JPS6356228B2

JPS6356228B2 -

Info

Publication number: JPS6356228B2
Application number: JP4173779A
Authority: JP
Inventors: Kikuo Kotani; Susumu Watanabe; Nobuaki Nakagawa; Kunio Ooyama
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1979-04-05
Filing date: 1979-04-05
Publication date: 1988-11-07
Also published as: ES490248A0; JPS55133382A; IT1209408B; ES8104797A1; IT8019507A0

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、下記一般式〔〕（ただし式中、Ｒは２―ベンゾチアゾリル基、
Ｘは炭素数２〜10を有するアルキレン基、アルキ
レンオキシアルキレン基またはヒドロキシル基を
置換したアルキレン基である少なくともＳ―Ｓ基
に直結するアルキレン基を有するスペーサー基を
示す）で表わされる新規な多官能性化合物に関す
る。本発明の一般式〔〕で表わされる新規な多官
能性化合物（以下、多官能性化合物〔〕とい
う）は、チオール基を有する化合物、例えば酵
素、ハプテン、抗原、受容体などの免疫関連物
質、蛋白質担体、不溶性担体などの担体、または
それらのチオール化修飾誘導体に対して、ほぼ等
モル反応において、まず第一段の反応としてＳ―
Ｓ交換反応性の速い２―ベンゾチアゾリル基に結
合するＳ―Ｓ基とチオール基を有する化合物のチ
オール基とがＳ―Ｓ交換反応を示し、次いでその
第一段の反応後さらにチオール基を有する化合物
を加えて反応せしめることにより、Ｓ―Ｓ交換反
応性の遅い２―ピリジル基に結合するＳ―Ｓ基と
そのチオール基とにてＳ―Ｓ交換反応を示すもの
で、２種のＳ―Ｓ交換反応性を有する架橋試薬と
して有用な化合物であつて、そのチオール基を有
する化合物を適宜選択し、組合せることにより、
例えば酵素と免疫関連物質との結合体たる免疫測
定用の標識物質、酵素と不溶性担体との結合体た
る固定化酵素、免疫関連物質と不溶性担体との免
疫測定用固相体やアフイニテイークロマトグラフ
イー用担体、ハプテンと蛋白質担体との抗体産生
用ハプテン結合体などの種々の有用性を有するも
のが得られる。本発明者らは、先に、下記一般式〔〕（ただし式中、R′は２―ベンゾチアゾリル基
または２―ピリジル―Ｎ―オキサイド基を示す）
で表わされるＳ―Ｓ交換反応の速い２―ベンゾチ
アゾールに結合するＳ―Ｓ基と、これに比べてＳ
―Ｓ交換反応性の遅い２―ピリジル基に結合する
Ｓ―Ｓ基の２種のＳ―Ｓ交換反応性を示す新規な
化合物を見い出した（特願昭54―3507号明細書＝
特開昭55―94367号公報）。本発明者らは、さらに研究した結果、一般式
（〕で表わされる化合物の如くの分子内に―CO
―NH―結合を含まず目的とする２種のＳ―Ｓ交
換反応性を示す新規な多官能性化合物〔〕を得
ることに成功した。本発明の多官能性化合物〔〕は、不活性媒体
中、２，2′―ジチオビス（ベンゾチアゾール）、
２，2′―ジチオビス（ピリジン）および一般式
〔〕 HS―Ｘ―SH 〔〕（ただし式中、Ｘは前記と同じ基を示す）で表
わされるジチオール化合物（以下、ジチオール化
合物〔〕という）を反応せしめることにより得
られたものであつて、上記の通り、新規かつ極め
て有用なものである。本発明は上記の知見に基いて完成されたもので
下記一般式〔〕（ただし式中、ＲおよびＸは前記と同じ意味を
示す）で表わされる新規な多官能性化合物であつ
て、種々の有用性を有する新規な化合物を提供す
ることを目的とするものである。まず本発明の多官能性化合物〔〕を得るに当
つては、上記の如く、不溶性媒体中、２，2′―ジ
チオビス（ベンゾチアゾール）、２，2′―ジチオ
ビス（ピリジン）およびジチオール化合物〔〕
を反応せしめることにより得られるもので、使用
される不活性媒体としては２，2′―ジチオビス
（ベンゾチアゾール）、２，2′―ジチオビス（ピリ
ジン）、ジチオール化合物〔〕を溶解し得る溶
剤であればよく、例えばメタノール、エタノール
などのアルコール類、テトラヒドロフラン、ジオ
キサン、エチルエーテル、ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキサイド、アセトン、ベンゼ
ンなどの単一または混合有機溶剤、または上記有
機溶剤と水または緩衝液との混合溶剤などが挙げ
られる。また本発明に使用されるジチオール化合物
〔〕としては、そのチオール基に直結する基が
アルキレン基であればよく、またこのアルキレン
基は直鎖状、分枝鎖状であつてもよく、また水酸
基またはその保護誘導体を置換したものが好まし
く、またエーテル結合基を有してもよく例えば
１，２―ジメルカプトエタン、１，４―ジメチル
カプトプタン、１，６―ジメチルカプトヘキサ
ン、１，８―ジメチルカプトオクタン、１，９―
ジメチルカプトノナン、１，10―ジメルカペトデ
カン、２，３―ジメルカプト―１―プロパノー
ル、ジ（２―メルカプトエチル）エーテル、ジチ
オエリスリトール、ジチオスレイトールなどの炭
素数２〜10のジチール化合物が挙げられる。次いで、上記の不活性媒体に、２，2′―ジチオ
ビス（ベンゾチアゾール）、２，2′―ジチオビス
（ピリジン）、ジチオール化合物〔〕を溶解せし
めるのであるが、これらはあらかじめ各々溶解し
て使用してもよく、同時に溶解せしめてもよく、
また反応に際してはジチオール化合物〔〕／モ
ル当り２，2′―ジチオビス（ベンゾチアゾール）
１モル以上、好ましくは１モル〜1.5モル程度、
２，2′―ジチオビス（ピリジン）１モル以上、好
ましくは５〜30モル程度の割合にて使用すればよ
い。さらに反応せしめるに当つて、反応温度とし
ては０〜40℃、反応時間としては、反応温度や溶
媒により多少異なるが通常２〜240分間程度にて
行なえばよい。このようにして反応せしめた後、その反応液よ
り、本発明の目的物たる多官能性化合物〔〕を
分離採取するのであるが、分離採取に当つては、
溶媒抽出、カラムクロマトグラフイーなどの公知
の分離採取および必要に応じて精製の手段を用い
て目的物を得ればよい。このようにして得られる多官能性化合物〔〕
は、そのスペーサー基の両端にＳ―Ｓ基を結合
し、各々のＳ―Ｓ基は２―ベンゾチアゾリル基、
２―ピリジル基を結合してなるもので、またその
スペーサー基は使用するジチオール化合物〔〕
の基Ｘと同一基からなるものであつて、そのＳ―
Ｓ基に直結するアルキレン基を有するものであつ
て、直鎖状であつてもよく、分析鎖状であつても
よく、また置換基としてヒドロキシル基を有して
もよく、さらにエーテル結合基を有するアルキレ
ンオキシアルキレン基でもよいものであり、炭素
数２〜10のスペーサー基が挙げられるものであ
る。また、このようにして得られた多官能性化合物
〔〕は、例えば10％ジメチルホルムアミド含有
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に溶解し、これに２
―メルカプトエタノールを添加して反応せしめ、
それによつて生成する２―メルカプトベンゾチア
ゾールおよび２―メルカプトピリジンの量を分析
することによつて、目的たるＳ―Ｓ交換反応性を
有するものであることが確認される。これらの多官能性化合物〔〕は、、その１モ
ル当り、１モルの２―メルカプトエタノールの使
用量においてＲ―Ｓ―Ｓ―基のＳ―Ｓ交換反応性
の速い基が２―メルカプトエタノールと反応して
まず基Ｒに基づく２―ベンゾチアゾールを生成
し、次いで１モルの２―メルカプトエタノールの
使用により、Ｓ―Ｓ交換反応性の遅い

【式】基に基づく２―メルカプトピリジンを生成するもので、本発明の多官能性化合
物〔〕は、少なくともＳ―Ｓ基に直結するアル
キレン基を有し、かつ一端を２―ベンゾチアゾリ
ル基、他端を２―ピリジル基となすことにより、
目的とする２種のＳ―Ｓ交換反応性を有する架橋
試薬として有用な化合物となし得るものである。上記の如くして得られた本発明の多官能性化合
物〔〕は、前記の如く種々のチオール化合物を
適宜選択し、組合せることにより種々の有用なも
のが得られるものである。次に本発明の実施例および参考例を挙げて具体
的に説明するが、本発明はこれによつて何んら限
定されるものではない。実施例１２，2′―ジチオビス（ベンゾチアゾール）20mg
を、40％エタノール含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
6.4、1mMEDTA含有）３に溶解し、これに、
２，2′―ジチオビス（ピリジン）397mgを溶解し
た40％エタノール含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
6.4、1mMEDTA含有）１および１，２―ジメ
ルカプトエタン5.7mgを溶解した40％エタノール
含有0.1Mリン酸緩衝液（PH6.4、1mMEDTA含
有）１を室温下撹拌しながら加えて60分間反応
せしめた。反応後減圧下にてエタノールを留去
し、次いでクロロホルムにて３回抽出し、そのク
ロロホルム層を回収し、併合し、これに芒硝を加
えて乾燥せしめた後濃縮した。次いでこれを、シ
リカゲル充填カラム（径1.0×40cm）にチヤージ
し、ベンゼン：酢酸エチル＝20：１の溶出溶媒に
て溶出せしめて、その目的物を含むフラクシヨン
を回収し、これを減圧乾固して１―（2′―ベンゾ
チアゾリル―ジチオ）２―（2′―ピリジル―ジチ
オノエタン13.2mgを得た。本品の理化学的性状は次の通りである。 λmax×279nm（ジメチルホルムアミド：0.1M
リン酸緩衝液（PH7.5）＝１：９） Rf＝0.51（ベンゼン：酢酸エチル＝10：１によ
るシリカゲル薄層クロマトグラフイー）構造式また、本品を0.030mMの濃度に溶解した10％
ジメチルホルムアミド含有．1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）に、２―メルカプトエタノールを0.1％
添加したところ、２―メルカプトベンゾチアゾー
ル0.029mMおよび２―メチルカプトピリジン
0.028mMが遊離したものであつた。実施例２２，2′―ジチオビス（ベンゾチアゾール）20mg
を溶解した40％エタノール含有0.1Mリン酸緩衝
液（PH6.4、1mMEDTA含有）３と、２，2′―
ジチオビス（ピリジン）132mgを溶解した40％エ
タノール含有0.1Mリン酸緩衝液（PH6.4、
1mMEDTA含有）１を混合し、これに、1.10
―ジメルカプトデカン12.4mgを溶解した40％エタ
ノール含有0.1Mリン酸緩衝液（PH6.4、
1mMEDTA含有）１を室温下撹拌しながら加
えて90分間反応せしめた。反応後エタノールを減圧留去せしめ、クロロホ
ルムにて３回抽出せしめ、このクロロホルム層を
回収、併合し、芒硝にて乾燥した後濃縮した。次
いでこの濃縮液を、シリカゲル充填カラム（径
1.0×20cm）にチヤージし、ベンゼン：酢酸エチ
ル＝20：１の溶出溶媒にて溶出せしめ、その目的
物を含むフラクシヨンを回収し、これを減圧乾固
して１―（2′―ベンゾチアゾリル―ジチオ）10―
（2′―ピリジル―ジチオ）デカン19.5mgを得た。本品の理化学的性状は次の通りである。 λmax×279nm（ジメチルホルムアミド：0.1M
リン酸緩衝液（PH7.5）＝１：９） Rf＝0.51（ベンゼン：酢酸エチル＝10：１によ
るシリカゲル薄層クロマトグラフイー） Rf＝0.75（ベンゼン：酢酸エチル＝３：１によ
るシリカゲル薄層クロマトグラフイー）構造式また本品の0.030mMの10％ジメチルホルムア
ミド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）の溶液に、
２―メルカプトエタノールを0.1％添加した結果、
２―メルカプトベンゾチアゾール0.029mM、２
―メルカプトピリジン0.029mMを遊離した。実施例３〜９２，2′―ジチオビス（ベンゾチアゾール）、２，
2′―ジチオビス（ピリジン）および下記の種々の
ジチオール化合物〔〕を用いて、実施例１と同
様に反応せしめて、各々の多官能性化合物〔〕
を得た。またジチオール化合物〔〕としては、１，４
―ジメルカプトブタン、１，６―ジメルカプトヘ
キサン、１，８―ジメルカプヘオクタン、１，９
―ジメルカプトノナン、ジ（２―メルカプトエチ
ル）エーテル、ジチオエリスリトール、ジチオス
レイトールを使用した。さらに各々の使用量等は次表の通りであつた。

【表】

【表】カゲル薄層クロマトグラフイーによるものである。
また上記の各多官能性化合物〔〕は、10％ジ
メチルホルムアミド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）中にて、２―メルカプトエタノールの添加
により、その多官能性化合物〔〕の97〜93％相
当モル量の２―メルカプトベンゾチアゾールおよ
び２―メルカプトピリジンを遊離した。参考例１１―（2′―ベンゾチアゾリルージチオ）２―
（2′―ピリジル―ジチオ）エタンの0.32mMに調製
したジメチルホルムアミド溶液１mlに、
0.071mMのグルタチオンの0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.2、1mMEDTA含有）９mlを加えて25℃、
30分間反応せしめた。反応後その反応液について２―メルカプトベン
ゾチアゾールおよび２―メルカプトピリジンそれ
ぞれの吸収極大波長である312nmおよび345nmに
おける吸光度と各波長における各々のモル吸光係
数（２―メルカプトベンゾチアゾール；312nm
（ξ＝20200）、345nm（ξ＝500）、２―メルカプト
ピリジン；312nm（ξ＝3150）、345nm（ε＝
7800））に基いて、その反応液中の２―メルカプ
トベンゾチアゾールおよび２―メルカプトピリジ
ンの濃度を測定した結果それぞれ約0.030mMお
よび0.029mMであつた。また、１―（2′―ベンゾチアゾリル―ジチオ）
10―（2′―ピリジル―ジチオ）デカンについて、
同様に反応を行なつた結果、その96％相当モル量
の２―メルカプトベンゾチアゾールおよび93％相
当モル量の２―メルカプトピリジンが遊離したも
のであつた。これらのことにより、上記の多官能性化合物
は、グルタチオンに対してほぼ定量的にＳ―Ｓ交
換反応性を示した良好な化合物であつた。参考例２：不溶化抗体の製造 ○イ AHSepharose4B（フアルマシア・フアイン、
ケミカルス社製）１ｇを0.1M炭酸水素ナトリ
ウム水溶液10mlにて膨潤せしめた後５％グルタ
ルアルデヒド10mlを加えて室温にて30分間撹拌
反応せしめ、次いで取し、さらに0.5MNacl
水溶液100mlで洗浄した。次いでこれに、２―
アミノエタンチオール0.2ｇ含有0.1M炭酸水素
ナトリウム水溶液20mlを加え、室温下60分間反
応せしめ、これを取し、0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）で洗浄した。さらにこれに、0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0）20mlに加え、さらに水素
化ホウ素ナトリウム100mgを加えて60分間還元
処理し、これを取し、0.15MNacl含有0.01M
リン酸緩衝液（PH8.5）100mlで洗浄し、次いで
この洗浄液20mlを加えて懸濁液となした。 ○ロインスリン抗体活性11％を含むモルモツト
Fab′0.5mgを、0.15MNacl含有0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.0）２mlに溶解し、5.3μｇの１―
（2′―ベンゾチアゾリル―ジチオ）６―（2′―
ピリジル―ジチオ）ヘキサンを含有するジメチ
ルホルムアミド0.2mlを加えて室温下30分間撹
拌反応せしめ、６―（2′―ピリジル―ジチオ）
ヘキサン―１―チオ基を導入したFab′を含有
する反応液を得た。次いでこの反応液を水酸化
ナトリウム水溶液にてPHを8.6に調整した。 ○ハ次いでこの反応液0.2mlに、上記の懸濁液を
加えて室温で60分間反応せしめ、反応後取
し、0.15MNacl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.2）100mlで洗浄し、AHSepharose4B10mg当
り0.38μｇのFab′が結合した不溶化抗体を得た。参考例３：Fab′―酵素結合体インスリン抗体活性11％を含むモルモツト
Fab′0.5mgを、0.5mlの0.15MNacl含有0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.0）に溶解し、これに、5.3μｇの
１―（2′―ベンゾチアゾリル―ジチオ）６―
（2′―ピリジル―ジチオ）ヘキサンを含むジメチ
ルホルムアミド溶液0.2mlを加え、室温下、30分
間撹拌反応せしめ、反応後その溶液のPHを8.5に
調整し、4.8mgのβ―ガラクトシダーゼ含有0.5ml
の0.15MNacl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH8.5）
を加えて室温下、30分間撹拌反応せしめた。反応
後、反応液を、セフアデツクスＧ―200（フアルマ
シア・フアイン・ケミケルズ社製）充填カラム
（径1.5×80cm）にチヤージし、0.15MNacl、0.2
％BSA、0.05％アジ化ナトリウム含有0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.2）を展開溶媒を用いて溶出し、
その45〜52ml分画のβ―ガラクトシダーゼ活性分
画を得た（遊離β―ガラクトシダーゼ含量7.5％、
活性収率82％）。

Claims

【特許請求の範囲】１下記一般式〔〕（ただし式中、Ｒは２―ベンゾチアゾリル基、
Ｘは炭素数２〜10を有するアルキレン基、アルキ
レンオキシアルキレン基またはヒドロキシル基を
置換したアルキレン基である少なくともＳ―Ｓ基
に直結するアルキレン基を有するスペーサー基を
示す）で表わされる新規な多官能性化合物。