JP3423032B2 - 固体担体上のバイオ特異的認識表面およびそれらの製造方法 - Google Patents
固体担体上のバイオ特異的認識表面およびそれらの製造方法Info
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Description
【０００１】本発明は、固体相上の生物学的認識層およ
びこれらの層の製造方法に関するものである。
びこれらの層の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生物学的認識層を有する固体相は、アッ
セイ技術として集合的に知られている生物学的分析方法
において使用されている。例は、問題の分子の標識方法
に依存して酵素免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイまたは
放射免疫アッセイである。
セイ技術として集合的に知られている生物学的分析方法
において使用されている。例は、問題の分子の標識方法
に依存して酵素免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイまたは
放射免疫アッセイである。
【０００３】最近の生物学的分析の文献においては、
「親和性センサー」がそのような検出方法について記述
されることが増加しつつある。既存のアッセイ技術とは
対照的に、これらのセンサーは標識無しの、洗浄および
分離工程を使用しない直接検出のために使用されうる。
これらの親和性センサーは、通常物理的転換器、例えば
より特定的にはピエゾ電気的転換器［Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．６３（１９９１）３９３Ａ］または光学的転換器
［Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ４（１９８３）２９
９；Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍｓ １２６（１９
８５）２０５；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｓｅｎｓｉｎｇ ６（１９９１）２１５］または電気化
学的転換器［Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅ
ｃｔｒｏｎｉｃｓ ６（１９９１）５５］を含み、該セ
ンサーは、前記生物学的認識層に密に連結される。
「親和性センサー」がそのような検出方法について記述
されることが増加しつつある。既存のアッセイ技術とは
対照的に、これらのセンサーは標識無しの、洗浄および
分離工程を使用しない直接検出のために使用されうる。
これらの親和性センサーは、通常物理的転換器、例えば
より特定的にはピエゾ電気的転換器［Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．６３（１９９１）３９３Ａ］または光学的転換器
［Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ４（１９８３）２９
９；Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍｓ １２６（１９
８５）２０５；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｓｅｎｓｉｎｇ ６（１９９１）２１５］または電気化
学的転換器［Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅ
ｃｔｒｏｎｉｃｓ ６（１９９１）５５］を含み、該セ
ンサーは、前記生物学的認識層に密に連結される。
【０００４】これらの親和性センサーの信号は、表面に
おける分子の吸着または脱着による占有の変化に直接的
に比例するため、センサーによる分析における生物学的
認識層は、特に高度な要求を満たさなければならない。
アッセイ技術において、生物学的認識層は、しばしば生
物学的認識分子または分子断片の物理的吸着によって固
体相に結合されているが、しかしながら、センサーによ
る分析においては認識分子の表面からの脱着を防止する
ために基本的には認識分子は表面に共有結合的に結合さ
れなければならない。生物学的認識分子を表面に共有的
に固定化する場合には、以下の点が考慮されなければな
らない。
おける分子の吸着または脱着による占有の変化に直接的
に比例するため、センサーによる分析における生物学的
認識層は、特に高度な要求を満たさなければならない。
アッセイ技術において、生物学的認識層は、しばしば生
物学的認識分子または分子断片の物理的吸着によって固
体相に結合されているが、しかしながら、センサーによ
る分析においては認識分子の表面からの脱着を防止する
ために基本的には認識分子は表面に共有結合的に結合さ
れなければならない。生物学的認識分子を表面に共有的
に固定化する場合には、以下の点が考慮されなければな
らない。
【０００５】検出の感度およびこれらの親和性センサー
の機能範囲は、表面被覆における変化に関する転換器の
分解能および検出されるべき物質についての認識層の親
和性ならびに前記物質を結合する表面の容量に依存す
る。「結合容量」は、単位面積当たりの活性結合部位の
数を意味する。
の機能範囲は、表面被覆における変化に関する転換器の
分解能および検出されるべき物質についての認識層の親
和性ならびに前記物質を結合する表面の容量に依存す
る。「結合容量」は、単位面積当たりの活性結合部位の
数を意味する。
【０００６】文献は、生物学的認識分子の表面への共有
的結合のための種々の方法の記述を含む。これらの方法
は、通常固定化に先行する分子の生物学的または化学的
修飾を含んでいる。以下は、免疫センサーへの抗体また
は抗体断片の共有的固定化の典型的例である：
的結合のための種々の方法の記述を含む。これらの方法
は、通常固定化に先行する分子の生物学的または化学的
修飾を含んでいる。以下は、免疫センサーへの抗体また
は抗体断片の共有的固定化の典型的例である：
【０００７】ｉ） Ｆｃ部分の糖残基の酸化、および得
られたアルデヒド基を介しての、ヒドラジン基の形態の
相補的反応性基を含む表面への抗体の固定化。
られたアルデヒド基を介しての、ヒドラジン基の形態の
相補的反応性基を含む表面への抗体の固定化。
【０００８】ii） 得られたアルデヒド基と適当なビオ
チン誘導体との反応。アビジンに対するビオチンの既知
の高い親和性のために、こうして修飾された抗体は、ア
ビジン／ストレプトアビジン表面にきわめて強固に吸着
する。
チン誘導体との反応。アビジンに対するビオチンの既知
の高い親和性のために、こうして修飾された抗体は、ア
ビジン／ストレプトアビジン表面にきわめて強固に吸着
する。
【０００９】iii) 抗体のペプシンによる処理、得られ
たＦａｂ２断片のＦａｂ’断片への還元およびＦａｂ’
断片のそれらのＳＨ基による適当な官能基（例えばジチ
オピリジル基）を備えた表面への固定化。
たＦａｂ２断片のＦａｂ’断片への還元およびＦａｂ’
断片のそれらのＳＨ基による適当な官能基（例えばジチ
オピリジル基）を備えた表面への固定化。
【００１０】既知の方法は、生物学的認識分子の化学的
および／または生化学的修飾が、活性の有意な損失を生
じることである。
および／または生化学的修飾が、活性の有意な損失を生
じることである。
【００１１】従って、本発明の目的は、認識されるべき
分子の固体相上への高い結合容量を有する生物学的認識
非修飾分子の、整列された共有的固定化層を提供するこ
とである。高い親和性および結合容量を得るために、活
性かつ特異的結合部位の高い密度が必要とされる。
分子の固体相上への高い結合容量を有する生物学的認識
非修飾分子の、整列された共有的固定化層を提供するこ
とである。高い親和性および結合容量を得るために、活
性かつ特異的結合部位の高い密度が必要とされる。
【００１２】驚くべきことに、前記生物学的認識分子の
整列された共有的固定化層が、官能基生成または認識分
子への共有結合のための化学的および／または生化学的
修飾無しに得られることが見い出された。
整列された共有的固定化層が、官能基生成または認識分
子への共有結合のための化学的および／または生化学的
修飾無しに得られることが見い出された。
【００１３】本発明によれば、生物学的認識分子の整列
された共有的固定化が、固体相表面の適当な修飾の後
に、分析されるべき物質を認識しない分子領域を介し
て、固定化されるべき分子の吸着によって行われる。こ
の吸着工程に次いで、分析されるべき物質を認識しない
領域を介して、この固定化工程に特に適し、かつ担体分
子を介して該方法に導入される特異的交差結合試薬を使
用して共有結合工程が行われる。該担体分子は、分析さ
れるべき物質を認識する分子の整列吸着の前、間、また
は後に固体相表面に吸着または結合されうる。
された共有的固定化が、固体相表面の適当な修飾の後
に、分析されるべき物質を認識しない分子領域を介し
て、固定化されるべき分子の吸着によって行われる。こ
の吸着工程に次いで、分析されるべき物質を認識しない
領域を介して、この固定化工程に特に適し、かつ担体分
子を介して該方法に導入される特異的交差結合試薬を使
用して共有結合工程が行われる。該担体分子は、分析さ
れるべき物質を認識する分子の整列吸着の前、間、また
は後に固体相表面に吸着または結合されうる。
【００１４】従って本発明は、認識分子層およびこの層
の製造方法を記述するもので、これによって非修飾認識
分子（例えば、抗体、レセプタまたはＤＮＡ分子）が、
表面上に整列された様式で固定化される。
の製造方法を記述するもので、これによって非修飾認識
分子（例えば、抗体、レセプタまたはＤＮＡ分子）が、
表面上に整列された様式で固定化される。
【００１５】該方法は原理的には、分析されるべき第１
の物質を認識する領域、および第１の領域から空間的に
十分に分離され、これによって認識分子が適切に修飾さ
れた表面に吸着されうる第２の領域を含む全ての認識分
子に適用可能である。示されるように、これらの構造的
前提条件は、ほとんど全ての認識生体分子において満た
される。
の物質を認識する領域、および第１の領域から空間的に
十分に分離され、これによって認識分子が適切に修飾さ
れた表面に吸着されうる第２の領域を含む全ての認識分
子に適用可能である。示されるように、これらの構造的
前提条件は、ほとんど全ての認識生体分子において満た
される。
【００１６】細胞膜のリガンド認識レセプタは、例えば
リガンド認識領域を含む分子の親水性部分を含み、か
つ、通常疎水性の膜内外部分を有する。これらのレセプ
タの疎水性表面に対する物理吸着は、膜内外部分を介し
て優先的に起こる。
リガンド認識領域を含む分子の親水性部分を含み、か
つ、通常疎水性の膜内外部分を有する。これらのレセプ
タの疎水性表面に対する物理吸着は、膜内外部分を介し
て優先的に起こる。
【００１７】抗体類は、抗原／ハプテンによってＦａｂ
部分を認識する領域、および抗原／ハプテン認識には重
要ではないＦｃ部分を含む。Ｆｃ部分を認識する分子の
固定化によって、固体相の表面は、抗体がＦｃ部分を介
して表面に方向付けして吸着されるように形成されう
る。
部分を認識する領域、および抗原／ハプテン認識には重
要ではないＦｃ部分を含む。Ｆｃ部分を認識する分子の
固定化によって、固体相の表面は、抗体がＦｃ部分を介
して表面に方向付けして吸着されるように形成されう
る。
【００１８】ＤＮＡ分子の場合には、相補鎖の認識のた
めに所定の配列のみが使用される。前記鎖上にあって相
補鎖認識に使用されない配列（例えば、３−１０塩基）
は、吸着前に対応する短い相補部分（例えば、３−１０
塩基）が、表面に固定化された場合に、方向付け吸着に
使用されうる。
めに所定の配列のみが使用される。前記鎖上にあって相
補鎖認識に使用されない配列（例えば、３−１０塩基）
は、吸着前に対応する短い相補部分（例えば、３−１０
塩基）が、表面に固定化された場合に、方向付け吸着に
使用されうる。
【００１９】最後に、認識生体分子は、遺伝子工学によ
って増大する量をもって製造されている。これらの方法
によって、認識分子の製造に使用されている微生物は、
付加的領域、特に表面への吸着に好適な領域が、認識分
子の特定の部分に合成されるように改変されうる。
って増大する量をもって製造されている。これらの方法
によって、認識分子の製造に使用されている微生物は、
付加的領域、特に表面への吸着に好適な領域が、認識分
子の特定の部分に合成されるように改変されうる。
【００２０】本発明は、例として抗体が固体相表面に共
有的に結合される抗原−ハプテン−認識層を参照して詳
細に論じられる。該固体相は、物理的転換器の表面であ
り得る。
有的に結合される抗原−ハプテン−認識層を参照して詳
細に論じられる。該固体相は、物理的転換器の表面であ
り得る。
【００２１】抗体の方向付け吸着は、最初に抗体のＦｃ
部分に対して特異的親和性を有する蛋白質の単分子層を
有する固体層の表面を与える。プロテインＡ、プロテイ
ンＧ、Ｆｃ部分認識抗体および抗体断片またはレセプタ
が、この種の蛋白質の典型的代表例であり、抗体のＦｃ
部分に対するそれらの親和性のためにそれらは抗体を表
面に整列することができる。優位には、この種のものの
うち抗体のＦｃ部分に対する多くの結合部位を有する蛋
白質（例えば、１分子あたりに４個の結合部位を有する
プロテインＡ）が使用され、また引き続いて分析される
べき抗体よりも有意に小さい空間（面積）をとるものが
使用される。（例えば、抗原認識領域間が１７ｎｍ離れ
たＩｇＧ−タイプ抗体に比較して、プロテインＡは、直
径約５ｎｍの球状構造を有する。）
部分に対して特異的親和性を有する蛋白質の単分子層を
有する固体層の表面を与える。プロテインＡ、プロテイ
ンＧ、Ｆｃ部分認識抗体および抗体断片またはレセプタ
が、この種の蛋白質の典型的代表例であり、抗体のＦｃ
部分に対するそれらの親和性のためにそれらは抗体を表
面に整列することができる。優位には、この種のものの
うち抗体のＦｃ部分に対する多くの結合部位を有する蛋
白質（例えば、１分子あたりに４個の結合部位を有する
プロテインＡ）が使用され、また引き続いて分析される
べき抗体よりも有意に小さい空間（面積）をとるものが
使用される。（例えば、抗原認識領域間が１７ｎｍ離れ
たＩｇＧ−タイプ抗体に比較して、プロテインＡは、直
径約５ｎｍの球状構造を有する。）
【００２２】これらの条件が至適状態で満たされた場合
には、蛋白質の共有結合的固定化が方向決定的に監視さ
れない場合にも、十分に高密度のＦｃ部分特異的結合部
位が表面上に得られる。
には、蛋白質の共有結合的固定化が方向決定的に監視さ
れない場合にも、十分に高密度のＦｃ部分特異的結合部
位が表面上に得られる。
【００２３】表面での配列を監視することなく前述のよ
うにＦｃ−部分認識蛋白質を固定化する既知方法は十分
な数存在する。通常、固体相の表面は、蛋白質の固定化
に適した高密度の官能基（例えば、ＣＯＯＨまたはＮＨ
2 ）を有する薄い付加的な有機層と共に与えられる。該
付加的な層は、例えばクロマトグラフィにより知られて
いるシラン化により、または最近の文献に記載されてい
るように溶液からの自己集積法、もしくは、化学蒸着、
プラズマ誘導化学蒸着またはプラズマ誘導重合として集
合的に知られている方法により気相から適用されうる。
Ｆｃ部分認識蛋白質は、既知の親和性クロマトグラフィ
法によって、表面の官能基を適当に活性化させ、次いで
それらを蛋白質上の官能基（例えば、ＮＨ2 またはＣＯ
ＯＨ）と反応させることにより共有的に固定化される。
うにＦｃ−部分認識蛋白質を固定化する既知方法は十分
な数存在する。通常、固体相の表面は、蛋白質の固定化
に適した高密度の官能基（例えば、ＣＯＯＨまたはＮＨ
2 ）を有する薄い付加的な有機層と共に与えられる。該
付加的な層は、例えばクロマトグラフィにより知られて
いるシラン化により、または最近の文献に記載されてい
るように溶液からの自己集積法、もしくは、化学蒸着、
プラズマ誘導化学蒸着またはプラズマ誘導重合として集
合的に知られている方法により気相から適用されうる。
Ｆｃ部分認識蛋白質は、既知の親和性クロマトグラフィ
法によって、表面の官能基を適当に活性化させ、次いで
それらを蛋白質上の官能基（例えば、ＮＨ2 またはＣＯ
ＯＨ）と反応させることにより共有的に固定化される。
【００２４】次いで抗体類は、表面に方向付けて固定化
され、この固定化は、固定化蛋白質の抗体ＦＣ部分に対
する親和性に基づく。しかしながら、これらの複合体
（例えばＩｇＧ プロテインＡ）の親和性定数が、通
常、ＩｇＧ分子の脱着を阻止するほどに十分ではないこ
とが知られている。更に、種々の下位種の抗体類は、そ
れらのＦｃ部分を介して蛋白質に結合される前に特定の
緩衝条件（例えば高いｐＨおよび高塩濃度）を必要と
し、また引き続いて緩衝溶液を変化させる（例えば、生
理的条件下）と抗体は直ちに脱着する。
され、この固定化は、固定化蛋白質の抗体ＦＣ部分に対
する親和性に基づく。しかしながら、これらの複合体
（例えばＩｇＧ プロテインＡ）の親和性定数が、通
常、ＩｇＧ分子の脱着を阻止するほどに十分ではないこ
とが知られている。更に、種々の下位種の抗体類は、そ
れらのＦｃ部分を介して蛋白質に結合される前に特定の
緩衝条件（例えば高いｐＨおよび高塩濃度）を必要と
し、また引き続いて緩衝溶液を変化させる（例えば、生
理的条件下）と抗体は直ちに脱着する。
【００２５】先に説明したように、方向付け吸着は、第
２の工程、すなわち整列分子の共有結合的固定化に続け
られなければならない。明らかであるが、この交差結合
工程は、抗原結合領域および引き続く抗体活性に影響を
与えない方法にて行われなければならない。交差結合の
ための慣用の化学的方法は、通常極めて非特異的であ
る、すなわち交差結合が抗原／ハプテン結合領域におい
ても起こるという欠点を有し、従って、次いで抗体の活
性が低下する。
２の工程、すなわち整列分子の共有結合的固定化に続け
られなければならない。明らかであるが、この交差結合
工程は、抗原結合領域および引き続く抗体活性に影響を
与えない方法にて行われなければならない。交差結合の
ための慣用の化学的方法は、通常極めて非特異的であ
る、すなわち交差結合が抗原／ハプテン結合領域におい
ても起こるという欠点を有し、従って、次いで抗体の活
性が低下する。
【００２６】交差結合工程は：
ｉ） 光活性化可能な基および化学的反応性基を含み、
特に分子の光活性化可能な部分に高い水溶性を有する２
官能性試薬を与え、
特に分子の光活性化可能な部分に高い水溶性を有する２
官能性試薬を与え、
【００２７】ii） 分析されるべき物質を認識しない領
域において光誘導的交差結合をもたらす方法、を含む選
択的交差結合技術によって行われる。
域において光誘導的交差結合をもたらす方法、を含む選
択的交差結合技術によって行われる。
【００２８】抗体が共有結合的に方向付けて結合される
表面を生ずる交差結合方法は、次の一般式を有する化合
物の使用に基づく。
表面を生ずる交差結合方法は、次の一般式を有する化合
物の使用に基づく。
【００２９】
【化１】
【００３０】式中、Ｘ1 は、カルボニル（＞Ｃ＝Ｏ）ま
たはスルホニル（＞ＳＯ2 ）基を意味し；Ｙ＝Ｈ、Ｙ’
またはＸ1 −Ｙ’であり、ここにおいてＹ’はヒドロキ
シル基またはアルコキシル基（−Ｏ−Ｙ”）またはアミ
ノ基（−ＮＨ−Ｙ”）であり、ここにおいてＹ”はＨま
たは（ＣＨ2 ）n Ａ型の水溶性基である。ｎ＝１−６で
ある。
たはスルホニル（＞ＳＯ2 ）基を意味し；Ｙ＝Ｈ、Ｙ’
またはＸ1 −Ｙ’であり、ここにおいてＹ’はヒドロキ
シル基またはアルコキシル基（−Ｏ−Ｙ”）またはアミ
ノ基（−ＮＨ−Ｙ”）であり、ここにおいてＹ”はＨま
たは（ＣＨ2 ）n Ａ型の水溶性基である。ｎ＝１−６で
ある。
【００３１】Ａは、グリコールまたはオリゴエチレング
リコール置換基、あるいはピリジル、ジアルキルアミ
ノ、Ｎ−アルキルピリジニウム、またはトリアルキルア
ンモニウム等の三級または四級アミノ基である。アルキ
ルは、およそＣ１−Ｃ４の低級アルキル残基を示す。
リコール置換基、あるいはピリジル、ジアルキルアミ
ノ、Ｎ−アルキルピリジニウム、またはトリアルキルア
ンモニウム等の三級または四級アミノ基である。アルキ
ルは、およそＣ１−Ｃ４の低級アルキル残基を示す。
【００３２】Ｒは、一般式：
【化２】
【００３３】式中、Ｘ2 は、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ
−）またはメチレン基（−ＣＨ2−）である、を有する
官能基である。
−）またはメチレン基（−ＣＨ2−）である、を有する
官能基である。
【００３４】Ｒ1 は、アミノ基（−ＮＨ−Ｒ2 ）または
カルボキシル誘導体（−ＣＯ−Ｒ3）を意味する。
Ｒ2 、は水素または誘導されたカルボキシアルカノイル
基（−ＣＯ−（−ＣＨ2 ）n ＣＯ−Ｒ3 ）である。
カルボキシル誘導体（−ＣＯ−Ｒ3）を意味する。
Ｒ2 、は水素または誘導されたカルボキシアルカノイル
基（−ＣＯ−（−ＣＨ2 ）n ＣＯ−Ｒ3 ）である。
【００３５】ＣＯ−Ｒ3 は、酸ハライド、イミダゾリ
ド、ヒドラジド、アンハイドライド、ジチオピリジル基
（−ＮＨ−（−ＣＨ2 ）n"' −Ｓ−Ｓ−ピリジル）を用
いて誘導されるカルボキシル基またはヒドロキシスクシ
ンイミド、イソウレア、もしくはヒドロキシスクシンイ
ミド−スルホン酸の反応性エステル等の活性化カルボキ
シル基である。
ド、ヒドラジド、アンハイドライド、ジチオピリジル基
（−ＮＨ−（−ＣＨ2 ）n"' −Ｓ−Ｓ−ピリジル）を用
いて誘導されるカルボキシル基またはヒドロキシスクシ
ンイミド、イソウレア、もしくはヒドロキシスクシンイ
ミド−スルホン酸の反応性エステル等の活性化カルボキ
シル基である。
【００３６】ｎ' 、ｎ" 、ｎ"'は、１−６の整数を示
す。
す。
【００３７】Ｘ2 がメチレン基を意味する場合には、Ｒ
3 はジスルフィド基を含まなければならず、従ってＲ3
は、例えばＲ2 が前記の意味を有し、Ｒ2 に含まれるＲ
3 がジスルフィド基を含まないシスタミン誘導体−ＮＨ
−( ＣＨ2 ）2 −Ｓ- Ｓ−(ＣＨ2 ）2 −ＮＨ−Ｒ2 を
示す。
3 はジスルフィド基を含まなければならず、従ってＲ3
は、例えばＲ2 が前記の意味を有し、Ｒ2 に含まれるＲ
3 がジスルフィド基を含まないシスタミン誘導体−ＮＨ
−( ＣＨ2 ）2 −Ｓ- Ｓ−(ＣＨ2 ）2 −ＮＨ−Ｒ2 を
示す。
【００３８】Ｙ＝Ｈの場合、Ｘ1-Ｒ（Ｒ3 を含まない）
は、親水性基（例えば、Ｘ1 ＝−ＳＯ2 −またはＲ1 ＝
三級または四級アミノ基）である。
は、親水性基（例えば、Ｘ1 ＝−ＳＯ2 −またはＲ1 ＝
三級または四級アミノ基）である。
【００３９】親水性基Ｘ1 −Ｒ（Ｒ3 を含まない）につ
いて、Ｙは場合によりＸ1 −Ｒ（二重固定）であり得
る。
いて、Ｙは場合によりＸ1 −Ｒ（二重固定）であり得
る。
【００４０】アミノ基Ｒ1 はまた、イソシアネート、イ
ソチオシアネート、ビニルスルホンアミド（−ＮＨ−Ｓ
Ｏ2 −ＣＨ＝ＣＨ2 ）、マレイミド、ハロ−置換トリア
ジノアミノ、ピリミジンアミノもしくはピリジンアミノ
化合物（例えばジクロロトリアジン）、２−ハロカルボ
ン酸誘導体（２−ハロ酢酸ハライド、２−ハロプロピオ
ン酸ハライド等）、ジカルボン酸ハライド由来のモノア
ミド、例えばエピクロロヒドリンによるエポキシド、ま
たはキノンへのミカエル付加によるシクロヘキセンジオ
ン誘導体等、他の反応性基の変換されうる。
ソチオシアネート、ビニルスルホンアミド（−ＮＨ−Ｓ
Ｏ2 −ＣＨ＝ＣＨ2 ）、マレイミド、ハロ−置換トリア
ジノアミノ、ピリミジンアミノもしくはピリジンアミノ
化合物（例えばジクロロトリアジン）、２−ハロカルボ
ン酸誘導体（２−ハロ酢酸ハライド、２−ハロプロピオ
ン酸ハライド等）、ジカルボン酸ハライド由来のモノア
ミド、例えばエピクロロヒドリンによるエポキシド、ま
たはキノンへのミカエル付加によるシクロヘキセンジオ
ン誘導体等、他の反応性基の変換されうる。
【００４１】
X1 = -CO-
X1 = -SO2-
X2 = -S-S-
X2 = -(CH2)-
Y = -H A = -O-(CH2)2-O-H
Y = -Y' A = -O-[(CH2)2-O] n -H
Y = -CO-Y' = -X1-Y' Y' = -O-Y" Y" = -H A = -N(アルキル)2
Y = -SO2-Y' = -X1-Y' Y' = -NH-Y" Y" =-(CH2)n -A A = -N+ (アルキル)3
A = -ヒ゜リシ゛ン
A=-ピリジニウム(N-アルキル)
【００４２】
R1 = -CO-R3 R2 = H COR3 = CO-Cl
R1 = -NH-R2 R2 = -CO-(CH2) n -CO-R3 COR3 = CO-O-アシル
COR3 = CO-イソウレア
COR3 = CO-OSu
COR3 = CO-OSu(SO3H)
COR3 = CO-NH-NH2
COR3 = CO-NH-(CH2)n -S-S-ヒ゜リシ゛ル
COR3 = CO-NHCONH2
COR3 = CO-イミタ゛ソ゛リル
【００４３】Ｘ2 ＝−ＣＨ2 −、
Ｒ1 ＝ＣＯＲ3 ＝ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2 ）2 −Ｓ- Ｓ−
（ＣＨ2 ）2 −ＮＨ−Ｒ 2(Ｒ2 ＝Ｈ、ＣＯ−（ＣＨ2 ）
n −ＣＯ−Ｒ3 ）、ここにおいてＲ3 はジスルフィド化
合物を除いて上記３列目に定義されたものと同様であ
る。
（ＣＨ2 ）2 −ＮＨ−Ｒ 2(Ｒ2 ＝Ｈ、ＣＯ−（ＣＨ2 ）
n −ＣＯ−Ｒ3 ）、ここにおいてＲ3 はジスルフィド化
合物を除いて上記３列目に定義されたものと同様であ
る。
【００４４】
Ｒ1 ＝ピリジニウム（Ｎ−ＣＨ2 −ＣＯ−Ｒ3 ）
Ｒ1 ＝ＮＨ2 → −Ｎ＝Ｃ＝Ｏ
−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ
ＣＨ2 ＝ＣＨ−ＳＯ2 −ＮＨ−
−マレインイミジル
−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｃｌ）−アルキル
−ＮＨ−ＣＯ−アルキレン−ＣＯ−Ｃｌ
−ＮＨ−ＣＨ2 −オキシラン
−ＮＨ−シクロヘキセンジオン
−ＮＨ−ジクロロトリアシニル
【００４５】ここにクレームされる先に特定した異種２
官能性試薬を使用する方向付け固定化方法は、Ｆｃ部分
認識蛋白質が共有結合的に固定化される表面に基づいて
いる。本発明による方法は、蛋白質層および次いでＦｃ
部分を介して層に固定される抗体のいずれもが、光誘発
交差結合の前に光活性化可能な交差結合試薬によって修
飾されないことを特徴とする。このことは、抗体のＦｃ
部分の結合のための蛋白質層の活性が、交差結合試薬に
て層を修飾することによって劇的に低減することによ
る。すでに述べたように、固定化されるべき抗体が抗原
認識領域において試薬と結合することによって化学的に
修飾された場合には、抗原−ハプテン認識活性が損なわ
れるか、または表面に固定化された蛋白質によるＦＣ部
分の認識が、Ｆｃ部分の付加によって損なわれる。
官能性試薬を使用する方向付け固定化方法は、Ｆｃ部分
認識蛋白質が共有結合的に固定化される表面に基づいて
いる。本発明による方法は、蛋白質層および次いでＦｃ
部分を介して層に固定される抗体のいずれもが、光誘発
交差結合の前に光活性化可能な交差結合試薬によって修
飾されないことを特徴とする。このことは、抗体のＦｃ
部分の結合のための蛋白質層の活性が、交差結合試薬に
て層を修飾することによって劇的に低減することによ
る。すでに述べたように、固定化されるべき抗体が抗原
認識領域において試薬と結合することによって化学的に
修飾された場合には、抗原−ハプテン認識活性が損なわ
れるか、または表面に固定化された蛋白質によるＦＣ部
分の認識が、Ｆｃ部分の付加によって損なわれる。
【００４６】固定化蛋白質または固定化されるべき抗体
の光活性化可能な交差結合試薬による化学修飾は、光化
学試薬のための担体としての第３の分子種（補助分子）
を使用することによって回避することができる。ここに
おいて更に特定されるこれらの担体分子は、交差結合試
薬と引き続いて多くの光活性化可能な基が、単一の担体
分子に共有的に結合されるように外因的に反応する。こ
の化学的修飾形態において、担体分子は、転換器の表面
に抗体−整列蛋白質によって固定化されるか、または固
定化されるべき抗体と共に蛋白質表面に共吸着される。
驚くべきことに、これらの担体分子の整列蛋白質との同
時固定化、および前記担体分子の同時吸着が、共有的に
結合された蛋白質層上の抗体の吸着に対して干渉するこ
となく行われうることが見い出された。
の光活性化可能な交差結合試薬による化学修飾は、光化
学試薬のための担体としての第３の分子種（補助分子）
を使用することによって回避することができる。ここに
おいて更に特定されるこれらの担体分子は、交差結合試
薬と引き続いて多くの光活性化可能な基が、単一の担体
分子に共有的に結合されるように外因的に反応する。こ
の化学的修飾形態において、担体分子は、転換器の表面
に抗体−整列蛋白質によって固定化されるか、または固
定化されるべき抗体と共に蛋白質表面に共吸着される。
驚くべきことに、これらの担体分子の整列蛋白質との同
時固定化、および前記担体分子の同時吸着が、共有的に
結合された蛋白質層上の抗体の吸着に対して干渉するこ
となく行われうることが見い出された。
【００４７】担体分子に一般的に要求されることは、
ｉ） 水に対する高い溶解性；
ii） 交差反応が分子上に多くの活性化可能な基が存在
する場合にのみ起こるため、光活性化可能な試薬との反
応のための多くの官能基の存在； iii) 同時固定化に際して固体相と共有的に交差結合す
るための官能基の存在； iv） 同時吸着の場合に、吸着に十分な程度でＦｃ部分
を認識するタンパク質に覆われた表面と相互作用する分
子領域、である。
する場合にのみ起こるため、光活性化可能な試薬との反
応のための多くの官能基の存在； iii) 同時固定化に際して固体相と共有的に交差結合す
るための官能基の存在； iv） 同時吸着の場合に、吸着に十分な程度でＦｃ部分
を認識するタンパク質に覆われた表面と相互作用する分
子領域、である。
【００４８】前述の性質は、アルブミン、ポリサッカラ
イド等の生体分子、または水溶性合成ポリマー等によっ
て得られる。適切な生体分子を使用することの優位点
は、表面が非特異的吸着に対して極めて非感受性となる
ことである。効率的な交差反応が、これらの担体分子が
多くの光活性化可能な基を有している場合にのみ起こる
という事実は、分子の光活性化可能な部分が水溶性であ
る、水溶性（親水性）２官能性試薬についての前述の要
求の重要性を明らかにしている。この要求が満たされな
い場合には、修飾が、担体分子の水溶性を低減させるで
あろう。
イド等の生体分子、または水溶性合成ポリマー等によっ
て得られる。適切な生体分子を使用することの優位点
は、表面が非特異的吸着に対して極めて非感受性となる
ことである。効率的な交差反応が、これらの担体分子が
多くの光活性化可能な基を有している場合にのみ起こる
という事実は、分子の光活性化可能な部分が水溶性であ
る、水溶性（親水性）２官能性試薬についての前述の要
求の重要性を明らかにしている。この要求が満たされな
い場合には、修飾が、担体分子の水溶性を低減させるで
あろう。
【００４９】これらの担体分子の同時固定化が、図１に
模式的に示されている。第１に、整列されるべき蛋白質
（例えば、プロテインＡ）および担体分子（例えばＢＳ
Ａ）が、同時固定化され、担体分子は、すでに光活性化
可能な交差結合試薬（Ｌ）を保持している（図１ａ）。
模式的に示されている。第１に、整列されるべき蛋白質
（例えば、プロテインＡ）および担体分子（例えばＢＳ
Ａ）が、同時固定化され、担体分子は、すでに光活性化
可能な交差結合試薬（Ｌ）を保持している（図１ａ）。
【００５０】担体分子の同時固定化は、整列蛋白質の固
定化と同時である場合には、整列蛋白質の固定化に使用
する方法と同じ方法により行われる。表面における相対
濃度は、溶液中の２つの分子種の濃度比によって調整さ
れる。
定化と同時である場合には、整列蛋白質の固定化に使用
する方法と同じ方法により行われる。表面における相対
濃度は、溶液中の２つの分子種の濃度比によって調整さ
れる。
【００５１】次の工程は、図１ｂに示されるように抗体
（生物学的認識分子）の吸着である。交差結合試薬
（Ｌ）の光活性化による該蛋白質の他方および表面との
交差結合は、図１ｃ中に結合線によって表してある。
（生物学的認識分子）の吸着である。交差結合試薬
（Ｌ）の光活性化による該蛋白質の他方および表面との
交差結合は、図１ｃ中に結合線によって表してある。
【００５２】同時吸着の種類に関しては、担体分子は、
２種類に分けられる。第１の種類は、表面に非特異的に
吸着する担体分子（例えば、アルブミン、ポリサッカラ
イドまたは水溶性合成ポリマー）を含み、従って、Ｆｃ
部分を認識する蛋白質によって被覆されていない表面部
分を被覆する。担体分子のこの種類は、好ましくは認識
抗体の吸着前に吸着される。
２種類に分けられる。第１の種類は、表面に非特異的に
吸着する担体分子（例えば、アルブミン、ポリサッカラ
イドまたは水溶性合成ポリマー）を含み、従って、Ｆｃ
部分を認識する蛋白質によって被覆されていない表面部
分を被覆する。担体分子のこの種類は、好ましくは認識
抗体の吸着前に吸着される。
【００５３】図２は、表面の遊離の結合部位に対する担
体分子の非特異的吸着の際の、天然抗体の方向付け共有
的固定化を模式的に示すものである。
体分子の非特異的吸着の際の、天然抗体の方向付け共有
的固定化を模式的に示すものである。
【００５４】図２ａは、共有的に固定化される整列蛋白
質（例えばプロテインＡ）を表す。図２ｂにおいて、担
体分子（例えばＢＳＡ）の非特異的吸着は、共有的に固
定化される整列蛋白質の間のＬが付された円によって表
される。その後に、抗体が方向付けされて吸着される。
（図２ｃ）。前述と同様に結合線は、蛋白質の他方およ
び表面との間の交差結合を表している（図２ｄ）。
質（例えばプロテインＡ）を表す。図２ｂにおいて、担
体分子（例えばＢＳＡ）の非特異的吸着は、共有的に固
定化される整列蛋白質の間のＬが付された円によって表
される。その後に、抗体が方向付けされて吸着される。
（図２ｃ）。前述と同様に結合線は、蛋白質の他方およ
び表面との間の交差結合を表している（図２ｄ）。
【００５５】第２の種は、共有的に固定化された蛋白質
層上のＦｃ結合部位を特異的に被覆する担体分子を含
む。抗体のＦｃ断片は、この種の典型的な代表例であ
る。これらの担体分子は、固定化されるべき抗体と同時
に、またはその吸着の後に表面に吸着されうる。第１の
場合には、担体分子（例えばＦｃ断片）および認識抗体
の濃度比は、過剰な数の結合部位が補助蛋白質によって
占有されることを防止するために、極めて正確に調節さ
れなければならない。表面上のＦｃ結合部位が補助蛋白
質によって占有された場合には、結果として抗原認識抗
体の濃度の低下を生じ、従って、センサーの感度および
ダイナミックレンジが極端に低下することになる。引き
続く担体蛋白質（例えばＦｃ断片）の場合、３次元の幾
何学的理由のためより大きい抗体分子が接近不可能な、
第１の結合部位によって飽和が起こるであろう。しかし
ながら、交差結合試薬によって修飾されたこれらの担体
分子は、吸着した抗原認識抗体を表面から置換可能であ
る。この置換は緩慢な工程であるために、それを補助蛋
白質を用いてインキュベーション時間によって制御する
ことは容易である。
層上のＦｃ結合部位を特異的に被覆する担体分子を含
む。抗体のＦｃ断片は、この種の典型的な代表例であ
る。これらの担体分子は、固定化されるべき抗体と同時
に、またはその吸着の後に表面に吸着されうる。第１の
場合には、担体分子（例えばＦｃ断片）および認識抗体
の濃度比は、過剰な数の結合部位が補助蛋白質によって
占有されることを防止するために、極めて正確に調節さ
れなければならない。表面上のＦｃ結合部位が補助蛋白
質によって占有された場合には、結果として抗原認識抗
体の濃度の低下を生じ、従って、センサーの感度および
ダイナミックレンジが極端に低下することになる。引き
続く担体蛋白質（例えばＦｃ断片）の場合、３次元の幾
何学的理由のためより大きい抗体分子が接近不可能な、
第１の結合部位によって飽和が起こるであろう。しかし
ながら、交差結合試薬によって修飾されたこれらの担体
分子は、吸着した抗原認識抗体を表面から置換可能であ
る。この置換は緩慢な工程であるために、それを補助蛋
白質を用いてインキュベーション時間によって制御する
ことは容易である。
【００５６】図３は、整列蛋白質の結合部位への担体分
子の特異的吸着の場合における天然抗体の方向付け共有
的固定化を模式的に例示するものである。
子の特異的吸着の場合における天然抗体の方向付け共有
的固定化を模式的に例示するものである。
【００５７】図３ａは、同様に共有的に固定化された整
列蛋白質（例えばプロテインＡ）を例示するものであ
る。図３ｂにおいて、担体分子（例えば抗体のＦｃ部
分）の特異的同時吸着が、Ｌが付され、整列蛋白質に結
合する棒によって示されている。該抗体は、同時に吸着
される。蛋白質の他のものおよび表面との交差結合は、
結合線によって示されている（図３ｃ）。
列蛋白質（例えばプロテインＡ）を例示するものであ
る。図３ｂにおいて、担体分子（例えば抗体のＦｃ部
分）の特異的同時吸着が、Ｌが付され、整列蛋白質に結
合する棒によって示されている。該抗体は、同時に吸着
される。蛋白質の他のものおよび表面との交差結合は、
結合線によって示されている（図３ｃ）。
【００５８】固定化されるべき抗体、および交差結合試
薬により修飾された担体分子の同時吸着の後（または、
担体分子の整列蛋白質との同時固定化の後）、該表面上
の蛋白質は、照射によって他と交差結合されうる。前述
と同様に、２官能性交差結合試薬の光活性化可能な部分
が、水に易溶性であることは重要である。この高い水溶
性は、活性化基（ニトレン）が溶液中に突出し、従って
分子間（分子内ではない）交差結合に付される場合に重
要である。光誘導交差結合の場合に、照射時間は、光誘
導副反応（光酸化等）の抗体活性に対する悪影響低減す
るために最小限に保たれなければならない。
薬により修飾された担体分子の同時吸着の後（または、
担体分子の整列蛋白質との同時固定化の後）、該表面上
の蛋白質は、照射によって他と交差結合されうる。前述
と同様に、２官能性交差結合試薬の光活性化可能な部分
が、水に易溶性であることは重要である。この高い水溶
性は、活性化基（ニトレン）が溶液中に突出し、従って
分子間（分子内ではない）交差結合に付される場合に重
要である。光誘導交差結合の場合に、照射時間は、光誘
導副反応（光酸化等）の抗体活性に対する悪影響低減す
るために最小限に保たれなければならない。
【００５９】以下は、抗ＨＢｓＡｇ−（肝炎Ｂ表面抗
原）抗体の光化学的固定化の例である。
原）抗体の光化学的固定化の例である。
【００６０】１．センサー表面のシラン化
センサー表面を、既知の方法においてヘキサデカン中の
オクテニルトリクロロシランの希釈溶液（０．５％）中
で、１５分間シラン化した。次いでセンサー表面をヘキ
サデカン、ヘキサンおよびエタノールにて十分に洗浄し
た。シラン化表面上の末端二重結合を、２．５ｍＭ過マ
ンガン酸カリウムおよび１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウ
ムの溶液中で少なくとも６０分間でカルボン酸基に酸化
した。該反応を、該センサーを１００ｍＭのチオ亜硫酸
ナトリウム溶液に浸漬することによって停止させ、その
後、センサー表面を水およびエタノール中にて十分に洗
浄した。この方法は、高品質の単分子付加層を生成し
た。
オクテニルトリクロロシランの希釈溶液（０．５％）中
で、１５分間シラン化した。次いでセンサー表面をヘキ
サデカン、ヘキサンおよびエタノールにて十分に洗浄し
た。シラン化表面上の末端二重結合を、２．５ｍＭ過マ
ンガン酸カリウムおよび１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウ
ムの溶液中で少なくとも６０分間でカルボン酸基に酸化
した。該反応を、該センサーを１００ｍＭのチオ亜硫酸
ナトリウム溶液に浸漬することによって停止させ、その
後、センサー表面を水およびエタノール中にて十分に洗
浄した。この方法は、高品質の単分子付加層を生成し
た。
【００６１】２．プロテインＡの固定化
センサー表面のカルボン酸基を最初に活性化し、次いで
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換した。活
性化は、メチレンクロライド中の５％エチルクロロホル
メートおよび４％ピリジン溶液中で保護気体雰囲気中、
１時間で行われた。これらの活性化カルボン酸基は、セ
ンサー表面をピリジン中の５００ｍＭＮ−ヒドロキシス
クシンイミド溶液中でインキュベートすることによって
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換された。
次いで、センサーは、エタノールおよび水にて清浄化さ
れ、次いで乾燥させられた。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換した。活
性化は、メチレンクロライド中の５％エチルクロロホル
メートおよび４％ピリジン溶液中で保護気体雰囲気中、
１時間で行われた。これらの活性化カルボン酸基は、セ
ンサー表面をピリジン中の５００ｍＭＮ−ヒドロキシス
クシンイミド溶液中でインキュベートすることによって
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換された。
次いで、センサーは、エタノールおよび水にて清浄化さ
れ、次いで乾燥させられた。
【００６２】プロテインＡは、担体を１００ｍＭのクエ
ン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ４．８中の蛋白質溶液
（０．１ｍｇ／ｍｌ）にて１時間インキュベートするこ
とによってセンサー表面に固定化される。次いで該蛋白
質は、クエン酸ナトリウム緩衝溶液および水にて洗浄さ
れる。
ン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ４．８中の蛋白質溶液
（０．１ｍｇ／ｍｌ）にて１時間インキュベートするこ
とによってセンサー表面に固定化される。次いで該蛋白
質は、クエン酸ナトリウム緩衝溶液および水にて洗浄さ
れる。
【００６３】３．光活性化可能な試薬により修飾された
ＢＳＡの吸着 固定化プロテインＡに加えて、所定量のＢＳＡがこうし
て調製されたセンサー表面に吸着されうる。該ＢＳＡ
は、最初に光活性化可能な試薬によって修飾される。こ
の目的のために、１Ｍ硫酸アンモニウム緩衝溶液、ｐＨ
９．０中のＢＳＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌを用
意し、これを１００μｌのＤＭＳＯ中の７．５ｍｇの６
−（ｐ−アジドベンゼンスルホニルアミノ）カプロン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと混合した。
該修飾反応を１５分間継続した。次いで、センサー表面
をＢＳＡ溶液と３０分間接触させた。
ＢＳＡの吸着 固定化プロテインＡに加えて、所定量のＢＳＡがこうし
て調製されたセンサー表面に吸着されうる。該ＢＳＡ
は、最初に光活性化可能な試薬によって修飾される。こ
の目的のために、１Ｍ硫酸アンモニウム緩衝溶液、ｐＨ
９．０中のＢＳＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌを用
意し、これを１００μｌのＤＭＳＯ中の７．５ｍｇの６
−（ｐ−アジドベンゼンスルホニルアミノ）カプロン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと混合した。
該修飾反応を１５分間継続した。次いで、センサー表面
をＢＳＡ溶液と３０分間接触させた。
【００６４】４．抗体の吸着およびその光化学的固定化
５ｍｇ／ｍｌの抗体を１Ｍ硫酸アンモニウム緩衝溶液、
ｐＨ９．０に溶解させた。センサー表面を該溶液中にて
３０分間インキュベートし、抗体をプロテインＡ上に吸
着させた。次いで該センサー表面を同じ硫酸アンモニウ
ム緩衝溶液にて洗浄し、次いで被覆し、引き続き水銀ラ
ンプを使用して３０秒間照射した。この工程は、プロテ
インＡ、ＢＳＡおよび抗体のＦｃ部分の光化学的交差結
合を生じた。抗体の結合部位は、完全な状態に維持され
た。このようなセンサー表面は、抗体の脱着無しに生理
学的緩衝条件に付すことができる。
ｐＨ９．０に溶解させた。センサー表面を該溶液中にて
３０分間インキュベートし、抗体をプロテインＡ上に吸
着させた。次いで該センサー表面を同じ硫酸アンモニウ
ム緩衝溶液にて洗浄し、次いで被覆し、引き続き水銀ラ
ンプを使用して３０秒間照射した。この工程は、プロテ
インＡ、ＢＳＡおよび抗体のＦｃ部分の光化学的交差結
合を生じた。抗体の結合部位は、完全な状態に維持され
た。このようなセンサー表面は、抗体の脱着無しに生理
学的緩衝条件に付すことができる。
【００６５】光活性化可能な試薬を次のように製造し
た。一般的事項 アジド基を含む全ての化合物を、光を遮断して更に撹拌
した。ＨＰＬＣを１ｍｌ／ｍｉｎの流速にて行い，２５
４ｎｍのＵＶにて検出した。
た。一般的事項 アジド基を含む全ての化合物を、光を遮断して更に撹拌
した。ＨＰＬＣを１ｍｌ／ｍｉｎの流速にて行い，２５
４ｎｍのＵＶにて検出した。
【００６６】例１
４１ｍｇのＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）−
Ｎ’−（３−カルボキシプロピオニル）シスタミンを、
１ｍｌの塩化チオニルと共に５時間撹拌し、次いで水流
ポンプ減圧下で濃縮した。粗製の酸塩化物を５ｍｌのＴ
ＨＦに溶解し、ピリジン１ｍｌ中の溶液形態の１４ｍｇ
のＮ−ヒドロキシスクシンイミドにて処理した。該混合
物を２時間撹拌し、次いで高真空下で濃縮した。６８ｍ
ｇのＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）−Ｎ’−
（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピオニ
ル）シスタミンをピリジニウム塩の形態で得た。
Ｎ’−（３−カルボキシプロピオニル）シスタミンを、
１ｍｌの塩化チオニルと共に５時間撹拌し、次いで水流
ポンプ減圧下で濃縮した。粗製の酸塩化物を５ｍｌのＴ
ＨＦに溶解し、ピリジン１ｍｌ中の溶液形態の１４ｍｇ
のＮ−ヒドロキシスクシンイミドにて処理した。該混合
物を２時間撹拌し、次いで高真空下で濃縮した。６８ｍ
ｇのＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）−Ｎ’−
（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピオニ
ル）シスタミンをピリジニウム塩の形態で得た。
【００６７】使用した出発材料を次のように調製した。
２．２ｇのシスタミンジヒドロクロライドを、２０ｍｌ
の水に溶解し、ＮａＯＨにてｐＨ１０に調整した。２．
１ｇのｐ−アジドベンゼンスルホクロライドを該溶液中
に懸濁し、該混合物を室温にて５時間撹拌した。沈殿し
たＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）シスタミンを
２ｇの無水コハク酸と反応させ、一夜撹拌した。得られ
た溶液をＨＣｌにて酸性化し、次いで生成物をろ別し、
水にて洗浄した。残渣を室温にて高真空下で乾燥させ、
１．５ｇのＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）−
Ｎ’−（３−カルボキシプロピオニル）シスタミンを得
た。ＩＲは、３２８３（アミドＮＨ）、２１３４（アジ
ド）、１７１４（酸カルボニル）、１６５０（アミ
ド）、１５８９＋１５４７（芳香族）、１２８４（ＣＯ
ＯＨ）、１３２８＋１１８０（アリールスルホニル）、
８３９（ｐ−ジ置換ベンゼン）においてバンドを示し
た。ＴＬＣ（シリカゲル−ＮＨ3 濃度／ＥｔＯＨ＝１
％）、Ｒｆ＝０．７、ｍ. ｐ.:１６３℃（分解）。
２．２ｇのシスタミンジヒドロクロライドを、２０ｍｌ
の水に溶解し、ＮａＯＨにてｐＨ１０に調整した。２．
１ｇのｐ−アジドベンゼンスルホクロライドを該溶液中
に懸濁し、該混合物を室温にて５時間撹拌した。沈殿し
たＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）シスタミンを
２ｇの無水コハク酸と反応させ、一夜撹拌した。得られ
た溶液をＨＣｌにて酸性化し、次いで生成物をろ別し、
水にて洗浄した。残渣を室温にて高真空下で乾燥させ、
１．５ｇのＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）−
Ｎ’−（３−カルボキシプロピオニル）シスタミンを得
た。ＩＲは、３２８３（アミドＮＨ）、２１３４（アジ
ド）、１７１４（酸カルボニル）、１６５０（アミ
ド）、１５８９＋１５４７（芳香族）、１２８４（ＣＯ
ＯＨ）、１３２８＋１１８０（アリールスルホニル）、
８３９（ｐ−ジ置換ベンゼン）においてバンドを示し
た。ＴＬＣ（シリカゲル−ＮＨ3 濃度／ＥｔＯＨ＝１
％）、Ｒｆ＝０．７、ｍ. ｐ.:１６３℃（分解）。
【００６８】例２
０．５ｇのε−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）アミ
ノカプロン酸を５ｍｌの塩化チオニルと共に５時間撹拌
し、次いで水流ポンプ減圧下で濃縮した。粗製の酸塩化
物を５ｍｌのＴＨＦに溶解し、ピリジン５ｍｌ中の溶液
形態の３４８ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドにて
処理した。該混合物を２時間撹拌し、次いで高真空下で
濃縮した。１．０９ｍｇのε−（ｐ−アジドベンゼンス
ルホニルアミノ）カプロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルをピリジニウム塩の形態で得た。
ノカプロン酸を５ｍｌの塩化チオニルと共に５時間撹拌
し、次いで水流ポンプ減圧下で濃縮した。粗製の酸塩化
物を５ｍｌのＴＨＦに溶解し、ピリジン５ｍｌ中の溶液
形態の３４８ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドにて
処理した。該混合物を２時間撹拌し、次いで高真空下で
濃縮した。１．０９ｍｇのε−（ｐ−アジドベンゼンス
ルホニルアミノ）カプロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルをピリジニウム塩の形態で得た。
【００６９】使用した出発材料を次のように調製した。
４．５７ｇのε−アミノカプロン酸を、１００ｍｌの水
中の８．８ｇのＮａＨＣＯ３溶液に溶解した。７．６ｇ
のｐ−アジドベンゼンスルホン酸クロライドをこれに懸
濁し、該混合物を一夜撹拌した。得られた溶液からＨＣ
ｌを用いて沈殿した生成物をろ別し、水にて洗浄した。
残渣を室温にて高真空下で乾燥させ、４．５６ｇのε−
（ｐ−アジドベンゼンスルホニルアミノ）カプロン酸を
得た。ＩＲは、２９０７（アジド）、１７１５（酸カル
ボニル）、１５８５＋１４００（芳香族）、１２８２
（ＣＯＯＨ）、１３１９＋１１５３（アリールスルホニ
ル）、８３４（ｐ−ジ置換ベンゼン）においてバンドを
示した。ＴＬＣ（シリカゲル：ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ＝
３）、Ｒｆ＝０．５５、ｍ. ｐ.:１２６−１２７℃。
４．５７ｇのε−アミノカプロン酸を、１００ｍｌの水
中の８．８ｇのＮａＨＣＯ３溶液に溶解した。７．６ｇ
のｐ−アジドベンゼンスルホン酸クロライドをこれに懸
濁し、該混合物を一夜撹拌した。得られた溶液からＨＣ
ｌを用いて沈殿した生成物をろ別し、水にて洗浄した。
残渣を室温にて高真空下で乾燥させ、４．５６ｇのε−
（ｐ−アジドベンゼンスルホニルアミノ）カプロン酸を
得た。ＩＲは、２９０７（アジド）、１７１５（酸カル
ボニル）、１５８５＋１４００（芳香族）、１２８２
（ＣＯＯＨ）、１３１９＋１１５３（アリールスルホニ
ル）、８３４（ｐ−ジ置換ベンゼン）においてバンドを
示した。ＴＬＣ（シリカゲル：ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ＝
３）、Ｒｆ＝０．５５、ｍ. ｐ.:１２６−１２７℃。
【００７０】同様な方法で調製したε−（ｐ−アジドベ
ンゼンスルホニルアミノ）カプロン酸は、ＴＬＣにて同
様な挙動を示し、また１３２−１３３℃にて融解した。
これは例６に従って、ε−（ｐ−アジドベンゼンスルホ
ニルアミノ）カプロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルに変換されうる。
ンゼンスルホニルアミノ）カプロン酸は、ＴＬＣにて同
様な挙動を示し、また１３２−１３３℃にて融解した。
これは例６に従って、ε−（ｐ−アジドベンゼンスルホ
ニルアミノ）カプロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルに変換されうる。
【００７１】例３
３１ｍｇのε−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）アミ
ノカプロン酸を１ｍｌの塩化チオニルと共に５時間撹拌
し、次いで水流ポンプ減圧下で濃縮した。粗製の酸塩化
物を５ｍｌのＴＨＦに溶解し、ピリジン１ｍｌ中の溶液
形態の２２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド−２−
スルホン酸にて処理した。該混合物を２時間撹拌し、次
いで高真空下で濃縮した。５８ｍｇのε−（ｐ−アジド
ベンゼンスルホニルアミノ）カプロン酸（Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド−２−スルホン酸）エステルをジピリ
ジニウム塩の形態で得た。使用した出発材料を例２に従
って調製した。
ノカプロン酸を１ｍｌの塩化チオニルと共に５時間撹拌
し、次いで水流ポンプ減圧下で濃縮した。粗製の酸塩化
物を５ｍｌのＴＨＦに溶解し、ピリジン１ｍｌ中の溶液
形態の２２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド−２−
スルホン酸にて処理した。該混合物を２時間撹拌し、次
いで高真空下で濃縮した。５８ｍｇのε−（ｐ−アジド
ベンゼンスルホニルアミノ）カプロン酸（Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド−２−スルホン酸）エステルをジピリ
ジニウム塩の形態で得た。使用した出発材料を例２に従
って調製した。
【００７２】例４
５５０ｍｇのε−（ｐ−アジドベンゾイル）アミノカプ
ロン酸を５ｍｌのＴＨＦに溶解させ、０．５ｍｌの塩化
チオニルを添加した。該混合物を５時間撹拌し、次いで
濃縮した。粗製の酸塩化物を５ｍｌのＴＨＦに溶解し、
ピリジン２ｍｌ中の２５１ｍｇの２−（２−アミノエチ
ルジチオピリジン）にて処理し、該混合物を更に２時間
撹拌した。２０ｇの氷を添加し、ｐＨをＮａＯＨにて６
に調節し、６ｇのＮａＣｌを添加した。該混合物を１時
間撹拌し、次いでろ過し、飽和塩化ナトリウムにてせん
じょうし、次いで高真空下（室温）で濃縮した。ＴＬＣ
（シリカゲル：濃ＨＣｌ／ＥｔＯＨ＝１％）、Ｒｆ＝
０．２、ＴＬＣ（シリカゲル−ＥｔＯＡｃ）、Ｒｆ＝
０．６。
ロン酸を５ｍｌのＴＨＦに溶解させ、０．５ｍｌの塩化
チオニルを添加した。該混合物を５時間撹拌し、次いで
濃縮した。粗製の酸塩化物を５ｍｌのＴＨＦに溶解し、
ピリジン２ｍｌ中の２５１ｍｇの２−（２−アミノエチ
ルジチオピリジン）にて処理し、該混合物を更に２時間
撹拌した。２０ｇの氷を添加し、ｐＨをＮａＯＨにて６
に調節し、６ｇのＮａＣｌを添加した。該混合物を１時
間撹拌し、次いでろ過し、飽和塩化ナトリウムにてせん
じょうし、次いで高真空下（室温）で濃縮した。ＴＬＣ
（シリカゲル：濃ＨＣｌ／ＥｔＯＨ＝１％）、Ｒｆ＝
０．２、ＴＬＣ（シリカゲル−ＥｔＯＡｃ）、Ｒｆ＝
０．６。
【００７３】例５
２８０ｍｇのε−（ｐ−アジドベンゾイル）アミノカプ
ロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを５ｍ
ｌのＴＨＦに溶解させ、２０ｍｌの水中の１４０ｍｇの
ヒドラジニウムモノクロライドの溶液を滴々添加した。
該混合物を過剰量のソーダにて塩基性にし、次いでろ過
した。残渣を水にて洗浄し、高真空下で乾燥させた。３
０５ｍｇのε−（ｐ−アジドベンゾイル）アミノカプロ
ン酸ヒドラジドを得た。ＴＬＣ（シリカゲル：濃ＨＣｌ
／ＥｔＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．７；ＴＬＣ（シリカゲ
ル：濃ＮＨ3 ／ＥｔＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．８。
ロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを５ｍ
ｌのＴＨＦに溶解させ、２０ｍｌの水中の１４０ｍｇの
ヒドラジニウムモノクロライドの溶液を滴々添加した。
該混合物を過剰量のソーダにて塩基性にし、次いでろ過
した。残渣を水にて洗浄し、高真空下で乾燥させた。３
０５ｍｇのε−（ｐ−アジドベンゾイル）アミノカプロ
ン酸ヒドラジドを得た。ＴＬＣ（シリカゲル：濃ＨＣｌ
／ＥｔＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．７；ＴＬＣ（シリカゲ
ル：濃ＮＨ3 ／ＥｔＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．８。
【００７４】例６
１００ｍｇの６−（３−アジド−５−スルホベンゾイル
アミノ）ヘキサン酸（０．２８ｍｍｏｌ）を２ｍｌの乾
燥ＴＨＦに室温にて溶解させ、撹拌しつつ、０．７ｍｌ
の塩化チオニルを滴々加えて処理し、次いで該混合物を
室温にて一夜撹拌した（磁気撹拌器）。次いで過剰量の
塩化チオニルおよび溶媒を水流ポンプ減圧下（ＣａＣｌ
2 チューブ）で除去し、塩化チオニルを完全に除去する
ために残渣をそれぞれ２ｍｌのＴＨＦと共に２回撹拌し
た（磁気撹拌器、水流ポンプ減圧下）。黄色残渣を２ｍ
ｌのＴＨＦに溶解させ、１ｍｌのＴＨＦ中の３５ｍｇの
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを該溶液に添加し、細か
く粉砕した２００ｍｇの炭酸水素ナトリウムの添加後、
該混合物を室温にて２４時間撹拌した。底部の固形物の
除去後、黄色の溶液を室温にて水流ポンプ減圧下で濃縮
した。生成物を分離するために、酢酸エチルを添加し、
６−（３−アジド−５−スルホベンゾイルアミノ）ヘキ
サン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、室
温にて高真空下で乾燥させて黄色粉末（約７０ｍｇ）と
して得た。ＩＲ（ＫＢｒ；ｃｍ-1）：３４２０（アミド
−ＮＨ）、２１１４（アジド）、１７３７（エステルの
カルボニル）、１６５８（アミドのカルボニル）、１５
８９（芳香族）、１５４１（アミド−２つのバンド）、
１１９５（スルホネート）。ＴＬＣ（シリカゲル：エタ
ノール−ＮＨ3 ）：Ｒｆ生成物＝０．８、Ｒｆ抽出物＝
０．６、Ｒｆヒドロキシスクシンイミド＝０．０５。
アミノ）ヘキサン酸（０．２８ｍｍｏｌ）を２ｍｌの乾
燥ＴＨＦに室温にて溶解させ、撹拌しつつ、０．７ｍｌ
の塩化チオニルを滴々加えて処理し、次いで該混合物を
室温にて一夜撹拌した（磁気撹拌器）。次いで過剰量の
塩化チオニルおよび溶媒を水流ポンプ減圧下（ＣａＣｌ
2 チューブ）で除去し、塩化チオニルを完全に除去する
ために残渣をそれぞれ２ｍｌのＴＨＦと共に２回撹拌し
た（磁気撹拌器、水流ポンプ減圧下）。黄色残渣を２ｍ
ｌのＴＨＦに溶解させ、１ｍｌのＴＨＦ中の３５ｍｇの
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを該溶液に添加し、細か
く粉砕した２００ｍｇの炭酸水素ナトリウムの添加後、
該混合物を室温にて２４時間撹拌した。底部の固形物の
除去後、黄色の溶液を室温にて水流ポンプ減圧下で濃縮
した。生成物を分離するために、酢酸エチルを添加し、
６−（３−アジド−５−スルホベンゾイルアミノ）ヘキ
サン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、室
温にて高真空下で乾燥させて黄色粉末（約７０ｍｇ）と
して得た。ＩＲ（ＫＢｒ；ｃｍ-1）：３４２０（アミド
−ＮＨ）、２１１４（アジド）、１７３７（エステルの
カルボニル）、１６５８（アミドのカルボニル）、１５
８９（芳香族）、１５４１（アミド−２つのバンド）、
１１９５（スルホネート）。ＴＬＣ（シリカゲル：エタ
ノール−ＮＨ3 ）：Ｒｆ生成物＝０．８、Ｒｆ抽出物＝
０．６、Ｒｆヒドロキシスクシンイミド＝０．０５。
【００７５】使用した出発材料を以下のように調製し
た。１４．６ｇの３−ニトロ−５−スルホ安息香酸１ナ
トリウム塩を３００ｍｌのピリジンに溶解して２時間撹
拌し、その後、２．２ｍｌのオキサルクロライドを滴々
添加した。１時間後に１６．６ｇのベンジルε−アミノ
カプロエートを１００ｍｌのＴＨＦ溶液として滴々添加
し、該混合物を一夜撹拌した。該混合物をロータリーエ
バポレータにて濃縮し、次いで１００ｍｌの水中の１０
０ｇの強酸性イオン交換体と共に５０時間撹拌した。該
混合物をろ過し、水にて洗浄し、ろ液を濃縮した。残渣
を３０％メタノール／水に溶解し、２１ｇのテトラエチ
ルアンモニウムブロマイドにて処理し、水酸化ナトリウ
ム溶液を用いてｐＨ６．５に調整した。得られた溶液
を、５００ｇのシラン化シリカゲル（ＲＰ２）上で、３
０％メタノールを用いてクロマトグラフィにかけた。
８．６ｇのベンジルε−（３−ニトロ−５−スルホベン
ゾイルアミノ）カプロエートをテトラエチルアンモニウ
ム塩の形態で得、これを水中の１００ｇの陽イオン交換
体と共に撹拌し、ろ別し、水にて洗浄した。ろ液を濃縮
して対応する遊離のスルホン酸を得た。ＴＬＣ（シリカ
ゲル：ＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃ＝２０％）Ｒｆ＝０．７
（抽出物＝０．４）； ＴＬＣ（シリカゲル：ＮＨ3 ／
ＥｔＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．８（抽出物＝０．７）；Ｔ
ＬＣ（ＲＰ１８：ＥｔＯＨ／Ｅｔ4 Ｎ+ （０．０１Ｍ）
リン酸緩衝溶液（０．１Ｍ；ｐＨ６．５）＝６０％）Ｒ
ｆ＝０．４（抽出物＝０．８）。ＨＰＬＣ（ＲＰ１８：
ＭｅＣＮ／Ｅｔ4 Ｎ+ （０．０１Ｍ）リン酸緩衝溶液
（０．１Ｍ；ｐＨ６．５）＝３０％）ｔR ＝５．９分
（抽出物＝１．３分）
た。１４．６ｇの３−ニトロ−５−スルホ安息香酸１ナ
トリウム塩を３００ｍｌのピリジンに溶解して２時間撹
拌し、その後、２．２ｍｌのオキサルクロライドを滴々
添加した。１時間後に１６．６ｇのベンジルε−アミノ
カプロエートを１００ｍｌのＴＨＦ溶液として滴々添加
し、該混合物を一夜撹拌した。該混合物をロータリーエ
バポレータにて濃縮し、次いで１００ｍｌの水中の１０
０ｇの強酸性イオン交換体と共に５０時間撹拌した。該
混合物をろ過し、水にて洗浄し、ろ液を濃縮した。残渣
を３０％メタノール／水に溶解し、２１ｇのテトラエチ
ルアンモニウムブロマイドにて処理し、水酸化ナトリウ
ム溶液を用いてｐＨ６．５に調整した。得られた溶液
を、５００ｇのシラン化シリカゲル（ＲＰ２）上で、３
０％メタノールを用いてクロマトグラフィにかけた。
８．６ｇのベンジルε−（３−ニトロ−５−スルホベン
ゾイルアミノ）カプロエートをテトラエチルアンモニウ
ム塩の形態で得、これを水中の１００ｇの陽イオン交換
体と共に撹拌し、ろ別し、水にて洗浄した。ろ液を濃縮
して対応する遊離のスルホン酸を得た。ＴＬＣ（シリカ
ゲル：ＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃ＝２０％）Ｒｆ＝０．７
（抽出物＝０．４）； ＴＬＣ（シリカゲル：ＮＨ3 ／
ＥｔＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．８（抽出物＝０．７）；Ｔ
ＬＣ（ＲＰ１８：ＥｔＯＨ／Ｅｔ4 Ｎ+ （０．０１Ｍ）
リン酸緩衝溶液（０．１Ｍ；ｐＨ６．５）＝６０％）Ｒ
ｆ＝０．４（抽出物＝０．８）。ＨＰＬＣ（ＲＰ１８：
ＭｅＣＮ／Ｅｔ4 Ｎ+ （０．０１Ｍ）リン酸緩衝溶液
（０．１Ｍ；ｐＨ６．５）＝３０％）ｔR ＝５．９分
（抽出物＝１．３分）
【００７６】１．３２ｇのベンジル６−（３−ニトロ−
５−スルホベンゾイルアミノ）ヘキサノエートを３０ｍ
ｌのエタノール／水＝６０％中に溶解し、１００ｍｇの
Ｐｄ／Ｃ１０％を添加し、該混合物を撹拌（磁気撹拌
器）しつつ水素添加した。水素の全吸収量（１．５時
間）は、２３５ｍｌであった。ＴＬＣの対照は、出発物
質がすでに存在しないことを示した。ＴＬＣにおいて
は、アミンはほとんど出発点に存在する。触媒をろ別
し、該溶液をロータリーエバポレータにて濃縮乾燥させ
た。該物質のＩＲの対照は、元々のニトロ基およびベン
ジル基が全く存在しないことを示した。得られたベンジ
ル６−（３−ニトロ−５−スルホベンゾイルアミノ）ヘ
キサン酸をアジドの調整のために直接に使用した。
５−スルホベンゾイルアミノ）ヘキサノエートを３０ｍ
ｌのエタノール／水＝６０％中に溶解し、１００ｍｇの
Ｐｄ／Ｃ１０％を添加し、該混合物を撹拌（磁気撹拌
器）しつつ水素添加した。水素の全吸収量（１．５時
間）は、２３５ｍｌであった。ＴＬＣの対照は、出発物
質がすでに存在しないことを示した。ＴＬＣにおいて
は、アミンはほとんど出発点に存在する。触媒をろ別
し、該溶液をロータリーエバポレータにて濃縮乾燥させ
た。該物質のＩＲの対照は、元々のニトロ基およびベン
ジル基が全く存在しないことを示した。得られたベンジ
ル６−（３−ニトロ−５−スルホベンゾイルアミノ）ヘ
キサン酸をアジドの調整のために直接に使用した。
【００７７】約１ｇのベンジル６−（３−ニトロ−５−
スルホベンゾイルアミノ）ヘキサン酸（約３．０ｍｍｏ
ｌ）を１５ｍｌの水および３ｍｌのＴＨＦに溶解し、１
ｍｌの濃ＨＣｌを添加し、該溶液を０℃に冷却した。次
いで、１．５ｍｌの水中の２１０ｍｇの硝酸ナトリウム
を０℃にて滴々添加した。滴下による添加完了後、微細
な沈殿が形成され（ジアゾニウム塩）、これを室温にて
１時間撹拌した。次いで、１ｍｌの水中の２０８ｍｇの
アジ化ナトリウムをゆっくり滴々添加した（気体発生、
発泡；懸濁物を溶液中に通した）。アジ化ナトリウムと
の交換は急速に進行し、１時間後には、ＴＬＣはアジド
のみを示し、アミンはなかった。シリカゲル：エタノー
ル／ＨＣｌを用いたＴＬＣ：Ｒｆ（アジド）：約０．
６；Ｒｆ（アミン）：約０．５；アミンは蛍光を発し、
アジドは吸収する。アジドのスポットは、ＵＶ光のもと
で褐色である。アジド溶液を、室温下で撹拌しつつ、高
真空下で完全に濃縮する。それは、粉末状、結晶性かつ
黄色である。ＩＲ対照：６−（３−アジド−５−スルホ
ベンゾイルアミノ）ヘキサン酸に要求されるＩＲバンド
が全て存在し正しかった。
スルホベンゾイルアミノ）ヘキサン酸（約３．０ｍｍｏ
ｌ）を１５ｍｌの水および３ｍｌのＴＨＦに溶解し、１
ｍｌの濃ＨＣｌを添加し、該溶液を０℃に冷却した。次
いで、１．５ｍｌの水中の２１０ｍｇの硝酸ナトリウム
を０℃にて滴々添加した。滴下による添加完了後、微細
な沈殿が形成され（ジアゾニウム塩）、これを室温にて
１時間撹拌した。次いで、１ｍｌの水中の２０８ｍｇの
アジ化ナトリウムをゆっくり滴々添加した（気体発生、
発泡；懸濁物を溶液中に通した）。アジ化ナトリウムと
の交換は急速に進行し、１時間後には、ＴＬＣはアジド
のみを示し、アミンはなかった。シリカゲル：エタノー
ル／ＨＣｌを用いたＴＬＣ：Ｒｆ（アジド）：約０．
６；Ｒｆ（アミン）：約０．５；アミンは蛍光を発し、
アジドは吸収する。アジドのスポットは、ＵＶ光のもと
で褐色である。アジド溶液を、室温下で撹拌しつつ、高
真空下で完全に濃縮する。それは、粉末状、結晶性かつ
黄色である。ＩＲ対照：６−（３−アジド−５−スルホ
ベンゾイルアミノ）ヘキサン酸に要求されるＩＲバンド
が全て存在し正しかった。
【００７８】例７
例６に従って、β−（３−アジド−５−スルホベンゾイ
ルアミノ）プロピオン酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルに変換した。以下のようにして出発材料を調
製した。
ルアミノ）プロピオン酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルに変換した。以下のようにして出発材料を調
製した。
【００７９】１４．６ｇの３−ニトロ−５−スルホ安息
香酸モノナトリウム塩を、３００ｍｌのピリジンに溶解
して２時間撹拌し、次いで２．２ｍｌのオキサリルクロ
ライドを滴々添加した。１時間後、１３．６ｇのβ−ア
ラニンtertブチルエステルを加え、該混合物を一夜撹拌
した。該混合物をロータリーエバポレータにて濃縮し、
次いで１００ｍｌの水中の１００ｇの強酸性イオン交換
体と共に１６時間撹拌した。該混合物をろ過し、水にて
洗浄し、ろ液を濃縮した。残渣を３０％メタノール／水
の溶解し、２１ｇのテトラエチルアンモニウムブロマイ
ドを加え、水酸化ナトリウム溶液にてｐＨを６．５に調
節した。得られた溶液を１ｋｇのシラン化シリカゲル
（ＲＰ２）にて３０％メタノールを使用してクロマトグ
ラフィにかけた。約６ｇのβ−（３−ニトロ−５−スル
ホベンゾイル）アミノプロピオン酸を、テトラエチルア
ンモニウム塩の形態で得、これを水中の１００ｇの陽イ
オン交換体と共に撹拌し、ろ過後に水にて洗浄した。ろ
液を濃縮して対応する遊離のスルホン酸を得た。ＴＬＣ
（シリカゲル：ＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃ）Ｒｆ＝０．５
（副生成物：ジアミド＝０．９）。還元によるニトロ基
のアミノ基への変換、およびアジド基へのＳａｎｄｍｅ
ｙｅｒ反応は、例６と同様にして行った。
香酸モノナトリウム塩を、３００ｍｌのピリジンに溶解
して２時間撹拌し、次いで２．２ｍｌのオキサリルクロ
ライドを滴々添加した。１時間後、１３．６ｇのβ−ア
ラニンtertブチルエステルを加え、該混合物を一夜撹拌
した。該混合物をロータリーエバポレータにて濃縮し、
次いで１００ｍｌの水中の１００ｇの強酸性イオン交換
体と共に１６時間撹拌した。該混合物をろ過し、水にて
洗浄し、ろ液を濃縮した。残渣を３０％メタノール／水
の溶解し、２１ｇのテトラエチルアンモニウムブロマイ
ドを加え、水酸化ナトリウム溶液にてｐＨを６．５に調
節した。得られた溶液を１ｋｇのシラン化シリカゲル
（ＲＰ２）にて３０％メタノールを使用してクロマトグ
ラフィにかけた。約６ｇのβ−（３−ニトロ−５−スル
ホベンゾイル）アミノプロピオン酸を、テトラエチルア
ンモニウム塩の形態で得、これを水中の１００ｇの陽イ
オン交換体と共に撹拌し、ろ過後に水にて洗浄した。ろ
液を濃縮して対応する遊離のスルホン酸を得た。ＴＬＣ
（シリカゲル：ＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃ）Ｒｆ＝０．５
（副生成物：ジアミド＝０．９）。還元によるニトロ基
のアミノ基への変換、およびアジド基へのＳａｎｄｍｅ
ｙｅｒ反応は、例６と同様にして行った。
【００８０】例８
８．６ｇのＮ−（３−アジド−５−スルホベンゾイル）
−Ｎ’−（３−カルボキシプロピオニル）エチレンジア
ミンを５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、１０ｍｌの塩化チオ
ニルにて処理し、５時間撹拌した。該混合物を濃縮し、
残渣（粗製の酸塩化物）を５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、
１０ｍｌのＴＨＦ中の２ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、続いて１０ｇの重炭酸ナトリウムにより処理し
た。該混合物を一夜撹拌し、ろ過し、残渣をＴＨＦにて
洗浄し、次いでろ液を濃縮し、残渣を室温にて高真空下
で乾燥させた。 ＴＬＣ（シリカゲル：濃ＮＨ3 ／Ｅｔ
ＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．８。
−Ｎ’−（３−カルボキシプロピオニル）エチレンジア
ミンを５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、１０ｍｌの塩化チオ
ニルにて処理し、５時間撹拌した。該混合物を濃縮し、
残渣（粗製の酸塩化物）を５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、
１０ｍｌのＴＨＦ中の２ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、続いて１０ｇの重炭酸ナトリウムにより処理し
た。該混合物を一夜撹拌し、ろ過し、残渣をＴＨＦにて
洗浄し、次いでろ液を濃縮し、残渣を室温にて高真空下
で乾燥させた。 ＴＬＣ（シリカゲル：濃ＮＨ3 ／Ｅｔ
ＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．８。
【００８１】以下のようにして出発材料を調製した。１
２ｇの３−ニトロ−５−スルホ安息香酸モノナトリウム
塩を、２００ｍｌのピリジンと共に２時間撹拌し、次い
で８．８ｇの塩化チオニルにて処理した。１時間後、２
４ｇのエチレンジアミンを滴々加え、該混合物を一夜撹
拌した。該混合物を濃縮し、残渣をＴＨＦに溶解し、１
０ｇの無水コハク酸および続いて２０ｇのソーダにより
処理し、該混合物を再度一夜撹拌した。該混合物をろ過
し、ＴＨＦにて洗浄し、ろ液を濃縮して残渣を次の工程
に使用した。３３１０＋３２５５（アミン）、１７３０
（酸カルボニル）、１６４０＋１５０６（芳香族）、１
６４０＋１５３９（アミド）、１２９６（アリルスルホ
ニル）。ＴＬＣ（シリカゲル：濃ＨＣｌ／ＥｔＯＨ＝１
％）Ｒｆ＝０．５；ＴＬＣ（シリカゲル：濃ＮＨ 3 ／Ｅ
ｔＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．６；ＨＰＬＣ（１０％ＭｅＣ
Ｎ−ＲＰ１８）：ｔR ＝１．７分（ｔR 中間体＝３．３
分／ｔR 抽出物＝３分）。
２ｇの３−ニトロ−５−スルホ安息香酸モノナトリウム
塩を、２００ｍｌのピリジンと共に２時間撹拌し、次い
で８．８ｇの塩化チオニルにて処理した。１時間後、２
４ｇのエチレンジアミンを滴々加え、該混合物を一夜撹
拌した。該混合物を濃縮し、残渣をＴＨＦに溶解し、１
０ｇの無水コハク酸および続いて２０ｇのソーダにより
処理し、該混合物を再度一夜撹拌した。該混合物をろ過
し、ＴＨＦにて洗浄し、ろ液を濃縮して残渣を次の工程
に使用した。３３１０＋３２５５（アミン）、１７３０
（酸カルボニル）、１６４０＋１５０６（芳香族）、１
６４０＋１５３９（アミド）、１２９６（アリルスルホ
ニル）。ＴＬＣ（シリカゲル：濃ＨＣｌ／ＥｔＯＨ＝１
％）Ｒｆ＝０．５；ＴＬＣ（シリカゲル：濃ＮＨ 3 ／Ｅ
ｔＯＨ＝１％）Ｒｆ＝０．６；ＨＰＬＣ（１０％ＭｅＣ
Ｎ−ＲＰ１８）：ｔR ＝１．７分（ｔR 中間体＝３．３
分／ｔR 抽出物＝３分）。
【００８２】Ｎ−（３−アミノ−５−スルホベンゾイ
ル）エチレンジアミンを１２ｍｌの塩酸（３７％）およ
び１００ｍｌの水に溶解し、０℃にて硝酸ナトリウム溶
液（４Ｎ）にて滴々添加処理し、この温度にて１時間撹
拌した（ＫＩ／スターチ、およびアルカリ性２−ナフト
ール溶液との反応により示される）。次いで１３ｇのア
ジ化ナトリウムをゆっくり添加し、該混合物を室温にて
更に５時間撹拌し、次いで２０ｇのＮａＣｌ添加し、該
混合物を１時間撹拌し、ろ過した。該残渣を飽和塩化ナ
トリウム溶液にて洗浄し、室温にて高真空下で乾燥させ
た。粗生成物をＩＲにて特徴付け、直接に次の工程に使
用した。２１２１（アジド）、１７３６（酸カルボニ
ル）、１５０７（芳香族）、１６４０＋１５０７（アミ
ド）、１１８０（アリルスルホニル）、８５７（ｐ−ジ
置換ベンゼン）。
ル）エチレンジアミンを１２ｍｌの塩酸（３７％）およ
び１００ｍｌの水に溶解し、０℃にて硝酸ナトリウム溶
液（４Ｎ）にて滴々添加処理し、この温度にて１時間撹
拌した（ＫＩ／スターチ、およびアルカリ性２−ナフト
ール溶液との反応により示される）。次いで１３ｇのア
ジ化ナトリウムをゆっくり添加し、該混合物を室温にて
更に５時間撹拌し、次いで２０ｇのＮａＣｌ添加し、該
混合物を１時間撹拌し、ろ過した。該残渣を飽和塩化ナ
トリウム溶液にて洗浄し、室温にて高真空下で乾燥させ
た。粗生成物をＩＲにて特徴付け、直接に次の工程に使
用した。２１２１（アジド）、１７３６（酸カルボニ
ル）、１５０７（芳香族）、１６４０＋１５０７（アミ
ド）、１１８０（アリルスルホニル）、８５７（ｐ−ジ
置換ベンゼン）。
【００８３】例９
１５ｇの２−（ｐ−アジドベンゾイルアミノメチル）ピ
リジンを、５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、５０ｇの２−ブ
ロモアセチルブロマイドにより−２０℃にて処理し、同
じ温度に一夜静置した。該混合物を濃縮し、残渣を５０
ｍｌのＴＨＦに溶解させた。１１．５ｇのＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドを添加し、該混合物を室温にて一夜撹
拌し、次いで濃縮した。こうして、Ｎ−（スクシンイミ
ジルオキシカルボニルメチル）−２−（ｐ−アジドベン
ゾイルアミノメチル）ピリジンを得た。
リジンを、５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、５０ｇの２−ブ
ロモアセチルブロマイドにより−２０℃にて処理し、同
じ温度に一夜静置した。該混合物を濃縮し、残渣を５０
ｍｌのＴＨＦに溶解させた。１１．５ｇのＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドを添加し、該混合物を室温にて一夜撹
拌し、次いで濃縮した。こうして、Ｎ−（スクシンイミ
ジルオキシカルボニルメチル）−２−（ｐ−アジドベン
ゾイルアミノメチル）ピリジンを得た。
【００８４】別法として、１５ｇの２−（ｐ−アジドベ
ンゾイルアミノメチル）ピリジンを５００ｍｌの水に溶
解し、１０ｇの２−クロロ酢酸にて処理し、一夜撹拌し
た。１００ｇのＮａＣｌを添加し、該混合物を１時間撹
拌し、ろ過し、残渣を飽和塩化ナトリウム溶液にて洗浄
し、高真空下で乾燥させた。Ｎ−カルボニルメチル−２
−（アジドベンゾイルアミノメチル）ピリジンを得、こ
れは、ＩＲにおいて以下のバンドを示した：３４２７＋
３２８３（アミド−ＮＨ）、２１２１（アジド）、１６
３３＋１５６５（アミド）、１４９９＋１６０１（芳香
族）、８５９（ｐ−ジ置換ベンゼン）、７１０＋７６３
（一置換ベンゼン）。
ンゾイルアミノメチル）ピリジンを５００ｍｌの水に溶
解し、１０ｇの２−クロロ酢酸にて処理し、一夜撹拌し
た。１００ｇのＮａＣｌを添加し、該混合物を１時間撹
拌し、ろ過し、残渣を飽和塩化ナトリウム溶液にて洗浄
し、高真空下で乾燥させた。Ｎ−カルボニルメチル−２
−（アジドベンゾイルアミノメチル）ピリジンを得、こ
れは、ＩＲにおいて以下のバンドを示した：３４２７＋
３２８３（アミド−ＮＨ）、２１２１（アジド）、１６
３３＋１５６５（アミド）、１４９９＋１６０１（芳香
族）、８５９（ｐ−ジ置換ベンゼン）、７１０＋７６３
（一置換ベンゼン）。
【００８５】該化合物は、例６の従って前述のＮ−（ス
クシンイミジルオキシカルボニルメチル）−２−（ｐ−
アジドベンゾイルアミノメチル）ピリジンに変換され
る。
クシンイミジルオキシカルボニルメチル）−２−（ｐ−
アジドベンゾイルアミノメチル）ピリジンに変換され
る。
【００８６】出発材料を以下のように調製した：１４．
３ｇのｐ−アジド安息香酸を１００ｍｌの塩化チオニル
に懸濁し、５時間撹拌した（溶液を生じた）。該混合物
を濃縮し、残渣を５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、３０ｍｌ
の２−アミノメチルピリジンを添加して該混合物を室温
にて２時間撹拌した。次いで、該混合物を２００ｇの氷
に注ぎ、ＮａＯＨで中和し、ろ過し、水にて洗浄し、高
真空下で乾燥させた。ＩＲは、３３０６（アミド−Ｎ
Ｈ）、２１２５（アジド）、１６２６＋１５４７（アミ
ド）、１５００＋１６０３（芳香族）、８５２（ｐ−ジ
置換ベンゼン）にバンドを示した。ＨＰＬＣ（ＲＰ１
８：２０分間で３０−１００％ＭｅＣＮ）ｔR ＝８分
（ｔR 抽出物＝１０分）。ＴＬＣ（シリカゲル：ＨＯＡ
ｃ／ＥｔＯＡｃ＝２０％）Ｒｆ＝０．２。
３ｇのｐ−アジド安息香酸を１００ｍｌの塩化チオニル
に懸濁し、５時間撹拌した（溶液を生じた）。該混合物
を濃縮し、残渣を５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、３０ｍｌ
の２−アミノメチルピリジンを添加して該混合物を室温
にて２時間撹拌した。次いで、該混合物を２００ｇの氷
に注ぎ、ＮａＯＨで中和し、ろ過し、水にて洗浄し、高
真空下で乾燥させた。ＩＲは、３３０６（アミド−Ｎ
Ｈ）、２１２５（アジド）、１６２６＋１５４７（アミ
ド）、１５００＋１６０３（芳香族）、８５２（ｐ−ジ
置換ベンゼン）にバンドを示した。ＨＰＬＣ（ＲＰ１
８：２０分間で３０−１００％ＭｅＣＮ）ｔR ＝８分
（ｔR 抽出物＝１０分）。ＴＬＣ（シリカゲル：ＨＯＡ
ｃ／ＥｔＯＡｃ＝２０％）Ｒｆ＝０．２。
【００８７】例１０
５−アジドイソフタロイルジクロライドを、２．５ｇの
５−アジドイソフタル酸から新たに調製し、これを粗製
形態で１００ｍｌの水中の５．２ｇのεアミノカプロン
酸溶液および１０ｇのソーダを用いて反応させた。５時
間撹拌後、得られた溶液をＨＣｌにて酸性化し、次いで
ろ過し、水にて洗浄した。３，５−ジ（６−カプロニル
アミノ）アジドベンゼンからなる残渣を乾燥させ、ＩＲ
により特徴付けした：３４６０（アミド−ＮＨ）、２１
２１（アジド）、１７１７＋１５５９（アミド）、１５
９９＋１６３１（芳香族）。カルボン酸基を、例６に従
って活性化した。
５−アジドイソフタル酸から新たに調製し、これを粗製
形態で１００ｍｌの水中の５．２ｇのεアミノカプロン
酸溶液および１０ｇのソーダを用いて反応させた。５時
間撹拌後、得られた溶液をＨＣｌにて酸性化し、次いで
ろ過し、水にて洗浄した。３，５−ジ（６−カプロニル
アミノ）アジドベンゼンからなる残渣を乾燥させ、ＩＲ
により特徴付けした：３４６０（アミド−ＮＨ）、２１
２１（アジド）、１７１７＋１５５９（アミド）、１５
９９＋１６３１（芳香族）。カルボン酸基を、例６に従
って活性化した。
【図１】図１は、固体相表面への担体分子の同時結合を
表す模式図である。
表す模式図である。
【図２】図２は、固体相表面の遊離結合部位への担体分
子の非特異的吸着における天然抗体の方向付けされた共
有的固定化を示す模式図である。
子の非特異的吸着における天然抗体の方向付けされた共
有的固定化を示す模式図である。
【図３】図３は、整列蛋白質の結合部位に対する担体分
子の特異的吸着における天然抗体の方向付け固定化を示
す模式図である。
子の特異的吸着における天然抗体の方向付け固定化を示
す模式図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ヨゼフ ヒューブスケル
スイス国ヌニンゲン，ザースペルストラ
ーセ １
(72)発明者 ユルグ フルスト
スイス国バーゼル，クララグラーベン
134
(72)発明者 ダニエル スクラッター
スイス国オベルウィル，ブルデルホルツ
ストラーセ 67
(56)参考文献 特開 平２−221300（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−90060（ＪＰ，Ａ)
国際公開91／013358（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48 - 33/98
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】 固体相に共有結合的に固定化され、かつ
分析されるべき物質を認識し結合する分子領域、および
分析されるべき物質を認識しないまたは結合しない分子
領域を含んでなる生物学的認識非修飾分子からなる生物
学的認識層であって、 該生物学的認識非修飾分子が、官能基生成のためまたは
該生物学的認識非修飾分子への共有結合のための化学的
および／または生化学的修飾をされることなく共有結合
的に固定化され； 分析されるべき物質を認識しないまたは結合しない分子
領域が、該生物学的認識非修飾分子を整列させ、該生物
学的認識非修飾分子の整列する吸着のための特別の結合
部位を有する層に結合され； 該固体相上には付加的有機層が与えられ、該生物学的認
識非修飾分子の整列した層が、該付加的有機層上に固定
化された整列蛋白質を有してなり； 該生物学的認識非修飾分子が、整列蛋白質と直接結合
し、また、化学的に修飾された担体分子を介して整列蛋
白質と交差結合し、そして、該生物学的認識非修飾分子
は化学的に修飾された該担体分子を介して互いに交差結
合し； そして、該分析されるべき物質を認識し結合する分子領
域が固体相表面から遠方に位置し、かつ分析されるべき
物質を認識し結合する分子領域が該共有結合によって変
化を受けないように好ましい方向を持って共有結合的に
固定化されている、生物学的認識層。 - 【請求項２】 請求項１に記載の生物学的認識層の製造
に際し、生物学的認識非修飾分子の吸着前に固体相表面
に、化学的または生物学的処理によって結合部位を生成
させ、これによって生物学的認識非修飾分子を交差結合
に先立って整列蛋白質に整列吸着させ、該結合部位が該
生物学的認識非修飾分子の分析されるべき物質を認識し
ない領域を吸着的に結合することを含んでなる生物学的
認識層の製造方法。 - 【請求項３】 交差結合が光化学的に行われる請求項２
に記載の生物学的認識層の製造方法。 - 【請求項４】 光化学的交差結合に使用する試薬が、担
体分子を使用して固体相表面に適用される請求項２また
は３に記載の生物学的認識層の製造方法。 - 【請求項５】 該担体分子が、分析されるべき物質を認
識する分子の固体相表面への整列吸着の前、または同
時、または後に、固体相表面に吸着される請求項２〜４
のいずれか１項に記載の生物学的認識層の製造方法。 - 【請求項６】 該担体分子の化学修飾が、水に易溶性の
２官能性試薬を用いて行われる請求項２〜５のいずれか
１項に記載の生物学的認識層の製造方法。 - 【請求項７】 該２官能性試薬の２官能性基が、化学的
反応性基および光活性化可能なフェニルアジド基を含ん
でなる請求項６に記載の生物学的認識層の製造方法。 - 【請求項８】 該２官能性試薬の２種の官能基がスペー
サ基を介して担体分子に連結される請求項６又は７に記
載の生物学的認識層の製造方法。 - 【請求項９】 該２官能性試薬の水溶性基が、スルホン
酸、カルボン酸もしくはそれらの誘導体、またはヒドロ
キシル基または第三アミノおよび／または第四アンモニ
ウム基である請求項６〜８のいずれか１項に記載の生物
学的認識層の製造方法。 - 【請求項１０】 該２官能性試薬の水溶性基が、スペー
サ基または光活性化可能な基のいずれかに結合され、か
つ担体分子との反応において切断されない請求項６〜９
のいずれか１項に記載の生物学的認識層の製造方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH217892 | 1992-07-10 | ||
| CH02178/92-6 | 1992-07-10 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP17041993A Expired - Fee Related JP3423032B2 (ja) | 1992-07-10 | 1993-07-09 | 固体担体上のバイオ特異的認識表面およびそれらの製造方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0578148B1 (ja) |
| JP (1) | JP3423032B2 (ja) |
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| FR2716206B1 (fr) * | 1994-02-11 | 1996-05-10 | Pasteur Institut | Surfaces hautement spécifiques pour réactions biologiques, procédé pour leur préparation et procédé de dosage d'une molécule utilisant ces surfaces. |
| ES2296297T3 (es) * | 1995-08-09 | 2008-04-16 | Adam J. Simon | Orientacion molecular de macromoleculas mediante la accion de un menisco sobre superficies altamente especificas. |
| DE19618812C1 (de) * | 1996-05-10 | 1997-11-20 | Karlsruhe Forschzent | Sensor zum Nachweis von Proteinen und Verfahren zu dessen Herstellung |
| DE19818360C2 (de) * | 1998-04-24 | 2000-05-31 | Suisse Electronique Microtech | Dextranbeschichtete Oberfläche |
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| US20040192842A1 (en) * | 2003-03-25 | 2004-09-30 | Council Of Scientific And Industrial Research | Method for preparing photoreactive polymers and immobilization of biomolecules onto these polymers |
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| US7754497B2 (en) * | 2003-08-29 | 2010-07-13 | Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. | Method for immobilizing proteins |
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| EP3227428A4 (en) * | 2014-12-01 | 2018-07-18 | Modoc Technologies, LLC | Sensors, systems and metheods for detecting analytes using same |
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