DE2805962C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Lidocain-Antigene und die dadurch gebildeten Antikörper.

Die Art und Weise, in der Arzneimittel verabreicht werden, gewinnt zunehmend an Bedeutung. Da in vielen Fällen die Wirksamkeit des Arzneimittels in direkter Beziehung steht zu der Konzentration des Arzneimittels in dem Blutstrom, beeinflussen sowohl die Art und Weise der Verabreichung als auch die Menge des verabreichten Arzneimittels den Gehalt des Arzneimittels in dem Blut über einen längeren Zeitraum hinweg. Die Geschwindigkeit, mit der der gewünschte Blutgehalt erzielt oder überschritten wird, hängt von der Art des Arzneimittels, der Art der Verabreichung, der Dosierung sowie der Geschwindigkeit des Stoffwechsels ab. Die Geschwindigkeit bzw. Rate, mit der ein Arzneimittel in den Blutstrom gelangt, wenn es auf andere Art als intravenös verabreicht wird, und die Geschwindigkeit bzw. Rate, mit der das Arzneimittel in den Stoffwechsel eingreift, variiert individuell stark. Außerdem variiert auch der Grad der Wirksamkeit individuell stark.

Bei der Verabreichung von Arzneimitteln ist es daher erwünscht, den Grad der individuellen Wirksamkeit, die Geschwindigkeit, mit der dieser Wirksamkeitsgrad bei einer bestimmten Dosis erreicht wird, und die Dauer, während der ein bestimmter Gehalt aufrechterhalten wird, zu kontrollieren. Auf diese Weise kann die Menge des Arzneimittels, das verabreicht wird, dann sorgfältig überwacht werden, um den gewünschten Gehalt aufrechtzuerhalten. Dadurch kann die Wirksamkeit gewährleistet und das Auftreten von Nebenwirkungen minimal gehalten werden.

Um ein Arzneimittel in einer physiologischen Flüssigkeit zu überwachen, müssen empfindliche Tests zur Verfügung stehen, mit deren Hilfe es möglich ist, das Arzneimittel schnell zu bestimmen und von unwirksamen Stoffwechselprodukten zu unterscheiden. Mit dem Test muß es daher möglich sein, eindeutig zwischen dem interessierenden Arzneimittel und Verbindungen mit einer sehr ähnlichen Struktur zu unterscheiden. In Konkurrenz- Proteinbindungs-Assays werden Antikörper verwendet, die mittels Antigen-Konjugaten von Derivaten des interessierenden Arzneimittels hergestellt werden. Damit die Antikörper wirksam sind, müssen sie in einem hohen Titer gebildet werden, eine starke Bindungskonstante an das interessierende Arzneimittel aufweisen und sie dürfen sich nur schwach an Verbindungen mit einer ähnlichen Struktur binden.

Außerdem benötigt man ein Reagens, das ein meßbares Signal in Abhängigkeit von der in dem Testmedium enthaltenen Arzneimittelmenge liefert. Wo Antikörper vorhanden sind, muß das Reagens wirkungsvoll mit dem Arzneimittel in bezug auf die Antikörperbindung auf reproduzierbare Weise konkurrieren und bei kleinen Änderungen der Arzneimittelkonzentration innerhalb des interessierenden Konzentrationsbereiches signifikante Änderungen des Signals hervorrufen.

Andere Erwägungen für ein Reagens sind die, daß es durch in der zu untersuchenden unbekannten Probe vorhandene Stoffe nicht beeinflußt werden darf oder daß störende Stoffe entfernt werden können, daß ein leicht feststellbares Signal erhalten wird, daß das Reagens unter den Testbedingungen stabil ist und eine gute Lagerfähigkeit hat und daß es durch die Antikörper für das Arzneimittel leicht erkennbar ist.

Konkurrenz-Proteinbindungs-Assays sind beispielsweise in den US-Patentschriften 38 17 837, 38 50 752, 36 90 834 und in dem Artikel von Murphy in "J. Clin. Endocr.", 27, 973 (1967), beschrieben. Die Herstellung von Antigen-Konjugaten und Antikörpern für eine Reihe von verschiedenen Arzneimitteln ist in den US-Patentschriften 38 88 866, 37 66 162, 38 43 696 und 38 78 187 beschrieben. In der US-Patentschrift 38 75 011 sind Glukose-6-phosphat-dehydrogenase-Konjugate für die Verwendung in homogenen Enzym-Immunoassays beschrieben. Dahlborn et al beschreiben in "Acta Chem. Scand.", 13, 1145 (1959), die Herstellung von 4-Amino-2,6-dimethyl-γ- dimethylaminoacetanilid.

Aus der DE-OS 23 24 544 sind immunogene Verbindungen von Haptenen bekannt, bei denen ein Ringatom des Haptens mit dem immunogenen Träger verknüpft ist. Auf diese Weise können sehr unterschiedliche Haptene mit dem immunogenen Träger verknüpft werden.

Wie nachstehend noch näher ausgeführt wird, ist die Erfindung auf die enge Klasse der Haptene mit Lidocainstruktur beschränkt, wobei insbesondere eine Aminogruppe am Lidocain-Benzolring die Verknüpfungsstelle mit dem immunogenen Träger darstellt.

Gegenstand der Erfindung sind also neue Verbindungen, d. h. Derivate von Anilide enthaltenden Anästhetika, wie z. B. Lidocain, die eine Aminogruppe am Ring aufweisen. Sie besitzen eine di-funktionelle brückenbildende Gruppe, die eine Brücke zwischen der Aminogruppe am Ring und einem Antigen bildet, wobei das dabei erhaltene Konjugat für die Herstellung von Antikörpern verwendet wird. Die Antikörper werden insbesondere in Konkurrenz-Proteinbildungs- Assays verwendet. Außerdem werden Konjugate an Enzyme hergestellt, die insbesondere in homogenen Enzym-Immunoassays verwendet werden.

Erfindungsgemäß werden Arzneimittel mit einer Anilid-Funktion modifiziert durch Einführung einer Aminogruppe, die an ein Ringkohlenstoffatom gebunden ist, und das Arzneimittel wird dann durch eine brückenbildende Gruppe über die Aminogruppe an eine Antigen-Verbindung, normalerweise eine "Poly(aminosäure)" oder ein Enzym, gebunden. Dafür werden insbesondere difunktionelle brückenbildende Gruppen verwendet, die mit Aminogruppen stufenförmig reagieren können. Insbesondere wird Lidocain mit einer Aminogruppe am Ring versehen und mit einer zweibasischen Carbonsäure umgesetzt unter Bildung eines Säureamids, das dann mit den verfügbaren Aminofunktionen eines Polypeptids umgesetzt wird.

Arzneimittel mit einer Anilidfunktion werden über einen Aminosubstituenten am Ring an Antigene konjugiert unter Bildung von Antigen-Konjugaten für die Bildung von Antikörpern für das erfindungsgemäße Arzneimittel. Bei den interessierenden Arzneimitteln handelt es sich um N-substituierte Glycinanilide, in denen das Stickstoffatom des Glycins durch Alkylgruppen mit 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 2 Kohlenstoffatomen oder eine Alkylenkette und eine Alkylgruppe disubstituiert ist, wobei 0 bis 2, vorzugsweise 1 bis 2 niedere Alkylsubstituenten an den Anilidring gebunden sind. Die durch eine brückenbildende Gruppe modifizierten Arzneimittel weisen normalerweise 12 bis 30 Kohlenstoffatome auf und sie enthalten eine meta- oder para-Aminogruppe für die Bindung an die "Poly(aminosäure)" oder eine andere Antigen-Verbindung.

Unter einer "Poly(aminosäure)" sind hier Polypeptide und Proteine einschließlich der prosthetischen Gruppen oder andere polymere Zusammensetzungen, wie Polysaccharide und Nukleinsäure, zu verstehen.

Obgleich Polysaccharide auch Antigene sein können, werden im allgemeinen Polypeptide verwendet, um die Bildung von Antikörpern zu Haptenen zu induzieren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben die folgende Formel

worin bedeuten:

X und X¹jeweils Methyl, a und bdie Zahl 0 oder 1, wobei die Summe von a+b mindestens 1 beträgt, wobei die an den aromatischen Ring gebundenen Aminogruppen durch 3 bis 4 Kohlenstoffatome voneinander getrennt sind, YWasserstoff, Methyl oder zusammen mit Z einen 6gliedrigen Ring mit den Kohlenstoff- und Stickstoffatomen, an die Y und Z jeweils gebunden sind, bilden kann, Z und Z¹die gleich oder voneinander verschieden sind, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, daß Z mit Y verbunden sein kann, Reine brückenbildende Gruppe, Aeine "Poly(aminosäure)" mit einem Molekulargewicht von mindestens 5000 und neine Zahl von mindestens 1, die jedoch nicht größer ist als die Anzahl der in A vorhandenen verfügbaren Aminogruppen.

Insbesondere bedeuten
Z und Z¹ Methyl, Äthyl und n-Butyl, vorzugsweise Äthyl, wenn Z und Z¹ gleich sind; Z kann aber auch zusammen mit Y einen 6gliedrigen Ring bilden.

R kann eine brückenbildende Gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, die 1 bis 4 Heteroatome aus der Gruppe Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel aufweist, enthalten, wobei der Sauerstoff in Form von Oxy- oder Nicht-Oxocarbonyl, insbesondere in Form der letzteren, der Stickstoff in Form von tertiären Amino-, Amido- oder Iminogruppen und der Schwefel in Form von Thioäther- oder Thionogruppen vorliegen. Ferner kann R einfach äthylenisch ungesättigt sein.

Das Molekulargewicht von A ist nach oben nicht begrenzt, beträgt jedoch normalerweise nicht mehr als 10 Mio, vorzugsweise nicht mehr als etwa 600 000. In der Regel gibt es verschiedene Molekulargewichtsbereiche, je nachdem, ob ein Enzym oder ein Antigen vorliegt, wobei das Molekulargewicht bei den Enzymen im allgemeinen im Bereich von etwa 10 000 bis etwa 600 000, vorzugsweise im Bereich von 10 000 bis 300 000, und bei den Antigenen im Bereich von 5000 bis 10⁷, vorzugsweise von 20 000 bis 600 000, insbesondere von 25 000 bis 250 000 liegt.

Die Zahl n liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis zu dem Molekulargewicht von A, dividiert durch 1500; bei Enzymen liegt n in der Regel im Bereich von 1 bis 30, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 30, insbesondere im Bereich von 2 bis 12, während n bei Antigenen im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis etwa 500, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 250, insbesondere im Bereich von etwa 2 bis 100 liegt, speziell bei den Antigenen mit mittlerem Molekulargewicht.

Die Art und Weise, in der die vernetzende Gruppe an die Aminofunktionen gebunden sein kann, kann stark variieren, z. B. durch eine Einfachbindung, eine Doppelbindung oder über eine Amidogruppe einschließlich der Stickstoff- und Schwefel-Analogen davon, wie Amidin, Harnstoff, Thioamid und Thioharnstoff. Einfachbindungen können erzielt werden durch Verwendung eines Alkylhalogenids oder durch reduktive Aminierung eines Oxocarbonyls. Doppelbindungen können erzielt werden durch Verwendung einer Schiff'schen Base, während Bindungen über Amide und ihre Analogen erzielt werden können mittels aktivierter Ester, Acylhalogeniden, Anhydriden, Isocyanaten und Thioisocyanaten.

Vorzugsweise ist R eine Gruppe der Formel

worin bedeuten:

Eeine Bindung, eine Alkylen- oder Alkylen-NH-Gruppe mit 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Polymethylen, D und D¹die gleich oder voneinander verschieden sind, Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel, vorzugsweise Sauerstoff, wobei -(CD)- an die Aminogruppe am Ring gebunden ist. p und qdie Zahl 0 oder 1, wobei die Summe von p+q vorzugsweise mindestens 1 beträgt.

Zu Beispielen für die Gruppe R gehören Carbonyl, Maledioyl, Succindioyl, Glutardioyl, Oxoäthylen (-CH₂CO-), 1-Oxopropylen (-COCH₂CH₂-) und Succindiiminoyl.

Eine besonders interessierende Verbindung ist das Lidocain-Derivat der folgenden Formel

worin R, A und n die oben angegebenen Bedeutungen haben. Wenn die brückenbildende Funktion ein Nicht-Oxocarbonyl oder sein Stickstoff- bzw. Thioanalogon darstellt oder enthält, handelt es sich bei der brückenbildenden Funktion um ein Amid, Amidin oder Thioamid. Im allgemeinen werden Amide verwendet, die an verfügbare Aminogruppen an dem Antigen gebunden werden. Verfügbare Aminogruppen liegen vor in Form von endständigen Aminogruppen und bei Lysin, Arginin, Histidin und dgl.

Die Antigen-"Poly(aminosäuren)", die erfindungsgemäß verwendet werden können, variieren stark in bezug auf ihr Molekulargewicht, das normalerweise etwa 5000 bis etwa 10 Millionen, vorzugsweise etwa 25 000 bis etwa 600 000, insbesondere etwa 25 000 bis etwa 250 000, beträgt.

In der Regel liegt nicht mehr als etwa 1 Konjugat pro 1500 Molekulargewicht des Antigens, vorzugsweise nicht mehr als etwa 1 Konjugat pro 2000 Molekulargewicht des Antigens vor. In der Regel liegt mindestens etwa 1 Konjugat pro 500 000 Molekulargewicht, vorzugsweise mindestens 1 Konjugat pro 50 000 Molekulargewicht, vor. Bei Antigenen mit einem mittleren Molekulargewicht (35 000 bis 1 Million) liegt die Anzahl der Konjugat-Gruppen im allgemeinen bei etwa 2 bis etwa 250, vorzugsweise bei 10 bis 100. Bei Antigenen mit einem niedrigeren Molekulargewicht (unterhalb 35 000) liegt die Anzahl der Konjugate im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 1 bis etwa 10, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 2 bis 5.

Als Antigen-Material können verschiedene Protein-Typen verwendet werden. Zu diesen Typen gehören Albumine, Serumproteine, z. B. Globuline, Augenlinsenproteine, Lipoproteine und dgl. Zu beispielhaften Proteinen gehören Rinderserumalbumin, Fissurella-Schnecken (keyhole limpet), Hämocyanin, Eiovalbumin, Rinder-γ-Globulin und dgl. Es können aber auch synthetische "Poly(aminosäuren)" mit einer ausreichenden Anzahl von verfügbaren Aminogruppen, wie z. B. Lysine, hergestellt werden.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird ein geeignetes Anilinderivat mit geschützter Aminogruppe zweckmäßig nitriert, wobei auf diese Weise das meta- oder para-Nitroanilin entsteht. Die Schutzgruppe kann dann von der Aminogruppe entfernt werden. Die Aminogruppe wird anschließend in geeigneter Weise acyliert, wobei das gewünschte Anilid erhalten wird, anschließend wird die Nitrogruppe zu einer Aminogruppe reduziert, wobei man die Aminofunktion für die Brückenbindung erhält. Durch die nachfolgenden Formeln wird die Reaktionsfolge dargestellt:

worin alle Symbole die oben angegebenen Bedeutungen haben und T eine Schutzgruppe, z. B. Arylsulfonyl, Trifluoracetyl oder dgl., bedeutet. Die Nitrierung erfolgt leicht in Gegenwart einer Säure, wobei man mit einer schwachen Carbonsäure das para-Derivat erhält, während man mit einer starken Mineralsäure, wie Schwefelsäure, das meta-Derivat erhält. Es werden Temperaturen innerhalb des Bereiches von etwa 50 bis etwa 100°C angewendet.

Die Schutzgruppe wird dann durch Hydrolyse entfernt, zweckmäßig mittels einer wäßrigen Säure, anschließend wird die Aminogruppe mit der geeigneten Aminosäure oder mit Chloracetylchlorid acyliert, danach wird das Chloratom durch das geeignete sekundäre Amin verdrängt. Die Nitrogruppe kann dann auf irgendeine zweckmäßige Weise, beispielsweise durch katalytische Hydrierung, durch Verwendung von Platin oder Palladium unter milden Bedingungen oder durch Verwendung eines anderen konventionellen Reduktionssystems reduziert werden.

Die aus der Nitrogruppe abgeleitete Aminogruppe kann dann unter Verwendung eines aktiven Halogens, einer aktivierten Acylgruppe, wie z. B. eines aktiven Esters, wie p-Nitrophenyl, N-Oxysuccinimid und dgl., eines Acylhalogenids, eines Anhydrids oder der Carbonsäure mit einem Diimid oder durch Kondensation mit einem Oxocarbonyl und anschließende Reduktion mit einem Metallhydrid gekuppelt werden. In der Regel handelt es sich bei der zweiten Funktion an der brückenbildenden Gruppe um Nicht-Oxocarbonyl einschließlich der Stickstoff- und Schwefelanalogen davon, die auf irgendeine der vorstehend angegebenen Arten aktiviert werden können. Die Kondensation des Antigens wird normalerweise unter milden Bedingungen, im allgemeinen bei etwa -10 bis etwa 30°C in einem inerten polaren Lösungsmittel, in der Regel in einem gemischten wäßrigen Lösungsmittel, das etwa 0 bis etwa 50 Vol.-% eines organischen Lösungsmittels, wie z. B. eines Polyäthers, Dimethylformamid (DMF) oder dgl. enthalten kann, durchgeführt. Die Umsetzung wird im allgemeinen bei einem pH-Wert innerhalb des Bereiches von etwa 7 bis etwa 10 durchgeführt.

Wie oben angegeben, werden die Antikörper insbesondere in Konkurrenz- Proteinbindungs-Assays verwendet. Ein Konkurrenz-Proteinbindungs-Assay umfaßt die Verwendung von Enzymkonjugaten und er wird als homogener Enzym-Immunoassay bezeichnet. Bei diesem Assay (Nachweisverfahren) wird das Enzym an ein Derivat der interessierenden Verbindung konjugiert, so daß das dabei erhaltene Enzym-Konjugat in dem Immunoassay verwendet werden kann. Wenn der Antikörper an die an das Enzym konjugierten Gruppen gebunden ist, erfährt das Enzym vorzugsweise eine beträchtliche Änderung seiner Aktivität, in der Regel tritt eine wesentliche Herabsetzung seiner Aktivität auf.

Normalerweise liegt die Anzahl der an das Enzym konjugierten Gruppen innerhalb des Bereiches von etwa 1 bis etwa 30, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von etwa 2 bis etwa 20, insbesondere innerhalb des Bereiches von etwa 2 bis etwa 12.

Es können verschiedene Enzyme verwendet werden, wie z. B. Oxidoreduktasen, Hydrolasen, Lyasen und dgl. Zu Grupen von besonderem Interesse (Vorteil) gehören solche Enzyme, in denen Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) oder sein Phosphat (NADP) als Akzeptor verwendet wird, wie z. B. in Dehydrogenasen einschließlich Glukose- 6-phosphat-dehydrogenase, Malatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Lactatdehydrogenase und dgl.; Peroxidasen; Oxidasen; Glukosidhydrolasen und dgl.

Die Enzym-Konjugate haben im allgemeinen die folgende Formel

worin alle Symbole die weiter oben angegebenen Bedeutungen haben und n¹ im Durchschnitt eine Zahl von etwa 1 bis etwa 20, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 12, bedeutet und ENZ ein Enzym darstellt. Das Enzym hat im allgemeinen ein Molekulargewicht innerhalb des Bereiches von etwa 10 000 bis etwa 600 000, vorzugsweise von etwa 10 000 bis etwa 300 000. Zu beispielhaften Enzymen außer den oben angegebenen Enzymen gehören Lysozym, β-Glukoronidase, Glukoseoxidase, Katalase und Peroxidase.

Eine Beschreibung des Verfahrens zur Durchführung des homogenen Enzym-Immunoassays ist in der US-Patentschrift 38 17 837 zu finden. Das Verfahren besteht darin, daß man das Enzym-Konjugat, die zu untersuchende unbekannte Probe, die möglicherweise das interessierende Arzneimittel enthält, und den Antikörper für das interessierende Arzneimittel in einem wäßrigen gepufferten Medium miteinander vereinigt und die enzymatische Aktivität über eine vorher festgelegte Zeitspanne bestimmt im Vergleich zu einem Probe-Assay, der eine bekannte Menge des interessierenden Arzneimittels enthält.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Alle darin angegebenen Temperaturen beziehen sich, wenn nichts anderes angegeben ist, auf °C. Alle Prozentsätze sind, wenn nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht bezogen. Die in den folgenden Beispielen verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
TLC=Dünnschichtchromatographie; DMF=Dimethylformamid,
LAH=Lithiumaluminiumhydrid, THF=Tetrahydrofuran.

Beispiel 1 p-Toluolsulfonamid von 2,6-Dimethylanilin

Zu einer Lösung von 16 ml (15,6 g, 130 mMol) 2,6-Dimethylanilin in 50 ml Pyridin, das über einem Molekularsieb getrocknet worden war, wurden 27 g (71 mMol) Tosylchlorid, das zweimal aus Hexan umkristallisiert worden war, zugegeben. Nach 2stündigem Erhitzen unter Rückfluß wurde die Reaktionsmischung in 500 ml eiskalte 2 n HCl gegossen, wobei ein gelber Feststoff entstand, der nach dem Abschrecken in einem Eisbad gesammelt, mit einer Gummiplatte gepreßt und im Vakuum 1 Stunde lang über P₂O₅ getrocknet wurde (F. 130 bis 132°C). Das Rohprodukt wurde als solches für die nächste Stufe verwendet.

Beispiel 2 Herstellung von 1-(p-Toluolsulfonylamino)-2,6-dimethyl-4-nitrobenzol

Das rohe Sulfonamid des Beispiels 1 wurde in Portionen zu 25 ml rauchender Salpetersäure in 200 ml Wasser zugegeben. Nach der Zugabe von 200 ml Eisessig und etwa 700 mg NaNO₂ wurde die Mischung 1 Stunde lang unter Rückfluß erhitzt. Unter schnellem Rühren wurde die gekühlte Mischung in 400 ml Eiswasser gegossen. Der dabei entstehende hellgelbe Niederschlag wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet, wobei man 31,9 g Produkt (F. 157 bis 160°C) erhielt, das eine Reinheit, bestimmt durch Dünnschichtchromatographie (TLC) und Kernresonanz-Spektroskopie (NMR), von <95% aufwies; die Gesamtausbeute, bezogen auf 2,6-Dimethylanilin, betrug 81%. Eine aus Äthanol/Wasser umkristallisierte Probe hatte einen Schmelzpunkt von 162,5 bis 164°C.

Beispiel 3 Herstellung von 1-Amino-2,6-dimethyl-4-nitrobenzol

31,9 g des Nitrosulfonamids des Beispiels 2 wurden in einer Lösung von 100 ml konzentrierter H₂SO₄ und 10 ml Wasser suspendiert und in einem Wasserbad (etwa 95°C) erhitzt und gelegentlich aufgerührt, bis das gesamte Material gelöst war. Die dabei erhaltene dunkelbraune Mischung wurde in 300 ml Eiswasser gegossen und mit konzentriertem Ammoniumhydroxid basisch (pH 12) gemacht. Der dabei erhaltene gelblich-braune Niederschlag wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und in heißem Äthanol/Wasser kristallisiert, wobei man 11,3 g feine gelbe Nadeln erhielt (F. 156 bis 160°C). Durch Einengen der Mutterlauge und durch Zugabe von Wasser erhielt man 2,7 g Produkt, so daß eine Gesamtausbeute von 14 g (82%) erzielt wurde. Eine analytische Probe wurde in Chloroform kristallisiert, F. 158 bis 159°C.

Beispiel 4 Herstellung von α-Chlor-4-nitro-2,6-dimethylacetanilid

Bei Raumtemperatur wurde eine Lösung von 6 ml (79 mMol) Chloracetylchlorid in 30 ml Benzol, das über einem Molekularsieb getrocknet worden war, zu einer schnell gerührten Lösung von 12 g (72 mMol) des Produkts des Beispiels 3 und 5,8 ml (72 mMol) trockenem Pyridin in 500 ml Benzol zugetropft. Sofort entstand ein Niederschlag. 45 Minuten nach Beendigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung abgeschreckt, der Niederschlag wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumexsikkator über Nacht getrocknet. Eine Kristallisation wurde erzielt durch Auflösen des Produktes in 2,5 l siedendem Benzol, aus dem nach dem Einengen auf etwa 1,5 l das Produkt (12,73 g, 73%) in Form von sehr langen, dünnen, hellgelben Nadeln ausfiel, F. 227 bis 228°C.

Beispiel 5 Herstellung von α-Diäthylamino-4-nitro-2,6-dimethylacetanilid

12,7 g (52,5 mMol) des Chlorids des Beispiels 4 und 13,6 ml (132 mMol) Diäthylamin in 75 ml trockenem Benzol wurden 15 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, das Chlorid wurde langsam gelöst und die Lösung wurde am Ende der Reaktion klar. Nach dem Abkühlen wurde die braune Lösung filtriert und mit 160 ml 10%iger Chlorwasserstoffsäure gründlich extrahiert. Die kombinierte wäßrige Schicht wurde mit Äther gewaschen, abgeschreckt und mit konzentrierter KOH alkalisch gemacht und der gelbe Niederschlag wurde gesammelt. Das Produkt wurde in Äthanol gelöst und in wäßrigem Äthanol kristallisiert, wobei die erste Charge 9,7 g und die zweite Charge 2,1 g ergab, entsprechend einer Ausbeute von 80%. Die flockigen, hellgelben Kristalle hatten einen Schmelzpunkt von 92 bis 94°C.

Beispiel 6 Herstellung von α-Diäthylamino-4-amino-2,6-dimethylacetanilid

2,0 g (7,2 mMol) der Nitroverbindung des Beispiels 5 in 50 ml Äthanol, der 20 Tropfen Eisessig und 2 gehäufte Spatel Adam-Katalysator enthielt, wurden 2 Stunden lang in einer Parr-Apparatur bei 2,5 kg/cm² (35 psi) hydriert. Der Katalysator wurde unter einer Stickstoff-Schutzatmosphäre durch Absaugen durch ein Celite-Polster, das mit absolutem Äthanol gründlich gewaschen wurde, abfiltriert. Nach dem Eindampfen erhielt man in quantitativer Ausbeute ein gelbes Öl, das beim Stehenlassen kristallisierte. Der Feststoff wurde in einer minimalen Menge Äther gelöst, mit Aktivkohle gekocht, eingeengt, abgeschreckt und beim Kratzen erhielt man zwei Chargen von feinen gelben Nadeln, jeweils 467 und 400 mg, F. 91 bis 92°C. Eine zweite Kristallisation in Cyclohexan ergab einen Schmelzpunkt von 93,5 bis 95°C.

Beispiel 7 Herstellung des p-Nitrophenylesters des Carboxyamids von γ-Diäthylamino-4-amino-2,6-dimethylacetanilid und seine Konjugation an Rinder-γ-Globulin (BgG)

Zu einer Lösung von 55 mg (0,22 mMol) p-Aminolidocain (Beispiel 6) in 2,0 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) unter Stickstoff wurden 110 µl Triäthylamin zugegeben. Die Lösung wurde auf -20°C abgekühlt und es wurden 53 mg (0,265 mMol) p-Nitrophenylchlorformiat zugegeben; die dabei erhaltene Mischung wurde 2 Stunden lang zwischen -20 und -20°C gerührt. Über einen Zeitraum von 1 Stunde wurde die Carbamatlösung zu 700 mg BgG (0,32 mMol Lysin) in einer Mischung aus 30 ml eines 0,1 M Carbonatpuffers (pH 9,1) und 12 ml DMF zugegeben; der pH-Wert wurde mit HCl ständig eingestellt, um einen Wert von 8 bis 9 aufrechtzuerhalten. Nach Beendigung der Zugabe des Carbamats wurde die Reaktionsmischung 3 Stunden lang in einem Eisbad gerührt, dann etwa 3 Tage lang gegen 4×4 l 0,1 M NaHCO₃ und 4×4 l wäßrigem Ammoniumhydroxid (pH 9) dialysiert.

Die Konjugatlösung wurde durch Glaswolle, dann durch eine grob eingelegte Scheibe filtriert und schließlich lyophilisiert, wobei man 320 mg Konjugat erhielt. Die Hapten-Zahl von 38,1 wurde nach dem UV-Differenzverfahren bei λ _max =280 nm bestimmt.

Beispiel 8 Herstellung des Hemisuccinamids von p-Aminolidocain

Eine Lösung von 1,54 g (5,1 mMol) p-Aminolidocain (Beispiel 6) und 520 mg (5,2 mMol) Bernsteinsäureanhydrid in 50 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF) (frisch destilliert über Lithiumaluminiumhydrid (LAH)) wurde über Nacht gerührt. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) (Aluminiumoxid, Chloroform) zeigte restliches Ausgangsmaterial. Kleine Portionen des Anhydrids wurden zugegeben, bis die TLC kein restliches Ausgangsmaterial mehr zeigte. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei man einen gelblichen Schaum erhielt. Das Produkt wurde in Wasser gelöst und es wurde 6 n Chlorwasserstoffsäure bis zur Erzielung von pH 2 zugegeben, dann wurde die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge Wasser gelöst und es wurde Aceton unter Erhitzen bis zum Trübungspunkt zugegeben. Das Hydrochlorid kristallisierte in Form von kleinen hexagonalen Kristallen, F. 152 bis 154°C. Das Material war sehr hygroskopisch.

Beispiel 9 Konjugation des Hemisuccinamids von p-Aminolidocain an BgG

Unter Stickstoff wurden 94 mg (0,242 mMol) des Hemisuccinamids von p-Aminolidocain gemäß Beispiel 8 in 10 ml trockenem DMF mit 68 µl (2 Äquivalenten) Triäthylamin behandelt. Nach dem Abkühlen auf -25°C und 30minütigem Rühren wurden 32 µl (1 Äquivalent) Isobutylchlorformiat zugegeben und das Rühren wurde weitere 1,5 Stunden lang bei -25°C fortgesetzt.

Das wie oben hergestellte gemischte Anhydrid wurde innerhalb von 15 Minuten zu einer eiskalten Lösung von BgG (500 mg, 0,242 mMol Lysin) in 20 ml Wasser bei pH 8,5 zugetropft. Je nach Bedarf wurde verdünntes Natriumhydroxid zugegeben, um den pH-Wert zwischen 8,4 und 8,7 zu halten. Die Mischung wurde 2 Stunden lang gerührt, dann einmal gegen 4 l 0,1 M NaHCO₃ und gegen 4×4 l Wasser dialysiert. Die Lyophilisierung ergab 300 mg Konjugat. Eine Hapten-Zahl von 4,5 wurde bestimmt nach einem UV-Differenzverfahren bei λ _max =280 nm. Eine zweite Konjugation nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren ergab eine Hapten-Zahl von 10.

Beispiel 10 Konjugation des Hemisuccinamids von p-Aminolidocain an Rinderserumalbumin (BSA)

Das gemischte Isobutylanhydrid wurde unter Stickstoff bei -25°C aus 200 mg des Hemisuccinamids von p-Aminolidocain des Beispiels 8, 2 Äquivalenten Triäthylamin und 1 Äquivalent Isobutylchlorformiat in 4 ml trockenem DMF hergestellt. Nach 2 Stunden bei -25°C wurde das gemischte Anhydrid zu 300 mg BSA in 20 ml Wasser bei pH 8,5 und 0°C zugegeben, wobei je nach Bedarf verdünntes Natriumhydroxid zugegeben wurde, um den pH-Wert zwischen 8,4 und 8,6 zu halten. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt, dann gegen 4 l 0,1 M Na₂CO₃/0,1 M NaHCO₃-Puffer und gegen mehrmaligen Austausch von Wasser lyophilisiert. Bei der Lyophilisierung erhielt man 333 mg weißes Pulver. Unter Anwendung eines UV-Differenz-Verfahrens bei λ _max =279 und 248 nm erhielt man eine Hapten-Zahl von 13.

Beispiel 11 Herstellung von 1-Benzolsulfonylamino-2,6-dimethyl-3-nitrobenzol

Das rohe Sulfonamid des Beispiels 1 (36,8 g, 141 mMol) wurde in einer Mischung aus 250 ml Eisessig und 120 ml konzentrierter Schwefelsäure suspendiert, die Lösung wurde auf 60 bis 70°C erwärmt, wobei sie gelb wurde. Nach dem Abkühlen auf etwa 45°C wurde eine Lösung von 50 ml konzentrierter Schwefelsäure, 50 ml Eisessig und 8 ml rauchender Salpetersäure unter starkem Rühren zu der Suspension zugetropft, die dann über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt wurde. Die dabei erhaltene gelbe Aufschlämmung wurde auf 500 g Eis gegossen, abgeschreckt und gesammelt. Nach der Kristallisation in wäßrigem Äthanol erhielt man 32,2 g Produkt, F. 130 bis 132°C.

Beispiel 12 Herstellung von 2,6-Dimethyl-3-nitroanilin

Das Sulfonamid des Beispiels 11 (32,2 g, 0,105 Mol) wurde in 75 ml 90%iger Schwefelsäure suspendiert und 20 bis 30 Minuten lang auf einem Wasserdampfbad erhitzt, abgekühlt und in 300 ml Eiswasser gegossen. Der dabei entstandene Feststoff wurde abfiltriert, indem man die Lösung durch einen Wattepfropfen laufen ließ, und die dabei erhaltene Lösung wurde abgeschreckt und mit konzentriertem Ammoniak alkalisch gemacht. Der gelbe Niederschlag wurde gesammelt und in Benzol/Leichtpetroleum kristallisiert, wobei man zwei Chargen mit einem Gewicht von 14,2 g (81%) erhielt, F. 70 bis 72°C. Eine zweite Kristallisation in Benzol/Heptan ergab einen Schmelzpunkt von 72 bis 75°C.

Beispiel 13 Herstellung von α-Chlor-3-nitro-2,6-dimethylacetanilid

Unter starkem Rühren wurden 4,4 ml (7,21 g, 55 mMol) Chloracetylchlorid in 50 ml trockenem Benzol zu 8,3 g (50 mMol) in 200 ml trockenem Benzol, das 4,1 ml (50 mMol) trockenes Pyridin enthielt, zugetropft. Das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt und der gebildete gelbe Niederschlag wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumexsikkator über Nacht getrocknet. Das Produkt, feine Nadeln, hatte ein Gewicht von 8,7 g (72%), F. 162 bis 163°C.

Beispiel 14 Herstellung von α-Diäthylamino-3-nitro-2,6-dimethylacetanilid

Eine Lösung von 5,0 g (20,6 mMol) der Chlorverbindung des Beispiels 13 und 5,3 ml (3,78 g, 51,6 mMol) Diäthylamin in 300 ml Benzol wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die organische Schicht mit drei 50-ml-Portionen 10%iger Chlorwasserstoffsäure extrahiert und die kombinierte wäßrige Schicht wurde mit 50 ml Benzol gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde abgeschreckt und mit konzentriertem Ammoniumhydroxid alkalisch gemacht. Dabei entstand kein Niederschlag. Nach dem Extrahieren der wäßrigen Schicht mit 150 ml Chloroform und dem anschließenden Trocknen und Eindampfen erhielt man ein gelbes Öl, das beim Stehenlassen fest wurde (5,17 g, 90%), F. 55 bis 59°C.

Nach dem Verfahren der Beispiele 6, 7, 9 und 10 kann das meta-Nitrolidocain reduziert und an verschiedene Antigene konjugiert werden zur Herstellung von Antikörpern für Lidocain.

Beispiel 15 Glukose-6-phosphat-dehydrogenase-Konjugat an das Hemisuccinamid von para-Aminolidocain

Es wurde eine Vorratslösung von Glukose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH) hergestellt durch Anrühren eines trockenen Pulvers von G6PDH mit einem 0,055 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,1 (Raumtemperatur) zur Erzielung einer Konzentration von etwa 2 bis etwa 3 mg/ml. In einen kleinen Kolben wurde 1 ml der Enzymlösung eingeführt und die Lösung wurde unter Rühren auf 0°C abgekühlt. Zu der Lösung wurden dann 20 mg Glukose-6-phosphat und 20 mg NADH zugegeben, anschließend wurden langsam 300 µl Carbitol (Diäthylenglykolmonoäthyläther) zugegeben und der pH-Wert wurde mit 2 n NaOH auf 9 eingestellt.

Es wurde eine Lösung aus trockenem Lidocainhemisuccinamid-HCl (0,075 mMol) in 375 µl trockenem DMF hergestellt, die Mischung wurde gerührt und unter die Oberfläche der Flüssigkeit wurden unter Rühren 21 µl Triäthylamin eingeführt, während die Mischung bei -10°C gehalten wurde. Zu der dabei erhaltenen Lösung wurden langsam 14 µl Carbitolchlorformiat unter die Oberfläche der gerührten Lösung eingeführt. Nach 1,5 Stunden war das gemischte Anhydrid fertig für die Verwendung.

Über einen Zeitraum von etwa 15 Sekunden wurden 15 µl des gemischten Anhydrids unter solchen Bedingungen zugegeben, daß die lokale Konzentration minimal gehalten wurde. Nach einer etwa 15minütigen Reaktionszeit wurde ein aliquoter Anteil des Enzyms entnommen und auf seine Aktivität hin untersucht und die Zugabe des gemischten Anhydrids wurde, wie vorstehend beschrieben, wiederholt, bis die gewünschte Aktivität und Hemm- bzw. Inhibierbarkeit erzielt worden waren. Der pH-Wert wurde während des Verlaufs der Reaktion durch Zugabe von 2 n Natriumhydroxid in dem erforderlichen Maße oberhalb 8,5 gehalten. In der nachfolgenden Tabelle sind die dabei erhaltenen Ergebnisse angegeben. Die Assays (Tests) wurden mit Antikörpern durchgeführt, die bei der Einspritzung des Antigens des Beispiels 9 nach konventionellen Verfahren gebildet wurden. Die Durchführung des Assays wird nachfolgend näher beschrieben.

Tabelle I

Aus den Ergebnissen der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß eine ausgezeichnete Inhibierbarkeit erzielt werden kann bei einem noch verhältnismäßig geringen Grad der Desaktivierung. Die Enzym-Konjugate können daher in Assays (Tests) zur Bestimmung von Lidocain verwendet werden, in denen verhältnismäßig große Differenzen in bezug auf die optische Dichte (OD) über verhältnismäßig kurze Zeiträume abgelesen werden können, bezogen auf die kleinen Differenzen in bezug auf die Konzentration an Lidocain in dem Assay-Medium.

Bei der Durchführung des Assays wurde eine Gilford 300N-Spektrophotometer-Mikroprobe verwendet mit einer Thermo-Küvette mit einer Fließzelle. Alle Ablesungen wurden bei 340 nm gemacht. Die nachfolgend angegebenen Lösungen wurden als Reagentien für die Verwendung in dem Assay hergestellt.
Puffer:0,055 M Tris-HCl, pH 8,1 (Raumtemperatur (RT))
0,05% Natriumazid
0,005% Thimerosal Enzym-Konjugat:Puffer
0,9% NaCl
1,0% RSA (Kaninchenserumalbumin), pH 8,1 (RT) genügend Enzym-Konjugat (Beispiel 15) zur Erzielung einer maximalen Geschwindigkeit bzw. Rate von ΔOD=750 in dem Assay-Medium. Assay-Puffer:Puffer
0,5% NaCl
0,01 Vol./Vol.-% Triton X-100, pH 8,1 (RT) Antikörper-Reagens:Puffer
1,0% RSA
G6P (Na) 0,066 M
NAD 0,04 M
pH 5 (RT)
Antilidocain, für den Assay optimiert

Alle Prozentangaben beziehen sich, wenn nichts anderes angegeben ist, auf Gew.-/Volumen (g/ml).

Zur Durchführung eines Assays wurde die folgende Arbeitsweise angewendet: 50 µl der Probe wurden in eine Verdünnungseinrichtung abgezogen und mit 250 µl des Assay-Puffers in einer 1 ml Croan-Schale verteilt. Ein 50 µl-Aliquot der verdünnten Probe wurde abgezogen und mit einer 250 µl-Portion Assay-Puffer in einer zweiten Coan-Schale verteilt. In die zweite Coan-Schale wurden 50 µl des Antikörper-Reagens mit 250 µl des Assay-Puffer eingeführt, danach wurden 50 µl des Enzym-Reagens und 250 µl des Assay-Puffers zugegeben. Unmittelbar nach der Enzymzugabe wurde die gesamte Probe in die Fließzelle eingesaugt. Nach 15 Sekunden wurde eine erste Ablesung durchgeführt, woran sich eine zweite Ablesung nach einem Zeitabstand von 30 Sekunden anschloß. Die Ergebnisse sind angegeben als Differenz in bezug auf die Extinktion×2,667. In der nachfolgenden Tabelle III sind die mit einer Reihe von Proben mit bekannten Lidocainmengen erhaltenen Ergebnisse angegeben.

Tabelle III

Durch graphische Darstellung der obigen Ergebnisse auf halblogarithmischem Papier kann dann die Lidocain-Konzentration in einer Lidocain enthaltenden Probe bestimmt werden.

Es wurde eine Überkreuz-Untersuchung (cross-reactivity study) durchgeführt, in der die Proben mit 30 µl/ml Lidocain-Serum und 5 µl des Überkreuz-Reaktanten versetzt wurden. Bei den sehr ähnlichen Arzneimitteln, wie Procainamid, Isoproterinol, Propanolol, Ephedrin und Methamphetamin wurde keine Überkreuz-Reaktivität beobachtet. Es wurde jedoch gefunden, daß durch Einführung von Mengen innerhalb des Bereiches von etwa 3 bis etwa 10 µg/ml dieses überkreuzreagierenden Metaboliten in das Assay-Medium die Überkreuz-Reaktivität auf wirksame Weise gedämpft werden konnte, so daß jeder in der zu untersuchenden Probe enthaltende Metabolit die Ablesung nicht in signifikanter Weise beeinflussen würde.

Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, daß ein empfindlicher, genauer, reproduzierbarer Nachweis (Assay) für Lidocain und Lidocain-Analoge erfindungsgemäß erzielbar ist. Die gebildeten Antikörper weisen keine signifikante Überkreuz-Reaktion auf mit Ausnahme des Desäthylmetaboliten von Lidocain. Diese Überkreuz-Reaktivität kann leicht beseitigt werden durch Zugabe einer geringen Menge des Metaboliten zu dem Assay-Medium, so daß weitere Mengen des in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Metaboliten das Ergebnis nicht beeinflussen.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie keineswegs darauf beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Claims (22)

1. Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel worin bedeuten:X und X¹jeweils Methyl, a und bdie Zahl 0 oder 1, wobei die Summe von a+b mindestens 1 beträgt, wobei die an den aromatischen Ring gebundenen Aminogruppen durch 3 bis 4 Kohlenstoffatome voneinander getrennt sind, YWasserstoff, Methyl oder zusammen mit Z einen 6gliedrigen Ring mit den Kohlenstoff- und Stickstoffatomen, an die Y und Z jeweils gebunden sind, bilden kann, Z und Z¹die gleich oder voneinander verschieden sind, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, daß Z mit Y verbunden sein kann, Reine brückenbildende Gruppe, Aeine "Poly(aminosäure)" mit einem Molekulargewicht von mindestens 5000 und neine Zahl von mindestens 1, die jedoch nicht größer ist als die Anzahl der in A vorhandenen verfügbaren Aminogruppen.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A ein Antigen bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A ein Enzym bedeutet.

4. Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Z und Z¹ Äthyl, a und b beide die Zahl 1 und Y Wasserstoff bedeuten.

5. Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Gruppe der Formel ist worin bedeuten:Eeine Bindung, eine Alkylen- oder Alkylen-NH-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, D und D¹Sauerstoff oder Schwefel und p und qdie Zahl 0 oder 1.

6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß E Alkylen, p und q die Zahl 1 und D und D¹ Sauerstoff bedeuten.

7. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß p die Zahl 1, q die Zahl 0 und E eine Bindung bedeuten.

8. Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel worin bedeuten:Aeine "Poly(aminosäure)", neine Zahl innerhalb des Bereiches von 1 bis 500, Reine Gruppe der Formel worin E eine Bindung, eine Alkylen- oder Alkylen-NH-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, D und D¹ Sauerstoff oder Stickstoff und p und q die Zahl 0 oder 1 bedeuten.

9. Verbindung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß A ein Antigen bedeutet.

10. Verbindung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß A ein Enzym bedeutet.

11. Verbindung nach den Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß D und D¹ Sauerstoff und p und q die Zahl 1 bedeuten.

12. Verbindung nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß E Alkylen bedeutet.

13. Verbindung nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß E eine Bindung, D¹ Sauerstoff, q die Zahl 1 und p die Zahl 0 bedeuten.

14. Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel worin A eine "Poly(aminosäure)" bedeutet.

15. Verbindung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß A Rinder-q-Globulin bedeutet.

16. Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel worin A eine Antigen-"Poly(aminosäure)" bedeutet.

17. Verbindung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß A Rinder-γ-Globulin bedeutet.

18. Verbindung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß A Rinderserumalbumin bedeutet.

19. Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel worin ENZ ein Enzym bedeutet.

20. Verbindung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um eine Dehydrogenase handelt.

21. Verbindung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Dehydrogenase um Glukose-6-phosphat-dehydrogenase handelt.

22. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er hervorgerufen durch ein Konjugat nach Anspruch 2, 9 oder 16 gebildet worden ist.