JP3000239B2 - 凝集原理による均一イムノアッセイ実施法 - Google Patents
凝集原理による均一イムノアッセイ実施法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＦａｂ’−フラグメント
と成分Ｋとからなる複合体を使用して凝集原理により均
一イムノアッセイを実施するための方法に関する。
と成分Ｋとからなる複合体を使用して凝集原理により均
一イムノアッセイを実施するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】体液及び組織中には、特異的結合パート
ナーと結合性であり、かつ人体の病気又は健康状態のパ
ラメーターとして働く非常に多くの物質が存在する。こ
れには、一方では例えば腫瘍マーカー、ホルモン又はビ
ールス蛋白質のような表面に結合位を有する免疫活性蛋
白質を、他方ではＤＮＡ−フラグメントを挙げることが
できる。これらの物質はしばしば非常に僅かな量で出現
するので、その検出のために、この物質を非常に特異的
にかつ正確に測定することのできる、イムノアッセイの
原理による方法を使用する。これには多くの変法があ
る。種々の免疫学的測定法は均一及び不均一法に分ける
ことができる。不均一法においては、検出すべき物質及
び標識成分を含有する複合体を固定し、これにより結合
していない成分から分離するために固層反応が常に関与
する。均一法においては結合した標識及び結合していな
い標識の分離は行なわれないので、結合した及び結合し
ていない標識の差を他の方法で行なわなければならな
い。
ナーと結合性であり、かつ人体の病気又は健康状態のパ
ラメーターとして働く非常に多くの物質が存在する。こ
れには、一方では例えば腫瘍マーカー、ホルモン又はビ
ールス蛋白質のような表面に結合位を有する免疫活性蛋
白質を、他方ではＤＮＡ−フラグメントを挙げることが
できる。これらの物質はしばしば非常に僅かな量で出現
するので、その検出のために、この物質を非常に特異的
にかつ正確に測定することのできる、イムノアッセイの
原理による方法を使用する。これには多くの変法があ
る。種々の免疫学的測定法は均一及び不均一法に分ける
ことができる。不均一法においては、検出すべき物質及
び標識成分を含有する複合体を固定し、これにより結合
していない成分から分離するために固層反応が常に関与
する。均一法においては結合した標識及び結合していな
い標識の分離は行なわれないので、結合した及び結合し
ていない標識の差を他の方法で行なわなければならな
い。
【０００３】このためには種々の可能性がある。
【０００４】西独特許公開第２７４９９５６号公報から
は凝集反応の評価に基づく蛋白質を検出するための方法
が公知である。この際、測定すべき物質に対する抗体を
直接凝集性粒子に結合させる。しかしながら、この結合
により抗体の反応性は妨げられる。更に、この種の測定
法はリウマトイド因子による妨害に敏感である。
は凝集反応の評価に基づく蛋白質を検出するための方法
が公知である。この際、測定すべき物質に対する抗体を
直接凝集性粒子に結合させる。しかしながら、この結合
により抗体の反応性は妨げられる。更に、この種の測定
法はリウマトイド因子による妨害に敏感である。
【０００５】ヨーロッパ特許公開第０３５６９６４号公
報中にはそれまで公知の方法の欠点をすでに克服した均
一検出法が記載されている。この際、試料溶液を相互に
結合性であり、かつそのうちの１つは検出すべき物質と
結合することのできる、少なくとも２種のレセプターと
共に恒温保持する。この際、凝集は試験すべき物質と両
方のレセプターとが結合した時のみ行なわれるが、レセ
プターが相互に結合するか、又は試験すべき物質が両方
のレセプターの１方とのみ結合する時は生じない。
報中にはそれまで公知の方法の欠点をすでに克服した均
一検出法が記載されている。この際、試料溶液を相互に
結合性であり、かつそのうちの１つは検出すべき物質と
結合することのできる、少なくとも２種のレセプターと
共に恒温保持する。この際、凝集は試験すべき物質と両
方のレセプターとが結合した時のみ行なわれるが、レセ
プターが相互に結合するか、又は試験すべき物質が両方
のレセプターの１方とのみ結合する時は生じない。
【０００６】検出すべき物質と結合性のレセプターとし
て、特異的に相互に結合性のペアの１方のパートナーと
測定すべき物質と特異的に結合性の成分Ｋとからなる複
合体を使用する。ここに記載された原理を多くの同じエ
ピトープを有する蛋白質の検出のために使用する場合、
検出すべき物質と結合性のレセプターとして、非特異的
凝集を締め出すために検出すべき物質に関して唯一の結
合位のみを有する複合体を使用すべきである。
て、特異的に相互に結合性のペアの１方のパートナーと
測定すべき物質と特異的に結合性の成分Ｋとからなる複
合体を使用する。ここに記載された原理を多くの同じエ
ピトープを有する蛋白質の検出のために使用する場合、
検出すべき物質と結合性のレセプターとして、非特異的
凝集を締め出すために検出すべき物質に関して唯一の結
合位のみを有する複合体を使用すべきである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、非特
異的凝集をできるかぎり回避し、こうして正確で再現性
のある結果が得られる、均一イムノアッセイを実施する
ための方法を提供することである。
異的凝集をできるかぎり回避し、こうして正確で再現性
のある結果が得られる、均一イムノアッセイを実施する
ための方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この課題は免疫グロブリ
ンクラスＧの抗体のＦ（ａｂ’）2 −フラグメントを還
元性条件に置き、かつ引き続き結合に好適な官能基を有
するか、または好適な方法で官能基を導入することによ
り誘導体化された成分Ｋと反応させて、成分Ｋを還元の
際に生じたＦａｂ’−フラグメントの遊離ＳＨ−基に官
能基を介して結合させることにより得られた複合体を使
用し、かつ成分Ｋと結合性の物質を有する凝集性粒子を
使用することを特徴とする、Ｆａｂ’−フラグメントと
成分Ｋとからなる複合体を使用し、凝集原理により均一
イムノアッセイを実施する方法により解決する。
ンクラスＧの抗体のＦ（ａｂ’）2 −フラグメントを還
元性条件に置き、かつ引き続き結合に好適な官能基を有
するか、または好適な方法で官能基を導入することによ
り誘導体化された成分Ｋと反応させて、成分Ｋを還元の
際に生じたＦａｂ’−フラグメントの遊離ＳＨ−基に官
能基を介して結合させることにより得られた複合体を使
用し、かつ成分Ｋと結合性の物質を有する凝集性粒子を
使用することを特徴とする、Ｆａｂ’−フラグメントと
成分Ｋとからなる複合体を使用し、凝集原理により均一
イムノアッセイを実施する方法により解決する。
【０００９】意外なことに、この複合体を使用する際に
非特異的凝集が高度に回避されうることが見出された。
一価の結合パートナーの使用により、凝集イムノアッセ
イの原理による方法をその正確さ及び再現性において更
に改良することができた。
非特異的凝集が高度に回避されうることが見出された。
一価の結合パートナーの使用により、凝集イムノアッセ
イの原理による方法をその正確さ及び再現性において更
に改良することができた。
【００１０】本発明方法に関しては検出すべき物質と特
異的に結合性であるＩｇＧ−抗体のＦａｂ’−フラグメ
ントと成分Ｋとからなる複合体を使用する。この種の複
合体はそれぞれ使用すべき抗体を自体公知法でペプシン
で処理することにより製造することができる。この際２
つのパラトープを有し、かつ２つの重鎖がジスルフィド
結合により一緒になっている、Ｆ（ａｂ’）2 と呼ばれ
るフラグメントが生じる。次いで、このＦ（ａｂ’）2
−フラグメントを、優先的に分子内ジスルフィドをヒン
ジ域で分離するが、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド橋
は分離しないような緩和な還元性条件に置く。従って、
有利に緩和な試薬での還元を実施する。このために好適
であるのは、例えばシステアミン、システィン、メルカ
プトエタノール又は水素化硼素である。こうして遊離Ｓ
Ｈ−基１〜３個を有するＦａｂ’−フラグメントが得ら
れる。すべての遊離ＳＨ−基は成分Ｋとの結合のために
提供される。しかしながら、立体障害により１つの成分
Ｋのみと結合するか、又は２つ又はそれ以上の結合した
成分Ｋのうちの１つだけがその活性を保持することが明
らかになった。
異的に結合性であるＩｇＧ−抗体のＦａｂ’−フラグメ
ントと成分Ｋとからなる複合体を使用する。この種の複
合体はそれぞれ使用すべき抗体を自体公知法でペプシン
で処理することにより製造することができる。この際２
つのパラトープを有し、かつ２つの重鎖がジスルフィド
結合により一緒になっている、Ｆ（ａｂ’）2 と呼ばれ
るフラグメントが生じる。次いで、このＦ（ａｂ’）2
−フラグメントを、優先的に分子内ジスルフィドをヒン
ジ域で分離するが、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド橋
は分離しないような緩和な還元性条件に置く。従って、
有利に緩和な試薬での還元を実施する。このために好適
であるのは、例えばシステアミン、システィン、メルカ
プトエタノール又は水素化硼素である。こうして遊離Ｓ
Ｈ−基１〜３個を有するＦａｂ’−フラグメントが得ら
れる。すべての遊離ＳＨ−基は成分Ｋとの結合のために
提供される。しかしながら、立体障害により１つの成分
Ｋのみと結合するか、又は２つ又はそれ以上の結合した
成分Ｋのうちの１つだけがその活性を保持することが明
らかになった。
【００１１】特異的に結合するペアのパートナーである
成分ＫがこのＦａｂ′−フラグメントに結合する。成分
Ｋはすでに存在しているか又は導入され、かつ場合によ
り活性化される官能基を介してＦａｂ′−フラグメント
に今や結合することができる。この結合はＦａｂ′−フ
ラグメントのＳＨ−基と成分Ｋの官能基との間で直接行
なわれるか、又はスペーサーを介して行なわれる。
成分ＫがこのＦａｂ′−フラグメントに結合する。成分
Ｋはすでに存在しているか又は導入され、かつ場合によ
り活性化される官能基を介してＦａｂ′−フラグメント
に今や結合することができる。この結合はＦａｂ′−フ
ラグメントのＳＨ−基と成分Ｋの官能基との間で直接行
なわれるか、又はスペーサーを介して行なわれる。
【００１２】Ｆａｂ′−フラグメントと成分Ｋとの結合
は直接それぞれ存在する官能基を介して行なうことがで
きる。この実施形においては非特異的結合は特に僅かで
ある。結合のためにスペーサーを使用することは、同様
に可能である。この際、スペーサーの長さは遊離ＳＨ−
基の位置に依り決まり、更にこの位置は使用したＩｇＧ
−抗体のサブクラスに依存する。成分分子３個までは結
合されうるが、立体障害により１個だけが特異的結合ペ
アのパートナーと結合性であるということが見い出され
た。
は直接それぞれ存在する官能基を介して行なうことがで
きる。この実施形においては非特異的結合は特に僅かで
ある。結合のためにスペーサーを使用することは、同様
に可能である。この際、スペーサーの長さは遊離ＳＨ−
基の位置に依り決まり、更にこの位置は使用したＩｇＧ
−抗体のサブクラスに依存する。成分分子３個までは結
合されうるが、立体障害により１個だけが特異的結合ペ
アのパートナーと結合性であるということが見い出され
た。
【００１３】スペーサーとしては、ＳＨ基と結合性であ
る官能基と、これと同一又は異なっていてよい、成分と
共有結合することのできる第２の官能基とを有する二官
能性化合物が好適である。スペーサーの長さはＳＨ−結
合の位置により決まる、すなわちこのフラグメントが由
来する抗体のサブクラスにより決まる。スペーサーが長
すぎる場合、スペーサーは多くのＳＨ−基が比較的近く
に相互に存在しているとしても、立体障害が克服されて
いるのですべての成分に１つの結合が可能であるように
する。従って、スペーサーの長さはＳＨ−結合の位置に
より、かつこうして使用すべきＦａｂ′−フラグメント
により決まり、ＩｇＧ−サブクラスＩのＦａｂ′−フラ
グメントに関しては４〜１６個の原子、有利に４〜８個
の原子、サブクラスＩｇＧＩＩの抗体のＦａｂ′−フラ
グメントに関しては４〜１０個の原子、有利に４〜６個
の原子である。成分ＫとサブクラスＩのＩｇＧ−抗体の
Ｆａｂ′−フラグメントとからなる複合体の製造のため
にはスペーサーとしてマレイミドブチルリジンを、Ｉｇ
Ｇ−サブクラスＩＩのＦａｂ′−フラグメントを含有す
る複合体のためにはマレイミドエチルアミンを使用する
のが有利である。
る官能基と、これと同一又は異なっていてよい、成分と
共有結合することのできる第２の官能基とを有する二官
能性化合物が好適である。スペーサーの長さはＳＨ−結
合の位置により決まる、すなわちこのフラグメントが由
来する抗体のサブクラスにより決まる。スペーサーが長
すぎる場合、スペーサーは多くのＳＨ−基が比較的近く
に相互に存在しているとしても、立体障害が克服されて
いるのですべての成分に１つの結合が可能であるように
する。従って、スペーサーの長さはＳＨ−結合の位置に
より、かつこうして使用すべきＦａｂ′−フラグメント
により決まり、ＩｇＧ−サブクラスＩのＦａｂ′−フラ
グメントに関しては４〜１６個の原子、有利に４〜８個
の原子、サブクラスＩｇＧＩＩの抗体のＦａｂ′−フラ
グメントに関しては４〜１０個の原子、有利に４〜６個
の原子である。成分ＫとサブクラスＩのＩｇＧ−抗体の
Ｆａｂ′−フラグメントとからなる複合体の製造のため
にはスペーサーとしてマレイミドブチルリジンを、Ｉｇ
Ｇ−サブクラスＩＩのＦａｂ′−フラグメントを含有す
る複合体のためにはマレイミドエチルアミンを使用する
のが有利である。
【００１４】Ｆａｂ′−フラグメントと成分Ｋとからな
る複合体を均一イムノアッセイの実施の際にレセプター
として自体公知で使用する。もう１つのレセプターとし
て本発明方法においては成分Ｋと結合性の物質を有する
凝集性粒子を使用する。有利な実施形においては、成分
Ｋと結合性の物質が二官能性光反応性スペーサーを介し
て共有結合している、凝集性粒子を使用する。この種の
凝集性粒子は、まず成分Ｋと結合性の物質をヘテロ二官
能性試薬と反応させることにより製造することができる
が、このヘテロ二官能性試薬は一方ではアリールアチド
基を、他方では結合パートナーのアミノ基と反応する官
能基を有する。この際、アミノ基と反応性の基が結合性
物質と反応する。未反応の試薬を除去した後、生物学的
材料をあらかじめ決めた時間の間、例えば粒径１００ｎ
ｍを下まわるポリスチロールラテックスであってよい、
不活性担体材料と一緒にし、次いで光を作用させること
により光反応を惹起するが、この際アリールアチド基か
らの反応性ニトレンの形成を介して不活性担体への結合
が行なわれる。引き続き、共有結合していない材料を洗
浄剤洗浄により効果的に分離し、遠心分離又は膜での透
析を介して除去する。この種の粒子の表面特性を、例え
ば免疫学的に不活性な蛋白質、例えばＲＳＡを前処理、
同時処理又は後処理により粒子の上に担持させることに
より所定の変性を行なうことができる。これにより試薬
の安定性をも高める。粒子あたりの特異的に結合性の物
質の量は使用した蛋白質量並びに負荷の際のラテックス
濃度を介して限定され、かつ再現性に調節することがで
きる。更に、限定された特異的結合性を有する表面をヘ
テロ二官能性試薬もしくはその鎖長の選択により調節す
ることができる。この方法の利点は特異的に結合性の物
質がすべての種類の固相に結合することができるという
ことである、すなわち官能基を有する固相粒子を指定し
ないということである。固相として特にスチロール及び
メチルスチロールのホモ及びコポリマー、アクリル酸及
びそのエステルのホモ及びコポリマー、メタクリル酸及
びその誘導体、例えばアクリロニトリル又はアクリルア
ミドのホモ及びコポリマー及びブタジエン、クロロプレ
ン又はイソプレンのようなジエン及び塩化ビニルのホモ
及びコポリマーが好適である。このような結合により不
所望なラテックス−ラテックス−結合は実質的に生じ
ず、アチド基の非特異的結合においてラテックスと蛋白
質との共有結合だけが生じ、わずかな量で蛋白質と蛋白
質との結合が生じる。
る複合体を均一イムノアッセイの実施の際にレセプター
として自体公知で使用する。もう１つのレセプターとし
て本発明方法においては成分Ｋと結合性の物質を有する
凝集性粒子を使用する。有利な実施形においては、成分
Ｋと結合性の物質が二官能性光反応性スペーサーを介し
て共有結合している、凝集性粒子を使用する。この種の
凝集性粒子は、まず成分Ｋと結合性の物質をヘテロ二官
能性試薬と反応させることにより製造することができる
が、このヘテロ二官能性試薬は一方ではアリールアチド
基を、他方では結合パートナーのアミノ基と反応する官
能基を有する。この際、アミノ基と反応性の基が結合性
物質と反応する。未反応の試薬を除去した後、生物学的
材料をあらかじめ決めた時間の間、例えば粒径１００ｎ
ｍを下まわるポリスチロールラテックスであってよい、
不活性担体材料と一緒にし、次いで光を作用させること
により光反応を惹起するが、この際アリールアチド基か
らの反応性ニトレンの形成を介して不活性担体への結合
が行なわれる。引き続き、共有結合していない材料を洗
浄剤洗浄により効果的に分離し、遠心分離又は膜での透
析を介して除去する。この種の粒子の表面特性を、例え
ば免疫学的に不活性な蛋白質、例えばＲＳＡを前処理、
同時処理又は後処理により粒子の上に担持させることに
より所定の変性を行なうことができる。これにより試薬
の安定性をも高める。粒子あたりの特異的に結合性の物
質の量は使用した蛋白質量並びに負荷の際のラテックス
濃度を介して限定され、かつ再現性に調節することがで
きる。更に、限定された特異的結合性を有する表面をヘ
テロ二官能性試薬もしくはその鎖長の選択により調節す
ることができる。この方法の利点は特異的に結合性の物
質がすべての種類の固相に結合することができるという
ことである、すなわち官能基を有する固相粒子を指定し
ないということである。固相として特にスチロール及び
メチルスチロールのホモ及びコポリマー、アクリル酸及
びそのエステルのホモ及びコポリマー、メタクリル酸及
びその誘導体、例えばアクリロニトリル又はアクリルア
ミドのホモ及びコポリマー及びブタジエン、クロロプレ
ン又はイソプレンのようなジエン及び塩化ビニルのホモ
及びコポリマーが好適である。このような結合により不
所望なラテックス−ラテックス−結合は実質的に生じ
ず、アチド基の非特異的結合においてラテックスと蛋白
質との共有結合だけが生じ、わずかな量で蛋白質と蛋白
質との結合が生じる。
【００１５】凝集性の粒子に結合する物質及び成分Ｋは
相互に結合性である。相互に特異的に結合するすべての
ペアがここでは好適である。本発明においては成分Ｋと
して、および結合性物質としてストレプトアビジンもし
くはアビジン及びビオチンを使用するのが有利である。
相互に結合性である。相互に特異的に結合するすべての
ペアがここでは好適である。本発明においては成分Ｋと
して、および結合性物質としてストレプトアビジンもし
くはアビジン及びビオチンを使用するのが有利である。
【００１６】この方法の実施の際に、すなわち試料溶液
と複合体及び凝集性粒子との恒温保持の際、一方では検
出すべき物質が複合体のＦａｂ′−フラグメントに、か
つ他方では複合体の成分Ｋが凝集性粒子に結合する。こ
の結合によってのみ凝集は惹起する。この複合体は検出
すべき物質への結合に関し、および凝集性粒子への結合
に関し１価であるので、凝集はレセプターにより生じる
ことはない。検出すべき物質が試料溶液中に多ければ多
い程、より強い凝集が生じる。公知法により検出するこ
とのできる凝集の程度は、従って検出すべき物質の含量
に関する直接の尺度である。
と複合体及び凝集性粒子との恒温保持の際、一方では検
出すべき物質が複合体のＦａｂ′−フラグメントに、か
つ他方では複合体の成分Ｋが凝集性粒子に結合する。こ
の結合によってのみ凝集は惹起する。この複合体は検出
すべき物質への結合に関し、および凝集性粒子への結合
に関し１価であるので、凝集はレセプターにより生じる
ことはない。検出すべき物質が試料溶液中に多ければ多
い程、より強い凝集が生じる。公知法により検出するこ
とのできる凝集の程度は、従って検出すべき物質の含量
に関する直接の尺度である。
【００１７】本発明による方法は、ヨーロッパ特許公開
第３４９９８８号公報又は同第３５６９６４号公報に記
載されている実施形にとって特に好適である。この実施
形は検出すべき物質を含有する試料溶液を少なくとも２
つのレセプターと恒温保持する均一イムノアッセイを記
載しており、このレセプターの１つは特異的に結合性の
ペアのパートナーと測定すべき物質と特異的に結合する
成分とからなる複合体であり、かつ他のレセプターは特
異的に結合性のパートナーのために少なくとも２つの結
合位を有している。試料溶液を両方のレセプターと恒温
保持することにより、検出すべき物質への及び他のレセ
プターへの複合体の結合が生じ、これにより凝集は生じ
る。検出すべき物質と両方のレセプターとが結合してい
る結合体のみが凝集することができる。正確さを高める
ために、結合に関して１価の部分を有する複合体を使用
することが有利である。
第３４９９８８号公報又は同第３５６９６４号公報に記
載されている実施形にとって特に好適である。この実施
形は検出すべき物質を含有する試料溶液を少なくとも２
つのレセプターと恒温保持する均一イムノアッセイを記
載しており、このレセプターの１つは特異的に結合性の
ペアのパートナーと測定すべき物質と特異的に結合する
成分とからなる複合体であり、かつ他のレセプターは特
異的に結合性のパートナーのために少なくとも２つの結
合位を有している。試料溶液を両方のレセプターと恒温
保持することにより、検出すべき物質への及び他のレセ
プターへの複合体の結合が生じ、これにより凝集は生じ
る。検出すべき物質と両方のレセプターとが結合してい
る結合体のみが凝集することができる。正確さを高める
ために、結合に関して１価の部分を有する複合体を使用
することが有利である。
【００１８】
【実施例】次に実施例につき本発明を詳細に説明する。
【００１９】例１ ストレプトアビジンラテックスの製造 ストレプトアビジン（ベーリンガー・マンハイム）を５
０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ８．０中に１０ｍｇ／ｍｌの
濃度まで溶かした。引き続き、暗所でＤＭＳＯ中のＮ−
ヒドロキシサクシンイミジル−４−アジドベンゾエート
（ＨＳＡＢ）の溶液を、１０：１（ＨＳＡＢ：ストレプ
トアビジン）のモル比が生じるように加えた。光の遮蔽
下に２５℃で２時間恒温保持した。引き続き、過剰のＨ
ＳＡＢを透析により暗所で分離した。
０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ８．０中に１０ｍｇ／ｍｌの
濃度まで溶かした。引き続き、暗所でＤＭＳＯ中のＮ−
ヒドロキシサクシンイミジル−４−アジドベンゾエート
（ＨＳＡＢ）の溶液を、１０：１（ＨＳＡＢ：ストレプ
トアビジン）のモル比が生じるように加えた。光の遮蔽
下に２５℃で２時間恒温保持した。引き続き、過剰のＨ
ＳＡＢを透析により暗所で分離した。
【００２０】ストレプトアビジンでのラテックスの被覆
のためにポリスチロール−粒子（Ｄｏｗ＜１００ｎｍ）
の１％懸濁液を光遮蔽下に活性化ストレプトアビジン
（１ｍｇ／ｍｌ、製法：前記）と共に１夜恒温保持し
た。引き続き、この粒子にＵＶ−光（３４０ｎｍ）を照
射した。このストレプトアビジン・ラテックスを５０ｍ
Ｍグリシン、ｐＨ７．５で２回洗浄し、その後１６時
間、後負荷溶液（０．１％ＲＳＡ）と共に恒温保持し
た。５０ｍＭグリシン、ｐＨ７．５での更なる後洗浄の
後、ストレプトアビジン・ラテックスをグリシン緩衝液
中４℃で貯蔵した。
のためにポリスチロール−粒子（Ｄｏｗ＜１００ｎｍ）
の１％懸濁液を光遮蔽下に活性化ストレプトアビジン
（１ｍｇ／ｍｌ、製法：前記）と共に１夜恒温保持し
た。引き続き、この粒子にＵＶ−光（３４０ｎｍ）を照
射した。このストレプトアビジン・ラテックスを５０ｍ
Ｍグリシン、ｐＨ７．５で２回洗浄し、その後１６時
間、後負荷溶液（０．１％ＲＳＡ）と共に恒温保持し
た。５０ｍＭグリシン、ｐＨ７．５での更なる後洗浄の
後、ストレプトアビジン・ラテックスをグリシン緩衝液
中４℃で貯蔵した。
【００２１】例２ Ｆａｂ′−ビオチン−複合体の製造 マウスの免疫により常法で得られた免疫グロブリンクラ
スＧＩ及びＧＩＩａのモノクローナル抗体を次に記載し
た方法により変換し、Ｆａｂ′−ビオチン−複合体にし
た。
スＧＩ及びＧＩＩａのモノクローナル抗体を次に記載し
た方法により変換し、Ｆａｂ′−ビオチン−複合体にし
た。
【００２２】マウス−ＩｇＧ ５０ｍｇを１００ｍＭク
エン酸ナトリウム、ｐＨ３．６中に１０ｍｇ／ｍｌの蛋
白質濃度まで溶かした。３７℃で加熱した溶液にペプシ
ン溶液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．６中
１ｍｇ／ｍｌ）を１：１０００の比で加えた。３７℃
で、２．５時間撹拌した後、反応混合物のｐＨ−値をト
リスを添加することにより、８．３に調節した。引き続
き、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．８に対して透析
した。未消化ＩｇＧ及びＦｃ−フラグメントのＦ（ａ
ｂ′）2からの分離はＤＥＡＥ−セファロース・ファス
ト・フロー（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ
ｆｌｏｗ）及びセファクリルＳ−２００により行なっ
た。Ｆ（ａｂ′）2−フラグメントを集めて、凍結乾燥
した。
エン酸ナトリウム、ｐＨ３．６中に１０ｍｇ／ｍｌの蛋
白質濃度まで溶かした。３７℃で加熱した溶液にペプシ
ン溶液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．６中
１ｍｇ／ｍｌ）を１：１０００の比で加えた。３７℃
で、２．５時間撹拌した後、反応混合物のｐＨ−値をト
リスを添加することにより、８．３に調節した。引き続
き、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．８に対して透析
した。未消化ＩｇＧ及びＦｃ−フラグメントのＦ（ａ
ｂ′）2からの分離はＤＥＡＥ−セファロース・ファス
ト・フロー（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ
ｆｌｏｗ）及びセファクリルＳ−２００により行なっ
た。Ｆ（ａｂ′）2−フラグメントを集めて、凍結乾燥
した。
【００２３】Ｆ（ａｂ′）２１０ｍｇを１００ｍＭ Ｋ
Ｈ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．３中に溶か
し、濃度１０ｍｇ／ｍｌにした。引き続き５００ｍＭ亜
砒酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＫＨ
２ＰＯ４、ｐＨ６．８の溶液２０μｌ並びに２００ｍＭ
メルカプトエチルアミノ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍ
Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８からなる溶液２５μｌを
添加した。３７℃で２時間撹拌下に恒温保持した。引き
続き、Ｆａｂ′−プールをセファデックスＧ−２５−カ
ラムでクロマトグラフィーにかけることにより低分子成
分から分離した。
Ｈ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．３中に溶か
し、濃度１０ｍｇ／ｍｌにした。引き続き５００ｍＭ亜
砒酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＫＨ
２ＰＯ４、ｐＨ６．８の溶液２０μｌ並びに２００ｍＭ
メルカプトエチルアミノ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍ
Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８からなる溶液２５μｌを
添加した。３７℃で２時間撹拌下に恒温保持した。引き
続き、Ｆａｂ′−プールをセファデックスＧ−２５−カ
ラムでクロマトグラフィーにかけることにより低分子成
分から分離した。
【００２４】ビオチニル化のためにはマレイミドエチル
アミン−ビオチン及びマレイミドブチリルリジン−ビオ
チンをそれぞれＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍｌまで溶かし
た。分離した配合物中ではＦａｂ′−フラグメントの溶
液にマレイミドエチルアミン−ビオチンもしくはマレイ
ミドブチリルリジン−ビオチンを、モル比１０：１（ビ
オチン誘導体：Ｆａｂ′）が生じるように添加した。２
５℃で１時間の恒温保持後、まずシスティンを全１ｍ
Ｍ、および更に３０分後ヨードアセトアミドを全５ｍＭ
添加した。更に、３０分間恒温保持した後２ｍＭ ＫＨ
2ＰＯ4、ｐＨ７．５に対して透析した。得られたＦａ
ｂ′−ビオチン−複合体を−２０℃で貯蔵した。
アミン−ビオチン及びマレイミドブチリルリジン−ビオ
チンをそれぞれＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍｌまで溶かし
た。分離した配合物中ではＦａｂ′−フラグメントの溶
液にマレイミドエチルアミン−ビオチンもしくはマレイ
ミドブチリルリジン−ビオチンを、モル比１０：１（ビ
オチン誘導体：Ｆａｂ′）が生じるように添加した。２
５℃で１時間の恒温保持後、まずシスティンを全１ｍ
Ｍ、および更に３０分後ヨードアセトアミドを全５ｍＭ
添加した。更に、３０分間恒温保持した後２ｍＭ ＫＨ
2ＰＯ4、ｐＨ７．５に対して透析した。得られたＦａ
ｂ′−ビオチン−複合体を−２０℃で貯蔵した。
【００２５】例３ ストレプトアビジンで被覆したラテックス−粒子および
抗−ＴＳＨ−抗体フラグメントとビオチンとからなる複
合体を使用したテストにおいて、本発明による複合体の
使用により非特異的凝集がどの程度減少するかを試験し
た。
抗−ＴＳＨ−抗体フラグメントとビオチンとからなる複
合体を使用したテストにおいて、本発明による複合体の
使用により非特異的凝集がどの程度減少するかを試験し
た。
【００２６】免疫グロブリンクラスＧＩのモノクローナ
ル抗−ＴＳＨ−抗体（ＥＣＡＣＣ８７１２２２０２）を
使用した。７：１（ビオチン：ＩｇＧ）の比でＮ−ヒド
ロキシサクシンイミド−Ｘ−ビオチンとの反応によりＪ
ＡＣＳ．第１００巻、１９７８年、第３５８５〜３５９
０による抗体のアミノ基を介して完全抗体のビオチニル
化を比較のために行なった。
ル抗−ＴＳＨ−抗体（ＥＣＡＣＣ８７１２２２０２）を
使用した。７：１（ビオチン：ＩｇＧ）の比でＮ−ヒド
ロキシサクシンイミド−Ｘ−ビオチンとの反応によりＪ
ＡＣＳ．第１００巻、１９７８年、第３５８５〜３５９
０による抗体のアミノ基を介して完全抗体のビオチニル
化を比較のために行なった。
【００２７】この抗体からの本発明によるＦａｂ′−ビ
オチン−複合体を例２に記載されたように、マレイミド
ブチリルリジン−ビオチンの使用下に製造した。
オチン−複合体を例２に記載されたように、マレイミド
ブチリルリジン−ビオチンの使用下に製造した。
【００２８】凝集の測定のために、１％ストレプトアビ
ジン−ラテックス（例１により製造）６０μｌ、１００
ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０ ８００μｌ及び抗−
ＴＳＨ−ＩｇＧ−ビオチン−複合体（比較）２０μｌも
しくは抗−ＴＳＨ−Ｆａｂ′−ビオチン−複合体（本発
明）２０μｌをパーキン・エルマー測光器のキュベット
中にピペットで入れた。複合体の蛋白質濃度はそれぞれ
１０μｇ／ｍｌであった。
ジン−ラテックス（例１により製造）６０μｌ、１００
ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０ ８００μｌ及び抗−
ＴＳＨ−ＩｇＧ−ビオチン−複合体（比較）２０μｌも
しくは抗−ＴＳＨ−Ｆａｂ′−ビオチン−複合体（本発
明）２０μｌをパーキン・エルマー測光器のキュベット
中にピペットで入れた。複合体の蛋白質濃度はそれぞれ
１０μｇ／ｍｌであった。
【００２９】４０５ｎｍにおける吸光度上昇をｔ＝１分
及びｔ＝１０分の間測定した。この結果を第１表中に示
した。この表は、本発明によるＦａｂ′−ビオチン−複
合体の使用下に非特異的凝集を参照値（ＩｇＧ−ビオチ
ン−複合体）の1/5 より小量に減少することができたこ
とを示した。
及びｔ＝１０分の間測定した。この結果を第１表中に示
した。この表は、本発明によるＦａｂ′−ビオチン−複
合体の使用下に非特異的凝集を参照値（ＩｇＧ−ビオチ
ン−複合体）の1/5 より小量に減少することができたこ
とを示した。
【００３０】 第１表 抗体−複合体 吸光度上昇（ｍＥ） ＩｇＧ−ビオチン（比較） ６６３ Ｆａｂ′−ビオチン（本発明） １１９ 例４ 本発明により製造した複合体の非特異的凝集を例３に記
載したように試験した。
載したように試験した。
【００３１】免疫グロブリンクラスＩｇＧＩに属する
が、２種の異なるモノクローナル抗−ミオグロビン−抗
体を例２に記載したようにＦａｂ′−ビオチン−複合体
に変換した。非特異的凝集に対するスペーサーの長さの
影響を試験するために、両方のＦａｂ′−フラグメント
をスペーサーとしてマレイミドエチルアミン（ＭＥＡ）
及びマレイミドブチリルリジン（ＭＢＬ）を使用して、
ビオチンと反応させた。
が、２種の異なるモノクローナル抗−ミオグロビン−抗
体を例２に記載したようにＦａｂ′−ビオチン−複合体
に変換した。非特異的凝集に対するスペーサーの長さの
影響を試験するために、両方のＦａｂ′−フラグメント
をスペーサーとしてマレイミドエチルアミン（ＭＥＡ）
及びマレイミドブチリルリジン（ＭＢＬ）を使用して、
ビオチンと反応させた。
【００３２】結果を第２表にまとめた。より短かいＭＥ
Ａ−スペーサーを使用することにより、非特異的凝集は
更に減少させることができることが明らかである。
Ａ−スペーサーを使用することにより、非特異的凝集は
更に減少させることができることが明らかである。
【００３３】 第２表 抗体−複合体 吸光度上昇（ｍＥ） （Ｆａｂ′−ビオチン） ＭＢＬ ＭＥＡ 抗−ミオグロビン−ＡＫ１ ２６７ ８８ 抗−ミオグロビン−ＡＫ２ ２２８ ７２ 例５ 一方は免疫グロブリンクラスＧＩ（ＭａｂＬＪ７３８）
に、他方はクラスＧＩＩａ（ＭａｂＴｕｌｌ、ＥＣＡＣ
Ｃ８７０４１００２）に属する、２種の異なるモノクロ
ーナル抗−ＡＦＰ−抗体を例２に記載したようにＦａ
ｂ′−ビオチン−複合体に変換した。この際、両方のＦ
ａｂ′−フラグメントをスペーサーとしてＭＥＡもしく
はＭＢＬを使用してビオチニル化した。
に、他方はクラスＧＩＩａ（ＭａｂＴｕｌｌ、ＥＣＡＣ
Ｃ８７０４１００２）に属する、２種の異なるモノクロ
ーナル抗−ＡＦＰ−抗体を例２に記載したようにＦａ
ｂ′−ビオチン−複合体に変換した。この際、両方のＦ
ａｂ′−フラグメントをスペーサーとしてＭＥＡもしく
はＭＢＬを使用してビオチニル化した。
【００３４】非特異的凝集の測定のために、種々の複合
体（１０μｇ／ｍｌ）２０μｌ、１００ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、２％ＰＥＧ４００００、２％プルロニック（Ｐｌ
ｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８、ｐＨ７．０ ８００μｌ及び１
％ストレプトアビジン−ラテックス（例１により製造）
２０μｌをそれぞれパーキン・エルマー測光器のキュベ
ット中にピペットで入れた。吸光度上昇をｔ＝１分及び
ｔ＝１０分の間で４０５ｎｍで測定した。
体（１０μｇ／ｍｌ）２０μｌ、１００ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、２％ＰＥＧ４００００、２％プルロニック（Ｐｌ
ｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８、ｐＨ７．０ ８００μｌ及び１
％ストレプトアビジン−ラテックス（例１により製造）
２０μｌをそれぞれパーキン・エルマー測光器のキュベ
ット中にピペットで入れた。吸光度上昇をｔ＝１分及び
ｔ＝１０分の間で４０５ｎｍで測定した。
【００３５】結果を第３表中に示した。免疫グロブリン
クラスＩの他のモノクローナル抗体に関してすでに測定
したように（例３及び４を比較）、ＩｇＧＩからの抗−
ＡＦＰ−Ｆａｂ′−ビオチンを用いて低い非特異的凝集
が得られ、これはより短かいＭＥＡ−スペーサーの使用
により更に抑さえられる。
クラスＩの他のモノクローナル抗体に関してすでに測定
したように（例３及び４を比較）、ＩｇＧＩからの抗−
ＡＦＰ−Ｆａｂ′−ビオチンを用いて低い非特異的凝集
が得られ、これはより短かいＭＥＡ−スペーサーの使用
により更に抑さえられる。
【００３６】これに対し、ＩｇＧＩＩａからの抗−ＡＦ
Ｐ−Ｆａｂ′−ビオチン−複合体はＭＢＬ−スペーサー
で比較的高い非特異的凝集を示した。しかしながらより
短かいＭＥＡ−スペーサーの使用により有利な結果を達
成することができた。
Ｐ−Ｆａｂ′−ビオチン−複合体はＭＢＬ−スペーサー
で比較的高い非特異的凝集を示した。しかしながらより
短かいＭＥＡ−スペーサーの使用により有利な結果を達
成することができた。
【００３７】 第３表 抗体−複合体 吸光度上昇（ｍＥ） （Ｆａｂ′−ビオチン） ＭＢＬ ＭＥＡ 抗−AFP−Mab−LJ738（IgG I） ４２ ３ 抗−AFP−Mab−Tull（IgG IIa） ４３４ ２１２ 例６ 複合体Ｍａｂ−Ｔｕｌｌ−Ｆａｂ′−ＭＥＡ−ビオチン
及びＭａｂ−ＬＪ７３８−Ｆａｂ′−ＭＢＬ−ビオチン
を用いてストレプトアビジン−ラテックス−ベースの均
一イムノアッセイを実施した：両方の複合体（１０μｇ
／ｍｌ、抗体−複合体の比１：１）の溶液５０μｌ、１
００ｍＭトリス／ＨＣｌ、２％ＰＥＧ４００００、２％
プルロニックＦ６８、ｐＨ７．０ ８００μｌ及び１％
ストレプトアビジン−ラテックス２０μｌ並びにそれぞ
れＡＦＰ−スタンダード（０、５０、１００、１０００
及び２０００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌをキュベット中にピ
ペットで入れた。凝集の増大をパーキン・エルマー測光
器中で４０５ｎｍでｔ＝１分とｔ＝１０分の間で測定し
た。
及びＭａｂ−ＬＪ７３８−Ｆａｂ′−ＭＢＬ−ビオチン
を用いてストレプトアビジン−ラテックス−ベースの均
一イムノアッセイを実施した：両方の複合体（１０μｇ
／ｍｌ、抗体−複合体の比１：１）の溶液５０μｌ、１
００ｍＭトリス／ＨＣｌ、２％ＰＥＧ４００００、２％
プルロニックＦ６８、ｐＨ７．０ ８００μｌ及び１％
ストレプトアビジン−ラテックス２０μｌ並びにそれぞ
れＡＦＰ−スタンダード（０、５０、１００、１０００
及び２０００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌをキュベット中にピ
ペットで入れた。凝集の増大をパーキン・エルマー測光
器中で４０５ｎｍでｔ＝１分とｔ＝１０分の間で測定し
た。
【００３８】このイムノアッセイの結果を第４表中に記
載する。
載する。
【００３９】 第４表 スタンダード濃度（ｎｇ／ｍｌ） ０ ５０ １００ 500 1000 2000 吸光度 ４４ ５１ ６０ １５１ ２９９ ５４７ （平均値） ＶＫ（％） １７.６ １２.８ １２.２ ８.４ ４.５ １.９ Ｓｔｄ．０＋３ｓ域 ６７ − − − − −
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フランソワ ギヨ フランス国 メイラン リュ シュヌヴ ィエール 21 (72)発明者 ミヒャエル ベルガー ドイツ連邦共和国 ペンツベルク クナ ッペンシュトラーセ 16 (56)参考文献 特開 平２−107966（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−13156（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−76899（ＪＰ，Ａ)
Claims (8)
- 【請求項１】 免疫グロブリンクラスＧの抗体Ｆ（ａ
ｂ’）2 −フラグメントを還元性条件下に置き、かつ引
き続き成分Ｋと反応させて、該成分Ｋを還元の際に生じ
たＦａｂ’−フラグメントの遊離ＳＨ−基に結合させる
ことにより得られた複合体を使用し、かつ成分Ｋと結合
性の物質を有する凝集性粒子を使用することを特徴とす
る、凝集原理により均一イムノアッセイを実施する方
法。 - 【請求項２】 成分Ｋとしてビオチンを使用する請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 Ｆａｂ’−フラグメントと成分Ｋとをス
ペーサーを介して結合する請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 ＩｇＧ−サブクラスＩの抗体のＦａｂ’
−フラグメントを使用し、かつ鎖長原子数４〜１６のス
ペーサーを使用する請求項１から３までのいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項５】 ＩｇＧ−サブクラスＩＩの抗体のＦａ
ｂ’−フラグメントを使用し、かつ鎖長原子数４〜１０
のスペーサーを使用する請求項１から３までのいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項６】 凝集性粒子として、成分Ｋと結合性の物
質が二官能性化合物を介して結合しているラテックス粒
子を使用することを特徴とする請求項１から５までのい
ずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 凝集性粒子として、成分Ｋと結合性の物
質と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基及びア
リールアジド基を有する二官能性化合物とを、僅かにア
ルカリ性の条件下に水溶液中で反応させ、その後過剰の
二官能性化合物を分離し、この溶液にラテックスを添加
し、次いで光照射してラテックスへの結合を形成させた
ものを使用する請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 ＩｇＧ抗体のＦａｂ’−フラグメントと
ビオチンとを、Ｆａｂ’−フラグメントの遊離のＳＨ基
を介して結合させてなる複合体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4020204A DE4020204A1 (de) | 1990-06-25 | 1990-06-25 | Durchfuehrung eines homogenen immunoassays nach dem agglutinationsprinzip |
| DE4020204.6 | 1990-06-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04232466A JPH04232466A (ja) | 1992-08-20 |
| JP3000239B2 true JP3000239B2 (ja) | 2000-01-17 |
Family
ID=6409035
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3151322A Expired - Fee Related JP3000239B2 (ja) | 1990-06-25 | 1991-06-24 | 凝集原理による均一イムノアッセイ実施法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3000239B2 (ja) |
| AT (1) | ATE127232T1 (ja) |
| DE (2) | DE4020204A1 (ja) |
| ES (1) | ES2076416T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1404577A (zh) * | 2000-12-11 | 2003-03-19 | 株式会社药得论 | 免疫分析试剂和分析方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6113156A (ja) * | 1984-06-28 | 1986-01-21 | Sumitomo Chem Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−αの定量用試薬及び定量法 |
| US4814433A (en) * | 1987-09-16 | 1989-03-21 | Miles Inc. | Method for obtaining a papain-free antibody fragment preparation |
| US4914040A (en) * | 1988-03-03 | 1990-04-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Reagent and method for determination of a polyvalent substance using an immunoaggregate |
| DE3822750A1 (de) * | 1988-07-05 | 1990-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| DE3829245A1 (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
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-
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- 1990-06-25 DE DE4020204A patent/DE4020204A1/de not_active Withdrawn
-
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- 1991-06-24 AT AT91110369T patent/ATE127232T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-06-24 JP JP3151322A patent/JP3000239B2/ja not_active Expired - Fee Related
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- 1991-06-24 DE DE59106352T patent/DE59106352D1/de not_active Expired - Fee Related
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| DE59106352D1 (de) | 1995-10-05 |
| ATE127232T1 (de) | 1995-09-15 |
| EP0464554B1 (de) | 1995-08-30 |
| ES2076416T3 (es) | 1995-11-01 |
| DE4020204A1 (de) | 1992-01-02 |
| JPH04232466A (ja) | 1992-08-20 |
| EP0464554A2 (de) | 1992-01-08 |
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