KR101159071B1 - 신규한 히드로겔 공중합체, 상기 공중합체가 코팅되어있는 기판, 상기 공중합체를 이용하여 마이크로어레이를제조하는 방법 및 그에 의하여 제조된 마이크로어레이 - Google Patents

신규한 히드로겔 공중합체, 상기 공중합체가 코팅되어있는 기판, 상기 공중합체를 이용하여 마이크로어레이를제조하는 방법 및 그에 의하여 제조된 마이크로어레이 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 히드로겔 공중합체, 상기 공중합체가 코팅되어 있는 기판, 상기 공중합체를 이용하여 마이크로어레이를 제조하는 방법 및 그에 의하여 제조된 마이크로어레이를 제공한다. 본 발명의 히드로겔 공중합체를 이용하면 단백질의 효율적인 제거가 가능하고, 마이크로어레이용 기판에 핵산 및 단백질을 고집적화하는 것이 가능하다.

Description

신규한 히드로겔 공중합체, 상기 공중합체가 코팅되어 있는 기판, 상기 공중합체를 이용하여 마이크로어레이를 제조하는 방법 및 그에 의하여 제조된 마이크로어레이{Novel hydrogel copolymer, a substrate coated with the copolymer, method for producing a microarray using the copolymer and a microarray produced by the method}
도 1은 본 발명의 히드로겔 중합체를 이용한 IgG 제거 효율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 압타머로 코팅된 각각의 기판에 결합된 Cy3 태깅된 인간 IgG의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것을 나타내는 그래프이다.
도 3은 각각의 기판에 고정화된 Cy3 태깅된 인간 IgG의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 신규한 히드로겔 공중합체, 상기 공중합체가 코팅되어 있는 기판, 상기 공중합체를 이용하여 마이크로어레이를 제조하는 방법 및 그에 의하여 제조된 마이크로어레이에 관한 것이다.
마이크로어레이는 특정한 분자가 기판 상에 일정한 영역에 고밀도로 고정화되어 있는 것을 말한다. 이러한 마이크로어레이에는 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 및 단백질 마이크로어레이가 포함된다. 이러한 마이크로어레이의 제조에는 프로브 물질을 기판 상에서 단계적으로 합성하는 방식과 이미 합성되어 있는 프로브 물질을 활성화된 기판 상에 결합하는 스팟팅 방법이 널리 사용되고 있다.
스팟팅법에 있어서, 마이크로어레이는 반응성이 있는 관능기 예를 들면, 아미노기를 갖는 링커 물질 (예를 들면, GAPS (감마-아미노프로필트리에톡시 실란) 및 GAPDES (감마-아미노프로필디에톡시 실란) 등)을 기판 상에 코팅하고, 상기 관능기와 활성화된 프로브 물질과 반응시킴으로써 프로브 물질을 기판에 고정시키거나, 링커 물질을 기판 상에 코팅하고 상기 링커 물질을 활성화 예를 들면, N-히드록실숙신이미드(NHS)를 결합시켜 반응성이 높은 상태로 변환시킨 다음, 아미노 기와 같은 반응성 관능기를 갖는 프로브 물질과 반응시킴으로써 제조된다. 종래 링커 물질로 사용된 화합물의 예에는 카르복실기를 갖는 알킬실란 및 카르복실기를 갖는 알킬 황 화합물이 포함된다. 이들 화합물은 각각 규소 또는 황 원소를 포함하고 있어 SiO2 및 Au 기판에 결합할 수 있고, 카르복실기를 가지고 있기 때문에 용이하게 활성화될 수 있다.
상기한 종래 기술에 의하면, 링커 물질은 먼저 기판 상에 코팅된 다음 활성화되는 2 단계의 반응 과정을 거친 후에 프로브 물질과 반응할 수 있다. 따라서, 반응 효율이 낮고 활성화가 균질하게 되지 않을 수 있는 문제점이 있다. 또한, 종 래 사용되어 오던 링커 물질은 알킬기와 같은 소수성인 부분을 포함하고 있어, 프로브 물질을 고정화시켜 마이크로어레이를 제조하고 이를 이용하여 프로브 물질과 표적 물질을 반응시켜 그로부터 발생하는 신호를 측정하여 분석하는 방법에 있어서, 여백 부분과의 비특이적 결합으로부터 발생하는 신호, 즉 노이즈가 강하여 분석효율이 떨어지는 문제점이 있었다.
미국 특허 제6,174,683호에는 프로브 물질을 기판 상에 고정화하기 위해 폴리우레탄 기재 히드로겔을 이용함으로써 신속하고, 값싼 바이오칩을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법에 사용된 히드로겔은 히드로겔의 골격으로서 폴리에틸렌옥시드(PEO)를 이용하고 있으나, 본 발명의 폴리[N-이소프로필아크릴아미드]를 이용하여 프로브 물질을 고집적화한 기재는 없다.
본 발명자들은 이와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자 노력하던 중 기판 상에 코팅되어 있는 상태에서 프로브 물질의 고집적화가 가능하면서, 마이크로어레이의 제조에 유용하게 이용될 수 있는 화합물을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 기판 상에 코팅되어 있는 상태에서 프로브 물질의 고집적화가 가능한 히드로겔 공중합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 공중합체가 코팅되어 있는 기판을 이용하여 아미노기를 갖는 물질을 선택적으로 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 공중합체가 코팅되어 있는 마이크로어레이용 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 공중합체에 생물분자가 고정화되어 있는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 공중합체를 이용하여 마이크로어레이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
하기 화학식 1 및 2의 반복단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 히드로겔 공중합체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112005002141737-pat00001
(식 중,
X1은 단순결합, O, S, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내 지 20의 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 20의 헤테로알케닐렌, 혹은 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기를 나타내며, R1, R2, 및 R 3는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 히드록시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기, 혹은 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴옥시기를 나타내며, b는 10 내지 100,000의 정수이다);
[화학식 2]
Figure 112005070824213-pat00037
(식 중,
X3는 단순결합, O, S, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내 지 20의 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 20의 헤테로알케닐렌, 혹은 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기를 나타내며, R5는
Figure 112005002141737-pat00003
,
Figure 112005002141737-pat00004
또는
Figure 112005002141737-pat00005
이고, d는 10 내지 100,000의 정수이다).
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 히드로겔 공중합체는 하기 화학식 3의 반복단위를 더 포함할 수 있다.
[화학식 3]
Figure 112005002141737-pat00006
(식 중,
a는 10 내지 100,000의 정수를 나타낸다).
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 히드로겔 공중합체는 하기 화학식 4의 반복단위를 더 포함할 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112005002141737-pat00007
(식 중,
X2는 단순결합, O, S, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 20의 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 20의 헤테로알케닐렌, 혹은 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기를 나타내며, R4는 수소원자, 할로겐원자, 히드록시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기, 혹은 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴옥시기를 나타내며. c는 10 내지 100,000의 정수이다).
본 발명의 하나의 구현예에서, 하기 화학식 1 내지 4의 반복단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 히드로겔 공중합체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112005002141737-pat00008
[화학식 2]
Figure 112005070824213-pat00038
[화학식 3]
Figure 112005002141737-pat00010
[화학식 4]
Figure 112005002141737-pat00011
(식 중,
X1, X2, X3, R1, R2, R3, R4 , R5, a, b, c 및 d는 상기 정의된 바와 같다).
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 알킬기는 탄소수 1 내지 20의 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함하며, 바람직하게는 1 내지 약 12 탄소원자를 갖는 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함한다. 더욱 바람직한 알킬 라디칼은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬이다. 이와 같은 라디칼의 예로서는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, iso-아밀, 헥실 등을 들 수 있다. 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬 라디칼이 더욱 더 바람직하다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 알콕시기는 탄소수 1 내지 20의 알킬 부분을 각각 갖는 산소-함유 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함한다. 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 저급 알콕시 라디칼이 더욱 바람직한 알콕시 라디칼이다. 이와 같은 라디칼의 예로서는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 및 t-부톡시를 들 수 있다. 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 저급 알콕시 라디칼이 더욱 더 바람직하다. 상기 알콕시 라디칼은 플루오로, 클로로 또는 브로모와 같은 하나 이상의 할로 원자로 더 치환된 할로알콕시 라디칼을 제공할 수 있다. 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 저급 할로알콕시 라디칼이 더욱 더 바람직하다. 이와 같은 라디칼의 예로서는 플루오로메톡시, 클로로메톡시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 플루오로에톡시 및 플루오로프로폭시를 들 수 있다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 알케닐기는 탄소-탄소 이중결합을 함유하는 탄소수 2 내지 30의 직쇄형 또는 분지형일 수 있는 지방족 탄화수소기를 의미한다. 바람직한 알케닐기는 쇄 내에 2 내지 12개의 탄소원자를 가지며, 더욱 바람직하게는 쇄 내에 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는다. 분지형은 하나 이상의 저급알킬 또는 저급알케닐기가 알케닐 직쇄에 부착된 것을 의미한다. 이러한 알케닐기는 치환되지 않거나, 할로, 카르복시, 히드록시, 포밀, 설포, 설피노, 카바모일, 아미노 및 이미노를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 하나 이상의 기에 의 해 독립적으로 치환될 수 있다. 이와 같은 알케닐기의 예로서는 에테닐, 프로페닐, 카르복시에테닐, 카르복시프로페닐, 설피노에테닐 및 설포노에테닐 등이 있다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 아릴기는 단독 또는 조합하여 사용되어, 하나 이상의 고리를 포함하는 탄소원자수 6 내지 20개의 카보사이클 방향족 시스템을 의미하며 상기 고리들은 펜던트 방법으로 함께 부착되거나 또는 융합될 수 있다. 아릴이라는 용어는 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인단 및 비페닐(biphenyl)과 같은 방향족 라디칼을 포함한다. 더욱 바람직한 아릴은 페닐이다. 상기 아릴기는 히드록시, 할로, 할로알킬, 니트로, 시아노, 알콕시 및 저급 알킬아미노와 같은 1 내지 3개의 치환기를 가질 수 있다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 아릴옥시기는 아릴-O-를 의미한다. 아릴옥시기중 아릴에 대한 정의는 상기한 바와 같다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 헤테로아릴기는 N, O 또는 S 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리원자가 C인 고리원자수 6 내지 20의 1가 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 라디칼을 의미한다. 또한, 상기 용어는 고리내 헤테로원자가 산화되거나 사원화되어, 예를 들어 N-옥사이드 또는 4차 염을 형성하는 1가 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 라디칼을 의미한다. 대표적인 예로는 티에닐, 벤조티에닐, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 퀴놀리닐, 퀴녹살리닐, 이미다졸릴, 푸라닐, 벤조푸라닐, 티아졸릴, 이속사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 트리아졸릴, 피라졸릴, 피롤릴,인돌릴, 2-피리도닐, 4-피리도닐, N-알킬-2-피리도닐, 피라지노닐, 피리다지노 닐, 피리미디노닐, 옥사졸로닐, 및 이들의 상응하는 N-옥사이드(예를 들어, 피리딜 N-옥사이드, 퀴놀리닐 N-옥사이드), 이들의 4차 염 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 헤테로아릴옥시기는 헤테로아릴-O- 을 의미하며, 헤테로아릴옥시기중 헤테로아릴에 대한 정의는 상기 정의한 바와 같다.
본 발명의 상기 화합물은 고체 기판에 용이하게 결합할 수 있는 실란 모이어티와 친수성을 띠고 있어 분자 전체를 친수성의 정도를 증가시키는 폴리[N-이소프로필아크릴아미드] 모이어티와 아미노기와 같은 관능기와 커플링 반응을 일으킬 수 있는 활성화된 관능기 모이어티로 구성되어 있다. 고체 기판은 예를 들면, 유리, 실리콘 웨이퍼, 플라스틱, 폴리스티렌, 막, 및 금속판이 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 고체 기판은 특별한 형상에 한정되는 것은 아니며 예를 들면, 평편한 형상, 나노입자 및 채널상의 형상을 가질 수 있으나 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 활성화된 관능기 모이어티는 커플링 반응에서 치환되는 용이 이탈기 (good leaving group)와 그를 활성화시키기 위한 기로 구성되어 있으며, 상기 용이 이탈기는 예를 들면,
Figure 112005002141737-pat00012
,
Figure 112005002141737-pat00013
또는
Figure 112005002141737-pat00014
이다. 상기 활성화를 위한 관능기는 디카르복실레이트로부터 유래된 것이다.
본 발명의 상기 화합물은 기판에 용이하게 결합할 수 있는 모이어티와 용이 이탈기를 보유하고 있어 기판 상에 물질을 고정화하고자 하는 경우 링커 물질로서 사용될 수 있다. 이 경우 본 발명의 화합물 중의 폴리[N-이소프로필아크릴아미드] 모이어터는 강한 친수성 특성으로 인하여, 고정화된 물질과 표적 물질이 상호작용하는 경우 비특이적으로 여백 부분에 결합하는 것을 방지할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 기판에 용이하게 결합할 수 있는 모이어티와 용이 이탈기를 보유하고 있기 때문에 상기 화합물을 기판 상에 코팅하는 과정과 고정화 물질을 커플링하는 과정을 하나의 화합물을 이용하여 연속적으로 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 히드로겔 공중합체를 나노세공(nanopore)이 형성되어 있는 기판 상에 도포하는 단계;
상기 히드로겔 공중합체와 아미노기를 갖는 물질을 포함하는 시료를 반응시키는 단계; 및
반응되지 않은 시료를 용출하는 단계를 포함하는 시료로부터 아미노기를 갖는 물질을 선택적으로 제거하는 방법을 제공한다.
나노세공이 형성되어 있는 기판 상에 본 발명의 히드로겔 공중합체를 도포 하면 히드로겔 중합체의 일부인 실란 모이어티가 기판과 공유결합을 형성하게 된다. 기판 상에 결합된 히드로겔 공중합체에 아미노기를 갖는 물질을 포함하는 시료를 반응시키면, 히드로겔 공중합체의 N-히드록실숙신이미딜(NHS) 에스테르와 같은 활성화된 관능기 모이어티가 단백질과 같은 아미노기를 포함하는 물질의 아미노기와 반응하여 용이 이탈기가 이탈되면서 펩티드 결합을 형성한다. 단백질과 같은 아미노기를 포함하는 물질이 히드로겔 공중합체에 결합하면 반응하지 않은 DNA와 같은 핵산은 용출 용액을 이용하여 용출할 수 있다. 세포 또는 바이러스를 용해하면 단백질, 핵산 등이 용해물 중에 존재하게 되는데, 여기에서 핵산을 정제하기 위해서는 단백질의 제거가 필요하다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 세포 용해물로부터 단백질을 제거하여 핵산을 효율적으로 정제할 수 있으므로, LOC 구현에 적합할 수 있다. 이는 히드로겔 공중합체가 수축 상태일때 DNA만 통과하고 단백질, 항체, 항원 등은 히드로겔의 활성화된 관능기 모이어티와 공유결합하여 통과하지 못하게 함으로써 수행할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 히드로겔 공중합체가 코팅되어 있는 마이크로어레이용 기판을 제공한다.
본 발명의 기판에 있어서, 기판은 예를 들면, 유리, 실리콘 웨이퍼, 플라스틱, 폴리스티렌, 막, 및 금속판이 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 기판은 특별한 형상에 한정되는 것은 아니며 예를 들면, 평편한 형상, 나노입자 및 채널상의 형상을 가질 수 있으나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 코팅은 종래 마 이크로어레이의 제작과정에 있어서 널리 알려져 있으며, 본 발명에 있어서 종래에 알려진 이들 임의의 코팅 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 코팅은 자기조립박막코팅법, 스핀 코팅법, 침적법, 스프레이법, 프린팅법 및 랑그무어 블로젯트법 (LB 법)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 이루어질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 기판에 상기 히드로겔 공중합체의 코팅은 알콕시실란과 기판 상의 OH 기의 반응을 통해 수행된다. 또한, 상기한 바와 같은 코팅법을 사용하여 당업자라면 선택된 코팅 방법에 따라 적절한 조건을 설정하여 반응을 수행할 수 있다.
본 발명은 또한, 기판 상의 상기 히드로겔 공중합체에 생물분자가 고정화되어 있는 마이크로어레이를 제공한다. 상기 생물분자는 단백질 또는 핵산일 수 있으므로, 본 발명의 마이크로어레이는 예를 들면, 단백질 및 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이가 포함된다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 히드로겔 공중합체를 기판에 코팅하는 단계; 및
상기 코팅된 히드로겔 공중합체와 생물분자를 커플링 반응시켜 생물분자를 기판 상에 고정화하는 단계를 포함하는 마이크로어레이의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 기판에 있어서, 기판은 예를 들면, 유리, 실리콘 웨이퍼, 플라스틱, 폴리스티렌, 막, 및 금속판이 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 기판은 특별한 형상에 한정되는 것은 아니며 예를 들면, 평편한 형상, 나노입자 및 채널상의 형상을 가질 수 있으나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 코팅은 종래 마이크로어레이의 제작과정에 있어서 널리 알려져 있으며, 본 발명에 있어서 종래에 알려진 이들 임의의 코팅 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 코팅은 자기조립박막코팅법, 스핀 코팅법, 침적법, 스프레이법, 프린팅법 및 랑그무어 블로젯트법 (LB 법)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 이루어질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 기판에 상기 히드로겔 공중합체의 코팅은 알콕시실란과 기판 상의 OH 기의 반응을 통해 수행된다. 또한, 상기한 바와 같은 코팅법을 사용하여 당업자라면 선택된 코팅 방법에 따라 적절한 조건을 설정하여 반응을 수행할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 커플링 반응은 상기 기판 상에 코팅된 히드로겔 공중합체의 용이 이탈기 (good leaving group), 예를 들면
Figure 112005002141737-pat00015
,
Figure 112005002141737-pat00016
또는
Figure 112005002141737-pat00017
를 생물분자 중의 반응기 예를 들면, 아미노기와의 반응에 의하여 생물분자로 치환되는 반응이다. 상기 생물분자는 기판 상에 고정화되는 물질로서, 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 생물분자에는 예를 들면, 단백질, 핵산 및 다당류가 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 생물분자는 단백질 또는 핵산이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 본 발명의 히드로겔 공중합체의 합성
1 단계: 6-아크릴로일아미노-헥산산(1) 합성
Figure 112005002141737-pat00018
수산화나트륨 (7.6 g, 190 mmol) 및 6-아미노헥산산 (10 g, 76 mmol)을 실온에서 증류수(50 mL)에 용해하였다. 건조 CH2Cl2(50 mL) 중의 아크릴로일 클로라이드 (8.24 g, 91 mmol)를 실온에서 상기 혼합물에 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하였다. 반응을 실온에서 10% HCl(20 mL, pH=3)을 첨가함으로써 정지시키고, 혼합물을 에틸 아세테이트(2×100 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4 로 건조하고, 농축하여 백색 고체로서 생성물을 수득하였다(11.6 g, 82%). 상기 화합물을 추가 정제 없이 사용하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.40 (m, 2H), 1.59 (m, 4H), 2.37 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.48 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 5,63 (dd, J = 10.2 Hz, J = 1.5Hz, 1H), 5.78 (s, NH-, 1H), 6.10 (dd, J = 17.1 Hz, J = 10.5 Hz, 1H), 6.28 (dd, J = 17.1 Hz, J = 1.5 Hz, 1H).

2 단계: 6-아크릴로일아미노-헥산산 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (2) 합성
Figure 112005002141737-pat00019
N-히드록시숙신이미드 (3.34 g, 29 mmol) 및 6-아크릴로일아미노-헥산산 (1, 5 g, 27 mmol)을 실온에서 건조 CH2Cl2(100 mL)에 용해하였다. 건조 CH2 Cl2(20 mL)중의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC) (5.98 g, 29 mmol) 용액을 0℃에서 상기 혼합물에 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 고체 잔류물을 소결된 유리 필터를 통해 여과하고, 여과액을 농축하여 백색 고체로서 생성물을 수득하였다(6.3 g, 84%). 칼럼 크로마토그래피[Hex:EA = 1:2 (+ 10% MeOH)]에 의한 조 생성물의 정제로 백색 고체로서 생성물을 수득하였다(6.1 g, 80%).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.5 (m, 4H), 1.59 (m, 2H), 2.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.85 (s, J = 4H), 3.36 (q, J = 6 Hz, 2H), 5,63 (dd, J = 10.2 Hz, J = 1.5Hz, 1H), 6.10 (dd, J = 17.1 Hz, J = 10.5 Hz, 1H), 6.28 (dd, J = 17.1 Hz, J = 1.5 Hz, 1H).

3 단계: 3-(트리에톡시실릴)프로필아크릴아미드 (3) 합성
Figure 112005002141737-pat00020
3-아미노프로필트리에톡시실란 (1.5 g, 6.78 mmol) 및 트리에틸아민 (1.03 g, 10.17 mmol)을 질소 대기하에 0℃에서 건조 THF (7 mL)에 용해하였다. 건조 THF (7 mL) 중의 아크릴로일 클로라이드(0.92 g, 10.17 mmol)를 0℃에서 상기 혼합물에 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 10시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 소결된 유리 필터를 통해 여과하고, 여과액을 농축하여 적색 오일로서 생성물을 수득하였다(1.31 g, 70%). 상기 화합물을 추가 정제 없이 사용하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.65 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 9H), 1.57 (m, 2H), 3.33 (q, J = 6 Hz, 2H), 3.82 (q, J = 6.9 Hz, 6H), 5,60 (dd, J = 9.9 Hz, J = 1.5Hz, 1H), 6.12 (dd, J = 17.1 Hz, J = 9.9 Hz, 1H), 6.25 (dd, J = 17.1 Hz, J = 1.5 Hz, 1H).

4 단계: 무작위 공중합체 (4) 합성
Figure 112005002141737-pat00021

6-아크릴로일아미노-헥산산 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (2, 0.71 g, 2.5 mmol), 3-(트리에톡시실릴)프로필아크릴아미드 (3, 0.69 g, 2.5 mmol), N-이소프로필아크릴아미드 (1.42 g, 12.5 mmol), 디(에틸렌글리콜)에틸 에테르 아크릴레이트 (2.35 g, 12.5 mmol) 및 N,N'-아조비스이소부티로니트릴 (AIBN, 0.59g, 3 mmol)을 질소 대기하에서 실온에서 건조 톨루엔 (80 mL)에 용해하였다. 상기 혼합 물을 80℃에서 20시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 헥산(500 ml)내로 적하하여 중합체를 침전시켰다. 생성된 침전물을 여과로 수합하고, 진공에서 건조시켜 담황색 고체로서 원하는 중합체를 수득하였다 (2 g, 40%).
실시예 2: 본 발명의 히드로겔 공중합체를 이용한 단백질의 제거 효과
상기 실시예 1에서 합성된 본 발명의 히드로겔 공중합체가 핵산과 단백질이 포함된 시료에서 단백질을 효율적으로 제거하는지를 알아보기 위해, 여과지에 본 발명의 히드로겔 공중합체를 코팅하였다. 여과지(공극 크기: 3㎛)를 상기 히드로겔 공중합체로 코팅하고, Cy3 태깅된 DNA(500-머) 및 Cy3 태깅된 IgG를 각각 상기 코팅된 여과지를 통과시켰다. 여과지를 통과한 후의 Cy3 태깅된 DNA 및 IgG의 상대적인 양을 530nm에서의 흡광도를 통해 측정하였다. 대조군은 코팅되지 않은 여과지를 사용한 것이다. 결과는 하기 표와 같다.

DNA		 DNA 용액 0.067 -
히드로겔 필터 0.066 1.5% 제거
대조군 0.066 1.5% 제거

단백질(IgG)		 IgG 용액 0.120 -
히드로겔 필터 0.061 50% 제거
대조군 0.093 24% 제거

도 1은 본 발명의 히드로겔 중합체를 이용한 IgG 제거 효율을 나타내는 그래프이다. 상기 표 및 도 1에서 보여주는 바와 같이, DNA는 본 발명의 히드로겔 중합체가 코팅된 히드로겔 필터에 의해 1.5% 정도로 매우 적게 제거되는 반면, IgG는 본 발명의 히드로겔 필터에 의해 50% 정도로 매우 많이 제거된다는 것을 알 수 있다. 대조군으로 사용된 본 발명의 히드로겔 중합체로 코팅되지 않은 여과지를 이 용한 경우에도 IgG 는 24% 제거된다는 것을 알 수 있다. 그러나, 본 발명의 히드로겔 필터를 이용하면 대조군보다 약 2배 정도의 단백질 제거 효율을 보인다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 히드로겔 공중합체를 이용하면 세포를 용해한 후의 세포 용해물에 존재하는 핵산 및 단백질의 혼합물로부터 단백질을 제거하여 핵산을 효율적으로 정제할 수 있음을 알 수 있는 것이다.
실시예 3: 본 발명의 히드로겔 공중합체를 코팅한 기판의 제조
본 발명의 히드로겔 공중합체를 이용하여 마이크로어레이용 기판을 제조하였 다. 기판의 제작 공정은 하기와 같은 순서로 제작하였다.
Figure 112005002141737-pat00022
1. 유리 세정
본 발명에서는 생체물질 고정화용 기판으로 25×75 mm 크기의 슬라이드 글라스(#2948, 코닝사, USA) 기판을 사용하였다. 코팅을 하기전에 유리 표면에 부착된 먼지, 오염물질(유기물, 무기물)등을 제거하는 것이 중요하므로, 먼저 슬라이드 글라스를 탈이온수로 충분하게 흘려서 먼지를 제거하고 H2SO4 용액과 H2O 2 용액을 3:1 배합으로 혼합한 혼합용액 (piranha 용액)에 1시간 동안 침적시켜서 오염물질을 제 거하였다. 이어서, 탈이온수로 충분하게 흘려서 표면에 잔존하는 piranha 용액을 제거한 후 아세톤 용액, 이소프로필알코올 용액에서 각각 5분간 초음파세정을 수행하였다. 세정이 완료된 유리 기판은 스핀 드라이어(spin dryer)를 사용하여 건조하였다.
2. 코팅액 제조
코팅액의 용매는 디메틸포름아미드(DMF), 에탄올, 톨루엔 등을 사용하였다. 상기 용매 중 코팅 특성이 가장 양호한 용매는 DMF 이었다. 코팅액은 히드로겔을 중량%로 DMF 용매에 1% (w/w %) 혼합하여 제조하였다.
3. 코팅 (자기조립 박막 코팅)
세정된 유리 표면에 단백질, DNA 등과 반응할 수 있는 히드로겔 링커를 코팅하는 단계이다. 세정된 유리를 상온에서 1시간 동안 상기 제조한 히드로겔 코팅액에 침적하여 표면에 코팅시켰다.
4. 제1세정
자기조립박막법으로 코팅된 히드로겔 기판 위에 반응하지 않고 남아 있는 코팅액을 제거하는 단계이다. 화학적으로 공유결합한 코팅 물질이 기판에 단분자막으로 균일하게 코팅되게 하고 그 외 불순물들을 제거하기 위하여, 에탄올 용액에 침지시켜 5분간 교반하였다. 세정 후 스핀 드라이어를 이용하여 건조시켜 얼룩이 생기지 않도록 하였다.
5. 굽기
유리 기판에 공유 결합된 히드로겔 링커의 결합력을 향상시키기 위하여 110 ℃ 오븐에서 45분 동안 경화시켰다.
6. 제2세정 및 건조
굽기 공정이 완료된 히드로겔 코팅 기판 표면에 화학적으로 결합하지 않은 코팅물질, 불순물등을 완전히 제거하기 위하여 에탄올 용액에 침지시켜 5분 동안 교반하여 세정 공정을 수행하였다. 스핀 드라이어를 이용하여 표면에 남아 있는 에탄올을 증발시켜 기판을 건조시켰다.
실시예 4: 본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판을 이용한 핵산의 고정화 효과
본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판이 핵산을 효율적으로 고정화하는지를 알아보기 위해, DNA 프로브인 압타머(aptamer)를 상기 기판에 고정화하였다. 압터머의 상기 기판에의 고정화는 통상적인 고정화 기술을 이용하였다. 압타머는 IgG의 Fc에 특이적인 압타머(70-머, 1.4μM)를 이용하였으며, 압타머에 특이적으로 결합하는 분석 단백질은 Cy3 태깅된 인간 IgG(10㎍/ml)를 이용하였다. 사용된 기판으로는 본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판, NHS가 코팅된 기판(본 실험실 제조), 및 아민 기판(코닝사)을 이용하였다. 상기 각각의 코팅된 기판에 분석 단백질을 결합시킨 후, 레이저 스캐너를 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 도 2는 압타머로 코팅된 각각의 기판에 결합된 Cy3 태깅된 인간 IgG의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것을 나타내는 그래프이다. 도 2에 보여주는 바와 같이, 본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판은 NHS가 코팅된 기판에 비해 약 130%의 핵산의 고정화 능력을 향상시킨다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판을 이용하면 핵산을 고집적화할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5: 본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판을 이용한 단백질의 고정화 효과
본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판이 단백질을 효율적으로 고정화하는지를 알아보기 위해, IgG 프로브를 상기 기판에 고정화하였다. IgG 프로브의 상기 기판에의 고정화는 통상적인 고정화 기술을 이용하였다. IgG는 Cy3 태깅된 인간 IgG를 각각 100㎍/ml, 1㎍/ml, 및 0.01㎍/ml을 이용하였다. 사용된 기판으로는 본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판, NHS가 코팅된 기판(본 실험실 제조), 및 아민 기판(코닝사)을 이용하였다. 상기 각각의 기판에 고정화된 Cy3 태깅된 인간 IgG를 레이저 스캐너를 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 도 3은 각각의 기판에 고정화된 Cy3 태깅된 인간 IgG의 형광 강도를 레이저 스캐너로 측정한 것을 나타내는 그래프이다. 도 3에 보여주는 바와 같이, 본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판은 아민 기판에 비해 Cy3 태깅된 인간 IgG가 1㎍/ml의 경우에는 122% 및 0.01㎍/ml의 경우에는 1160% 단백질 고정화 능력을 향상시킨다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 히드로겔 공중합체가 코팅된 기판을 이용하면 단백질을 고집적화할 수 있음을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 히드로겔 공중합체를 이용하면 단백질의 효율적인 제거가 가능하고, 마이크로어레이용 기판에 핵산 및 단백질을 고집적화하는 것이 가능하다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1 및 2의 반복단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 히드로겔 공중합체:
    [화학식 1]
    Figure 112011015882864-pat00023
    (식 중,
    X1은 단순결합, O, S, 탄소수 1 내지 20의 알킬렌, 탄소수 1 내지 20의 헤테로알킬렌, 탄소수 2 내지 20의 알케닐렌, 탄소수 2 내지 20의 헤테로알케닐렌, 혹은 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기를 나타내며, R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 히드록시기, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 1 내지 20의 알콕시기, 탄소수 1 내지 20의 알케닐기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기, 혹은 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴옥시기를 나타내며, b는 10 내지 100,000의 정수이다);
    [화학식 2]
    Figure 112011015882864-pat00039
    (식 중,
    X3는 단순결합, O, S, 탄소수 1 내지 20의 알킬렌, 탄소수 1 내지 20의 헤테로알킬렌, 탄소수 2 내지 20의 알케닐렌, 탄소수 2 내지 20의 헤테로알케닐렌, 혹은 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기를 나타내며, R5는
    Figure 112011015882864-pat00025
    ,
    Figure 112011015882864-pat00026
    또는
    Figure 112011015882864-pat00027
    이고, d는 10 내지 100,000의 정수이다).
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 화학식 3의 반복단위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히드로겔 공중합체:
    [화학식 3]
    Figure 112005002141737-pat00028
    (식 중,
    a는 10 내지 100,000의 정수를 나타낸다).
  3. 제 1 항에 있어서, 하기 화학식 4의 반복단위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히드로겔 공중합체:
    [화학식 4]
    Figure 112011015882864-pat00029
    (식 중,
    X2는 단순결합, O, S, 탄소수 1 내지 20의 알킬렌, 탄소수 1 내지 20의 헤테로알킬렌, 탄소수 2 내지 20의 알케닐렌, 탄소수 2 내지 20의 헤테로알케닐렌, 혹은 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기를 나타내며, R4는 수소원자, 할로겐원자, 히드록시기, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 1 내지 20의 알콕시기, 탄소수 1 내지 20의 알케닐기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기, 혹은 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴옥시기를 나타내며. c는 10 내지 100,000의 정수이다).
  4. 하기 화학식 1 내지 4의 반복단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 히드로겔 공중합체:
    [화학식 1]
    Figure 112011097272205-pat00030
    [화학식 2]
    Figure 112011097272205-pat00040
    [화학식 3]
    Figure 112011097272205-pat00032
    [화학식 4]
    Figure 112011097272205-pat00033
    (식 중, X1, X2 및 X3은 단순결합, O, S, 탄소수 1 내지 20의 알킬렌, 탄소수 1 내지 20의 헤테로알킬렌, 탄소수 2 내지 20의 알케닐렌, 탄소수 2 내지 20의 헤테로알케닐렌, 혹은 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기를 나타내며, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 히드록시기, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 1 내지 20의 알콕시기, 탄소수 1 내지 20의 알케닐기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기, 혹은 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴옥시기를 나타내며, R5는
    Figure 112011097272205-pat00041
    ,
    Figure 112011097272205-pat00042
    또는
    Figure 112011097272205-pat00043
    이고, a,b,c 및 d는 10 내지 100,000의 정수이다).
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 히드로겔 공중합체를 나노세공(nanopore)이 형성되어 있는 기판 상에 도포하는 단계;
    상기 히드로겔 공중합체와 아미노기를 갖는 물질을 포함하는 시료를 반응시 키는 단계; 및
    반응되지 않은 시료를 용출하는 단계를 포함하는 시료로부터 아미노기를 갖는 물질을 선택적으로 제거하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 아미노기를 갖는 물질은 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 히드로겔 공중합체가 코팅되어 있는 마이크로어레이용 기판.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 기판은 유리, 실리콘 웨이퍼, 플라스틱, 폴리스티렌, 막, 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기판.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 기판에 상기 히드로겔 공중합체의 코팅은 알콕시실란과 기판 상의 OH 기의 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 기판.
  10. 제 7 항에 따른 기판 상의 상기 히드로겔 공중합체에 단백질 또는 핵산이 고정화되어 있는 마이크로어레이.
  11. 삭제
  12. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 따른 히드로겔 공중합체를 기판에 코팅하는 단계; 및
    상기 코팅된 히드로겔 공중합체와 단백질 또는 핵산을 커플링 반응시켜 단백질 또는 핵산을 기판 상에 고정화하는 단계를 포함하는 마이크로어레이의 제조 방법.
  13. 삭제
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