna substancia de interesse biologico» por exemplo com um antigene» um anticorpo» uma hormona» um me dicamento* um metabolito medicamentoso» uma toxina ou um alca loide» obtendo—se um composto luwinescente. Neste caso liga— —se o derivado de acridinio à substancia de interesse biológi co» quer directamente» quer por meio de uma molécula ponte” como por exemplo aminoácidos» oligo— ou poli—aminoácidos» pé— ptidos ou polímeros sintéticos» formando—se um conjugado imu— nologicamente activo estável. Este conjugado designa—se também por traçador e utiliza—se nos testes imunológicos lumines centes a seguir descritos. No teste imunológico lumir.escente» de acordo com a invenção» para a determinaçap de uma substancia antigénica numa amostra de líquido» segundo um processo competitivo ou um processo eendwich utiliza—se pelo menos um componente imunologicamente activo» imobilizado sobre uma fase sólida» para além do traçador luwinescente.

Após terminada a reacçao imunológica e depois dos eventuais passos de lavagem necessários» desencadeia—se a w w _Λ emissão luminosa per adiçao sucessiva ou simultânea de um ou mais reagentes» contendo polo menos um reagente um agente oxi dante na forma ligada ou nao ligada^ 0 teste imunológico lumi neecente pode então efectuar—se por vários processos.

Uma maneira possível consiste era incubar o an ticorpo imobilizado» que reage especificamente com o antigene» com unta amostra do líquido a testar e com um conjugado do an—

tigene e de um derivado de acridínio quirai luminescente (anti— gene-t?eçador), separar a amostra e o traçador nao ligado, fa zer reagir o traçador ligado com os reagentes necessários, de ** w modo a provocar uma emissão luminosa, e determinar então a quantidade de «ntigene presente a partir da intensidade de emissão luminosa medida· «w

Uma outra possibilidade para a execução do tes te imunológico luminescente consiste em se incubar um anticor po imobilizado, reagindo especificamente com o antigene, com uma amostra do líquido a analizar, com um conjugado de um segundo anticorpo de reacçao. especifica e de um derivado de acridínio quimiluminescente, se separar a amostra e o conjuga do marcado nao ligado, se fazer reagir o conjugado marcado li gado com os reagentes necessários, de modo a obter—se uma emis sao luminosa e se calcular a quantidade do antigene presente a partir da intensidade de emissão luminosa medida.

Os testes i.nunológicos luminescentes acima men cionados podem também efectuar—se separando, antes da adiçao do conjugndo marcado, o líquido a analisar do anticorpo imobi «A lizado.

Em outros testes imunológicos luminescentes a efectuar de acordo com a invenÇao, nao e o anticorpo que se encontra imobilizado mas sim c antigene. Pode assim incubar— —se um antigene imobilizado, reagindo especificamente com o anticorpo, com uma amostra de líquido a analisar e com uma so «* lução de um conjugado do anticorpo e de um derivado de acridi nio quimiluminescente, separar—se depois a amostra e o conju— w

gado marcado nao ligado e fazer—se por fim reagir o conjugado # *** marcado ligado com os reagentes necessários. Observa—se então uma emissão luminosa, a partir de cuja intensidade se pode de terminar a quantidade do antigene presente.

Uma outra variante consiste em incubar um an— tigene imobilizado, reagindo especificamente com o anticorpo, com uma solução de um conjugado do anticorpo e de um derivado de acridinio quimiluminescente, separar o conjugado marcado nao transformado, adicionar uma amostra do líquido a analisar se separer em seguida novamente a amostre, se fazer reagir o conjugado marcado ligado com os reagentes necessários, obtendo—se uma emissão luminosa, e calcular—se a partir desta a quantidade de antigene presente.

Finalmente, é ainda possível efectuar o ensaio imunologico luminescente, incubando um antigene imobilizado, reagindo especificamente com o anticorpo, com uma solu— çao de um conjugado do anticorpo e de um derivado de acridi— nio quimiluainescente, adicionando uma amostra do líquido a analisar, separando a amostra e o conjugado nao ligado, fazen do reagir o conjugado marcado ligado com os reagentes neces— sarios, e calculando—se então a quantidade de antigene presen te a partir da emissão luminosa medida.

Os exemplos 1 a 7 destinam-se a ilustrar melhor a preparaçao dos compostos de acridinio de acordo com a invenÇno.

Exemplo 1

Amida do ácido N—(4—metoxifenil)—N—/Ç—(2—benziloxicarbonile— til)benzenosulfonil7acridina—9—carboxilico (3)

Misturam-se 17 g de éster benzílico do acido 4’-/R-(4-mctoxifenil)sulfamido7-3-fenilpropiónico (l) em 400 ml de diclorometano com 460 mg de 4—(N,N—dimetilamino)piridi— na e 22,1 ml de trietilamina, adicionam-ee passados 10 minutos 11,2 g de cloridrato do cloreto do ácido acridina—9—carbo xílico (2) e aquece—se durante 6 horas a refluxo. Agita—se li «lf geiramente a solução arrefecida com NaOH2N, lava—se a fase or ganica separada com HO, seca—se sobre sulfato de magnésio e concentra-se. Purifica—se o resíduo por cromatografia em colu na.

Rendimento! 60%; Ponto de fusão! 130—132° C

NMR (DMSO, 100 MHz): 3* 2,7—3»° PP^m (d, largo, 2H) , §= 3,0— -3»3 P?m (d, largo, 2H) , 3,5 ppm (s, largo, 3H) , (5® 5»1 ppm (s,2H), 6,5 ppm (d, largo,2H), $= 7,1 ppm (d,largo,

2H), £$«= 7,35 ppm (e,5H), ¢5= 7,5-8,3 ppm (m,12H)

Bromidrsto de amida do ácido N—(4—metoxifeni1)—N—/5—(2-carboxieti1)benzeno sulfonil^acri dina— 9—carboxílico (4)

Aquecem-se a 60°C durante 2 horas 6,3 g de(j) em 3° ml de HBr n 33% em ácido acético, adiciona—se após arre focimento 60 ml de éter diieopropilico, remove—se o precipita do por filtraçao e seca—se em vacuo.

R«*ndim«ínto í 9°%i Ponto de fusão J decomposição a 237° C NMR (DMSO, 100MHz)í 2,7 ppm (d, largo, 2H) , tf* 3,1 ppm (d, largo,2H) , j ^c 3»5 ppm (s,largo,3H), = 6,5 ppm (d,largo,

2H) , (£ = 7,0-5,4 ppm (m,l?H)

Amida do ácido N—(9—metoxifenil)—N—/5—(2—succinimildoiloxicar bonileti1) benzencsulfonilPacridina—9—carboxílico (5)

Misturam—se 3,1 & de (4) em 5° ml de tetrahi— drofurano com l,4l ml de trietilamina, arrefece—se a —20°C e adicionam—se—lhe O,4?4 ml de éster etílico do ácido clorofór— mico. Agita—se durante 20 minutos, adiciona—se 575 mg de N—hi droxisuccinimida, agita—se durante 3 horas a —20° C e deixa— —se atingir a temperatura ambiente durante a noite, sob agita çao. Remove—se o precipitado por filtraçao, concentra—se o filtrado, toma—se o resíduo em diclorometano ou em acetato de etilo, lava—se a solução obtida com agua, uma solução de NaHCO^ e novamente com água e seca—se sobre MgSO^. Concentra— —se a fase orgânica e recristaliza—se o resíduo de tolueno. Rendimento! $0%

NMR (DMSO, 100 MHz) » 2,8 ppm (s, 4H) , cí = 3»2 ppm (s,largo, 4H), cS « 3,5 ppm (s,Br,3H), = 6,5 ppm (d,largo,2H), • = 7»2 ppm (d, largo , 2H) , = 7,6— 8,4 ppm (m,12H)

IV. 3400 cm^-1 (largo), 3θ6θ, 293°» l8l5(fraco), 1780(fraco),

174ο ( forte ) » l69O(mêdia ) , l600(fraca), 1510(média ) , 137O(mé— dia)» 1250(média), 1203(média), 1175(média).

Fluorosulfonato da amida do ácido N—(4—raetoxifenil)—N—/5—(2— -euccinimidoiloxicarboniletil)benzenosulfonil7-10—metilacridí ni o— 9— cn rboxí1i co(6)

Misturam—se 1»27 S de (5) em 60 ml de dicloro metano, a —20° C, com 0,4 ml de fluorosulfonato de metilo·

Deixa—se sob agitaÇao durante 2 horas a —20 C e descongela— * ** —se durante a noite ate a temperatura ambiente. Por adiçao de tolueno precipita um sólido amarelo que se filtra e seca em vácuo.

Rendimentoi 80%

NMR (DMSO, 100 MHz): 2,9 ppm (s,4h), <5β 3,2 ppm (s,largo,

4H), <£ « 3,5 ppm (s, largo, 3H) , « 4,8 ppm (s, largo, 3H) , <3 « 6,5 ppm (largo,2H), ¢) = 7,2 ppm (largo,2H), $ > 7,6-9,0 ppm (m,12H)

IV= 3400 cm'¹ (largo), 3160, 2970, l8l0(fraca), 1785( fraca), 1740(forte), l695(média), l600(fraca), 1555( fraca), 1510(mé— dia), 137O(média), 1290(média), 1250(média), 1210(média),

II7O(média)

Espectro de massas: m/Z: 652 M (Catiao)

Exemplo 2

A preparaçao do fluorosulfonato da amida do ácido N-(4—metoxifenil)-N-/5—succinimidoiloxicarbonilbutil)— benzenosulfonil?—10—metilacridínio—9—carboxílico (ll) a partir do éster benzilico do ácido 4·— /5í—(4—me toxi fenil) sulf amido 7—5—fenilvalérico (7) β de cloridrato do cloreto do ácido acridina—9—carboxílico (2) efectua—se de maneira análoga á da síntese de (6). Os rendimentos de cada um dos passos da slnte se bem como a caracterizaÇao espectroscópica indicam—se a seguir.

Amida do ácido N—(4—metoxifenil)—N—/5—(4—benziloxicarbonilbu—

til)benzenosulfonil7acridina—9—carboxílico (8)

Rendimento: 40%; óleo viscoso que solidifica parcialraente NMR (CDCl^, 100 MHz): 2,85 (m,4H), Ô= 2,45 ppm (t,largo,

2H) , £ = 2,8 ppm (t,largo ,2H) , $ χ 3,5 ppm (s,3H), <$ = 5,15 ppm (e,2H), c5 * 6,3 ppm (d,2H), = 6,9 ppm (d,2H), » 7»3-3,3 ppm (m,17H).

Bromidrato da amida do acido N—(4—metoxifenil)—Ν—/7k—(4—carboxibuti1)benzenosulfonil7acridina—9—carboxilico (9)

Rendimento: 95%, Ponto de fusão: decomposição a 153—5 C NMP (DMSO, 100 MHz): = 1,7 Ppm (β,largo,4H), çj« 2,3 ppm (t, largo , 2H) , <$ β 2,8 ppm ( s, largo , 2H) , $ « 3,5 ppm (e, largo,

3H) , Ó 6,5 ppm (largo,2H), 7»θ5 PP® (largo, 2H) , é « 7,5—8,5 ppm (m,12H).

Amida do ácido N—(4-metoxifenil)—N—/5—(4—succinimidoiloxicai— borilbutil )benzenosulfonil7acridina—9-cerboxilico (10)

I

Rendimento: 25%i Ponto de fusão! decomposição a 75—C NMR (DMSO, 100 MHz)} - 1,8 ppm (largo,4H), £« 2,3 ppm (s, 2H), ó = 2,85 ppm (s,largo,6H), 3,5 ppm ( s, largo, 3H) , » 6,5 ppm (d, largo ,2H) , <5« 7 »05 PP» (d, largo ,2H) , cf« 7,5— —8,3 ppm (m,12H)

Fluoroeulfonato da amida do ácido N-(4—metoxifenil)—N—/5—(4—

-succinimidoiloxicarbonilbutil)benzenosulfonil7-10-metilacri— dínio—9—carboxílico (ll)

Rendimento: 9θ%

NMR (DMSO, 100 MHz)} 1,3 Ppm (largo,4H), £x 2,3 ppm (s, largo,2H),J» 2,8 ppm ( s, largo , 6H) , 3,5 ppm ( β, largo , 3H) ,

4,8 ppm ( largo , 3H) > <$ » 6,5 ppm ( largo , 2H) , of = 7»θ5 ppm (largo,2H),J « 7,5-9,0 ppm (m,12H) . IV: 334o cm’¹ (largo), 3θ6θ(fraca), 293O(média), 2870( fraca), . l8l0(fraca), 1785(fraca), 1740(forte), l695(média), l600(fra18 I

ca), 1550( fraca ), 1510(média), l46O(fraca), 137O(média), 129θ (forte), I25O(forte), 1205(forte), 1170(forte)

Espectro de massa! m/z= 680 M (Catiao)

Exemplo 3

A preparaçao do fluorosulfonato da amida do áeido N—(2,4—dimetoxifenil) —N—/4—(2—succiniroidoiloxicarbonil— etil)benzenosulfonil7—10—metilacridinio—9—carboxílico (l6a) a partir do éster benzllico do ácido 4·-/n—(2,4-dimetoxifenil)sulfamido7-3—fenilpropriónico (12a) e do cloridrato do cloreto do ácido acridina—9—carboxílico (2), efectua-se de modo análogo ao da síntese de (6), Os rendimentos de cada um dos passos da síntese beir como a caracterizaçao espectroscópica indicam—se em seguida·

Amida do ácido N—(2,4—dimetoxifenil)—N—/í—(2—benziloxicarbo— niletil)—benzenosulfonil7«cridina—9-carboxllico (13a)

Rendimento! 5θ%ί Ponto de fusão: 74° C

NMP (DMS , 100 MHz): cí« 2,9 ppm ( d, largo , 2H) , aí» 3,1 ppm (d, largo ,2H), 3,3 ppm (a,3H), cie 3,4 ppm (s,3H), (§« 5,1 ppm (s,2H), a 5,9- 6,2 ppm (m,2H), cí = 7,0 ppm (d,lH),(ú a 7,35 ppm (β, 5H) , cia 7,5-8,2 ppm (m,12H)

Bromidrato da amida do ácido N—(2,4—dimetoxifenil)—N—(2—car— boxietil)benzenosulfonil7—acridina—9—carboxílico (l4a)

Rendimento! 95%

NMR (DMSO, 100 MHz): J « 2,75 ppm (d, largo, 2H) , cí« 3,05 ppm (d, largo ,2H), 3,3 PP·» (a,3H), ç$a 3,5 ppm (s,3H), cí« 5,95-6,3 ppm (m,2H), ç) a 7,05 ppm (d,lH), cia 7,6-8,6 ppm (m,12H), ώ» 9,2 ppm (s, largo , 2H) .

Amida do ácido N—(2,4—dimetoxifenil)—N—/4—(succinimidoiloxi— • carboniletil)benzenosulfonil7acridina—9-carboxílico (15a)

Rendimento 45%> Ponto de fusão: decomposição β “ 105 C

NMR (DMSO, 100 MHz): J = 2,9 ppra (s,4H), <5= 3 ppm (largo,2H) ,

3,2 ppm (s,3H), Ja 3,4 ppm (s,3H),J » 5,9-6,3 ppm (m,2H), <ja 7,0 ppm (d,lH), Ja 7,5-8,4 ppm (m,12H)

IV (pastilha de KBr): 3440 cm (largo), 3θ^0 (fraca), 293θ (fraco), 2850(fraco), l8l5(fraco), 1785(fraco), 174o(forte), lÓ95(médio), l600(fraco), 1510(médio), l460(fraco), l44o(fra— co), 1365(médio), 1320(fraco), 1290(fraco), 1240(mêdio), 1210(forte), ll65(médio), 1085(médio).

FIuorosulfonato da amida do ácido N—(2,4—dimetoxifenil)—N—/í— -(2—succinimidoiloxi carbonileti1)benzeno sulfonií7-10—metil— acridinio—9-carboxilico (l6a)

Rendimento: 80%} Ponto de fusão: decomposição a - 135 £

NMR (DMSO, 100 MHz): J = 2,9 ppm (s,4H), J- 2,95-4,2 ppm (m 10H) , J« 4,8-5,0 ppm (sfS,3H), <é« 6,05—6,25 ppm (m,lH),

J » 7,6-9,0 ppm (m,l4H)

IV (pastilha de KBr)í 343θ cm ^(médio), 2950(fraco), 287O(fra co), 2825(fraco), l8l0(fraco), 178o(médio), l?50(forte), l695(médlo), l6l0(raédio), 1555(fraco), 1510(médio), l465(mé— dio), 1380(raédio)> 128?(médio), 1250(médio), 1210(forte),

117D(mádio)

Exemplo 4

A sintese do íluorosulfonato da amida do ácido N—(3,4—etilenodioxi fenil)—N—/4—(2—succinimidoiloxicarbonil— etil)benzenosulíonil/—10—metilacridínio—9—carooxilico (l6b) a partir do éster benzilico do ácido 4’—/í5—(3»4—etilenodioxife— nil)sulfamido7—3—fenilpropriónico (12b) e do cioridrato do cloreto do ácido acridina—9—carboxilico (2), efectua-se de ma neira análoga á do exemplo 1. Os rendimentos de cada um dos passos da sintese bem como a caracterizaçao espectroscópica indicam—se em seguida.

Amida do ácido N—(3,4—etilenodioxifeni1)—N—/5—(2—benziloxicar boniletil )benzenosulfonil7acridina—9-carboxilico (13b)

Rendimento: 5θ%» Ponto de fueao: 91,5° C

NMR (DMSO, 100 MHz)» çj = 2,9 ppm (d, largo , 2H) , 3,1 ppm (d,largo ,2H) , ύ « 4, 0 ppm (s,Br,4H), 5,1 ppm (s,2H), 6,3-6,8 ppm (m,3H), e$ = 7,3 ppm (s,5H), oí» 7,6-8,3 ppm (m,12H).

Bromidreto da amida do ácido N—(3,4—etilenodioxifenil)—N—/5— — (2—carboniloxietil)Lenzenosulfoni Í7-9-carboxílico (l4b )

Rendimento: 95%, Ponto de fueao: >200° C

NMR (DMSC, 100 MHz): qS « 2«7 ppm (m,2H), χ 3,05 ppm (m,2H), <5 « 4,0 ppm (s,largo,4H), <§· 6,3 - 6,8 ppm (m,3H),^ χ 7,5-3,6 ppm (m,12H), á» 9,6 ppm (s,largo,2H).

Amida do ácido N—(3,4—etilenodioxifenil)—Ν— /K—(succinimidoil— oxicarbonileti1 )benzenosulfonil7acridÍT:a—9-carboxí lico ( 15b)

Rendimento: 459»» Ponto de fueao: decomposição a l40° C NMR (DMSO, 100 MHz): 2,7-2,9 ppm (d,s,sobrepoetos, 6H),

Jx 3,0 ppm (d,2H), 4,0 ppm (s, largo, 4H) , qJ = 6,3-6,8 ppm (m,3H), 7,5-3,4 ppm (m,12H)

IV (pastilha de KBr): 3420 cm (lar_co), 3θ6θ(médio), 2980 (médio), 2930(médio), l8l0(fraco), 1790(fraco), 1740(mêdio), 1695( forte), 1590(médio), l460(fraco), 1430( fraco), l4l0(fra— co) 1370(médio), 1300(médio), 1225(forte), 1175( forte).

Fluorosulfonato da amida do ácido N—(3,4—etilenodioxifenil)— —N—/5—(succinimidoiloxicarboniletil)benzenosulfonil/—10—metil— acridínio—9-carboxilico (l6b)·

Rendimento: 80%} Ponto de fueao: decomposição a - o J Λ V/

NMR (DMSO, 100 MHz): ¢)- 2,85 ppm (s,4h),^« 3,0-3,3 ppm { s,s,largo ,4H) , - 3,8-4,5 ppm (m, largo,4H) , o 4,75-5,1 ppm (s, largo com ombros, 3H), ^s 6,3-9,0 ppm (m,15H).

Exemplo 5

Amida do ácido N—(4—carboxifenil)—4—toluenosulfónico

Α uma mistura de 252 g (3 mol) de hidrogeno— carbonato de sódio e 139*1 g (1 mol) de ácido 4—aminobenzoico em 2,5 1 de água* adiciona—se gota a gota* a 20—30°C, uma mis tura de 190,5 g (1 mol) de 4—toluenosulfocloreto em 3θθ ml de éter Isopropílico. Agita—se vigcrosaraente durante 2—4 horas ate o sulfoc.í oreto se consumir. Λ solução aquosa separada a jus ta—se a pH 1 com ácido clorídrico concentrado e toma—se o pre cipitado em acetato de propilo. Lava-se o extracto duas vezes com ácido clorídrico 2N, uma vez com água, seca—se sobre sulfato de sódio e evapora—se. Obtêm—se 24o g (82,5% do rendimen to teórico) de amida do ácido N—(4—carboxifenil)—4—toluenosul f ón i co.

^IJti-NMP. (DMSO d₆): 2,3 (si CH^)} 7,1 (d, Aromático, 2H)

7*3 (d, Aromático, 2H) } 7,6-7,9 (m, Aromático, 4H)i 10,75 (largo)i 12,7 (largo).

Amida do ácido N—(4—benzlloxicarbonilfenil)—4—toluenoeulfónico

Aquece—se durante 4 horas a 140 C uma solução de 11,64 g (40 mmol) de amida do ácido N-(4—carboxifenil)— —4—toluenoeulfónico, 5*θ6 g (40 mmol) de cloreto de benzilo,

5,20 g (44 mmol) de diisopropiletilamina em ICO ml de dimetil formamida. Terminada a reacçao evapora-se a mistura em vacuo, toma—se o resíduo em acetato de propilo, lava—se duas vezes com acido clorídrico 2N, duas vezes com uma solução saturada de NaHCO^, seca—se sobre sulfato de sódio e evapora—se. Obtêm —se 11,8 g (78% do rendimento teórico) de amida do ácido N— —(4—benziloxicarbonilfenil)—4—toluenoeulfónico, que se recris taliza de metanol.

¹H- NMP (DMSO d₆): = 2,3 (s; CH^ ) i 5,3 (s, CH^ i 7,1-7,3 (dd, 4H aromáticos)’, 7,4 (s, C^H^j 7,7-7,9 (dd, 4H aromáticos)} 10,8 (largo, NH).

Amida do ácido N—(4—benziloxicarbonilfenil)—N—(4—toluenosul— fonll)acridina—9—carboxílico λ solução de 1,5 S nmol) de amida do ácido K— (4— bertzi loxicarbonilfenί 1 )—4— toluenosulfónico , 1,23 g (4,4 mmol) de cloridrato do cloreto do ácido acridlnico e 0,02 g de dimetilaminopiridina em 20 ml de tetrahidrofurano anidro, adiciona—se gota a gota, a 25°C, 2,1 ml (15 mmol) de trietilamina em 10 ml de tetrahidrofurano. Deixa—se subir a temperatura até 60° C.

Terminada a reacçao agita—se o produto impuro (a recristali— zar) com metanol, filtra—se e recristaliza—se de acetato de etilo.

Rendimento! 1,57 (67,0% do rendimento teórico) ¹H-NMR (CDClg): 2,5 (s, CH^); 5,2 (s, ch₂); 7,3 (e, c₆h₅)

7,0-8,2 (m, 1ÓH aromáticos).

Bromidrato da amida do ácido N—(4—carboxifenil)—N—(4—toluenosulfonil )acridina—9-carboxílico.

Àq uecem-se a 60° C durante 4 horas, sob agita çao, 1,17 g (2 mmol) de amida do ácido N—(4—benziloxicarbonil feni 1)—N— ( 4— to luenosulfon.il ) a cri dina— 9- carboxi lico juntamente com 10 ml de uma solução de brometo de hidrogénio a 32% em ácido acético glacial. Após arrefecimento filtra—se o precipi tado e seca—se em vácuo.

Rendimento: 1,00 g (87% do teórico)

NMR (TFÀ): çj» 2,6 (e, CHg)i 7,3-8,6 (m, l6H aromáticos); 11,65 (s, NH)i espectro de massa: 496 (M⁺).

Amida do ácido N—(4-succinimideiloxicarbonilfenil)—N—(4—tolue nosulfonil)acridina—9—carboxilico

A uma solução de 0,57 g (l mmol) de bromidrato da amida do ácido N— (4— carboxifenil )—N— (4— toluenosulfonil ) acridina-9—carboxilico e 0,21 g (2 mmol) de trietilamina em 25 ml de tetrahidrofurano anidro, adiciona—se, sob agitaÇso a —15°C, 0,11 g (1 mmol) de éster etílico do ácido clorofórmio. Agita—se durante 1 hora á mesma temperatura e adiciona—se de—

pois 0,12 g (l ramol) de N-hidroxisuccinimida. Após mais 1 hora deixa—se a mistura em repouso à temperatura ambiente duran te 15 horas. Evapora—se em vácuo,·toma—se o resíduo em aceta— to de etilo, lava—se com agua, com uma solução de hidrogeno— carbonaio de sódio e novamente cocí água e seca—se sobre sulf a to de sódio. Após evaporaçao obtêm—se 0,42 g (70,8% do rendimento teórico) do produto pretendido.

¹H-NMP (TFA): 2,6 (s, ) , 3,1 (s, CH^CH^, 7,0-8,6 (m, l6H aromático).

Fluorosulfonato da amida do ácido N—(4—succinimidoiloxicarbo— nilfenil)—N—(4—toluenosulfonil)—10-metilacridinio—9—carboxílico

A uma eoluçao de 0,59 g (l mmol) de amida do ácido Ν— í4-succinimidoiloxicarbonilfeni1)-N-(4-to1 uenosulfo— nil)acridina—9—carboxílico em 3θ ml d® 1,2—dicloroetano adiciona-se, sob agitaçao a 25°C, 0,85 g (7,5 mmol) de éster me— tílico do ácido fluorosulfónico. 0 produto da reacçao precipi ta no decorrer de 4 horas. Após filtraçao e secagem obtêm—de 0,43 g (60,8% dc rendimento teórico) do produto pretendido.

¹Η-ΝΜΠ (TFA)j J - 2,6 (s, Ar-CH^j 3,1 (s, CHg-CHg); 4,9 (β, N—CH^); 7,3-3,8 (m, l6H aromáticos).

Exemplo 6

De modo análogo ao do exemplo 5 prepara—se, a partir de amida do ácido N—(4—carboximetilfenil)—4—toluenosul fónico, o fluorosulfonato da amida do ácido N—(4—succinimido— iloxi carbonilmetilfeni1)—N—(4—toluenosulfonil)—10—metilacridi nio—9-carboxílico.

Amida do ácido N—(4—carboximetilfenil)—4-toluenosulfónico ¹H-NMP (DMSO)i 2,3 (s, ) J 3,5 (s, CH₂)} 7,0 (AB, )

7,3-7,6 (AB; c^); 10,2 (s, NH).

Amida do ácido N—(4—benziloxicarbonilmetilfenil)—4—toluenosul

fónico.

Rendimento: 35% do tecrico ¹H-NMR (DMSO): 2,3 (e, CH^ ) ; 3,6 (s, COCH^; 5,1 (5,

OCH^)} 6,9-7,7 (m, 13ri aromáticos); 10,2 (s, NH).

Amida do ácido N—(4—benziloxicarbonilmetilfenil)—N—(4—tolue— nosulfonil)—acridina—9—carboxili co Rendimento: 35% <1° teórico ¹H-NMR (CDCH^): J - 2,55 («, CH^); 3,3 (s, COCH^; 5,0 (e,

0—CH ), 6,7-8,2 (ra, 21H aromáticos).

Bromidrato da amida do ácido N—(4—carboximetilfenil)-N—(4—to— luenosulfonil)acridina—9—carboxilico Rendimento: 95% do teórico ¹H—NMR (TFA): çf« 2,65 (s, CH ); 3,55 (s,CH„); 6,8-8,6 (m, l6H aromáticos)

Amida do ácido N—(4—succinimidoiloxicarbonilmetilfenil)—N—(4— —toluenosulfoni1)acridina—9-carboxilico Rendimento: 71% do teórico ¹H—NMR (TFA): qJ « 2,65 (s, CH do tolueno); 3,0 (s, CH -CH ); 3,6 (largo, C0CH₂); 6,9-8,5 (m, aromático)

Fluorosulfonato da amida do ácido N—(4—succinimidoiloxicarbo— nilmetilfenil)—N— (4— to luenosulfonil)—10— metilacridínio— 9— car— boxilico

Rendimento: 80% do teórico ^H-NMR (TFA): Λ» 2,6 (s, CH do tolueno); 2,9 (e, CH —CH ); 3,6 (largo, COCHg); 4,9 (β, N—CH^); 6,8-8,9 (m, aromático)

Exemplo 7

De modo análogo ao do exemplo 5 prepara—ae, a partir da amida do ácido N—/5—(2—carboxietil)fenil7—4—to— luenoeulfónico, o fluorosulfonato da amida do ácido N-/5—(2succinimidoiloxicarboniletil)fenil7—N—(4—toluenosulfonil)—10—meti1acridínio—9-carboxilico.

Amida do ácido N—/5—(2—carboxieti1)fenil/—4—tnluenosulfónico Rendimento: 44% do teórico ¹H-NMR (DHSO): - 2,3 (e, CH^) j 2,4-2,8 (m, CH^CHg);

7,o (AB, 4h); 7,2-7,8 (AB, 4h); ίο,i (s, nh).

Amida do ácido N—/5—(2—benziloxicarboniletil)fenil/—4—tolue— noeulfón i co

Rendimento. 7θ% 8o teórico ' St-NMR (CDCl^)j GÍ» 2,35 (s, CH^) j 2,4-3,0 (ra, CH₂-CH₂),

5,1 (s, O-CH )j 7,0-7,8 (13H aromáticos, NH)

Amida do ácido N—/5—(2—benziloxicarboniletil)fenil7—N—(4—to— luenosulfoni1)acridina-9—carboxílico Rendimento: 77% do teórico ¹H-NMR (CDC1 ): ¢)« 2,2-2,8 (m, 7H)j 5,0 (e, CH )j 6,65-7,0 fe (AB, 4H aromáticos); 7,3-8,3 (®, 17H aromáticos) broraidraco da amida do ácido N—/?—(2—carboxietil)fenil7—N—(4— -toluenosulfoni1)acridina—9-carboxílico Rendimento: 65% do teórico ^H—NMR (CD OD): qJ« 2,1-2,8 (m, CH -CH ); 2,5 (s, CH );

> fe fe 3

6,7-8,5 (16H aromáticos)

Amida do ácido N-/5—(2—succinimidoiloxicarboniletil)fenil7—N—(4—toluenosulfoni1)acridina—9—carboxílico Rendimento: 9θ% do teórico ¹H-NMR (CDCI3): 2,6 (s, CH^); 2,7 (largo, CH^CH^i

2,8 (s, CH₂-CH₂>í 6,6-8,3 (lóH aromáticos)

Fluorosulfonato da amida do ácido N—/5—(2—auccinimidoiloxicar boniletil)fenil7—N—(4—toluenosulfoni1)—10—metilacridinio—9— —carboxílico

Rendimento: 84% do teórico ¹H-NMR (TFÁ): » 2,6 (s, CH^); 2,3-3,3 (base larga, 11H;

e, 3,1)» 4,9 (β, N—CH^)j 6,7-8,8 (16H aromáticos)

Exemplo 7a

De modo análogo ao dos exemplos anteriores, prepara—se o di—fluoroeulfonato da diamida do ácido N—/4—(N— —met i lmorfolj.no-N— 2— etoxi ) fenil/—N—/5— ( 2—succinimidoilcarbo— xietil)fenilsulfonil/—10—metilacridínio—9—carboxilico. Os pas sos processuais diferentes encontram-se descritos nos passos reaccionais seguintes.

Éster ter—butílico do ácido (4—clorosulfonil)—2—fenilpropiôni co

Misturam—se 25 g (0,1 mol) de ácido (4—cloro— sulfonil)—2—fenilpropiónico, 12 ml de ter—butano1, 60 ml de isobuteno e 3 «1 de ácido sulfúrico concentrado, a —15°C, e agitam—se intenaivarrente numa autoclave â temperatura ambiente durante 24 horas. A mistura reaccional, de novo arrefecida

O ** a — 3 5 C, agita—se num excesso de solução de hidrogenocarbona— to de sódio, extrai—se com cloreto de metileno e evapora—se por fim em vácuo.

Rendimentoi 20,4 g (67% do teórico). 0 produto recristaliza— —se de hexano ¹H-NMR (CDCl^í <£ « 1,4 (forte)} 2,6 (médio)} 3,0 (t)} 7,4 (médio)} 7,95 (médio).

MS: — « 305 (M⁺H)

O ácido (4—clorosulfonil)—2—fenilpropiónico preparou—se, de modo conhecido, a partir de ácido 2-fenilpro— piónico e de ácido clorosulfónico.

4—(morfolino—N—2—etoxi)anili«a

Aquecem—se a refluxo, durante 4 horas, 25 g (0,1 mol) de 4—(morfolino—N—2—etoxi )nitrobenzeno com 75 g de zinco granulado em 400 ml de ácido clorídrico a 50%. Apôs arrefecimento delta—se a mistura reaccional em 400 ml de ácido clorídrico a 33%» extrai—se com éter isopropilíco e evapora— —se a fase orgânica após secagem.

¹H-NMP (CDCI3): 2,5 (t)i 2,7 (3»5 (largo)} 3,7 (t)}

4,0 (t)} 6,6 (médio)

Espectro de mass«: — = 222 (M+)

Obtêm—se o mesmo produto por hidrogenaÇeo do composto nitrido em metanol sobre paladio em carvao animal· O composto nitrado preparou—se de acordo com o Buli. Soc. Chim. France, 1955» 1353—62.

N—/4—(morfolino—N—2—etoxi ) fenil?—N—/4— (2—ter—butoxicamonil— etil)fenilsulfonaraida?

Prepara-se uma solução límpida de 9»3 S (30 mmol) de éster ter-butílico do ácido 4—clorosulfonilfenilpro— piónico, 6,9 g de 4—(morfolino—N—2—etoxilalanina e 0,3 g de dimetilaminopiridina em 150 ml de cloreto de metileno, deixa— -se repousar durante 3.0 horas á temperatura ambiente, lava—se com uma solução saturnda de hidrogenocarbonato de sodio, concentra—se a 1/3 do volume e cromatografa-se numa coluna de si lico gel com uma mistura de 90% de cloreto de metileno e 10% de metanol. Evapora-se a fracçao principal do eluído.

Rendimento! 9 g (6l,2% do teórico) ¹H-NMR (CDCl^)í qÍ= 1,35 (forte)j 2,5 (médio) 2,7-3,0 (mêdio)i 3,7(m-edio)i 4,0 (t)i 6,6-7,0 (médio)> 7,2-7,7 (médio)

Espectro de massa «= 491 (M⁺H).

Amida do ácido N—/4—(morfolino—N—2—etoxi)fenil?—N—/4—(2—ter— -butoxicarboniletil)fenilsulfonil7—9—acridina carboxílico

Mistura—se uma solução de 2,0 g (4,1 mmol) do N— /4 —morfolino-N—2—etoxi)feni l/—N—/4—(2—ter—butoxicarbonil— etil)fenilsulfonamida? em 50 rol de cloreto de metileno, sob a.itaçno vigorosa, sucessivamente com 50 ml de hidróxido de sódio a 33%, 30 mg de dimetilaminopiridina, 1,2 g de cloreto de tetrabufcilamino e 1,55 g (5,6 mmol) de cloridato de cloreto do ácido 9—ecridinacarboxílico. Após 6 horas separa—se a fase orgânica, lava—se com água, seca—se sobre sulfato de sódio e evapora—se.

Rendimento! 2,8 g (9®% do teórico)

¹H-NMR (CDCl^)í J = 1,4 (forte)} 2,3-2,5 (médio)} 2,5-2,8 (mê dio)} 3»θ—3*3 (t)} 3*6-3,9 (médio)} 6,3 (d)} 7*4—8,3 (médio)· Espectro de mass*! « 695 (M⁺)

Amid<? do écido N— /4— (morfolino— tf— 2— etoxi )fenil?— N— /4— (2— carbo xieti1)feni1sulfoni1?—9—acridinacarboxílico

Dissolvem—se 0,7 g (l mmol) de amida do écido N—/?—(morfolino—2—etoxi)fenil?—N—/4—(2—ter—butoxicarbonileti1) fenilsulfonil?—9—acridinacarboxilico em 5 ml de ácido trifluo— roacético e deixa—se em repouso durante a noite à temperatura ambiente. Evapora—se com trompa de água, dissolve—se o resl— duo em agua e leva-se a solução apos filtraÇao a pH4 com acetato de sódio. Extrai—se o produto precipitado com cloreto de metileno, seca—se sobre sulfato de eódio e evaporo—se.

Rendimentoi 0,6 g (94% do teórico)

H—NMR (DMSO); » 2,6—3*0 (médio)} 3*D—3*3 (médio)} 3*6—4,0 (m—edio)} 4,0-4,4 (médio)} 5*6—6,6 (médio)} 6,8—7*0 (m-edio)} 7*3—8,4 (médio).

Espectro de massa: ~ 639 (W⁺)

Amida do ácido N— (morfolino—N—2—etoxi)fenil?—N—/4—(2—succi nimidoi1carboxíetil)fenilsulfonil?—9—acridinacarboxílico Rendimento: 95% do teórico ¹H-NMR (CDCl^): = 2,3-2,7 (médio)} 2,8 (forte)} 2,9-3*4 (médio)} 3*5—3*9 (médio)} 3*9-4,3 (médio)} 6,2-7*0 (médio)} 7*3—8,3 (médio).

Espectro de massa: 736 (M⁺)

Difluoroeulfonato da diamina do ácido N—/4—(N—metilmorfolino— —N—2—etoxi)fenil?—N—/4—(2—succinimidoilcarboxieti1)—fenilsul— fonil?—10—meti lacridina—9—carboxílico

Rendimento: 84% do teórico.

composto, de cor amarela, ê claramente solúvel em água. ^H-NMR (DMSO): 2,85 (forte)} 3*1 (forte)} 3*2—4,4 (médio)}

4,75 (forte)} 6,4-8,3 (médio)

Exemplo 8

Preparaçao do traçador para o ensaio imunologico quimilumines cente TSH

Incubara-se durante 15 minutos 91 pl de anticorpo (100 pg), 20 P¹ do derivade de acridínio preparado de acordo com o exemplo 1 (composto (6)) (1 mg/ml em acetonitrilo) e 600 pl de tampao de conjugação (fosfato 0,01 M, pH 8,0). Em seguida, adicionam—se 200 pl de lisina (10 mg/ml em tampao

4» .

de conjugação) e incuba—se durante mais 15 minutos. Coloca—se esta mistura numa coluna PD 10 (Sephadex' * , G 25 média (gel Dextran hidratado, em esferas)), da firma Pharraaciaj Suécia), e elui—se com fosfato 0,1 M a pH 6,3 como fase móvel. Recolhem —se 10 gotas por fracçao. Testa—se cada uma dos fracções, apos

4H diluição conveniente, ara relaçao a sua actividade de quimilu— raineectncia (350 J*1) de oxidente i · Ii^O^ a 0,1% em NaOH 0,lN). Reúnem—se as fracções de traçador (l^Q pico de actividade)ear mazenem—se a 4°C. 0 traçador pronto a utilizar para o ensaio imunológico quimiluminescente h—TSII prepara—se por diluição adequada com um tampao de fosfato (fosfato 0,1 M, pH 6,3, 1% de Tween 20 (monolaureato de polietilenosorbitano, por exem pio da firma ICI American Inc., USA), 0,1% da albumina de soro bovino, 0,1 M NaCl, 0,01% de NaN^)·

Exemplo 9

Execução do teste imunologico quimiluminescente h TSH

Agitam—se 50 p- de padrao/araostra e 200 ul de traçador, durante 2 horae à temperatura ambiente, em tubos con tendo anticorpos anti—TSH.-Leva—se depois 3 vezes com 1 ml de tampao e com agua destilada. A emissão luminosa ocorre apos adiçao de 300 pl de reagente de activaçao (tampao de pH 1, 0,5% de Η,,Ο^) e de 300 pl de reagente de iniciaçao (0,2N NaOH) por meio de dois tubos de carga no lurainómetro para os tubos. 0 tempo de medição e de cerca de 1 segundo.

A figura 3 mostra o decurso típico de uma cur va padrao num teste imuno—quimiluminométrico (ICMA) para a bor mona estimulante da tiroideia humana (h—TSH).

Claims

Processo para a preparaçao de derivados de acridlnio quimiluminescentes, de fórmula I r»a qual

R^ é hidrogénio, um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo com 1 a 10 átomos de carbono, um grupo benzilo ou arilo,

R e R^J sao hidrogénio, um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, utn grupo amino substituido ou nao substituido, um grupo carboxilo, alcooxilo, ciano, nitro ou um átomo de halo— géneo ,

R representa um grupo de fórmula II ou III (II) 'S0₂-X-RX-R(III)

5 , em que R e um grupo reactivo que pode formar, em condições

A apropriadas, uma ligaçao selectiva em substancias de interesse biológico, com os grupos amino, carboxilo, tio ou outros grupos funcionais;

R ê hidrogénio, um grupo alquilo, alcenilo ou alcooxilo com

Sis aSSSSZTs'

1 a 10 átomos de carbono» um grupo amino substituido» um grupo benzilo» um grupo arilo» um grupo heteroalquilo ou um grupo heterocíclico, que pode ainda estar mono— ou poli—substituído por hidroxilo, amino, alquilamino, alquilo, alcenilo ou alcooxilo com 1 a 4 átomos de carbono, polialcooxilo, ariloxi ou por um grupo heterocíclico, podendo os últimos substituintes mencionados estar por seu lado substituidos por um compos to heterocíclico ou por uma amina» ou podendo formar conjunta mente um heterociclo de 0 e/ou S e/ou NH ou N—alquilo) e X á um grupo arilo que está directamente ligado ou através de um grupo alquilo ou de ura grupo oxialquilo ao átomo de azo to ou de enxofre» e que está ligado ao grupo R^ através de um grupo oxialquilo» e que pode também estar mono- ou poli—substi tuido por grupos alquilo» alcenilo, hidroxilo, amino, alcooxi lo ou ariloxi e/ou por heteroátomos, ou é um grupo de um ácido aminocarboxilico alifático» arilali fatico ou aromatico, nao necessariamente natural, um é um grupo fenilo quando R^ é um grupo fenilo, que se encontra mono— ou poli—substituido por alquilo(C^—Οθ), caracterizado por se fazer reagir um composto de fórmula IX (IX) com uma sulfonamida de ácido carboxílico protegida, de fórmula X

H 0

6 I II

P - SO -N-X-C-OZ (X) ou de fórmula XI

H

6 1

R - N - S0₂ - X - COOZ (XI) em que Y é halogéneo ou um grupo oxicarbonilalquilo, oxicarbo nilarilo ou imidazolilo, X e R possuem os significados ante— riormente mencionados e Z é um grupo protector do grupo carbo xilo a remover posteriormente, e se transformar o ácido assim obtido no derivado de acridina desejado contendo o grupo R^ , que pode ainda transformar—se no aai de amónio quaternário no átomo de azoto do esqueleto de acridina.
2^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X ser um grupo de fórmula IV (IV) ou —((CH ) —O) — com n» 0 a 4 e ni= 1 a 6, 2 m n ,⁸ a R' _{v 9} *» **

R e ura substituinte na posição orto, meta ou pare em relaÇao ,7 de fórmula — (CH ) -, -(O-(CH_) -) ou -((CH ) -0)

2 p 2 na p 2mp com p= 1 a 6 e m» 1 a 6, ou uma cadeia de hidrocarboneto ramifica da ou linear com 3 a 4 átomos de carbono,

9 11e os substituintes R a R sao hidrogénio, cadeias de hidro— carboneto lineares ou ramificadas com até 30 átomos de carbono, podendo uma ou mais unidades —CH₂— estarem também substituídas por O, S, SO, SO , NH ou N—alquilo e podendo dois des— tes substituintes estar ligados entre si formando um anel.

- 3^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou

2, caracterizado por R^? eer um grupo de fórmula V

II

- C

- 4® (V)

Processo de acordo com uma ou mais das reivin dicaçoea anteriores, caracterizado por se obter um composto de fórmula VI \

(VI) //

S0„ - X-C - 0 - N y-J na qual X é um grupo de fórmula VII

-<Q (VII) com n«= 2 ou 4, e

12 13

P e R , independentemente um do outro, significam hidrogénio, um grupo alquilo, um grupo alcooxilo com 1 a 4 átomos de carbono, um grupo (—O—CH —CH ) —OP— em que N= 0 a 8 e R é um grupo morfolinoetilo ou um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou um grupo N,N—dimetilaminoetilo, ou representam em conjunto um grupo etilenodioxi, e /0 tem o significado men— «V cionado na reivindicação 1.

- 5^â Processo de acordo com a reivindicação 4» ca— 12 13 recterizado por X ser um grupo ρ—etilenofenilo » R =H e R

12 13 ser um grupo p—metoxi * ou R ser um grupo orto—metoxi e R ^J

12 13 um grupo p—metoxi» ou R e R serem em conjunto um grupo 3»4—etilenodioxi.

- 6a 2» cara cterizado

Processo por se de acordo com as obter um composto reivindicações 1 de fórmula VIII ou (VIII) na qual

X possui os significados mencionados nas reivindicações 1 ou

2» e R e um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou um grupo fenilo que pode estar substituido por até três grupos alquilo ou alcooxilo com 1 a 4 átomos de carbono cada» por um grupo (—0—CH — CK ) —OP—» em que n tem o valor de zero a 8 e R 2 * n é um grupo morfoliuoetilo ou um grupo N»N—dimetilaminoetilo ou um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono» ou por um grupo etilenodioxi» ou R^ é um grupo fenilo que pode estar substituido por até três grupos alquilo com 1 a 4 átomos de carbono cada e X é um grupo orto—» meta ou para—fenileno.

7* 35 -

Processo para a preparaçao de um composto lu— minescente, caracterizado por se ligar um derivado de acridi— na de fórmula I» quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, directamente ou através de uma molécula ponte, a uma proteína, a um polipeptido ou a uma outra substancia de interesse biologico, com forwaçao de um conjuga do estável, imunologicamente activo.

- 8a Processo para a preparaçao de um meio de en— saio imunoluminescente para a determinação de uma substancia antigênica nume amostra líquida, caracterizado por se imobili zar numa fase solida, por um processo competitivo ou ^Msandui— che”, pelo menos um componente imunologicamente activo e por conter pelo menos um outro componente, o traçador, sendo esse componente um composto luminescente preparado de acordo com a

M» reivindicação 7·

Processo para a preparaçao de um meio de en— saio imunolumineetente, de acordo com a reivindicação o, cara cterizado por

a) se incluir um anticorpo imobilizado, reagindo específicamente com um antigene, con uma amostra do líquido a analisar e com um conjugado do antigene e dé um derivado de acri di nio quimiluminescente preparado de acordo coro qualquer das reivindicações 1 n 6;

b) se separar a amostra e o conjugado marcado, nao ligado;

c) se misturar, sucessiva ou simultaneamente, o conjugado mar cado ligado com um ou mais reagentes, de modo a promover i

i uma emissão luminosa» e

d) se determinar a quantidade do antigene presente a partir da intensidade de emissão luminosa medida.

- 10a «V

Processo para a preparaçao de um meio de en— saio imunoluminescente» de acordo com a reivindicação 9, cara cterizado por se efectuar a separaçao do líquido a analisar w

do anticorpo imobilizado, antes da adiçao do conjugado marcado.

- 11^a Processo para a preparaçao de um meio de ensaio imunoluminescente» de acordo com a reivindicação 8, cara cterizado por

a) se incubar am anticorpo imobilizado, reagindo especificia— mente com o antigene, com uma amestra do liquido a analía sar e com um conjugado de um segundo anticorpo de reacçao específica e de um derivado de acridinio quimiluminescente preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6}

b) se separar a amostea e o conjugado marcado, nao ligado}

c) se misturar, sucessiva ou simultaneamente, o conjugado ma cado com um ou mais reagentes, de modo a promover uma emi «V sao luminosa} e

d) se determinar a quantidade de antigene presente a partir da «w intensidade de emissão luminosa medida.

ia

- 12^a 37 -

Processo para a preparaçao de um meio de en— j saio imunoluminescente, de acordo com a reivindicação 11, cn— racterizado por se efectuar a separaçao do liquido a analisar do anticorpo imobilizado, antes da adiçao do conjugado marcado

- 13^a Processo para a preparaçao de um meio de ensaio imunoluminescente, de acordo com a reivindicação 8, cara cterdzado por

a) se incubar um antigene imobilizado, reagindo especificamen te com o anticorpo, com uma amostra do líquido a analisar e com uma solução de um conjugado do anticorpo e de um deriva do de ecridínio quimiluminescente, preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6}

b) se separar a amostra e o conjugado marcado, nao ligado}

c) se misturar, sucessiva ou simultaneamente, o conjugado mar cado ligado com um ou mais reagentes, de modo a promover uma emissão luminosa} e

d) se determinar a quantidade de antigene presente o partir w

da intensidade de εκίβββο luminosa medida.

- 14a Processo para a preparaçao de um meio de en— saio imunoluminescente, de acordo com a reivindicação 8, cara cterizado por

a) ee incubar um antigene imobilizado, reagindo especificamen te com o anticorpo, com uma solução de um conjugado do anticorpo e de um derivado de acridinio quimiluminescente, preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6} bj se separer o conjugado marcado, nao ligadoj

c) se adicionar uma amostra do líquido a analisarj

d) se remover a seguir novamente a amostrai

e) se misturar, sucessiva ou simultaneamente, o conjugado mar cado ligado com um ou mais reagentes de modo a promover uma emissão luminosa> e

f) se determinar a quantidade de antigene presente a partir da intensidade de emissão luminosa medida.

- 15« 99

Frocesco para a preparaçao de um meio de ensaio imunolumineacente, de acordo com a reivindicação 8, cara cterizado por

a) se incluir um antigene imobilizado, reagindo especificamen te coe o anticorpo, com uma solução de um conjugado do anticorpo e de um derivado de acridinio quimiluminescente , preparado de acordo coa qualquer das reivindicações 1 a 6;

b) se adicionar uma ano stra do líquido a analisarj c ) se separar a amostra e 0 99 conjugado nao ligadoj d) se misturar, sucessiva ou simultaneamente, 0 conjugado mar

cado ligado com um ou mais reagentes, de modo e promover uma emissão luminosa» e

e) se determinar a quantidade de antigene presente a partir da intensidade de emissão luminosa medida.

Λ requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 20 de Fevereiro de ly88, sob ο n° Ρ 05 318.7·