JP2006143715A

JP2006143715A - 新規のリンカー化合物、該化合物がコーティングされている基板、該化合物を利用してマイクロアレイを製造する方法、及びそれによって製造されたマイクロアレイ

Info

Publication number: JP2006143715A
Application number: JP2005319833A
Authority: JP
Inventors: In-Ho Lee; 仁鎬李; Hoshin Bun; 鳳振文; Jun-Hong Min; ▲しゅん▼ 泓閔; Soshaku Ba; 壯錫馬
Original assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Current assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2006-06-08
Also published as: KR20060039715A; US20060263793A1; US7718577B2; KR100657907B1

Abstract

【課題】新規のリンカー化合物、該化合物がコーティングされている基板、該化合物を利用してマイクロアレイを製造する方法、及びそれによって製造されたマイクロアレイを提供する。
【解決手段】下記化学式の構造式を有する化合物、該化合物がコーティングされている基板、該化合物を利用してマイクロアレイを製造する方法及びそれによって製造されたマイクロアレイである。

【選択図】図１

Description

本発明は、新規のリンカー化合物、該化合物がコーティングされている基板、該化合物を利用してマイクロアレイを製造する方法、及びそれによって製造されたマイクロアレイに関する。

マイクロアレイは、特定の分子が基板上の一定領域に高密度に固定化されているものをいう。かかるマイクロアレイには、例えばポリヌクレオチド及び蛋白質マイクロアレイが含まれる。かかるマイクロアレイの製造には、プローブ物質を基板上で段階的に合成する方式と、すでに合成されているプローブ物質を活性化された基板上で結合するスポッティング法とが広く使われている。

スポッティング法において、マイクロアレイは、反応性のある官能基、例えばアミノ基を有するリンカー物質（例えば、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＴＥＳ）及びγ−アミノプロピルジエトキシシラン（ＧＡＰＤＥＳ）など）を基板上にコーティングし、前記官能基と活性化されたプローブ物質とを反応させることにより、プローブ物質を基板に固定させるか、またはリンカー物質を基板上にコーティングし、前記リンカー物質を活性化、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を結合させ、反応性の高い状態に変換させた後、アミノ基のような反応性官能基を有するプローブ物質と反応させることによって製造される。従来リンカー物質として使われた化合物の例には、カルボキシル基を有するアルキルシラン及びカルボキシル基を有するアルキル硫黄化合物が含まれる。それらの化合物は、それぞれケイ素または硫黄元素を含んでおり、ＳｉＯ_２及びＡｕ基板に結合でき、カルボキシル基を有しているために、容易に活性化されうる。

前記の従来技術によれば、リンカー物質は、まず基板上にコーティングされた後で活性化されるという二ステップの反応過程を経た後でプローブ物質と反応できる。したがって、反応効率が低く、活性化が均質になされないという問題点がある。また、従来使われてきたリンカー物質は、アルキル基のような疎水性である部分を含んでおり、プローブ物質を固定化させてマイクロアレイを製造し、これを利用してプローブ物質と標的物質とを反応させ、そこから発生する信号を測定して分析するという方法において、非特異的な結合から発生する信号、すなわちノイズが強く、分析効率が落ちるという問題点があった。

本発明の目的は、基板上にコーティングされている状態で、プローブ物質との反応性にすぐれて結合力も強い化合物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記化合物を製造する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記化合物がコーティングされている基板を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記化合物を利用してマイクロアレイを製造する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記マイクロアレイの製造方法によって製造されたマイクロアレイを提供することである。

本発明者らは、かような従来技術の問題点を解決しようと努力していたところ、基板上にコーティングされている状態で、プローブ物質との反応性にすぐれて結合力も強くありつつ、マイクロアレイの製造にも有用に利用可能な化合物を発見し、本発明を完成するに至った。

前記課題を解決するために、本発明は、下記化学式（１）の構造式を有する化合物を提供する：

式中、Ｒ_１は、それぞれ同一であるか、または異なり、Ｃ_１−Ｃ_２のアルコキシ基、ハロゲン及びＣ_１−Ｃ_３のアルキル基を有するホルミルアルキル基から選択され、Ｒ_２は、

であり、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数である。

本発明はまた、前記化学式（１）の構造を有する化合物を製造する方法であり、
Ｃ_４−Ｃ_４０２のポリエチレングリコールを水素化ナトリウムの存在下でアリルハライドまたはＣ_１−Ｃ_１５のアルキル基を有するアリルアルキルハライドと反応させ、下記化学式（２）の化合物：

式中、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数である；を得るステップと、
前記化学式（２）の化合物と炭素数３から６のジカルボン酸無水物とをＮａＨまたはピリジンの存在下で、触媒量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）とともに反応させ、下記化学式（３）の化合物：

式中、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数である；を得るステップと、
前記化学式（３）の化合物とＲ_２Ｈ；ここでＲ_２は、

である：とをＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で反応させ、下記化学式（４）の化合物：

式中、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数であり、Ｒ_２は、

である；を得るステップと、
前記化学式（４）の化合物とＳｉＨ（Ｒ_１）_３；Ｒ_１は、それぞれ同一であるか、または異なり、Ｃ_１−Ｃ_２のアルコキシ基、ハロゲン及びＣ_１−Ｃ_３のアルキル基を有するホルミルアルキル基から選択されるものである：を白金触媒の存在下で反応させ、前記化学式（１）の化合物を得るステップとを含む方法を提供する。

前記課題を解決するために、本発明は、前記化学式（１）によって表される化合物がコーティングされている基板を提供する。

前記課題を解決するために、本発明は、前記化学式（１）によって表される化合物を利用してマイクロアレイを製造する方法を提供する。

前記課題を解決するために、本発明は、前記方法によって製造されたマイクロアレイを提供する。

本発明の化合物は、基板に結合できる部分、親水性部分及び活性化部分をいずれも保有しており、基板上でプローブ物質を固定化するのに使われるリンカー化合物として有用に使われうる。

本発明の前記化合物の製造方法によれば、本発明の化合物を効率的に製造できる。

本発明のマイクロアレイの製造方法によれば、プローブ物質と標的物質との反応から発生する信号が優秀なマイクロアレイを製造できる。

本発明のマイクロアレイによれば、プローブ物質と標的物質との反応から発生する信号が優秀であり、さまざまな分析方法に使われうる。

本発明の基板は、プローブ物質との反応性が高く、結合力が強い。

本発明は、下記化学式（１）の構造式を有する化合物を提供する：

本発明の一具現例は、Ｒ_１は、エトキシ基であり、ｃは、２または３であり、Ｒ_２は、

である化学式（１）の化合物である。

本発明の前記化合物は、固体基板に容易に結合できるシラン部分と、親水性を帯びており、分子全体の親水性の程度を上昇させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と、アミノ基のような官能基とカップリング反応を起こすことができる活性化された官能基部分とから構成されている。固体基板は、例えばガラス、シリコンウェーハ及びプラスチック物質が含まれるが、それらの例に限定されるものではない。前記固体基板は、特別な形状に限定されるものではなく、例えば扁平な形状、ナノ粒子及びチャンネル状の形状を有することがあるが、それらの例に限定されるものではない。前記シラン部分は、構造式Ｓｉ（Ｒ_１）_３−で示される部分であり、Ｒ_１はそれぞれ同一であるか、または異なり、Ｃ_１−Ｃ_２のアルコキシ基、ハロゲン及びＣ_１−Ｃ_３のアルキル基を有するホルミルアルキル基から選択される。前記活性化された官能基部分は、カップリング反応に置換される容易脱離基とそれを活性化させるための基とから構成されており、前記容易脱離基は、例えば

である。前記活性化のための官能基は、ジカルボキシレートから由来しているものである。

本発明の前記化合物は、基板に容易に結合できるシラン部分と容易脱離基とを保有しており、基板上で物質を固定化しようとする場合、リンカー物質として使われうる。この場合、本発明の化合物のうち、ＰＥＧ部分は、強い親水性特性により、固定化された物質と標的物質とが相互作用する場合、非特異的に結合することを防止できるという長所がある。また、本発明の化合物は、基板に容易に結合できるシラン部分と容易脱離基とを保有しているために、前記化合物を基板上にコーティングする過程と、プローブ物質とをカップリングする過程とを一つの化合物を利用して連続的に行うことができる。

本発明はまた、下記化学式（１）の構造式を有する化合物：

であり、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数である；
を製造する方法である。

該方法において、Ｃ_４−Ｃ_４０２のＰＥＧを水素化ナトリウムの存在下でアリルハライドまたはＣ_１−Ｃ_１５のアルキル基を有するアリルアルキルハライドと反応させ、下記化学式（２）の化合物：

式中、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数である；を得るステップと、
前記化学式（３）の化合物と、Ｒ_２Ｈ；ここでＲ_２は、

である；とをＤＣＣの存在下で反応させ、下記化学式（４）の化合物：

である；を得るステップと、
前記化学式（４）の化合物とＳｉＨ（Ｒ_１）_３；Ｒ_１は、それぞれ同一であるか、または異なり、Ｃ_１−Ｃ_２のアルコキシ基、ハロゲン及びＣ_１−Ｃ_３のアルキル基を有するホルミルアルキル基から選択されるものである；とを白金触媒の存在下で反応させ、下記化学式（１）の化合物：

式中、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数であり、Ｒ_１は、それぞれ同一であるか、または異なり、Ｃ_１−Ｃ_２のアルコキシ基、ハロゲン及びＣ_１−Ｃ_３のアルキル基を有するホルミルアルキル基から選択され、Ｒ_２は、

である；を得るステップとを含む。

本発明の前記化学式（１）の化合物を製造する方法は、例えば、下記反応式（Ｉ）〜（ＩＶ）のような合成過程によって合成されうる：

反応（Ｉ）では、ＰＥＧとアリルハライドまたはアリルアルキルハライド化合物とをＮａＨの存在下で反応させ、アリル化またはアリルアルキル化されたＰＥＧである化合物（２）を得る。反応（Ｉ）で、ＰＥＧは、Ｃ_４−Ｃ_４０２のＰＥＧが望ましく、Ｘは、ハロゲンであり、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数である。このときの反応条件は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のような有機溶媒中で０℃から３０℃の温度、約１気圧の圧力で、３時間から２４時間である。望ましくは、ＴＨＦ中で室温で、３時間行われる。

反応（ＩＩ）では、化合物（２）をＮａＨまたはピリジンの存在下で、触媒量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、約５ｍｏｌ％）の存在下でジカルボン酸無水物と反応させ、化合物（３）のアリル化またはアリルアルキル化されてジカルボキシル化されたＰＥＧが得られる。前記ジカルボン酸無水物は、炭素数３から６のものである。このときの反応条件は、ＴＨＦのような有機溶媒中で０℃から３０℃の温度、１気圧下で３時間から２４時間である。望ましくは、ＴＨＦ中で室温で約３時間行われる。

反応（ＩＩＩ）では、化合物（３）とＲ_２ＨとをＤＣＣの存在下で反応させ、化合物（４）を得る。ここでＲ_２Ｈは、Ｒ_２が、

である化合物である。このときの反応条件は、塩化メチレン（ＭＣ）のような有機溶媒中で０℃から３０℃の温度、１気圧の圧力下で１時間から４時間である。望ましくは、塩化メチレン中で室温で２時間行われる。

反応（ＩＶ）では、化合物（４）とＳｉＨ（Ｒ_１）_３とを白金触媒の存在下で反応させ、化合物（１）を得る。ここでＲ_１は、それぞれ同一であるか、または異なり、Ｃ_１−Ｃ_２のアルコキシ基、ハロゲン及びＣ_１−Ｃ_３のアルキル基を有するホルミルアルキル基から選択される。このときの反応条件は、トルエン、ＴＨＦ及びアリルフェニルエーテルのような有機溶媒中で６０℃から１００℃の温度、１気圧から３０気圧の圧力で、１０時間から２４時間である。望ましくは、溶媒なしに６０℃から７０℃で１６時間行われる。

本発明の化学式（１）の化合物を製造する方法の一例は前記反応（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で、反応中間生成物を精製せずに他の副生成物と混合されている状態で反応されるものを含む。

本発明の製造方法によって製造された化学式（１）の化合物は、活性炭素フィルタ層とセライトフィルタ層とを通過させて触媒及び不純物を除去した後で濃縮させるか、またはｂが２０以上の生成物である場合には、同じフィルタを通過させた濾過液をジエチルエーテルやｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）溶媒に沈殿させた後で沈殿を濾し出して乾燥させることによって精製可能である。

本発明はまた、本発明による前記化学式（１）の化合物を固体基板上にコーティングするステップと、コーティングされている前記化学式（１）の化合物とプローブ物質とをカップリング反応させ、プローブ物質を基板上に固定化するステップとを含むマイクロアレイの製造方法を提供する。

本発明の方法において、固体基板は、例えばガラス、シリコンウェーハ及びプラスチック物質が含まれるが、それらの例に限定されるものではない。前記固体基板は、特別な形状に限定されるものではなく、例えば扁平な形状、ナノ粒子及びチャンネル状の形状を有することがあるが、それらの例に限定されるものではない。コーティングは、従来マイクロアレイの製作過程において広く知られており、本発明において公知のそれら任意のコーティング方法が使われうる。例えば、前記コーティングは、自己組織化薄膜コーティング法、スピンコーティング法、沈積法、スプレー法、プリンティング法及びラングミュアブロジェット法（ＬＢ法）からなる群から選択される方法によってなされるが、それらの例に限定されるものではない。また、前記のようなコーティング法を使用し、当業者ならば、選択されたコーティング方法によって適切な条件を設定して反応を行うことができる。

本発明の方法において、カップリング反応は、前記基板上にコーティングされている化学式（１）の容易脱離基Ｒ_２、例えば

をプローブ物質中の反応基、例えばアミノ基との反応によってプローブ物質に置換する反応である。プローブ物質とは、基板上に固定化される物質であり、標的物質と特異的に結合できる物質を意味する。本発明において、プローブ物質には、例えば蛋白質、ポリヌクレオチド及び多糖類が含まれるが、それらの例に限定されるものではない。

本発明はまた、本発明のマイクロアレイ製造方法によって製造されたマイクロアレイを提供する。本発明のマイクロアレイは、例えば蛋白質及びポリヌクレオチドのマイクロアレイが含まれる。

本発明はまた、本発明による前記化学式（１）の化合物がコーティングされているコーティング層を有するマイクロアレイ用の固体基板を提供する。

本発明の固体基板において、固体基板は、例えばガラス、シリコンウェーハ及びプラスチック物質が含まれるが、それらの例に限定されるものではない。前記固体基板は、特別な形状に限定されるものではなく、例えば扁平な形状、ナノ粒子及びチャンネル状の形状を有することがあるが、それらの例に限定されるものではない。コーティングは、従来マイクロアレイの製作過程において広く知られており、本発明において公知のそれら任意のコーティング方法が使われうる。例えば、前記コーティングは、自己組織化薄膜コーティング法、スピンコーティング法、沈積法、スプレー法、プリンティング法及びラングミュアブロジェット法からなる群から選択される方法によってなされるが、それらの例に限定されるものではない。また、前記のようなコーティング法を使用し、当業者ならば、選択されたコーティング方法によって適切な条件を設定して反応を行うことができる。

以下、本発明を実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：ＴＥＳ−ＰＥＧ−スクシネート−ＮＨＳ（８）（ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）−α−トリエトキシシリルプロピル−ω−［４−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，４−ジオキソブトキシ］エーテル）の合成
１．アリル−ＰＥＧ（５）（ポリ（エチレングリコール）−モノアリルエーテル）の合成

窒素雰囲気下で、ＮａＨ（８００ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）とＰＥＧ（４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）（Ｍｗ＝およそ２，０００）をフラスコに注入した後、乾燥ＴＨＦ（２００ｍＬ）を室温で添加した。その結果として得られるスラリを水素発生がそれ以上観察されなくなるまで（約２０分）撹拌した。次に、前記反応混合物に注射器を介して臭化アリル（１．７ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を滴下した。得られる混合物を３時間室温で撹拌した。

その結果として得られる反応混合物を遠心分離して固体残留物を分離して除去し、上澄み液を注ぎ出した。前記上澄み液を０℃でｔ−ブチルメチルエーテル（８００ｍｌ）に滴下して重合体を沈殿させた。前記沈殿物を濾過によって回収し、真空下で乾燥し、白色固体３４ｇ（８５％）を得た。得られた白色固体の核磁気共鳴（ＮＭＲ：ＮｕｃｌｅａｒＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ）の分析結果は次の通りである。前記白色固体には、ＰＥＧ：アリル−ＰＥＧ（５）：アリル−ＰＥＧ−アリルが１：２：１の割合で混合されていると見られる。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ５．９（ｍ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄ、Ｊ１＝１４．１Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄｄ、Ｊ１＝１１．４Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０３（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６１（ｍ、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）
２．アリル−ＰＥＧ−コハク酸（６）の合成

前記１で得た重合体の混合物（３４ｇ、１７ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（３．４ｇ、３４ｍｍｏｌ）、ＮａＨ（１．３６ｇ、３４ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１２０ｍｇ、５ｍｏｌ％）を窒素雰囲気下でフラスコに注入し、室温で乾燥ＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解させた。３時間室温で撹拌した後、前記混合物をアンバーライト（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ）（登録商標）ＩＲ−１２０（＋）樹脂でイオン交換した。得られた溶出液を焼結されたガラスフィルタを介して濾過した後、前記濾過物を０℃でｔ−ブチルメチルエーテル（５００ｍｌ）に滴下して重合体を沈殿させた。前記沈殿物を濾過によって回収して真空下で乾燥し、白色固体３２ｇ（９５％）を得た。得られた白色固体のＮＭＲ分析結果は、次の通りである。前記白色固体には、コハク酸−ＰＥＧ−コハク酸：アリル−ＰＥＧ−コハク酸（６）：アリル−ＰＥＧ−アリルが混合されていると見られる。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ５．９（ｍ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄ、Ｊ１＝１４．１Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄｄ、Ｊ１＝１１．４Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．０３（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６１（ｍ、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）、２．６５（ｍ、４Ｈ）。

３．アリル−ＰＥＧ−スクシネート−ＮＨＳ（７）（ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）−α−アリル−ω−［４−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，４−ジオキソブトキシ］エーテル）の合成

前記２で得られた重合体の混合物（１５ｇ、７．５ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１．７３ｇ、１５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で室温で乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍｌ）中に溶解させた。乾燥塩化メチレン（５０ｍｌ）中のＤＣＣ（３．１ｇ、１５ｍｍｏｌ）溶液を注射器を介して０℃で前記混合物にゆっくり添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。前記反応混合物を遠心分離し、上澄み液を注ぎ出して下端の固体残留物を除去した。前記上澄み液を０℃でｔ−ブチルメチルエーテル（５００ｍｌ）に滴下して重合体を沈殿させた。前記沈殿物を濾過によって回収して真空下で乾燥し、白色固体（１４ｇ、９３％）を得た。得られた白色固体のＮＭＲ分析結果は、次の通りである。前記白色固体には、ＮＨＳ−スクシネート−ＰＥＧ−スクシネート−ＮＨＳ：アリル−ＰＥＧ−スクシネート−ＮＨＳ（７）：アリル−ＰＥＧ−アリルが混合されていると見られる。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ５．９（ｍ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄ、Ｊ１＝１４．１Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄｄ、Ｊ１＝１１．４Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．０３（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６１（ｍ、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）、２．９６（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．７８（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）
４．ＴＥＳ−ＰＥＧ−スクシネート−ＮＨＳ（８）（ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）−α−トリエトキシシリルプロピル−ω−［４−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，４−ジオキソブトキシ］エーテル）の合成

前記３で得られた重合体の混合物（３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及び酸化白金（４ｍｇ、０．１ｍｏｌ％）をスクリューキャップされている培養チューブに充填し、開放されたスクリューキャップと隔膜とを有するように蓋をかぶせた。アリルフェニルエーテル（２ｇ、１５ｍｍｏｌ）及びトリエトキシシラン（ＴＥＳ）（２．９８ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）を注射器で隔膜を介して前記混合物に順次に添加した。前記混合物を６０℃から７０℃で１６時間撹拌した。得られた濃厚な褐色混合物を活性炭及びセライトの短いパッドを介して濾過した。前記濾過物を０℃でｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍｌ）に滴下して重合体を沈殿させた。前記沈殿物を濾過によって回収して真空下で乾燥し、灰色固体（２．５ｇ、８３％）を得た。得られた灰色固体のＮＭＲ分析結果は、次の通りである。前記灰色固体には、ＮＨＳ−スクシネート−ＰＥＧ−スクシネート−ＮＨＳ：ＴＥＳ−プロピル−ＰＥＧ−スクシネート−ＮＨＳ（８）：ＴＥＳ−プロピル−ＰＥＧ−プロピル−ＴＥＳが約１：２：１の割合で混合されていると見られる。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ４．２７（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．６１（ｍ、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）、２．９６（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．７８（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．７（ｍ、２Ｈ）、１．２（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、９Ｈ）、０．６２（ｔ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）
得られた前記化合物をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ：ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で分析した結果は、図１の通りである。その結果、前記化合物（８）の分子量は、予想値であるおよそ２，４２０と類似のおよそ２，５００であった。

実施例２：コハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１２）の合成
１．２−｛２−［２−（２−アリルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エタノール（９）の合成

窒素雰囲気下でＮａＨ（１．２ｇ、５０ｍｍｏｌ）をフラスコに注入した後、乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）を添加して０℃で１５分間撹拌した。前記ＮａＨの混合物に、テトラエチレングリコール（１０．７ｇ、５５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。前記混合物を室温で１時間撹拌した。次に、前記混合物を水（２０ｍＬ）で希釈して有機物を塩化メチレン（３×１０ｍＬ）で抽出した。その結果として得られる有機層を回収し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥して濃縮し、黄色液体として生成物を得た。前記粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ＝１：２（１０％ＭｅＯＨ））によって精製し、無色油状として前記生成物を得た（３．８ｇ、３２％）。得られた生成物のＮＭＲ分析結果は、次の通りである。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ５．９（ｍ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄ、Ｊ１＝１４．１Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄｄ、Ｊ１＝１１．４Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０３（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６１（ｍ、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−１６Ｈ）。

２．コハク酸モノ−（２−｛２−［２−（２−アリルオキシ−エトキシ）−エトキシ−エトキシ｝−エチル）エステル（１０）の合成

スクリューキャップ培養チューブに２−｛２−［２−（２−アリルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エタノール（９）（３．６ｇ、１５ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（１．８ｇ、１８ｍｍｏｌ）、ピリジン（１．２２ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１８３ｍｇ、１０ｍｏｌ％）、及び乾燥トルエン（５ｍＬ）を注入した。得られる混合物を８０℃で１０時間撹拌した。次に、反応を室温で１０％のＨＣｌ（６ｍＬ）を添加することによって中断させ、反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×１０ｍＬ）で抽出した。回収された有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、アンバーライト（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ）（登録商標）樹脂ＩＲ−１２０（＋）（２ｇ）を添加して撹拌することにより、イオン交換した。濾過によって前記樹脂を除去した後、前記濾過物を濃縮して黄色油として生成物を得た（５．２ｇ、９２％）。この化合物は、それ以上の精製なしに使用した。前記化合物に対するＮＭＲ分析結果は、次の通りである。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ５．９（ｍ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄ、Ｊ１＝１４．１Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄｄ、Ｊ１＝１１．４Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０３（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６１（ｍ、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−１４Ｈ）、２．６５（ｓ、４Ｈ）
３．コハク酸２−｛２−［２−（２−アリルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチルエステル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１１）の合成

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．５８ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）及びコハク酸モノ−（２−｛２−［２−（２−アリルオキシ−エトキシ）−エトキシ−エトキシ｝−エチル）エステル（１０）（４．６ｇ、１３．７６ｍｍｏｌ）を室温で乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）中に溶解させた。前記混合物中に乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）中のＤＣＣ（２．８４ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）溶液を０℃でゆっくり添加した。その結果として得られる混合物を室温で２時間撹拌した。その結果として得られる反応混合物のうちの固体残留物を焼結されたガラスフィルタを介して濾過して除去し、濾過物を濃縮して黄色油として生成物を得た（５．５ｇ、９３％）。この化合物は、それ以上精製せずに使用した。前記生成物のＮＭＲ分析結果は、次の通りである：
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ５．９（ｍ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄ、Ｊ１＝１４．１Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄｄ、Ｊ１＝１１．４Ｈｚ、Ｊ２＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０３（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６１（ｍ、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−１４Ｈ）、２．９６（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．７８（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）。

４．コハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１２）の合成

スクリューキャップ培養チューブにコハク酸２−｛２−［２−（２−アリルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチルエステル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１１）（３ｇ、６．９ｍｍｏｌ）を充填し、窒素雰囲気下で開放スクリューキャップ及び隔膜で蓋を覆った。前記混合物にトリエトキシシラン（２．３ｇ、１４ｍｍｏｌ）及びＫａｒｓｔｅｄｔ触媒（０．１ｍＬ）を順次に注射器を介して前記隔膜を介して添加した。前記混合物を８０℃で１６時間撹拌した。その結果として得られる褐色溶液を活性炭とセライトの短いパッドとを介して濾過した。前記濾過物を濃縮して黄色油として生成物を得た。この化合物は、それ以上精製せずに使用した（３．１ｇ、７５％）：
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ４．２７（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８２（ｍ、６Ｈ）、３．６１（ｍ、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−１４Ｈ）、３．４３（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．９６（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．７８（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．７（ｍ、２Ｈ）、１．２（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、９Ｈ）、０．６２（ｔ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）。

得られた化合物（１２）をＥＳＩ−ＭＳで分析した結果は、図２の通りである。その結果、前記化合物（１２）の分子量は、およそ７２８であった。

実施例３：コハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１２）でコーティングされている基板の製造及びその特性の評価
１．コハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１２）でコーティングされている基板の製造
前記実施例２で得られたコハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１２）をガラス材質の固体基板上で自己組織化薄膜コーティング法によってコーティングした。具体的なコーティング過程は、次の通りである。

エタノール中のコハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１２）溶液（濃度１％（ｗｔ／ｗｔ））を自己組織化薄膜コーティング法でコーティングした。自己組織化薄膜コーティングは、洗浄したガラスをコーティング液に１時間浸して反応を行った。自己組織化薄膜コーティングが完了した後、基板をエタノールで５分間洗浄して、１１０℃で４５分間硬化させた。硬化された基板は、表面に反応せずに残っているコーティング成分を除去するために、さらにエタノール溶液で５分間洗浄した後で乾燥した。乾燥は、スピンドライを介して行った。

２．コハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１２）でコーティングされている基板の反応性及び結合力評価
（１）Ａｌｅｘａ５３２染料との反応性及び結合力
前記１で製造されたコハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１２）でコーティングされている基板上に、Ａｌｅｘａ５３２染料（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ社、米国）に固定化反応を行ってアレイ状に固定化させた。固定化反応は、前記染料を１００μｇ／ｍｌの濃度で含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ）（０．１Ｍ）溶液を前記基板と３７℃で１時間反応させることによって行われた。

このように得られた本発明の基板に、Ｇｅｎｅｐｉｘ４１００Ｂｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ社、ＵＳＡ）を利用して５３２ｎｍの光を照射し、そこから発光される蛍光を５５０ｎｍで観察し、本発明の基板の反応性を測定した。対照群としては、エポキシ基のコーティングされている基板（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社、ＳＭＥ、米国）とアミノ基のコーティングされている基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、＃４０００４、米国）とに同じ染料をコーティングし、そこから発光される蛍光の強度を測定した。

次に、前記染料がコーティングされている基板を、それぞれＴｗｅｅｎ２０（０．５％（ｗｔ／ｗｔ））の含まれているＰＢＳ（０．１Ｍ）溶液で２回洗浄した後、そこから発光される蛍光の強度を同じ過程によって測定した。その結果を表１に表した。

表１に示されているように、本発明の基板を使用する場合、洗浄後に固定化されている染料の比率が顕著に高く、前記化合物と染料との結合が強くなされているということが分かる。

（２）Ａｌｅｘａ５３２染料が結合されているインシュリンとの反応性及び結合力
前記１で製造されたコハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１２）でコーティングされている基板上に、Ａｌｅｘａ５３２染料（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ社、米国）の結合されているインシュリンを固定化反応によってアレイ状に固定化させた。固定化反応は、前記インシュリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含むＰＢＳ（０．１Ｍ）溶液を前記基板と３７℃で１時間反応させることによって行われた。

このように得られた本発明の基板に、Ｇｅｎｅｐｉｘ４１００Ｂｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ社、ＵＳＡ）を利用して５３２ｎｍの光を照射し、そこから発光される蛍光を５５０ｎｍで観察し、本発明の基板の反応性を測定した。対照群としては、エポキシ基のコーティングされている基板（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社、ＳＭＥ、ＵＳＡ）とアミノ基のコーティングされている基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、＃４０００４、ＵＳＡ）とに同じ濃度のインシュリンをコーティングし、そこから発光される蛍光の強度を測定した。

次に、前記インシュリンのコーティングされている基板を、それぞれＴｗｅｅｎ２０（０．５％（ｗｔ／ｗｔ））が含まれているＰＢＳ（０．１Ｍ）溶液で２回洗浄した後、そこから発光される蛍光の強度を同じ過程によって測定した。その結果を表２に表した。

表２に示されているように、本発明の基板を使用する場合、洗浄後に固定化されているインシュリンの比率が顕著に高く、前記化合物とインシュリンとの結合が強くなされているということが分かる。

（３）プローブ物質と標的物質との特異的結合に及ぼす影響
前記（２）で製造されたインシュリンが固定化されたマイクロアレイに、Ａｌｅｘａ５３２染料と結合されている抗インシュリン抗体（ＺｙｍｅｄＬａｂ、ｃｌｏｎｅｚ００６）を結合させ、インシュリンと抗インシュリン抗体との特異的結合を誘導させた後、そこから発生する蛍光信号を測定した。

まず、固定化されたマイクロアレイ（２５スポット／プレート）で、前記（２）で製造されたインシュリンと抗インシュリン抗体１００ｎｇ／ｍｌを含む溶液とを混合し、３７℃で１時間反応させた。その後、Ｔｗｅｅｎ２０（０．５％（ｗｔ／ｗｔ））が含まれているＰＢＳ（０．１Ｍ）溶液で２回洗浄した。

次に、Ｇｅｎｅｐｉｘ４１００Ｂｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ社、ＵＳＡ）を利用して５３２ｎｍの光を照射し、そこから発光される蛍光を５５０ｎｍで観察し、本発明の基板の反応性を測定した。対照群としては、エポキシ基のコーティングされている基板（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社、ＳＭＥ、ＵＳＡ）とアミノ基のコーティングされている基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、＃４０００４、ＵＳＡ）とに同じ濃度のインシュリンをコーティングされている基板を使用し、そこから発光される蛍光の強度を測定した。その結果を表３及び図３に表した。

表３に示されているように、本願発明のマイクロアレイを使用する場合、Ｓ／Ｎ比（すなわちスポット／背景比）の蛍光強度の非常に優秀な蛍光信号を得ることができた。また、図３に示されているように、スポットの様子も、本発明の基板の場合、対照群基板に比べて明確で明らかであった。図３で、Ａは、本発明の基板、Ｂは、アミノ基のコーティングされている基板、及びＣは、エポキシ基のコーティングされている基板を利用して製造されたマイクロアレイについての結果である。

以上のように、本願発明の基板と対照群基板との間で発生する信号の差が、リンカーとして使われた化合物の種類によってマイクロアレイ表面の親水性の程度において違いが出て、この違いにより、プローブ物質と標的物質との間の反応結果から得られる信号に影響を及ぼすと推測できる。本発明者らは、これを立証するために、前記各マイクロアレイの親水性の程度を接触角を測定して確認した。接触角は、ＣＯＮＴＡＣＴＡＮＧＬＥＭＥＴＥＲ（ＫＲＵＳＳＧＭＢＨ、ドイツ）機器を使用して測定した。その結果を表４に表した。

表４に示されているように、本発明のマイクロアレイは、対照群に比べて顕著に親水性を帯びていることが分かる。

本発明は、試料分析関連の技術分野に効果的に適用可能である。

本発明の実施例１で得られた化合物をＥＳＩ−ＭＳで分析した結果を示す図面である。本発明の実施例２で得られたコハク酸２−｛２−［２−（２−（３−トリエトキシシリルプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルをＥＳＩ−ＭＳで分析した結果を表す図面である。本発明の化合物がコーティングされている基板（Ａ）、アミノ基がコーティングされている基板（Ｂ）、及びエポキシ基がコーティングされている基板（Ｃ）を利用して製造されたマイクロアレイ上で、標的物質とプローブ物質とを反応させた後で蛍光強度及びスポットの様子を示している。

Claims

下記化学式（１）の構造式を有する化合物：
式中、Ｒ_１は、それぞれ同一であるか、または異なり、Ｃ_１−Ｃ_２のアルコキシ基、ハロゲン及びＣ_１−Ｃ_３のアルキル基を有するホルミルアルキル基から選択され、Ｒ_２は、
であり、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数である。
前記化学式（１）において、Ｒ_１は、エトキシ基であり、ｃは、２または３であり、Ｒ_２は、
である、請求項１に記載の化合物。
下記化学式（１）の構造式を有する化合物：
式中、Ｒ_１は、それぞれ同一であるか、または異なり、Ｃ_１−Ｃ_２のアルコキシ基、ハロゲン及びＣ_１−Ｃ_３のアルキル基を有するホルミルアルキル基から選択され、Ｒ_２は、
であり、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数である；を製造する方法であり、
Ｃ_４−Ｃ_４０２のポリエチレングリコールを水素化ナトリウムの存在下でアリルハライドまたはＣ_１−Ｃ_１５のアルキル基を有するアリルアルキルハライドと反応させ、下記化学式（２）の化合物：
式中、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数である；を得るステップと、
前記化学式（２）の化合物と炭素数３から６のジカルボン酸無水物とをＮａＨまたはピリジンの存在下で、触媒量のジメチルアミノピリジンとともに反応させ、下記化学式（３）の化合物：
式中、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数である；を得るステップと、
前記化学式（３）の化合物と、Ｒ_２Ｈ；ここでＲ_２は、
である；とをＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反応させ、下記化学式（４）の化合物：
式中、ａは、３から１８の整数であり、ｂは、１から２００の整数であり、ｃは、１から４の整数であり、Ｒ_２は、
である；を得るステップと、
前記化学式（４）の化合物とＳｉＨ（Ｒ_１）_３；ここでＲ_１は、それぞれ同一であるか、または異なり、Ｃ_１−Ｃ_２のアルコキシ基、ハロゲン及びＣ_１−Ｃ_３のアルキル基を有するホルミルアルキル基から選択されるものである；とを白金触媒の存在下で反応させ、前記化学式（１）の化合物を得るステップとを含む方法。
請求項１または請求項２に記載の化合物を固体基板上にコーティングするステップと、
コーティングされている前記化合物とプローブ物質とをカップリング反応させてプローブ物質を基板上に固定化するステップとを含むマイクロアレイの製造方法。
前記コーティングは、自己組織化薄膜コーティング法、スピンコーティング法、沈積法、スプレー法、プリンティング法及びラングミュアブロジェット法からなる群から選択される方法によってなされる請求項４に記載の方法。
請求項４または請求項５に記載の方法によって製造されたマイクロアレイ。
プローブ物質が蛋白質またはポリヌクレオチドのマイクロアレイである、請求項６に記載のマイクロアレイ。
請求項１または請求項２に記載の化合物がコーティングされているコーティング層を有するマイクロアレイ用の固体基板。