JPH04268455A - イムノセンソリートランスデューサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はイムノセンソリートランスデュー
サーおよびその製造方法に関する。

【０００２】イムノアッセイの原理は、リガンド、たと
えば抗原（Ａｇ）またはハプテン（Ｈａｐ）の、抗リガ
ンド、たとえば抗体（Ａｂ）による選択的認識に基づく
ものである。通常、実際に用いられるイムノアッセイは
、いわゆる競合的アッセイであるかまたはサンドイッチ
アッセイである。両操作とも、標識されたリガンドまた
は抗リガンドを用いて行われる。このいわゆる標識の種
類によって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イ
ムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ
）等に分かれる。

【０００３】すなわち、たとえばサンドイッチアッセイ
の場合は、まず抗原に対する第一の抗体が固相（いわゆ
る「被覆試験管」法では試験管、いわゆる「被覆ビーズ
」法ではビーズ）上に固定化される。サンプル抗原およ
び標識された第二の抗体が互いにまた固相と、インキュ
ベートされる。この方法で、あらかじめ固定化された第
一の抗体によって形成された表面上の結合部位は、抗原
と第二の抗体によって満たされる。ついで、サンプル抗
原濃度の測定が、表面における標識の濃度の測定、すな
わち、ＥＩＡ法の場合は酵素基質、ＦＩＡ法の場合は蛍
光特性、ＲＩＡ法の場合は放射性照射線の測定を介して
行われる。以上述べた操作はいずれも時間のかかる洗浄
およびインキュベート工程を必要とする。

【０００４】したがって、最近の文献には、標識（放射
性同位元素、酵素、蛍光染料）の助けを借りないでＡｇ
−Ａｂ複合体の検出を可能にする測定技術の提案が次第
に多くなってきている。これらの操作は、イムノセンシ
ングという語で包括される。イムノセンサーは、一般的
に、物理的シグナルのトランスデューサーに厳密に連結
されるかまたはそれに統合される免疫学的に認識可能な
要素によって特徴づけられる。免疫学的に認識可能な要
素の役目は分析される溶液からの関心被検物質の選択的
認識および結合である。この要素の、それに伴う物理的
変化（たとえば、重量の増加、層厚の増加、または誘電
率の変化等）がトランスデューサーによって記録され、
シグナルに変換される。

【０００５】これらのトランスデューサーの基盤になる
物理的測定操作は、たとえば表面プラズモレゾナンス（
Ｏｐｔ．Ｃｏｍｍ．１８，３９５−３９９，１９７６；
Ｓｅｎｓｏｒｓ　　ａｎｄ　　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ　　
３，７９−８８，１９８２／８３）、グリッドカップリ
ング法（Ａｎａｌｙｔ．Ｌｅｔｔ．１９，２０５−２１
６，１９８６；Ｓｅｎｓｏｒｓ　　ａｎｄ　　Ａｃｔｕ
ａｔｏｒｓ　　１５，２７３−２８４，１９８８）、電
位差測定法（Ｊ．Ｍｅｍｂ．Ｓｃｉ．１２５−１３２，
１９７７；Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ　　１３
６，９３−９９，１９８２）、伝導度測定法（Ａｎａｌ
．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ　　６０，２３７４−２３７９，
１９８８）または圧電重量法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５
５，２３３３−２３３６，１９８３）である。グリッド
カップリング法の場合（誘電トランスデューサー表面）
を除き、他のすべての測定操作においては、免疫学的に
認識可能な要素は金属トランスデューサー表面に適用さ
れねばならない。

【０００６】金は、その腐食に対する抵抗性および、表
面プラズモレゾナンスにおいてはその光学的性質により
、好ましい金属である。上掲の測定技術はすべてよく開
発され、特性づけられているが、その相当するトランス
デューサー表面に適当な型で選択的認識可能な要素を適
用する技術を欠いている。これらの操作はすべて標識を
使用せず、したがって、増幅効果を適用できる可能性も
ないので、これらの要素には、きわめて高度な要求が寄
せられことになる。最も重要な要求は被検物質の結合に
関する高い活性と選択性である。これらの２つの要求の
適当な遂行は、免疫学的成分（たとえば、Ａｂ，Ａｇ）
の「被覆試験管」や「被覆ビーズ」法に用いられるよう
な物理的吸着では、不可能である。この、とくに疎水性
表面に起こる吸着には、以下のような重大な欠点がある
。 １）　　吸着後、蛋白質は、表面上にランダムな方向性
で存在する。したがって、各蛋白分子の活性ドメイン（
エピトープ、抗原結合部位）は一部、複合体の形成から
遮蔽されてしまう。 ２）　　このような表面では強い疎水性相互作用によっ
て、蛋白質が変性される。したがって、唯一の被検物質
に対する表面の選択性はもはや保証されない。 ３）　　吸着による表面の不完全な被覆が、表面の強い
吸着力により、付随する蛋白質をも表面に吸着させるこ
とになる。この非特異的吸着により、間接的検出の場合
のみでなく直接的検出の場合でも、試験結果はかなり不
正確になる。

【０００７】合成表面またはガラス表面上への抗リガン
ドの適当な固定化は、たとえばアフィニティークロマト
グラフィーに関してよく知られているが、ガラス表面上
への蛋白質分子の特定の固定化がはじめて明らかにされ
たのはごく最近である（ＷＯ９０／０５３０３参照）。 この特許明細書には、高い感受性と適当な動的範囲を達
成するためには、三次元マトリックス（好ましくは、た
とえばデキストランからなる多糖マトリックス）の必要
なことが特に強調されている。この方法は高分子量多糖
の、チオウンデカン誘導体を介した固定化に関するもの
で、この物質は、金表面への多糖の共有結合的繋留に関
与する。しかしながら、三次元マトリックスの製造はか
なり高価につき、一回使用後に廃棄されるセンサーの実
現という点では問題がある。

【０００８】本発明の目的は、認識分子（抗体、抗原）
のマトリックスへの被検物質の結合に関して高い活性と
選択性を有するイムノセンソリートランスデューサーを
提供することにある。

【０００９】驚くべきことに、高い感受性と十分な動的
範囲を達成するためには、三次元マトリックスは必要で
はないことが明らかにされた。このような三次元マトリ
ックスを放棄することによって、固定化操作は著しく簡
略化される。

【００１０】問題点は、金担体、その表面に配置された
単分子有機中間層、およびこの上に固定化されたリガン
ドまたは抗リガンド層からなる本発明のイムノセンソリ
ートランスデューサーによって解決される。

【００１１】本発明の方法は、含硫基を有するアルキル
誘導体の単分子層を自動化学吸着によって金属担体の表
面上に適用し、ついでこの層上に所望の免疫検出に適当
なリガンドまたは抗リガンドを固定化することを特徴と
する方法である。

【００１２】すなわち、この方法によれば、驚くべきこ
とに、蛋白質が金属表面に適当な様式で固定化できるこ
とが見出されたのである。このようにして得られた表面
は、表面上における免疫複合体の形成に関して、上述の
ような測定操作たとえば自動吸着またはシラン化もしく
はプラズマ重合による表面上へのポリマー薄層の適用、
ついで既知のアフィニティークロマトグラフィー操作に
よる固定化に関連してこれまで用いられてきた表面より
も、明らかに高い活性を有する。

【００１３】蛋白質を特定の、方向性のある様式で表面
上に固定化させる場合には、この表面は二官能性をもつ
ように調製されなければならない。すなわち、表面には
、蛋白質の自動吸着を防止する官能基と、その蛋白質上
に存在する基と共有結合する官能基とが与えられなけれ
ばならない。

【００１４】本発明の方法の好ましい実施態様によれば
、金の表面に、第一工程として薄い有機補助層が与えら
れる。これらの有機補助層の適用は、含硫基（チオール
、スルフィド、ジスルフィド）を有するアルキル誘導体
の既知の自動化学吸着に基づき、これらの化合物の溶液
から金の上への単層の形成によって行われる（Ｌａｎｇ
ｍｕｉｒ　　５，７２３−７２７，１９８９；Ｌａｎｇ
ｍｕｉｒ　　４，３６５−３８５，１９８８；Ｊ．Ｐｈ
ｙｓ．Ｃｈｅｍ．９１，６６６３，１９８７）。

【００１５】化学吸着は、含硫基が金の表面に繋留して
、アルカン鎖がこの表面からほぼ垂直に伸びるように行
われる。この操作で作成される層の厚さは、長さの異な
るアルカン鎖（Ｃ１１〜Ｃ２０）を用いることによって
、約１．３〜３ｎｍの範囲で変動させることができる。

【００１６】これらの化合物の単層の形成は、これらの
化合物が含硫基に対してω−位に、たとえば−ＣＯＯＨ
、−ＮＨ２　、−ＯＨ等を有する場合にも同様に行われ
る。したがって、これらの試薬によれば金表面に薄い有
機層が設けられ、これらの有機補助層は高密度に官能基
が充填された境界面（有機層と周囲の媒体間）を与える
。すなわち、表面の組成は、吸着に使用する溶液中の相
当する試剤の濃度比を変えることにより、各種官能基の
濃度を調節することが可能である。この操作により、必
要な二官能性を有する固定化のための表面が驚くほど簡
単に作成できる。

【００１７】さらに、有機補助層を合成するための含硫
基が、第二の官能基として、ヒドロキシル、ポリヒドロ
キシル、エチレングリコールおよびオリゴエチレングリ
コール、または単糖を構造要素に含む場合には、驚くべ
きことに、蛋白質の自動吸着が強力に抑制されることが
見出された。

【００１８】さらにまた、これらの末端基に存在するヒ
ドロキシル基は、それ自体公知の方法により、蛋白質の
共有結合のためのシアノゲンクロリド活性化、トシルク
ロリド活性化、エピクロルヒドリン活性化またはカルボ
ニルイミダゾール活性化に使用することができる（Ｍｅ
ｔｈ．ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　１３５，３０
−６５，１９８７）。これらの操作では、ある程度攻撃
性の強い試剤を使わなければならないが、いったん形成
された単層はこれらの活性化工程でも驚くほど無傷のま
ま維持される。

【００１９】本発明の方法の別の好ましい実施態様では
、固定化に際しての蛋白質の自動吸着を防止するための
ヒドロキシル含有基とともに、蛋白質の共有結合のため
の特定の基を有する誘導体が使用される。この場合、表
面に要求される二官能性は、自由に選択される官能基の
相対量に調節することが可能である。これに匹敵する調
節は、富ヒドロキシル表面の直接活性化では、不可能で
ある。官能基を介する共有結合に利用できる試剤は、２
つのグループに分けられる。第一のグループには、さら
に活性化工程を経てのみ共有結合に使用できる官能基を
もつ誘導体が包含される。この活性化は、金表面への誘
導体の化学吸着後に行われる。これらは、含硫構造要素
に加えて、カルボン酸機能〔クロロギ酸エチルにより（
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７４，６７６−６７８，
１９５２）、またはカルボジイミド、ヒドロキシスクシ
ンイミドもしくはチオニルクロリドとの反応により（Ｍ
ｅｔｈ．Ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　１３５，３
０−６５，１９８７）活性化〕、アミノ基〔無水コハク
酸との反応、ついでそのカルボン酸の活性化による（前
出）活性化〕、芳香族アミノもしくはニトロ基〔ジアゾ
ニウム塩への変換による（前出）活性化〕、またはフェ
ニルアジド基〔光化学的活性化（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　　１６，５６５０−５６５４，１９７７；Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７、１４０３−１４０８、（１９
７８）〕を含有する誘導体である。この場合も、ある程
度激烈な活性化方法によっても、金の表面のこれらの有
機補助層は破壊されない。

【００２０】第二のグループは、金の表面に適用したの
ちの活性化工程を要しない含硫アルキル誘導体からなる
。これらの試剤はまた、それ自体単層の型で金属表面に
配列する。これらは、蛋白質上の基と特異的に反応でき
る官能基を有する。これらの基の例には、マレイミド（
Ｆａｂ′フラグメントのＳＨ基と反応）、ｐ−ベンゾキ
ノン、シアヌル酸クロリド、エポキシド、スルホン酸誘
導体、カルボン酸アジド（蛋白質のアミノ基と反応）ま
たはヒドラジド（酸化炭水化物残基のアルデヒド機能と
反応）がある。しかしながら、これらの化合物は、含硫
基がチオールではない場合に、あらかじめ製造すること
のみが可能である。したがって、第二の基の利点は、固
定化共有結合蛋白質と反応する基を金の表面に直接提供
できる点に存在する。

【００２１】免疫検出に使用できる分子（たとえば、Ａ
ｂ、Ａｇ、Ｆａｂ′フラグメントまたはハプテン等）の
金表面への固定化操作は、一般式

【化１】 の化合物の使用に基づくものである。式中、Ｒ１　は基
Ｓ−Ｘであり、ＸはＨまたは−（ＣＨ２　）ｍ−Ｒ２　
であり、ｍおよびｐ＝ｎであり、ｎ＝１〜２０であるか
、Ｒ１　は式

【化２】 （式中、ｑ＝１〜２であり、ｎは上述の意味を有する）
であり、Ｒ２　は式Ｙ官能基であり、この基Ｙは、所望
により蛋白質とカップリングできる基Ｚに変換可能であ
るか、またはＲ２　はそのまま上述のＺの意味を有し、
この場合、Ｒ２　＝Ｚ、Ｒ１　＝ＳＨである（すなわち
、この化合物はチオレートとして製造され、製造後にＺ
へ変換されるか、または化合物はＺを含有し、Ｒ１　は
−Ｓ−もしくは−Ｓ−Ｓ−である）。

【００２２】Ｙの典型的な例は、

【化３】 である。

【００２３】Ｚの典型的な例は、 ａ）　　アルコールの活性化

【化４】 ｂ）　　カルボン酸の活性化

【化５】 ｃ）　　アミンの活性化

【化６】 である。

【００２４】例 例１ ２５４ｍｇ（０．５ミリモル）の２２−トシルオキシ−
１−ドコサノールを２０ｍｌのエタノール中、２００ｍ
ｇ（１．７５ミリモル）のチオ酢酸カリウムと２時間還
流加熱した。ついで、室温で２ｍｌの１Ｎ　　ＮａＯＨ
を加え、この混合物を一夜攪拌した。１Ｎ　　ＨＣｌで
酸性にしたのち、反応混合物をロータリーエバポレータ
ーで濃縮し、残留物をシリカゲル上、トルエン：酢酸エ
チル＝２：１を用いて濾過すると、１６５ｍｇの２２−
ヒドロキシ−１−ドコサンチオールが得られた。生成物
と抽出物のＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル２：１）のＲ
ｆ値はきわめて類似しているが、抽出物は蛍光消光（芳
香性）を示す。

【００２５】出発原料として用いられる２２−トシルオ
キシ−１−ドコサノールは、以下のようにして製造され
た。２５．１ｇ（０．１モル）の１１−ブロモウンデカ
ノールの、乾燥ピリジン６０ｍｌ中溶液に、攪拌しなが
ら２０ｇ（０．１２モル）のビス−トリトリメチルシリ
ルアセトアミドを滴下した。滴下終了後、反応混合物を
さらに２時間、室温で攪拌した。ついで、反応混合物を
三級ブチルメチルエーテルと水に取り、エーテル相を３
回水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリー
エバポレーターで濃縮した。残留物をトルエンに取り、
この溶液をシリカゲルを通して濾過した。１１−ブロモ
−１−ウンデシルトリメチルシリルエーテルがほぼ定量
的収率で得られた。ＴＬＣ（トルエン）Ｒｆ＝０．８

【
００２６】０．３３ｇ（１５ミリモル）の金属ナトリウ
ムをトルエン中、１２０°に攪拌しながら加熱して微細
に分散させた。室温に冷却したのち４．８５ｇ（１５ミ
リモル）の１１−ブロモ−ウンデシルトリメチルシリル
エーテルを攪拌しながら滴下し、混合物を再び１２０°
に加熱すると、臭化ナトリウムが徐々に沈殿し、溶液は
青色になった。１時間後にテトラクロロ銅酸リチウムを
カップリング触媒として加え、混合物をさらに２時間還
流加熱した。室温に冷却したのち、混合物に５０ｍｌの
三級ブチルメチルエーテルを加え、水を滴下して痕跡の
ナトリウムを分解した。有機相をシリカゲル上で濾過し
、ロータリーエバポレーターで濃縮した（収量２．８ｇ
＝７７％）。ＴＬＣ（トルエン）Ｒｆ＝０．７５、ＴＬ
Ｃ（トルエン：酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．９

【０
０２７】上述の反応で得られた１，２２−ジ−（トリメ
チルシリルオキシ）ドコサンを３０ｍｌの三級ブチルメ
チルエーテルに溶解し、この溶解を攪拌しながら、２０
ｍｌの１Ｎ　　ＨＣｌで処理した。１，２２−ジヒドロ
キシドコサンの結晶が直ちに分離した。１時間攪拌した
のち、沈殿した物質を分離し、高真空下に乾燥した。収
量はほぼ定量的で約１．９ｇであった。ＴＬＣ（トルエ
ン：酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．２５

【００２８】
ピリジン５ｍｌ中、２３０ｍｇ（０．６７ミリモル）の
１，２２−ジヒドロキシドコサンに、攪拌しながら、１
ｍｌのピリジン中１２７ｍｇ（０．６７ミリモル）トシ
ルクロリドを滴下し、ついで室温で２．５時間攪拌した
。次に、反応混合物を５０ｍｌのトルエンとともに分液
濾斗に移し、３０ｍｌの水と振盪した。水相を分離した
のち有機相を２Ｎ硫酸（ピリジンの除去）ついで重炭酸
塩溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリ
ーエバポレーターで蒸発させると、白色粉末が得られた
。未反応ジオールと痕跡のジトシレートをシリカゲル上
、トルエン：酢酸エチル＝２：１を用いたクロマトグラ
フィーによって除去すると、７４ｇの２２−トシルオキ
シ−１−ドコサノールが得られた。ＴＬＣ（トルエン：
酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．５５

【００２９】例２ ５０ｍｇ（０．１ミリモル）の２２−トシルオキシ−１
−ドコサノールを、２．５ｍｌ（０．０５ミリモル）の
０．０２Ｍの硫化ナトリウムのエタノール溶液とともに
２時間還流加熱した。ついで、混合物を水／クロロホル
ムに取り、有機相を分離し、ロータリーエバポレーター
で濃縮した。残留物をシリカゲル上、トルエン：酢酸エ
チル＝２：１を用いてクロマトグラフィーに付すと、１
０ｍｇの純粋なジ−（２２−ヒドロキシドコシル）−ス
ルフィドが得られた。

【００３０】例３ ２３０ｍｇ（０．６ミリモル）の４−（３′−ヒドロキ
シ−ブロモトリデカニル）−２，２−ジメチル−１，３
−ジオキソランと、１４０ｍｇ（１．２ミリモル）のチ
オ酢酸カリウムを４ｍｌのエタノールに溶解し、この溶
液を２時間還流加熱した。ついで、この混合物をロータ
リーエバポレーターで濃縮し、残留物をシリカゲル上、
トルエン：酢酸エチル＝２：１を用いてクロマトグラフ
ィーに付すと、１９４ｍｇの４−（３′−ヒドロキシ−
１３′−チオアセトキシトリデカニル）２，２−ジメチ
ル−１，３−ジオキソランが得られた。

【００３１】４−（３′−ヒドロキシ−１３′−チオア
セトキシトリデカニル）−２，２−ジメチル−１，３−
ジオキソランを５ｍｌのメタノールに溶解し、１Ｎ　　
ＫＯＨ０．５ｍｌを加え、混合物を一夜、室温で攪拌し
（チオアセテートの鹸化）、ついで溶液を１．５ｍｌの
イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ　　５０Ｗ　　Ｘ８（Ｈ＋）
と攪拌し、４５°に加熱してアセトニドを切断した（ト
ランスアセタール化）。メタノールをロータリーエバポ
レーターで除去したのち、残留物をシリカゲル上、クロ
マトグラフィーに付した。９０ｍｇ（５１％）の１１，
１４，１５−ヒドロキシ−１−ペンタデカンチオールが
得られた。ＴＬＣ（ＲＰ８；３％クロロホルム／エタノ
ール）Ｒｆ＝０．４

【００３２】出発原料として用いられる４−（３′−ヒ
ドロキシ−ブロモトリデカニル）−２，２−ジメチル−
１，３−ジオキソランは、以下の方法で製造された。 ２．１ｇ（１０ミリモル）の４−ブロモメチル−２，２
−ジメチル−１，３−ジオキソランを２５ｍｌのエーテ
ル中、常法によりマグネシウムと反応させてグリニアル
試薬に変換させた。得られたエーテル溶液を０°に冷却
し、これに攪拌しながら５ｍｌのエーテル中１ｇ（６．
２５ミリモル）の１１−ブロモ−１−ウンデカナールの
溶液を滴下した。室温で一夜攪拌したのち、炭酸水素ナ
トリウム溶液を加え、反応生成物をエーテルで抽出した
。 有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリーエバポ
レーターで濃縮し、残留物をシリカゲル上、トルエン：
酢酸エチル＝２：１を用いてクロマトグラフィーに付す
と、１．７ｇ（４５％）の４−（３′−ヒドロキシ−ブ
ロモトリデカニル）−２，２−ジメチル−１，３−ジオ
キソランが得られた。

【００３３】例４ ｐ−アジドベンゾイルクロリドは、０．６２５ｇ（４ミ
リモル）の相当する酸から、チオニルクロリド中で、文
献の記載と同様にして製造した。濃縮後、得られた粗製
の酸クロリドを０．９９４ｇ（２ミリモル）のジ（１１
−チオウンデシル）ジスルフィド二ナトリウム塩の懸濁
液に加え、混合物を一夜室温で攪拌した。次に、この混
合物を水流ポンプの真空下、７０°で濃縮し、残留物を
トルエン／濃塩酸に取り、シリカゲル上で濾過し、トル
エン；酢酸エチル＝２：１を用いて溶出した。純粋な分
画を含む溶出液を濃縮すると、１．１５ｇ（７９％）の
ジ〔１１−（ｐ−アジドベンゾイルメルカプト）−ウン
デシル〕ジスルフィド（Ｒｆ値＝０．１）が得られ、Ｎ
ＭＲおよび元素分析で確認された。

【００３４】出発原料として用いられるジ（１１−チオ
ウンデシル）ジスルフィド二ナトリウム塩は以下の方法
で製造された。６．５６ｇ（２０ミリモル）の１１−ブ
ロモ−１−ウンデカンを２００ｍｌのエタノールに溶解
し、２０．８ｇ（２００ミリモル）のチオ酢酸カリウム
を加えた。この混合物を１６時間還流した。得られた溶
液を水流ポンプの真空下に濃縮し、残留物をついでトル
エンに取り、シリカゲル上で濾過し、トルエンを用いて
溶出した。溶出液を濃縮すると、６．３２ｇ（９９％）
１，１１−ジアセチルメルカプトウンデカンが黄色油状
物として得られ、ＭＳで確認された。

【００３５】３．１８５ｇ（１０ミリモル）の１，１１
−ジアセチルメルカプトウンデカンを１００ｍｌのエタ
ノールに溶解した（攪拌すると最初、溶液が生成するが
、１時間後には結晶が析出する）。懸濁液をついで１６
時間室温で攪拌した。濾過し、残留物をエタノールで洗
浄し、乾燥した。０．８８ｇ（３３％）の１，１１−ウ
ンデカンジチオール二ナトリウム塩、融点６１−６２°
が得られ、正しい元素分析値を示した。濾液に２００ｍ
ｌの水を加え、ついで濾過した。残留物を水で洗浄し、
乾燥すると、１．３６ｇ（５４％）のジ（１１−チオウ
ンデシル）ジスルフィド二ナトリウム塩、融点２９２−
２９４°が得られ、ＮＭＲおよび元素分析が確認された
。

【００３６】例５ １００ｍｇのチオ酢酸１１−フタルイミドウンデシルエ
ステルを５ｍｌのヒドラジン中で、３日間還流した。つ
いで、溶液を濃縮し、沸騰濃塩酸に溶解し、再び濃縮し
た。白色の結晶性粗生成物をメタノールに取り、シラン
化シリカゲル上クロマトグラフィーに付した。このよう
にして得られた１１−アミノウンデシルチオールは、塩
酸塩としてＭＳおよびＮＭＲで確認された。元素分析の
結果は、生成物が１９モル％の所望の化合物と８１モル
％のヒドラジニウム一塩酸塩からなることを示した。

【００３７】出発原料として用いられるチオ酢酸１１−
フタルイミドウンデシルエステルは以下の方法で製造さ
れた。１２．５６ｇ（５０ミリモル）の１１−ブロモウ
ンデカノールを１００ｍｌのＤＭＦに溶解し、１８．５
２ｇ（１００ミリモル）のフタルイミドカリウムを加え
、１６時間還流煮沸した。ついで混合物を水流ポンプの
真空下に濃縮し、トルエン：酢酸エチル＝２：１を用い
てクロマトグラフィーに付すと、１５．６ｇ（９８％）
の１１−フタルイミノ−ウンデカノールが得られた。融
点８６−８７°を示し、ＮＭＲで確認された。ＨＰＬＣ
（３０％　　ＭｅＣＮ；ＲＰ１８　　１２５−４）ｔＲ
＝３．５分。

【００３８】４．７６ｇ（１５ミリモル）の１１−フタ
ルイミドウンデカノールと４．３４ｇ（１８ミリモル）
のトシルクロリドをピリジン５０ｍｌに溶解し、室温で
２時間攪拌した。ついで、混合物を飽和炭酸水素ナトリ
ウム溶液と１時間攪拌したのち、メチレンクロリドで抽
出した。有機相を水、１Ｎ塩酸、再び水で洗浄した。硫
酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮すると、５．９ｇ（８５
％）の１１−フタルイミド−ウンデシルトシレートが得
られ、ＮＭＲおよびＨＰＬＣで確認された。ＴＬＣ（ト
ルエン）Ｒｆ＝０．０８

【００３９】３ｇ（６．３６ミリモル）の１１−フタル
イミドウンデカニルトシレートを１５０ｍｌのエタノー
ルに溶解し、１．４５ｇ（１２．７ミリモル）のチオ酢
酸カリウムとともに１６時間煮沸した。ついで、混合物
を濃縮し、トルエンに取った。懸濁液をシリカゲル上、
クロマトグラフィーに付した。高真空乾燥したチオ酢酸
１１−フタルイミドウンデシルエステルは、ＮＭＲで確
認された。ＴＬＣ（トルエン）Ｒｆ＝０．１４

【００４
０】例６：糖残基上のアルデヒド機能を介した、ＳＰＲ
センサーの金表面上へのＩｇＧの固定化この固定化に際
しては、ＩｇＧの糖残基上に酸化によって遊離のアルデ
ヒド機能を生成させ、ついでこれを金表面上のヒドラジ
ド機能と反応させた。

【００４１】固定化に適当な金表面上にヒドラジド含有
有機補助層（３０％ヒドラジド、５０％ヒドロキシル機
能）を生成させるためには、金表面を、メルカプトウン
デカン酸（１×１０−３ｍｏｌ／ｌ）およびメルカプト
ウンデカノール（１×１０−３ｍｏｌ／ｌ）のメタノー
ル溶液と１２時間接触させる。この処理で単分子層が自
動的に形成される。この単分子層に存在するカルボン酸
機能はクロロギ酸メチルで活性化され金、酸ヒドラジド
機能に変換される。活性化は、表面を不活性気体下に、
メチレンクロリドおよびピリジン（４％ｖ／ｖ）中クロ
ロギ酸（５％ｖ／ｖ）溶液に１時間浸漬して行われる。 活性化カルボン酸機能のヒドラジドへの変換は、表面を
、メチレンクロリド中ヒドラジン（約１％ｖ／ｖ）の溶
液と反応させて行われる。この表面をついで、この固定
化操作のために修飾した抗体と反応させることができる
。

【００４２】ＩｇＧ分子の修飾はそれ自体公知の方法に
より、蛋白質を過ヨウ素酸ナトリウムで処理して行われ
る。このためには、抗体を、酢酸緩衝液（ｐＨ５．５；
０．１Ｍ）中０．５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム（２０ｍｇ
／ｍｌ）に溶解し、２０分間反応させる。このようにし
て修飾された抗体の固定化には、この反応溶液を上述の
ヒドラジド表面と１時間接触させる。

【００４３】遊離システインのＳＨ機能を介した、ＳＰ
Ｒセンサーの金表面上へのＦａｂ′フラグメントの固定
化修飾に際しては、この固定化に際しては、Ｆａｂ′フ
ラグメントは、それ自体公知のジスルフィド橋の酸化に
より、抗体のＦａｂ′フラグメントから作成される。Ｆ
ａｂ′フラグメントは、公知の方法により、抗体を酵素
的に切断すると得られる。

【００４４】Ｆａｂ′フラグメントの固定化に適当な金
表面上に補助層を生成させるためには、金表面を、１１
−アミノウンデカンアミン（１×１０−３ｍｏｌ／ｌ）
のメタノール溶液と４８時間接触させる。表面上にＳＨ
−特異的、反応基を導入するためには、アミノ基をＮ−
スクシンイミヂル−３−（２−ピリジニル）ジチオプロ
ピオネート、（Ｆｌｕｋａ）（イソプロパノール中１×
１０−３ｍｏｌ／ｌ）と反応させる。この表面をついで
、固定化用に調製した抗体Ｆａｂ′フラグメントと反応
させることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】　　金担体、その表面に配置された単分子
   有機中間相、およびこの上に固定化されたリガンドまた
   は抗リガンド層からなることを特徴とするイムノセンソ
   リートランスデューサー 【請求項２】　　中間層は含硫基を有するアルキル誘導
   体からなる請求項１に記載のイムノセンソリートランス
   デューサー 【請求項３】　　アルキル誘導体は含硫基に対してω−
   位に第二の官能基を有する請求項２に記載のイムノセン
   ソリートランスデューサー 【請求項４】　　第二の官能基はヒドロキシル、ヒドロ
   キシル含有ポリアルコールもしくはエチレングリコール
   残基、または単糖である請求項２および３のいずれか一
   つに記載のイムノセンソリートランスデューサー【請求
   項５】　　第二の官能基は蛋白質固定化のために活性化
   が可能な、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノフェニ
   ル、ニトロフェニルまたはフェニルアゾのような残基を
   含有する請求項２および３のいずれか一つに記載のイム
   ノセンソリートランスデューサー 【請求項６】　　第二の官能基は、シアネート、オキシ
   カルボニルイミダゾール、２−オキシキノン、２−オキ
   シメチレンキノン、−オキシ（ジクロロトリアジン、１
   −オキシ−２，３−エポキシプロパン、（２−オキシエ
   チル）−ビニルスルホン、（２，２，２−トリフルオロ
   エチル）−スルホニルオキシ、（ｐ−トリル）−スルホ
   ニルオキシ、ｐ−（オキシベンゾイル）−ニトレン、ｐ
   −メルカプトベンゾイル）−ニトレン、ｐ−（オキシベ
   ンジル）−ジアゾニウムクロリド、ピリジルジチオプロ
   ピオン酸エステル、混合無水物、イソ尿素エステル、ヒ
   ドロキシスクシンイミドエステル、酸クロリド、酸ヒド
   ラジド、酸アジド、２−アシルアミノエチルピリジルジ
   スルフィド、マレイミド、ｐ−（アミノベンゾイル）−
   ニトレン、ピリジルジチオプロピオンアミド、またはイ
   ソシアネートのような残基であり、さらに活性化しない
   でも蛋白質固定化に使用できる請求項２および３のいず
   れか一つに記載のイムノセンソリートランスデューサー
   【請求項７】　　含硫基を有するアルキル誘導体の単分
   子層を自動化学吸着によって金担体の表面上に適用し、
   ついでこの層上に所望の免疫検出に適当なリガンドまた
   は抗リガンドを固定化することを特徴とする請求項１〜
   ６のいずれか一つに記載のトランスデューサーの製造方
   法【請求項８】　　含硫基と第二の官能基を有するアル
   キル誘導体の単分子層がトランスデューサー金属（金）
   表面に適用される請求項７に記載のトランスデューサー
   の製造方法 【請求項９】　　含硫基と請求項３〜６のいずれか一つ
   に記載の異種の第二の官能基とを有するアルキル誘導体
   の混合物の単分子層をトランスデューサーの金表面に適
   用する請求項７および８のいずれか一つに記載のトラン
   スデューサーの製造方法