JPS61173778A - 重合体担体の活性化方法 - Google Patents
重合体担体の活性化方法Info
- Publication number
- JPS61173778A JPS61173778A JP27484185A JP27484185A JPS61173778A JP S61173778 A JPS61173778 A JP S61173778A JP 27484185 A JP27484185 A JP 27484185A JP 27484185 A JP27484185 A JP 27484185A JP S61173778 A JPS61173778 A JP S61173778A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polymer
- derivative
- group
- hydroxyl
- sulfhydryl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
- C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、有機リガンドを重合体担体に共有結合させる
方法に関する。よシ詳細には、本発明は、１又はそれ以
上の第−或いは第ニアミノ基、或いはスルフヒドリル基
を含有する有機リガンドを重合体グルに共有結合させる
新規な方法に関する。
方法に関する。よシ詳細には、本発明は、１又はそれ以
上の第−或いは第ニアミノ基、或いはスルフヒドリル基
を含有する有機リガンドを重合体グルに共有結合させる
新規な方法に関する。
生物学的に活性な材料を簡便な方法で精製する必要性は
長い間重視されてきている。例えば、酵素を精製する為
の初期の方法は、煩雑であり且つ多くの時間を要するも
のであった。最近になって、酵素その他の生物学的に活
性な材料は、次の様な工程によって精製され得ることが
わかった。すなわち、ここではリガンドとして言及され
る酵素その他の生物学的に活性な材料を固定化し、次に
固定化されたリガンドをそれの存在する混合物から分離
するということを含む工程である。リガンドは、必要に
応じ、固定化された状態で使用し得るし、或いは、適当
な化学処理によってその固定化された担体からはずして
固定化されていない状態でも用いることができる。リガ
ンドを重合体担体に共有結合させる方法の発見は、酵素
学、免疫学、そして他の様様な生物学的技術を発展させ
た。
長い間重視されてきている。例えば、酵素を精製する為
の初期の方法は、煩雑であり且つ多くの時間を要するも
のであった。最近になって、酵素その他の生物学的に活
性な材料は、次の様な工程によって精製され得ることが
わかった。すなわち、ここではリガンドとして言及され
る酵素その他の生物学的に活性な材料を固定化し、次に
固定化されたリガンドをそれの存在する混合物から分離
するということを含む工程である。リガンドは、必要に
応じ、固定化された状態で使用し得るし、或いは、適当
な化学処理によってその固定化された担体からはずして
固定化されていない状態でも用いることができる。リガ
ンドを重合体担体に共有結合させる方法の発見は、酵素
学、免疫学、そして他の様様な生物学的技術を発展させ
た。
生物学的リガンドの固定化方法のうち最初のものの１つ
に、ヒドロキシル基を含有する重合体を臭化シアン（Ｃ
ＮＢｒ ）などの活性化剤で処理する方法があった。活
性化された重合体は、共有結合によって種々の生物学的
リガンドを直接結合させるのに使用し得たのである。ポ
ラス（Ｐｏｒａｔｈ）らは、ＣＮＢｒ法を含むいくつか
の化学的活性化方法について記している（ポラス他。
に、ヒドロキシル基を含有する重合体を臭化シアン（Ｃ
ＮＢｒ ）などの活性化剤で処理する方法があった。活
性化された重合体は、共有結合によって種々の生物学的
リガンドを直接結合させるのに使用し得たのである。ポ
ラス（Ｐｏｒａｔｈ）らは、ＣＮＢｒ法を含むいくつか
の化学的活性化方法について記している（ポラス他。
イモーピライズド・エンデイムズ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚ
ｅｄＥｎｚｙｍｓｓ ）メン、ズφイン・エンディモロ
ジー（Ｍ＠ｔｈｏｄｓ ｉｎ ｆｆｉｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）モスパッチ（Ｍｏｓｂａｃｈ）編、第４４巻、１９
−４５頁、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄａｒｎｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）、（１９７６） ）。ヒドロキシル基を
含有する重合体の活性方法の初期のものの殆どは、不利
な点が生じ易い為に実際的には広く普及しなかった。と
シわけＣＮＢｒによる活性化工程には次のような欠点が
つきものである。すなわち、 （１） ＣＮＢｒで活性
化されたヒドロキシル基含有重合体と活性化された重合
体と反応するリガンドの７ミノ基との間に生ずる結合は
化学的に不安定であること、（２）活性化された重合体
とＩＪ ｆｆガントの反応は、しばしば電荷を導入し、
そのことが親和吸収における反応産物の利用を妨げるこ
と、（３） ＣＮＢｒは有毒で、偏涙性を有する有害な
化学物質であるので、取扱いの際に特別な配慮を必要と
すること、である。
ｅｄＥｎｚｙｍｓｓ ）メン、ズφイン・エンディモロ
ジー（Ｍ＠ｔｈｏｄｓ ｉｎ ｆｆｉｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）モスパッチ（Ｍｏｓｂａｃｈ）編、第４４巻、１９
−４５頁、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄａｒｎｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）、（１９７６） ）。ヒドロキシル基を
含有する重合体の活性方法の初期のものの殆どは、不利
な点が生じ易い為に実際的には広く普及しなかった。と
シわけＣＮＢｒによる活性化工程には次のような欠点が
つきものである。すなわち、 （１） ＣＮＢｒで活性
化されたヒドロキシル基含有重合体と活性化された重合
体と反応するリガンドの７ミノ基との間に生ずる結合は
化学的に不安定であること、（２）活性化された重合体
とＩＪ ｆｆガントの反応は、しばしば電荷を導入し、
そのことが親和吸収における反応産物の利用を妨げるこ
と、（３） ＣＮＢｒは有毒で、偏涙性を有する有害な
化学物質であるので、取扱いの際に特別な配慮を必要と
すること、である。
リガンドをヒドロキシル含有重合体に結合させる為の方
法として、ＣＮＢ ｒ法以外を捜す努力がされた結果、
三塩化トリアジン、Ｎ−ヒドロキシサクシミド、 １
．１’−力ルがニルジイミダゾール、及びエポキシ化合
物を含む幾つかの反応物を使用する方法が案出された。
法として、ＣＮＢ ｒ法以外を捜す努力がされた結果、
三塩化トリアジン、Ｎ−ヒドロキシサクシミド、 １
．１’−力ルがニルジイミダゾール、及びエポキシ化合
物を含む幾つかの反応物を使用する方法が案出された。
工４キシ化合物の使用については、アクセン（Ａｘ＠ｎ
） 他ＡｃｔａＣｈ＠ｎ、 ５ｃａｎｄ Ｂ２９ ：
４７１−４７４ （１９７５）に記載されている。エビ
クロロヒドリン、或いは、１．４−ビス（２，３−エポ
キシプロＩキシ）ブタンは、アガロースゲルのヒドロキ
シル基と反応して、エポキシドグルを生成するｉこのエ
ポキシドグルは、チオ硫酸ナトリウムと反応し、チオ硫
酸エステルを生じ、更にそれは、ジチオトレイトールに
より還元され、チオール基を含有する修飾されたアガロ
−スケ９ルを生成する。チオールゲルとしばしば呼ばれ
ているとのグルは、２．２′−ジピリジルスルフィドに
よりて、２−ピリジルジスルフィドグルに変換される。
） 他ＡｃｔａＣｈ＠ｎ、 ５ｃａｎｄ Ｂ２９ ：
４７１−４７４ （１９７５）に記載されている。エビ
クロロヒドリン、或いは、１．４−ビス（２，３−エポ
キシプロＩキシ）ブタンは、アガロースゲルのヒドロキ
シル基と反応して、エポキシドグルを生成するｉこのエ
ポキシドグルは、チオ硫酸ナトリウムと反応し、チオ硫
酸エステルを生じ、更にそれは、ジチオトレイトールに
より還元され、チオール基を含有する修飾されたアガロ
−スケ９ルを生成する。チオールゲルとしばしば呼ばれ
ているとのグルは、２．２′−ジピリジルスルフィドに
よりて、２−ピリジルジスルフィドグルに変換される。
そしてこのジスルフィドグルのカラムにウレアーゼの溶
液を通すと、蛋白含有量が高く、高い触媒作用を有する
酵素の結合物が得られる。この方法の一つの欠点は、エ
ポキシ置換重合体が充分安定でない為に保存がしにくい
ということである。
液を通すと、蛋白含有量が高く、高い触媒作用を有する
酵素の結合物が得られる。この方法の一つの欠点は、エ
ポキシ置換重合体が充分安定でない為に保存がしにくい
ということである。
更に最近になると、種々の有機スルホン酸塩が、固定化
親和リガンドを調製する上で広く使用され得ることがわ
かった。例えば、ニルンン（Ｎｉｌｍｓｏｎ）他、Ｅｕ
ｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ・、 ｌ １２ ： ３９
７−４０２（１９８０）には、ｐ−）ルエンスルホニル
クロリドによる幾つかの生物由来分子のアガロースグル
への結合について記されている。使用された生物由来分
子は、核酸及び酵素を含むものである。
親和リガンドを調製する上で広く使用され得ることがわ
かった。例えば、ニルンン（Ｎｉｌｍｓｏｎ）他、Ｅｕ
ｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ・、 ｌ １２ ： ３９
７−４０２（１９８０）には、ｐ−）ルエンスルホニル
クロリドによる幾つかの生物由来分子のアガロースグル
への結合について記されている。使用された生物由来分
子は、核酸及び酵素を含むものである。
その他の有機ハロダン化スルホニルの使用や、他のヒド
ロキシル基を持つ支持体の使用については、ニルソン（
Ｎｉｌａｍｏｎ）他、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ。
ロキシル基を持つ支持体の使用については、ニルソン（
Ｎｉｌａｍｏｎ）他、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ。
ｌ！吐■、Ｒａｓ、 Ｃｏｍｍ、 、 １０２ ： ４
４９−４５７（１９８１）に記載されている。最も活性
の高いハロダン化スルホニルは５２ｅ２ｅ２−ト９フル
オロエタンスルホニルクロリド（トレシルクロリド）で
あると思われる。この文献で言及されている他のヒドロ
キシル基を持つ支持体は、セルロース、ノオールーシリ
カ、グリコ７アーゼーグラス、及びヒドロキシエチルメ
タクリレートである。
４９−４５７（１９８１）に記載されている。最も活性
の高いハロダン化スルホニルは５２ｅ２ｅ２−ト９フル
オロエタンスルホニルクロリド（トレシルクロリド）で
あると思われる。この文献で言及されている他のヒドロ
キシル基を持つ支持体は、セルロース、ノオールーシリ
カ、グリコ７アーゼーグラス、及びヒドロキシエチルメ
タクリレートである。
モスパッチらによる米国特許第４，４１５，６６５号は
、重合体物質の反応性に富むスルホン酸塩誘導体を作成
し、次にこうし°Ｃ活性化した重合体物質を生物学的に
活性な有機物質と直接反応させることによりて、アミノ
、チオール、或いは、芳香ヒドロキシエチル基接、少な
くとも一つのヒドロキシル基を含有する重合体物質に共
有結合させる方法を教示している。ハロダン化スルホニ
ルの使用は、多くの面で利点を有するものであることは
証明されているが、更に活性の高い有機ハロダン化スル
ホニルを得ることはコストの面で難しく、又、トレシル
クロリドは、液体である為、取シ扱いが簡便ではない。
、重合体物質の反応性に富むスルホン酸塩誘導体を作成
し、次にこうし°Ｃ活性化した重合体物質を生物学的に
活性な有機物質と直接反応させることによりて、アミノ
、チオール、或いは、芳香ヒドロキシエチル基接、少な
くとも一つのヒドロキシル基を含有する重合体物質に共
有結合させる方法を教示している。ハロダン化スルホニ
ルの使用は、多くの面で利点を有するものであることは
証明されているが、更に活性の高い有機ハロダン化スル
ホニルを得ることはコストの面で難しく、又、トレシル
クロリドは、液体である為、取シ扱いが簡便ではない。
連続的チオール−ジスルフィド交換反応を用いた酵素の
精製については、カールソン１８０−１８２（１９７６
）に記載されて居シ、そこでは、アガロース−２−ピリ
ジルジスルフィドにウレアーゼが共有結合されている。
精製については、カールソン１８０−１８２（１９７６
）に記載されて居シ、そこでは、アガロース−２−ピリ
ジルジスルフィドにウレアーゼが共有結合されている。
この方法は、共有クロマトグラフによるウレアーゼの精
製には効果的ではあるが、アガロース−２−ピリジルス
ルフィドを取得するのには、不安定なエポキシド誘導体
を利用する工程を組合せなければならない。
製には効果的ではあるが、アガロース−２−ピリジルス
ルフィドを取得するのには、不安定なエポキシド誘導体
を利用する工程を組合せなければならない。
ムカイヤマらは、種々の２−ピリジル硫化物を取得する
為の反応物として、１−メチル−２−アルコキシピリジ
ニウム塩の使用を開示している（ Ｃｈ＠ｍ、 Ｌｅｔ
ｔ、、 １１５９−１１６２（１９７５））。
為の反応物として、１−メチル−２−アルコキシピリジ
ニウム塩の使用を開示している（ Ｃｈ＠ｍ、 Ｌｅｔ
ｔ、、 １１５９−１１６２（１９７５））。
ホ’） ｗ −ラ４！、アルコールを１−メチル−２、
−フルオロピリジニウム塩及びＮ、Ｎ 、−ジメチルチ
オカルバミン酸ナトリウムと反応させた後、還元的クリ
ーブによって、種々のアルコールのソレラに対応するチ
オールアルコールヘノ変換を示すことに成功した。炭水
化物やステロイドを含め、これらの著者によって例示さ
れているアルコールは、低分子量の単量体のアルコール
である（ Ｃ１５５ｍ、 Ｌｅｔｔ、 、 ４３７−４
４０（１９７７））。
−フルオロピリジニウム塩及びＮ、Ｎ 、−ジメチルチ
オカルバミン酸ナトリウムと反応させた後、還元的クリ
ーブによって、種々のアルコールのソレラに対応するチ
オールアルコールヘノ変換を示すことに成功した。炭水
化物やステロイドを含め、これらの著者によって例示さ
れているアルコールは、低分子量の単量体のアルコール
である（ Ｃ１５５ｍ、 Ｌｅｔｔ、 、 ４３７−４
４０（１９７７））。
２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−
スルホネート（ＦＭＰ）との反応によって活性化された
、ヒドロキシル含有重合体を利用する共有クロマトグラ
フのマトリ、クスを作製する為の便利な方法が、今や得
られた。活性化されたヒドロキシル含有重合体は、アミ
ノ及びスルフヒドリル基を含有する様々なリガンドとの
共有結合を形成するのに用いられ得る。しかしながら、
共有結合されたリガンドは、重合体マトリ、クスから除
去するのが難しい。したがって、リガンドを望ましい時
にいつでも除去可能な様に重合体へ結合させることが望
ましい。
スルホネート（ＦＭＰ）との反応によって活性化された
、ヒドロキシル含有重合体を利用する共有クロマトグラ
フのマトリ、クスを作製する為の便利な方法が、今や得
られた。活性化されたヒドロキシル含有重合体は、アミ
ノ及びスルフヒドリル基を含有する様々なリガンドとの
共有結合を形成するのに用いられ得る。しかしながら、
共有結合されたリガンドは、重合体マトリ、クスから除
去するのが難しい。したがって、リガンドを望ましい時
にいつでも除去可能な様に重合体へ結合させることが望
ましい。
この方法は、活性化された重合体のチオールダルへの変
換、すなわち、スルフヒドリル基含有重合体への変換を
含むものである。このチオールダルを２，２′−ジピリ
ジルノスルフイドと反応させ、重合体の２−ピリジルジ
スルフィドＷＩＦ４体を生成し得る。スルフヒドリル基
含有リガンドのチオール−ジスルフィド交換によって、
すｆンドは、ジスルフィド結合により重合体に結合する
。ジチオトレイトールのようなチオールでジスルフィド
結合を還元することにより、リガンドは、いつでも必要
な時に除去されるようになる。
換、すなわち、スルフヒドリル基含有重合体への変換を
含むものである。このチオールダルを２，２′−ジピリ
ジルノスルフイドと反応させ、重合体の２−ピリジルジ
スルフィドＷＩＦ４体を生成し得る。スルフヒドリル基
含有リガンドのチオール−ジスルフィド交換によって、
すｆンドは、ジスルフィド結合により重合体に結合する
。ジチオトレイトールのようなチオールでジスルフィド
結合を還元することにより、リガンドは、いつでも必要
な時に除去されるようになる。
チオールゲルを得る方法として、二つの異なったルート
が可能である。その一つは、ジメチルジチオカルバミン
酸ナトリウムを用いて、活性化重合体をその対応するジ
メチルジチオカルバミル誘導体に変換し、これを還元的
クリーブ（ｃｌｓａｖｅ ）によって任意のスルフヒド
リル置換重合体（ＤＳｒルと以下呼ぶ）に変換するとい
うルートである。
が可能である。その一つは、ジメチルジチオカルバミン
酸ナトリウムを用いて、活性化重合体をその対応するジ
メチルジチオカルバミル誘導体に変換し、これを還元的
クリーブ（ｃｌｓａｖｅ ）によって任意のスルフヒド
リル置換重合体（ＤＳｒルと以下呼ぶ）に変換するとい
うルートである。
チオールゲルを得るもう一方のルートは、ＦＭＰ活性化
重合体をジチオトレイトールで処理して、以下ＤＴＴダ
ルとして言及するところのチオールゲル、ジチオトレイ
チルダルを生成する過程を含むものであシ、フリーなス
ルフヒドリル基は、重合体へのチオエーテル結合から４
個の炭素原子で隔たっている。
重合体をジチオトレイトールで処理して、以下ＤＴＴダ
ルとして言及するところのチオールゲル、ジチオトレイ
チルダルを生成する過程を含むものであシ、フリーなス
ルフヒドリル基は、重合体へのチオエーテル結合から４
個の炭素原子で隔たっている。
共有クロマトグラフのマトリ、クスを特にどういった場
合に応用するかによって、ＤＳ −＃か又はＤＴＴダル
が、理想的に特定のクロマトグラフの各手順に適したも
のに使い分けられ得る。
合に応用するかによって、ＤＳ −＃か又はＤＴＴダル
が、理想的に特定のクロマトグラフの各手順に適したも
のに使い分けられ得る。
例えば、ＤＴＴ グルは、すｆンドが大きな原子団を含
んで居シ、介在する炭素の４原子鎖によって重合体表面
とジスルフィド結合との間にスペースが存在しなければ
、重合体に充分近づいてノスルフイド結合を攻撃するこ
とが容易でない場合に特に適用され得る。
んで居シ、介在する炭素の４原子鎖によって重合体表面
とジスルフィド結合との間にスペースが存在しなければ
、重合体に充分近づいてノスルフイド結合を攻撃するこ
とが容易でない場合に特に適用され得る。
重合体担体は、水溶性でも水不溶性の重合体物質でもよ
く、本発明の方法を遂行する上では担体の選択は決定的
なものではない。重合体としての性質を有し、炭素原子
に結合している、活性化や結合を可能にする少なくとも
一つのヒドロキシル基を含有するものであれば、原則と
してどのタイプの担体でも使用し得る。担体は、個々の
状況に於ける必要に応じ、先ず第一に、結合させるリガ
ンドのタイプ、そして結合産物の用途に応じて選択され
る。担体は、ヒドロキシル基を含有した、天然、半合成
、或いは合成によるものであっても良い。重要な担体材
料は。
く、本発明の方法を遂行する上では担体の選択は決定的
なものではない。重合体としての性質を有し、炭素原子
に結合している、活性化や結合を可能にする少なくとも
一つのヒドロキシル基を含有するものであれば、原則と
してどのタイプの担体でも使用し得る。担体は、個々の
状況に於ける必要に応じ、先ず第一に、結合させるリガ
ンドのタイプ、そして結合産物の用途に応じて選択され
る。担体は、ヒドロキシル基を含有した、天然、半合成
、或いは合成によるものであっても良い。重要な担体材
料は。
多糖類及び多糖類を含有する材料であシ１例えば、セル
ロース、アガロース、デキストラン及びその架橋結合物
である。合成担体としては１、／９エチレンクリコール
、＄リビエルアルコール、／リヒドロキシエチルメチル
アクリレート等が例示される。当然のことながら、通常
ヒドロキシル基を含有しない担体を使用することも可能
であるが、その場合は、適切な処理をすることによって
そうした基を付与することができる。その一つの例がシ
リカ粒子であシ、その表面に炭素原子に結合している少
なくとも一つのヒドロキシル基を含有する原子団が結合
されている。
ロース、アガロース、デキストラン及びその架橋結合物
である。合成担体としては１、／９エチレンクリコール
、＄リビエルアルコール、／リヒドロキシエチルメチル
アクリレート等が例示される。当然のことながら、通常
ヒドロキシル基を含有しない担体を使用することも可能
であるが、その場合は、適切な処理をすることによって
そうした基を付与することができる。その一つの例がシ
リカ粒子であシ、その表面に炭素原子に結合している少
なくとも一つのヒドロキシル基を含有する原子団が結合
されている。
ヒドロキシル含有重合体担体の活性化は、アセトニトリ
ル、アセトン、或いは、テトラヒドロフランの様な極性
の乾燥有機溶媒中にお埴て、トリエチルアミンやトリエ
チルアミンなどの第三アミンがわずかに過剰に存在する
状態で行なわれる。ＦＭＰは、通常約１〜１５分の速さ
で、周囲の温度（約２２−３５℃）及び圧力で１種種の
重合体材料と反応し、２−アルコキシ−１−メチルぎり
ゾ斤つム塩を生成し、それが、アフィニティリガンドと
して適切な様々な求核物質のアミノ或いはスルフヒドリ
ル基と直ぐに反応スル。２−クロロ−１−メチルピリジ
ニウム塩の様な２−へロー１−メチルピリジニウム塩も
使用され得るが、その大きな反応性から、２−フルオロ
゛−１−メチルピリジニウム塩のほうが、より望ましい
・ ＦＭＰのような活性化剤の反応しなかったものは、希塩
酸（例えば２ ｍＭ ＨＣＬ ）の様な希酸で容易に重
合体担体よシ洗い去ることができ、それによって、活性
化ヒドロキシル基に加水分解を起こさせることなく活性
化重合体を精製し、安定化させる。
ル、アセトン、或いは、テトラヒドロフランの様な極性
の乾燥有機溶媒中にお埴て、トリエチルアミンやトリエ
チルアミンなどの第三アミンがわずかに過剰に存在する
状態で行なわれる。ＦＭＰは、通常約１〜１５分の速さ
で、周囲の温度（約２２−３５℃）及び圧力で１種種の
重合体材料と反応し、２−アルコキシ−１−メチルぎり
ゾ斤つム塩を生成し、それが、アフィニティリガンドと
して適切な様々な求核物質のアミノ或いはスルフヒドリ
ル基と直ぐに反応スル。２−クロロ−１−メチルピリジ
ニウム塩の様な２−へロー１−メチルピリジニウム塩も
使用され得るが、その大きな反応性から、２−フルオロ
゛−１−メチルピリジニウム塩のほうが、より望ましい
・ ＦＭＰのような活性化剤の反応しなかったものは、希塩
酸（例えば２ ｍＭ ＨＣＬ ）の様な希酸で容易に重
合体担体よシ洗い去ることができ、それによって、活性
化ヒドロキシル基に加水分解を起こさせることなく活性
化重合体を精製し、安定化させる。
ＦＭＰ活性化重合体担体は、２□ＨＣｔに４℃で保存す
ると少なくとも４ケ月は安定である。活性化した重合体
担体は、薄い無機酸、例えば、２ ｍＭ ’Ｊン酸中で
も、或いは、必要ならば乾燥させた形態でも保存が可能
である。通常、１ｄのゲルに対し４〜７マイクロモルと
いう活性密度が得られる。
ると少なくとも４ケ月は安定である。活性化した重合体
担体は、薄い無機酸、例えば、２ ｍＭ ’Ｊン酸中で
も、或いは、必要ならば乾燥させた形態でも保存が可能
である。通常、１ｄのゲルに対し４〜７マイクロモルと
いう活性密度が得られる。
本発明の結合（ｅｏａｐｌ ｉｎｇ）方法は、上記した
アミノ或いはスルフヒドリル基を含有する有機リガンド
に全般的に応用され得る。例えば、第一アミノ、第二ア
ミノ或いは、スルフヒドリル基は活性化されたヒドロキ
シル含有重合体への結合に用いられ得る。同様にそのＮ
ａ塩の様なスルフヒドリル基を含有する化合物の塩もこ
の目的の為に有用である。一般に結合の為に選択される
生成物は、結合反応を円滑に行える様に、良好な求核物
質であるべきである。重合体から、１−メチル−２−ピ
リドキシ基を置換し得る基ならいかなるものも充分リガ
ンドとして使用され得る。そこで、結果的にリガンドが
、結合に使用され得る官能基を有するのであれば、りが
ンドは、あらゆる脂肪族、芳香族、複素環、ヘテロ芳香
族ラジカル又は、それらの組合わせより成るあらゆるラ
ジカルを含んで良い。特に興味深いものは、生物学的に
活性なリガンドであシ、例えば、酵素等の蛋白質、抗体
及び抗原。
アミノ或いはスルフヒドリル基を含有する有機リガンド
に全般的に応用され得る。例えば、第一アミノ、第二ア
ミノ或いは、スルフヒドリル基は活性化されたヒドロキ
シル含有重合体への結合に用いられ得る。同様にそのＮ
ａ塩の様なスルフヒドリル基を含有する化合物の塩もこ
の目的の為に有用である。一般に結合の為に選択される
生成物は、結合反応を円滑に行える様に、良好な求核物
質であるべきである。重合体から、１−メチル−２−ピ
リドキシ基を置換し得る基ならいかなるものも充分リガ
ンドとして使用され得る。そこで、結果的にリガンドが
、結合に使用され得る官能基を有するのであれば、りが
ンドは、あらゆる脂肪族、芳香族、複素環、ヘテロ芳香
族ラジカル又は、それらの組合わせより成るあらゆるラ
ジカルを含んで良い。特に興味深いものは、生物学的に
活性なリガンドであシ、例えば、酵素等の蛋白質、抗体
及び抗原。
アミノ酸、チオール化合物、コツアクタ、ヌクレオチド
、プリヌクレオチド、ノーブテン及びその他の多くの生
物学的に活性なリガンドであシ、特に、例えば、アフィ
ニティークロマトグラフィーに使用され得る、他の物質
に生物学的に特異的な親和性を有するものが挙げられる
。
、プリヌクレオチド、ノーブテン及びその他の多くの生
物学的に活性なリガンドであシ、特に、例えば、アフィ
ニティークロマトグラフィーに使用され得る、他の物質
に生物学的に特異的な親和性を有するものが挙げられる
。
反応の図式は、第１図に示されている。図中、■−ＣＨ
２−ＯＨというシンゲルは、少なぐとも一つの−ＣＨ２
−ＯＨ基を有する重合体担体を表し、ＴｓＯ−ハ、トル
エン−４−スルホ＊−）（、をンｔ−ｉＬ、ＴＥＡは、
トリエチルアミンを、Ｌ−Ｎｌ（２は、アミノ基含有リ
ガンドを、Ｌ−８Ｈは、スルフヒドリル基含有リガンド
を、夫々示す。
２−ＯＨというシンゲルは、少なぐとも一つの−ＣＨ２
−ＯＨ基を有する重合体担体を表し、ＴｓＯ−ハ、トル
エン−４−スルホ＊−）（、をンｔ−ｉＬ、ＴＥＡは、
トリエチルアミンを、Ｌ−Ｎｌ（２は、アミノ基含有リ
ガンドを、Ｌ−８Ｈは、スルフヒドリル基含有リガンド
を、夫々示す。
結合は、様々な温度及び−に於いて行ない得、極性有機
溶媒中だけでなく、水性の反応媒体中でも可能である。
溶媒中だけでなく、水性の反応媒体中でも可能である。
反応条件は、活性化の段階でも結合の段階でも決定的な
ものではなく、先ず。
ものではなく、先ず。
反応体の感受性及び実際上の便宜によって選択される。
穏やかな反応条件が望ましい。例えば、常温及び常圧下
で行うのが適切で、水性の反応媒体の場合、声は中性付
近、例えば、ｐＨ８〜９である。担体のヒドロキシル基
への結合の度合は、化学量論上の調節で実質的にすべて
の使用し得るヒドロキシル基を使用する必要がちるか、
そのどの程度の部分を必要とするかによって様様である
。７０〜８０チの結合効率が１通常実現される。
で行うのが適切で、水性の反応媒体の場合、声は中性付
近、例えば、ｐＨ８〜９である。担体のヒドロキシル基
への結合の度合は、化学量論上の調節で実質的にすべて
の使用し得るヒドロキシル基を使用する必要がちるか、
そのどの程度の部分を必要とするかによって様様である
。７０〜８０チの結合効率が１通常実現される。
結合反応の後に残った未反応の活性化原子団は、結合の
終った重合体の利用を妨げる可能性があるので、結合の
終った重合体をｐＨ９，０，２Ｍ ） リス−ＨＣ１に
室温で、２時間、懸濁して除去することができる。エタ
ノールアミンやメルカプトエタノールの様な他の求核物
質もまた、この目的に使用され得る。
終った重合体の利用を妨げる可能性があるので、結合の
終った重合体をｐＨ９，０，２Ｍ ） リス−ＨＣ１に
室温で、２時間、懸濁して除去することができる。エタ
ノールアミンやメルカプトエタノールの様な他の求核物
質もまた、この目的に使用され得る。
チオールダルの使用を含む本発明の望ましい結合方法に
ついては、第４図を参照して詳細に述べられる。第４図
中には、全体の反応に於ける様々なステ、プが示されて
いる。
ついては、第４図を参照して詳細に述べられる。第４図
中には、全体の反応に於ける様々なステ、プが示されて
いる。
示されている過程の最初の工程は、少なくとも一つの反
応性ヒドロキシル基を有するヒドロキシル含有重合体（
式１）の２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエ
ン−４−スルホネート（式２）との反応でオシ、既に上
に記した。
応性ヒドロキシル基を有するヒドロキシル含有重合体（
式１）の２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエ
ン−４−スルホネート（式２）との反応でオシ、既に上
に記した。
結果として得られる２−アルコキシ−１−メチルピリジ
ニウム塩（式３）は、時おり活性化重合体、或いは、活
性化ダルとして言及される。
ニウム塩（式３）は、時おり活性化重合体、或いは、活
性化ダルとして言及される。
１−メチル２−ピリドキシ基は、すガントによる求核的
置換の際に直ぐに１−メチル−２−ぎりトン（式４）に
変換される優良な離れ易い原子団である為、活性化重合
体は直ぐに求核物質によって攻撃される。
置換の際に直ぐに１−メチル−２−ぎりトン（式４）に
変換される優良な離れ易い原子団である為、活性化重合
体は直ぐに求核物質によって攻撃される。
チオールダルの製造に導く一連の反応では、スルフヒド
リル基が直接重合体の炭素原子に結合しているのである
が、求核的置換によって活性化重合体と反応し、重合体
のジメチルジチオカルバミル誘導体（式６）を生成する
のにジメチルジチオカルバミン酸ナトリウム（式５）が
用いられる。活性化ダルのジメチルジチオカルバミン酸
との反応は、Ｎ、Ｎ−ツメチルフォルムアミド（ＤＭＦ
）等の有機溶媒中で起きる。使用し得る他の溶媒は、ア
セトニトリル、アセトン、及びテトラヒドロフランを含
むものである。その反応は１周囲の温度及び圧力下で１
２〜２０時間行なわれる。
リル基が直接重合体の炭素原子に結合しているのである
が、求核的置換によって活性化重合体と反応し、重合体
のジメチルジチオカルバミル誘導体（式６）を生成する
のにジメチルジチオカルバミン酸ナトリウム（式５）が
用いられる。活性化ダルのジメチルジチオカルバミン酸
との反応は、Ｎ、Ｎ−ツメチルフォルムアミド（ＤＭＦ
）等の有機溶媒中で起きる。使用し得る他の溶媒は、ア
セトニトリル、アセトン、及びテトラヒドロフランを含
むものである。その反応は１周囲の温度及び圧力下で１
２〜２０時間行なわれる。
ダルのジメチルジチオカルバミル誘導体の還元の結果、
ダルの炭素原子に直接結合しているスルフヒドリル基を
有するチオールダル（式７）を生成する。還元は、水素
化ホウ素ナトリウム。
ダルの炭素原子に直接結合しているスルフヒドリル基を
有するチオールダル（式７）を生成する。還元は、水素
化ホウ素ナトリウム。
リチウムアルミニウムヒドリド或いは、ジチオナイトナ
トリウム等の標準の還元剤を用いて、容易に為され得る
。反応は、周囲の温度及び圧力（常温、常圧）下、６か
ら１２時間の間に行なわれる。結果として得られるＤＳ
−４’ルは、乾燥グルｌグラム当り５〜１５マイクロモ
ルのスルフヒドリル基含量を有する。
トリウム等の標準の還元剤を用いて、容易に為され得る
。反応は、周囲の温度及び圧力（常温、常圧）下、６か
ら１２時間の間に行なわれる。結果として得られるＤＳ
−４’ルは、乾燥グルｌグラム当り５〜１５マイクロモ
ルのスルフヒドリル基含量を有する。
チオールダルを生成するもう一つのルートは、活性化ダ
ル（式３）のジチオトレイトール（式８）との反応を含
み、これによｊ５ ＤＴＴ −ダル（式９）を生成する
。チオールダルは、重合体へのチオエーテル結合から４
炭素原子鎖によって隔てられているスルフヒドリル基を
有する。
ル（式３）のジチオトレイトール（式８）との反応を含
み、これによｊ５ ＤＴＴ −ダル（式９）を生成する
。チオールダルは、重合体へのチオエーテル結合から４
炭素原子鎖によって隔てられているスルフヒドリル基を
有する。
活性化ダルとジチオトレイトールとは、重炭酸ナトリウ
ムの様な塩基或いは、トリエチルアミンやトリブチルア
ミンなどの第三アミンの存在下で混合することにより容
易に反応する。この反応は、周囲の温度及び圧力で、４
〜８時間で完了する。
ムの様な塩基或いは、トリエチルアミンやトリブチルア
ミンなどの第三アミンの存在下で混合することにより容
易に反応する。この反応は、周囲の温度及び圧力で、４
〜８時間で完了する。
結果として得られるＤＴＴ −ダルは、・ｏｓ−ダルと
同様、共有クロマトグラフのマトリックスとして使用さ
れ得る。しかしながら、この使用に進む前に、未反応の
１−メチルピリドキシ活性原子団をＤＳ−ダル或いはＤ
ＴＴ −ダルから除去し、共有クロマトグラフの主体で
あるすｆ／ドとの望ましい反応の進行が得られる様にコ
ントロールすることが重要である。未反応の活性原子団
の除去は、トリス−ＨＣｔｌ例えば、０．２Ｍ）リス−
ＨＣｔ（ＰＨ９）、エタノールアミン、メルカプトエタ
ノール等の反応性リガンド、或いは、チオールダルのス
ルフヒドリル基とは反応しない他の適当な反応性リガン
ドを用いることにより容易に達成される。
同様、共有クロマトグラフのマトリックスとして使用さ
れ得る。しかしながら、この使用に進む前に、未反応の
１−メチルピリドキシ活性原子団をＤＳ−ダル或いはＤ
ＴＴ −ダルから除去し、共有クロマトグラフの主体で
あるすｆ／ドとの望ましい反応の進行が得られる様にコ
ントロールすることが重要である。未反応の活性原子団
の除去は、トリス−ＨＣｔｌ例えば、０．２Ｍ）リス−
ＨＣｔ（ＰＨ９）、エタノールアミン、メルカプトエタ
ノール等の反応性リガンド、或いは、チオールダルのス
ルフヒドリル基とは反応しない他の適当な反応性リガン
ドを用いることにより容易に達成される。
チオールダルは、所望のリガンドをダルに結合する役割
を果たすチオール−ジスルフィド交換反応を行う為に活
性化される。活性化は、チオールダルを２．２′ピリノ
ルジスルフイド（式１０）と反応させることにより最も
容易に達成される。反応は、周囲の温度及び圧力の条件
で進行し、１〜３時間で完了する。
を果たすチオール−ジスルフィド交換反応を行う為に活
性化される。活性化は、チオールダルを２．２′ピリノ
ルジスルフイド（式１０）と反応させることにより最も
容易に達成される。反応は、周囲の温度及び圧力の条件
で進行し、１〜３時間で完了する。
活性化されたｏｓ−ｖ”ル（第１１式）又は、活性化さ
れたＤＴＴ−ダル（第１２式）は、任意のリガンド（第
１図では、フリーなスルフヒドリル基を有する酵素とし
て示されているが）と反応し、ダルと酵素との間にジス
ルフィド結合を形成する。ＤＳ−ダルの場合は、ジスル
フィド結合が酵素をダルの炭素原子に直接結合させてい
る（第１４式）が、一方、ＤＴＴ−ダルの場合、酵素は
、イオウ原子によりてダルの炭素原子に結合している４
炭素原子鎖に、ジスルフィド結合している（式１５）。
れたＤＴＴ−ダル（第１２式）は、任意のリガンド（第
１図では、フリーなスルフヒドリル基を有する酵素とし
て示されているが）と反応し、ダルと酵素との間にジス
ルフィド結合を形成する。ＤＳ−ダルの場合は、ジスル
フィド結合が酵素をダルの炭素原子に直接結合させてい
る（第１４式）が、一方、ＤＴＴ−ダルの場合、酵素は
、イオウ原子によりてダルの炭素原子に結合している４
炭素原子鎖に、ジスルフィド結合している（式１５）。
いずれの場合でも、２−チオピリドン（式１６）が、活
性化されたチオールダルから置換されている。第１４及
び１５式は、固定化された酵素を示す。上記の方法に従
って、他の多くのリガンドが、同様に固定化され得るこ
とは、評価されるべきである。リガンドの活性化チオー
ルダルとの反応は、周囲の温度及び圧力の条件下、適当
に精製され緩衝液で調整されたリガンドを用いて、容易
に行なわれる。反応は２−６時間で完了する。
性化されたチオールダルから置換されている。第１４及
び１５式は、固定化された酵素を示す。上記の方法に従
って、他の多くのリガンドが、同様に固定化され得るこ
とは、評価されるべきである。リガンドの活性化チオー
ルダルとの反応は、周囲の温度及び圧力の条件下、適当
に精製され緩衝液で調整されたリガンドを用いて、容易
に行なわれる。反応は２−６時間で完了する。
固定化された酵素は、システィン、ジチオトレイトール
、或いはメルカプトエタノール等の還元剤（式１７）で
処理することにょシ、酵素（式１３）を離脱する。周囲
の温度及び圧力の条件によって酵素は容易に離脱する。
、或いはメルカプトエタノール等の還元剤（式１７）で
処理することにょシ、酵素（式１３）を離脱する。周囲
の温度及び圧力の条件によって酵素は容易に離脱する。
セファローズ（Ｓ＠ｐｈａｒｏｓｅ） ＣＬ−４Ｂを、
ダルの容積の２０倍の蒸留水、容積比２５ニア５゜５０
：５０，７５：２５のアセトンと水の混合物、及び１０
０％アセトン、最後に、ダルの容積の１０倍のドライア
セトンで、順に継続して洗浄した。５０．９量の洗浄さ
れたデルを、１ｄのトリエチルアミンの混合したドライ
アセトニトリル５０１１１ｔｌＣ＠濁し、室温で、激し
く攪拌した。ダル懸濁液に、４０．ｄのドライアセトニ
トリル及び１．５４のドライトリエチルアミンに３ｇの
ＦＭＰを溶解させた溶液を５ｄに分けて加えた。１０分
後、ダルを、ダルの１０倍容積のアセトンと２ ｍＭ
Ｆａｃｔとの混合物を、容積比で。
ダルの容積の２０倍の蒸留水、容積比２５ニア５゜５０
：５０，７５：２５のアセトンと水の混合物、及び１０
０％アセトン、最後に、ダルの容積の１０倍のドライア
セトンで、順に継続して洗浄した。５０．９量の洗浄さ
れたデルを、１ｄのトリエチルアミンの混合したドライ
アセトニトリル５０１１１ｔｌＣ＠濁し、室温で、激し
く攪拌した。ダル懸濁液に、４０．ｄのドライアセトニ
トリル及び１．５４のドライトリエチルアミンに３ｇの
ＦＭＰを溶解させた溶液を５ｄに分けて加えた。１０分
後、ダルを、ダルの１０倍容積のアセトンと２ ｍＭ
Ｆａｃｔとの混合物を、容積比で。
７５：２５，５０：５０，２５ニア５．そして希釈しな
い２ ｍＷ ＨＣＬを用いて順次洗浄した。
い２ ｍＷ ＨＣＬを用いて順次洗浄した。
実施例２
１００Ｉｎ９量のＮ、ε−２，４−ジニトロフェニル−
Ｌ−リシンをＯ−２Ｍ ＮａＨＣＯｓ ３０ ’に溶解
した。
Ｌ−リシンをＯ−２Ｍ ＮａＨＣＯｓ ３０ ’に溶解
した。
この溶液に実施例１の方法に従って得たＦＭＰ −活性
化ダル５ｇを加えた。その結果得られた懸濁液を室温で
１５時間、振盪した。次にダルを懸濁液から除去し、５
００−〇〇 −２Ｍ ＮａＨＣＯｓで洗浄し、１００Ｉ
ＩＬ（の０．１Ｍ）リス−ＨＣ２％−８に再び懸濁し、
室温で２時間、振盪した。ダルを５００ａ／のｌ Ｍ
ＮａＣ２及び０．１５ Ｍ ＮａＣｔを含むＰＨ７，５
の０．１ Ｍ ！ｊン酸ナナトリウム緩衝液 ＰＢＳ
）で洗浄した。
化ダル５ｇを加えた。その結果得られた懸濁液を室温で
１５時間、振盪した。次にダルを懸濁液から除去し、５
００−〇〇 −２Ｍ ＮａＨＣＯｓで洗浄し、１００Ｉ
ＩＬ（の０．１Ｍ）リス−ＨＣ２％−８に再び懸濁し、
室温で２時間、振盪した。ダルを５００ａ／のｌ Ｍ
ＮａＣ２及び０．１５ Ｍ ＮａＣｔを含むＰＨ７，５
の０．１ Ｍ ！ｊン酸ナナトリウム緩衝液 ＰＢＳ
）で洗浄した。
実施例３
トブラマイシンの活性化ダルへの結合 。
実施例１によりて得た、２ｍＭリン酸溶液中で保存した
ＦＭＰ−活性化ゲルをリン酸から除去し、その２０１７
量を０．２ミリモルのトブラマイシンを含ｂ １０ ａ
ｌｌ ＯＯ−５Ｍ ＮａＨＣＯ３Ｋ加えた。
ＦＭＰ−活性化ゲルをリン酸から除去し、その２０１７
量を０．２ミリモルのトブラマイシンを含ｂ １０ ａ
ｌｌ ＯＯ−５Ｍ ＮａＨＣＯ３Ｋ加えた。
ダル懸濁液を室温で２４時間、ゆるやかに振盪した後、
５００ｄのリン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
５００ｄのリン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
洗浄されたダルを１５分間、０．ＩＭＴｒｉｓ中に懸濁
し、未反応の活性化ヒドロキシル基を不活性化した。次
にダルをＰＢＳ ５００ｊｌｊ。
し、未反応の活性化ヒドロキシル基を不活性化した。次
にダルをＰＢＳ ５００ｊｌｊ。
ｌ Ｍ ＮａＣＬ含有ＰＢＳ１０００ｄ、そして最後に
ＰＢＳ５００Ｉｔｌで洗浄した。
ＰＢＳ５００Ｉｔｌで洗浄した。
重合体担体のヒドロキシル基の活性の度合を測定する為
に１−のダルにつき、マイクロ毫ル単位で、活性化の密
度を測定した。１−メチル−２−ピリドンは、求核物質
との結合の際に活性化ダルから離脱するので、結合反応
が行なわれている溶液の２９７ ｎｍに於ける吸収（吸
光度）によって活性化の密度を量的に測定することが可
能である。この波長では、０．２ Ｍ Ｔｒｆ「・ＨＣ
４ＰＨ９中で、１−メチル−２−ピリドンは、５９００
のモル吸光を有する。活性の密度は、１−の活性化ダル
を２Ｍの０．２ Ｍ Ｔｒｉｍ ＨＣＬ 、 ｐＨ９に
懸濁し、１０時間室温で、ゆるやかに振盪することによ
って測定され得る。結果として得られるグル懸濁液の遠
心の際に２９７ｎｍでの上清の吸収を測定し、既知濃度
の１−メチル−２−ピリドンの溶液の吸収と比較する。
に１−のダルにつき、マイクロ毫ル単位で、活性化の密
度を測定した。１−メチル−２−ピリドンは、求核物質
との結合の際に活性化ダルから離脱するので、結合反応
が行なわれている溶液の２９７ ｎｍに於ける吸収（吸
光度）によって活性化の密度を量的に測定することが可
能である。この波長では、０．２ Ｍ Ｔｒｆ「・ＨＣ
４ＰＨ９中で、１−メチル−２−ピリドンは、５９００
のモル吸光を有する。活性の密度は、１−の活性化ダル
を２Ｍの０．２ Ｍ Ｔｒｉｍ ＨＣＬ 、 ｐＨ９に
懸濁し、１０時間室温で、ゆるやかに振盪することによ
って測定され得る。結果として得られるグル懸濁液の遠
心の際に２９７ｎｍでの上清の吸収を測定し、既知濃度
の１−メチル−２−ピリドンの溶液の吸収と比較する。
ここに記述した活性化方法を用い、活性密度４０−７０
ｍ１ｃｒｏ〜ｍｏｌｅｓ／１１１７のセファローズＣ
Ｌ−４８の活性化ダルが得られた。
ｍ１ｃｒｏ〜ｍｏｌｅｓ／１１１７のセファローズＣ
Ｌ−４８の活性化ダルが得られた。
本発明によって得られる結合産物は、親和精製、共有ク
ロマトグラフィー、及び共有結合による生体分子の可逆
的及び不可逆的固定化など、生物学的に活性な材料等の
リガンドを重合体担体に付着させて固定化することが望
まれ場合に、様々な応用が可能である。以下の実施例で
、アフィニティークロマトグラフィーに於ける結合産物
の使用について例示する。
ロマトグラフィー、及び共有結合による生体分子の可逆
的及び不可逆的固定化など、生物学的に活性な材料等の
リガンドを重合体担体に付着させて固定化することが望
まれ場合に、様々な応用が可能である。以下の実施例で
、アフィニティークロマトグラフィーに於ける結合産物
の使用について例示する。
実施例４
精製
２ｄ量のウサギ抗−ＤＮＰ血清を遠心に対し、小片を除
去した。その上清を実施例２に従りて作製した０、５Ｘ
２０ｃＩＮカラムのＮ、ｅ −２，４−−／ニトロフェ
ニルーＬ ＋ １７シン結合セファローズＣＬ−４Ｂに
流した。抗血清を流した後、カラムを流出物の２８０ｎ
ｍの吸光度が０．０２未満になる迄ｐＢｓで充分に洗浄
した。そして、容積で１０チのテトラヒドロフランを含
む０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２，５）を流出液
として用いた。抗体は、グリシン−ＨＣｔ緩衝液を流し
た後３番目の５Ｍ画分に現れた。この実験の結果を第２
図に示す。
去した。その上清を実施例２に従りて作製した０、５Ｘ
２０ｃＩＮカラムのＮ、ｅ −２，４−−／ニトロフェ
ニルーＬ ＋ １７シン結合セファローズＣＬ−４Ｂに
流した。抗血清を流した後、カラムを流出物の２８０ｎ
ｍの吸光度が０．０２未満になる迄ｐＢｓで充分に洗浄
した。そして、容積で１０チのテトラヒドロフランを含
む０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２，５）を流出液
として用いた。抗体は、グリシン−ＨＣｔ緩衝液を流し
た後３番目の５Ｍ画分に現れた。この実験の結果を第２
図に示す。
実施例５
１ｄ量のウサギ抗トブラマイシン血清をＰＢＳで１０倍
に希釈した。希釈した抗血清を２００゜ｒｐｍで３０分
間、遠心に付し、小片を除いた。
に希釈した。希釈した抗血清を２００゜ｒｐｍで３０分
間、遠心に付し、小片を除いた。
上清全体を実施例３に記した様に調製したトブラマイシ
ン結合５ｅｐｈａｒｏｓ＠ＣＬ−４Ｂの０．５ Ｘ ２
０備カラムに流した。流出物の２８０ｔｒｍでの吸光度
が、０．０２未満になる迄、カラムをＰＢＳで洗浄した
。抗体を１０％テトラヒドロ゛７ラン含有０．１Ｍグリ
シン−ＨＣｌ 、 ｐＨ２，５と共に７Ｍ画分に流出さ
せた。結果を第３図に示す。
ン結合５ｅｐｈａｒｏｓ＠ＣＬ−４Ｂの０．５ Ｘ ２
０備カラムに流した。流出物の２８０ｔｒｍでの吸光度
が、０．０２未満になる迄、カラムをＰＢＳで洗浄した
。抗体を１０％テトラヒドロ゛７ラン含有０．１Ｍグリ
シン−ＨＣｌ 、 ｐＨ２，５と共に７Ｍ画分に流出さ
せた。結果を第３図に示す。
上記実施例４及び５に示される通シ、本発明の方法に従
って得られるリガンド結合重合体担体は、リガンド結合
重合体との間に親和結合（ａｆｆｌｎｉｔｙ ｂｏｎｄ
）を形成し得る様々な材料を精製する為の親和吸収材
として有用である。例えば、リガンド結合重合体は、抗
体の精製に使用し得、その場合、アフィニティーマトリ
、クスに吸収された抗体をマトリ、クスから、リガンド
を漏゛らすことなく流出させることが可能である。リガ
ンド結合マトリ、クスはまた一保存中に於けるその安定
性でも特徴づけられる。例えば、Ｎ、ｔ −２，４−ジ
ニトロフェニル−も−リシン結合セファローズＣＬ−４
Ｂは、リン酸１１１Ｆ液食塩水中、４Ｃで、すｆンド結
合マトリ、クスからのリガンドの漏出なくして、保存さ
れる。
って得られるリガンド結合重合体担体は、リガンド結合
重合体との間に親和結合（ａｆｆｌｎｉｔｙ ｂｏｎｄ
）を形成し得る様々な材料を精製する為の親和吸収材
として有用である。例えば、リガンド結合重合体は、抗
体の精製に使用し得、その場合、アフィニティーマトリ
、クスに吸収された抗体をマトリ、クスから、リガンド
を漏゛らすことなく流出させることが可能である。リガ
ンド結合マトリ、クスはまた一保存中に於けるその安定
性でも特徴づけられる。例えば、Ｎ、ｔ −２，４−ジ
ニトロフェニル−も−リシン結合セファローズＣＬ−４
Ｂは、リン酸１１１Ｆ液食塩水中、４Ｃで、すｆンド結
合マトリ、クスからのリガンドの漏出なくして、保存さ
れる。
上述した様に、本発明の結合方法の重要な利点は、結合
した物質、すなわち、リガンドが重合体担体の炭素原子
に直接共有結合し、加水分解による分裂を不可能にする
点である。更には、先行技術の結合方法の幾つかに於い
てそうである様に、結合反応の間に付加的な電荷が導入
されることはない。担体材料の交差結合は、従来可能な
結合方法に於いてよくある。ｔた、望ましくない副作用
であるが、本発明の結合方法によれば、それを避けるこ
とができる。
した物質、すなわち、リガンドが重合体担体の炭素原子
に直接共有結合し、加水分解による分裂を不可能にする
点である。更には、先行技術の結合方法の幾つかに於い
てそうである様に、結合反応の間に付加的な電荷が導入
されることはない。担体材料の交差結合は、従来可能な
結合方法に於いてよくある。ｔた、望ましくない副作用
であるが、本発明の結合方法によれば、それを避けるこ
とができる。
実施例６
実施例１の乾燥活性化グル１ｇのサンプルを１ＯＯＩＬ
ｌの乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）で
洗浄し、１．８１ｉツメチルジチオ力ルバミン酸ナトリ
ウム含有ＤＭＦ１００ｍに加えた。
ｌの乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）で
洗浄し、１．８１ｉツメチルジチオ力ルバミン酸ナトリ
ウム含有ＤＭＦ１００ｍに加えた。
そのグル懸濁液を室温で１６時間、振盪した。
そして１００ＩＬｌのドライＤＭＦで洗浄し、５Ｑｍの
乾燥ＤＭＦに再び懸濁した。懸濁液に、水素化ホウ素ナ
トリウムを加えた。懸濁液を室温で、更に４時間、振盪
し、２００ｄ伽σ、１０００ｄ１０００ｄ２．５００１
１１７０．５ＮＮａＣ１，及び５００Ｉｌｌ ２ ｍＭ
ＥｉＣＬで、グルを洗浄した。チオールゲルのスルフ
ヒドリル含量を、ジー・エル・エルマン（Ｇ、Ｌ、 Ｉ
ｌｌｍａｎ ） 、 Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏａｈ＠ｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ。
乾燥ＤＭＦに再び懸濁した。懸濁液に、水素化ホウ素ナ
トリウムを加えた。懸濁液を室温で、更に４時間、振盪
し、２００ｄ伽σ、１０００ｄ１０００ｄ２．５００１
１１７０．５ＮＮａＣ１，及び５００Ｉｌｌ ２ ｍＭ
ＥｉＣＬで、グルを洗浄した。チオールゲルのスルフ
ヒドリル含量を、ジー・エル・エルマン（Ｇ、Ｌ、 Ｉ
ｌｌｍａｎ ） 、 Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏａｈ＠ｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ。
８２ニア０−７７（１９５９）に記載の通シ、５．５’
−ゾチオピス（２−ニトロ安息香酸）によって測定した
結果、乾燥グル１１に対し、９マイクロモルであった。
−ゾチオピス（２−ニトロ安息香酸）によって測定した
結果、乾燥グル１１に対し、９マイクロモルであった。
実施例７
実施例１の乾燥活性化ｌ”Ａ／１１１を０．２ＭＮａＨ
ＣＯｓに１Ｍジチオトレイトール（・ＤＴ’ｒ ）を溶
解し、攪拌した溶液に加えた。この懸濁液を室温で５時
間、振盪した。次にグルを５００ＩｌｌＯ−２Ｍ Ｎａ
ＨＣＯｓ、５００ｄ蒸留水、及び１０００ｄ１０００ｄ
２で１．洗浄した。スルフヒドリル含量は、１１１の乾
燥グルにつき、６マイクロモルでアった・ 実施例８ 活性化チオールゲルの作製 実施例６のｏｓ−グル又は実施例７のＤＴＴ −ｒルを
エチレンシアミン四酢酸（ＫＤＴＡ ）中の６０チアセ
トｙ−４０％ ０．０５ＭＮａＨＣＯ３１ｍＭで洗浄し
た。洗浄されたグルは、０．３ Ｍ ２．２’−ジピリ
ジルジスルフィドと反応させた。
ＣＯｓに１Ｍジチオトレイトール（・ＤＴ’ｒ ）を溶
解し、攪拌した溶液に加えた。この懸濁液を室温で５時
間、振盪した。次にグルを５００ＩｌｌＯ−２Ｍ Ｎａ
ＨＣＯｓ、５００ｄ蒸留水、及び１０００ｄ１０００ｄ
２で１．洗浄した。スルフヒドリル含量は、１１１の乾
燥グルにつき、６マイクロモルでアった・ 実施例８ 活性化チオールゲルの作製 実施例６のｏｓ−グル又は実施例７のＤＴＴ −ｒルを
エチレンシアミン四酢酸（ＫＤＴＡ ）中の６０チアセ
トｙ−４０％ ０．０５ＭＮａＨＣＯ３１ｍＭで洗浄し
た。洗浄されたグルは、０．３ Ｍ ２．２’−ジピリ
ジルジスルフィドと反応させた。
実施例９
ウレアーゼの共有クロマトグラフィーによる精製
１ｙ量の部分精製したタチナタマメウレアーゼを、ｌ
ｍＭ ＥＤＴＡ及び５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ
）を含む４０ＩＬｌＯ，ＩＭ）リス−ａＣｔ、？７．
４に加えた。結果として得られる懸濁液を４℃で１時間
、攪拌し、遠心分離で小片を含む画分を除去した。５１
７の曇った上清を０．５ｍＭＥＤＴＡを含む０．０５
Ｍ ＴｒｉｓＨＣＡ 、 ｐＪ（７，４で平衡化したセ
フアープ、リス（Ｓ＠ｐｈａｄｅｘ ） Ｇ−５０Ｃ）
Ｘ５０ｍカラムに通した。こうした処理によって存在す
る全てのジチオトレイトールが除去され１次の共有クロ
マトグラフィーの段階での邪魔を防ぐことができる。
ｍＭ ＥＤＴＡ及び５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ
）を含む４０ＩＬｌＯ，ＩＭ）リス−ａＣｔ、？７．
４に加えた。結果として得られる懸濁液を４℃で１時間
、攪拌し、遠心分離で小片を含む画分を除去した。５１
７の曇った上清を０．５ｍＭＥＤＴＡを含む０．０５
Ｍ ＴｒｉｓＨＣＡ 、 ｐＪ（７，４で平衡化したセ
フアープ、リス（Ｓ＠ｐｈａｄｅｘ ） Ｇ−５０Ｃ）
Ｘ５０ｍカラムに通した。こうした処理によって存在す
る全てのジチオトレイトールが除去され１次の共有クロ
マトグラフィーの段階での邪魔を防ぐことができる。
ＤＴＴを除いた５Ｎの流出物を実施例８の活性化ＤＳ−
ｆルの０．５Ｘ２０ｔＭカラムに流した。次にカラムを
流出物の２８０ｎｍでの吸光度が０．１未満になる迄、
０．５ ｒｒＭ ＥＤＴＡを含む０．０５ Ｍ ）すｘ
−）１０４％ｐＨ７，４テ洗い、そして、０．０５ｍＭ
ＥＤＴＡ及び０．０５ＭＮ亀Ｃｔを含む０．０５ Ｍ
）リス−ＨＣ１、ｐＨ７，４で、吸収が０．０２未満
になる迄洗浄した。酵素ウレアーゼは、０．０５ ｍｙ
ｉＥＤＴＡ及び２０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ
）を含有する０、０５ ｍＭ ）リス−、ＨＣｔによっ
てカラムから流出した。ウレアーゼ活性は、グルタミ、
クデヒドロｒナーゼ連結反応によＪ、ＮＡＤＨの３４０
ｎｍ吸収の消失率を測定して分析された。
ｆルの０．５Ｘ２０ｔＭカラムに流した。次にカラムを
流出物の２８０ｎｍでの吸光度が０．１未満になる迄、
０．５ ｒｒＭ ＥＤＴＡを含む０．０５ Ｍ ）すｘ
−）１０４％ｐＨ７，４テ洗い、そして、０．０５ｍＭ
ＥＤＴＡ及び０．０５ＭＮ亀Ｃｔを含む０．０５ Ｍ
）リス−ＨＣ１、ｐＨ７，４で、吸収が０．０２未満
になる迄洗浄した。酵素ウレアーゼは、０．０５ ｍｙ
ｉＥＤＴＡ及び２０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ
）を含有する０、０５ ｍＭ ）リス−、ＨＣｔによっ
てカラムから流出した。ウレアーゼ活性は、グルタミ、
クデヒドロｒナーゼ連結反応によＪ、ＮＡＤＨの３４０
ｎｍ吸収の消失率を測定して分析された。
使用した基質の溶液は、０．０５Ｍ）ＩＪスーＨＣ４ｐ
Ｈ７，４； Ｏ，Ｅ ｍＭ ＥＤＴｋ ： １ ｍＭＡ
ＤＰ ： １ ｍＭアルファーケトゲルタレ−） ：
５０ｍＭ尿素及び５０Ｕグルタミ、クデヒドロｒナーゼ
を含有していた。
Ｈ７，４； Ｏ，Ｅ ｍＭ ＥＤＴｋ ： １ ｍＭＡ
ＤＰ ： １ ｍＭアルファーケトゲルタレ−） ：
５０ｍＭ尿素及び５０Ｕグルタミ、クデヒドロｒナーゼ
を含有していた。
アッセイは、２ｄの基質溶液に５〜１０マイクロリ、ト
ルの酵素溶液を加えることにより開始される。ウレアー
ゼのカラムへの固定化及びカラムからの流出の結果を第
５図に示す。第５図の実線から、ＵＶ吸収物質のほとん
どが、遅滞無くカラムを通過することがわかる。これら
の物質は、最初の１１画分に流出していた。高濃度のＮ
ａＣｔを含有する緩衝液を流すと、第１５〜２０画分に
少量のＷ吸収物質が更に流出した。
ルの酵素溶液を加えることにより開始される。ウレアー
ゼのカラムへの固定化及びカラムからの流出の結果を第
５図に示す。第５図の実線から、ＵＶ吸収物質のほとん
どが、遅滞無くカラムを通過することがわかる。これら
の物質は、最初の１１画分に流出していた。高濃度のＮ
ａＣｔを含有する緩衝液を流すと、第１５〜２０画分に
少量のＷ吸収物質が更に流出した。
破線は、ウレアーゼ活性を示し、 ＤＴＴがカラムに流
される迄、ウレアーゼ活性は検出されなかったことを示
す。曲線に示される通９、ＤＴＴが流された後、（第２
４画分から開始）第２９−３３画分に強いＵＶ吸収物質
が流出していた。
される迄、ウレアーゼ活性は検出されなかったことを示
す。曲線に示される通９、ＤＴＴが流された後、（第２
４画分から開始）第２９−３３画分に強いＵＶ吸収物質
が流出していた。
ＤＴＴを加えると酵素だけでなく、２−チオピリドンも
離脱し、それも２８０ ｎｍで強い吸収を示す。ＵＶ吸
収物質のほとんど（９０Ｓ近く）は２−チオピリドンで
構成されているということは、これらの画分を０．０５
Ｍ ）リスーＨＣ１中の０．０５ｍＭｇＤＴＡ ２０
００１１１７に対して透析を行ない、それらのＵＶｅ、
収に於いて、３４倍の縮少となったことから確実とされ
た。ウレアーゼ活性は、四吸収の増加と同時に増加した
。酵素溶液を単独で、活性化チオールダルに通した結果
、酵素全体の８３チが、１１倍の精製率で回収された。
離脱し、それも２８０ ｎｍで強い吸収を示す。ＵＶ吸
収物質のほとんど（９０Ｓ近く）は２−チオピリドンで
構成されているということは、これらの画分を０．０５
Ｍ ）リスーＨＣ１中の０．０５ｍＭｇＤＴＡ ２０
００１１１７に対して透析を行ない、それらのＵＶｅ、
収に於いて、３４倍の縮少となったことから確実とされ
た。ウレアーゼ活性は、四吸収の増加と同時に増加した
。酵素溶液を単独で、活性化チオールダルに通した結果
、酵素全体の８３チが、１１倍の精製率で回収された。
精製された酵素は、７７０単位／Ｉｎ９の特異的活性を
有することがわかった。実施例８の活性化ＤＴＴ−ダル
を用いても類似の結果が得られる。
有することがわかった。実施例８の活性化ＤＴＴ−ダル
を用いても類似の結果が得られる。
次の実施例では、本発明の活性化チオールダルにジスル
フィドプリ、デで結合した共有結合による生物学的活性
物質の可逆的な固定化について例示する。生物学的活性
物質を使用に便利な形態で提供する目的であれば、そう
した物質の固定化については、その生物学的活性物質の
活性に本質的に関わらないスル７ビドリル基を利用して
ソスルフイド結合を形成すべきであることを指摘しなけ
ればならない。
フィドプリ、デで結合した共有結合による生物学的活性
物質の可逆的な固定化について例示する。生物学的活性
物質を使用に便利な形態で提供する目的であれば、そう
した物質の固定化については、その生物学的活性物質の
活性に本質的に関わらないスル７ビドリル基を利用して
ソスルフイド結合を形成すべきであることを指摘しなけ
ればならない。
実施例１Ｏ
ベータガラクトシダーゼの可逆的固定化大腸菌（Ｌ Ｃ
ｏ１１ ）ベーターガラクトシダーゼ５ダを１０ゴの０
．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１５ Ｍ ＮａＣ
６，ｐＨ７，４に溶解させた。その酵素溶液に実施例８
の方法に従って作製した水分を含む活性化ＤＴＴ−ダル
２．５９を加えた。得られた懸濁液を室温で攪拌した。
ｏ１１ ）ベーターガラクトシダーゼ５ダを１０ゴの０
．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１５ Ｍ ＮａＣ
６，ｐＨ７，４に溶解させた。その酵素溶液に実施例８
の方法に従って作製した水分を含む活性化ＤＴＴ−ダル
２．５９を加えた。得られた懸濁液を室温で攪拌した。
ある間隔をおいて、０．１１１１７のグル懸濁液を取り
出して、２５００ｒｐｍで１分間、遠心分離に付した。
出して、２５００ｒｐｍで１分間、遠心分離に付した。
その上清をリン酸緩衝液で５０倍に希釈し、０．２５ｒ
Ｌｌの希釈上清について、２１ｊｏ−ニトロフェニル−
ベーターローガラクトピラノシド溶液中、ベーターガラ
クトシダーゼのアッセイを行った。室温で４時間インキ
ュベートした後、充分な活性を有するベーターガラクト
シダーゼの固定化が全て実現した。その時、０．０５Ｍ
ＩＪン酸塩、−７，７中の２０ ｍＭ ＤＴＴを固定化
された酵素と混合してサングルを取シ出し、ベーターガ
ラクトシダーゼについてアッセイを行なった。第６図に
示される通シ、ベーターガラクトシダーゼ活性は、反応
８時間で酵素が全て回収される迄増大した。
Ｌｌの希釈上清について、２１ｊｏ−ニトロフェニル−
ベーターローガラクトピラノシド溶液中、ベーターガラ
クトシダーゼのアッセイを行った。室温で４時間インキ
ュベートした後、充分な活性を有するベーターガラクト
シダーゼの固定化が全て実現した。その時、０．０５Ｍ
ＩＪン酸塩、−７，７中の２０ ｍＭ ＤＴＴを固定化
された酵素と混合してサングルを取シ出し、ベーターガ
ラクトシダーゼについてアッセイを行なった。第６図に
示される通シ、ベーターガラクトシダーゼ活性は、反応
８時間で酵素が全て回収される迄増大した。
本発明に関する上の記述は、説明及び例示を目的として
特に望ましい具体化の記述に向けられたものである。し
かしこの技術の分野に精通する者ならば、本発明の範囲
及び主旨から逸脱することなく、方法や材料について多
くの改良、改変が為され得ることは、明らかであろう・
例えば・他のヒドロキシル含有重合体担体及び他のりｆ
ンドが使用されるかもしれない。ここに記された特定の
アフィニティーシステムは、便宜上選択されたものであ
シ、限定を意図したものではない。出願人は、特許請求
の範囲が、そういったすべての均等な改良物やバリエー
ションをカバーするものであり、それらは、本発明の真
の範−囲及び主旨に含まれることを意図している。
特に望ましい具体化の記述に向けられたものである。し
かしこの技術の分野に精通する者ならば、本発明の範囲
及び主旨から逸脱することなく、方法や材料について多
くの改良、改変が為され得ることは、明らかであろう・
例えば・他のヒドロキシル含有重合体担体及び他のりｆ
ンドが使用されるかもしれない。ここに記された特定の
アフィニティーシステムは、便宜上選択されたものであ
シ、限定を意図したものではない。出願人は、特許請求
の範囲が、そういったすべての均等な改良物やバリエー
ションをカバーするものであり、それらは、本発明の真
の範−囲及び主旨に含まれることを意図している。
第１図は本発明による活性化重合体の製造方法の概略模
式図である。 第２図は、アフィニティーマトリ、クスとし”Ｃ２、４
−ＤＮＰ −リ’／ ７結合−≠隊ｉａ’ＣＬ’−４８
を用いた２、４−ジニトロフェニルウシ血清アルブミン
に対するウサギ抗血清のアフィニティー精製を示す流出
曲線である。 第３図は、トブラマイシン結合ｉ呼＃ ＣＬ−４Ｂをアフィニティーマトリ、クスとして用いた
ウサギ抗トブラマイシン血清のアフィニティー精製を示
す流出曲線である。 第４図は、チオールゲルの種々の製造ルートを示す概略
模式図である。 第５図は共有クロマトグラフィーによるタチナタマメウ
レアーゼの精製中に生じた流出物の色々な画分の吸収を
示す流出曲線である。 第６図は、大腸菌ベーターガラクトシダーゼの２．２′
−ジチオジピリノル活性化チオール（ＤＴＴ）グルへの
固定化の進行及び、ジチオトレイ） −ル付加による逆
反応の反応曲線である。 出願人代理人 弁理士 鈴 江 武 彦ＦＩＧ、 １ ＠ｃｎｚ−ｏｎ 士、ｆ’） ↓ ９ＣＨ２−ｏＱ ・７メ＼、 ９ＣＨ１４１１４４０ＣＨ２−乳 ＋ 口Ｇ、 ２ ＦＩＧ、 ３ 日Ｇ、４ ＦＩＧ、 ５ 画分１号。
式図である。 第２図は、アフィニティーマトリ、クスとし”Ｃ２、４
−ＤＮＰ −リ’／ ７結合−≠隊ｉａ’ＣＬ’−４８
を用いた２、４−ジニトロフェニルウシ血清アルブミン
に対するウサギ抗血清のアフィニティー精製を示す流出
曲線である。 第３図は、トブラマイシン結合ｉ呼＃ ＣＬ−４Ｂをアフィニティーマトリ、クスとして用いた
ウサギ抗トブラマイシン血清のアフィニティー精製を示
す流出曲線である。 第４図は、チオールゲルの種々の製造ルートを示す概略
模式図である。 第５図は共有クロマトグラフィーによるタチナタマメウ
レアーゼの精製中に生じた流出物の色々な画分の吸収を
示す流出曲線である。 第６図は、大腸菌ベーターガラクトシダーゼの２．２′
−ジチオジピリノル活性化チオール（ＤＴＴ）グルへの
固定化の進行及び、ジチオトレイ） −ル付加による逆
反応の反応曲線である。 出願人代理人 弁理士 鈴 江 武 彦ＦＩＧ、 １ ＠ｃｎｚ−ｏｎ 士、ｆ’） ↓ ９ＣＨ２−ｏＱ ・７メ＼、 ９ＣＨ１４１１４４０ＣＨ２−乳 ＋ 口Ｇ、 ２ ＦＩＧ、 ３ 日Ｇ、４ ＦＩＧ、 ５ 画分１号。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）少なくとも１つのヒドロキシル基を含有する重合
体物質を２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエ
ン−４−スルホネートと反応させ、上記重合体のヒドロ
キシル基の少なくとも幾つかが１−メチル−２−ピリド
キシ基に転化されている重合体産物を回収することより
成る、少なくとも１つのヒドロキシル基を含有する重合
体物質のヒドロキシル基を活性化する方法。 （２）（Ａ）第一アミノ基、第二アミノ基、及びスルフ
ヒドリル基より成る群の中から選択される少なくとも１
つの置換基を含有する有機リガンドを（Ｂ）少なくとも
１つのヒドロキシル基を含有する重合体物質に直接的に
共有結合させる方法であって、 （１）先ず、（ｉ）１−フルオロ−２−メチルピリジニ
ウムトルエン−４−スルホネートを、（ｉｉ）少なくと
も１つのヒドロキシル基を含有する重合体物質であって
その炭素原子に少なくとも１つの反応性ヒドロキシル基
が結合しているものと反応させて反応性誘導体を生成し
、ついで （２）上記反応性誘導体を有機リガンド（Ａ）と直接反
応させることから成る方法。 （３）少なくとも１つのヒドロキシル基を含有する重合
体物質のヒドロキシル基をスルフヒドリル基で、置換す
る方法であって、先ず、 （ｉ）２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン
−４−スルホネートを（ｉｉ）少なくとも一つのヒドロ
キシル基を含有する重合体物質であってその炭素原子に
少なくとも１つのヒドロキシル基が結合しているものと
反応させて反応性誘導体を生成し、上記反応性誘導体を
ジメチルジチオカルバミン酸ナトリウムと直接反応させ
、その結果得られるジメチルジチオカルバミル誘導体を
還元し、上記の少なくとも１つのヒドロキシル基がスル
フヒドリル基に置換されているチオールゲルを生成する
ことからなる方法。 （４）少なくとも１つのスルフヒドリル基がヒドロキシ
ル含有重合体の炭素原子に直接結合しているチオールゲ
ルの製造方法であって、少なくとも１つの反応性ヒドロ
キシル基を含有する重合体を２−メチル−１−フルオロ
−ピリジニウムトルエン−４−スルホネートと反応させ
て、上記重合体の炭素原子に１−メチル−２−ピリドキ
シ基が直接結合している活性化重合体を生成し、上記活
性化重合体をジチオトレイトールと反応させて、上記ジ
チオトレイトールのイオウ原子が上記重合体の炭素原子
に直接結合している上記重合体のジチオトレイチル誘導
体を生成することから成る方法。 （５）２−ピリジルジスルフィドで置換された重合体の
製造方法であって、ヒドロキシル含有重合体を２−フル
オロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネ
ートと反応させ、その結果得られる上記重合体の１−メ
チルピリドキシ誘導体をジメチルジチオカルバミン酸ナ
トリウムと反応させ、その結果得られるジメチルジチオ
カルバミル誘導体を還元的にクリーブしてスルフヒドリ
ルで置換された重合体を製造し、更に上記のスルフヒド
リルで置換された重合体を２，２′−ジピリジルジスル
フィドと反応させてその結果得られた、上記重合体の２
−ピリジルジスルフィド置換誘導体を回収することから
成る方法。 （６）ヒドロキシル含有重合体の２−ピリジルジスルフ
ィド誘導体の製造方法であって、少なくとも１つの反応
性ヒドロキシ基を有するヒドロキシル含有重合体を２−
フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スル
ホネートと反応させ、結果として得られる上記重合体の
１−メチルピリドキシ誘導体をジチオトレイトールと反
応させ、その結果得られるジチオトレイチルを反応させ
て、上記重合体のジチオトレイチル誘導体の２−ピリジ
ルジスルフィド誘導体を作成することから成る方法。 （７）固定化され、生物学的に活性化されたリガンドの
製造方法であって、少なくとも１つの反応性ヒドロキシ
ル基を含有するヒドロキシル含有重合体を２−フルオロ
−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネート
と反応させ、その結果として得られる上記重合体の１−
メチル−２−ピリドキシ誘導体をジメチルジチオカルバ
ミン酸ナトリウムと反応させ、その結果得られる上記重
合体のジメチルジチオカルバミル誘導体を還元的にクリ
ーブしてスルフヒドリル基が上記重合体の炭素原子に直
接結合しているスルフヒドリル置換重合体を生成し、上
記スルフヒドリル置換誘導体を２，２′−ジピリジルジ
スルフィドと反応させ、その結果得られる上記重合体の
２−ピリジルジスルフィド誘導体をフリーなスルフヒド
リル基を含有する生物学的に活性なリガンドと反応させ
て、固定化リガンドを製造することから成り、上記リガ
ンドが上記重合体にジスルフィド結合により結合してい
る方法。 （８）固定化され、生物学的に活性なリガンドの製造方
法であって、少なくとも１つの反応性ヒドロキシル基を
含有するヒドロキシル含有重合体を２−フルオロ−１−
メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネートと反応
させ、その結果得られる上記重合体の１−メチル−２−
ピリドキシ誘導体をジチオトレイトールと反応させ、そ
の結果得られる上記重合体のジチオトレイチル誘導体を
２，２′−ジピリジルジスルフィドと反応させて上記重
合体のジチオトレイチル誘導体の２−ピリジルジスルフ
ィド誘導体を製造し、上記２−ピリジルジスルフィド誘
導体をフリーなスルフヒドリル基を含有する生物学的に
活性なリガンドと反応させることから成り、上記リガン
ドがジスルフィド結合によって上記重合体に共有結合し
て居り、上記ジスルフィド結合が、ジチオトレイチル置
換重合体のスルフヒドリル基を置換している方法。 （９）フリーなスルフヒドリル基を含有する生物学的に
活性なリガンドを精製する為の共有クロマトグラフ方法
であって、特許請求の範囲第５項または６項の方法によ
り製造されたヒドロキシル含有重合体の２−ピリジルジ
スルフィド誘導体と上記リガンドを含有する混合物を含
有させ、その際、上記リガンドがジスルフィド結合によ
って上記重合体に結合し、ジチオトレイトール、メルカ
プトエタノール、及びシステインより成る群の中から選
択される低分子のスルフヒドリル含有化合物によって上
記重合体から上記リガンドを解離させることから成る方
法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67916784A | 1984-12-07 | 1984-12-07 | |
| US679167 | 1984-12-07 | ||
| US679525 | 1984-12-07 | ||
| US06/679,525 US4582875A (en) | 1984-12-07 | 1984-12-07 | Method of activating hydroxyl groups of a polymeric carrier using 2-fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28959893A Division JPH0747602B2 (ja) | 1984-12-07 | 1993-11-18 | 重合体担体の活性化方法 |
| JP5289599A Division JPH0747603B2 (ja) | 1984-12-07 | 1993-11-18 | 重合体担体の活性化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61173778A true JPS61173778A (ja) | 1986-08-05 |
| JPH074240B2 JPH074240B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=27102167
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27484185A Expired - Lifetime JPH074240B2 (ja) | 1984-12-07 | 1985-12-06 | 重合体担体の活性化方法 |
| JP28959893A Expired - Lifetime JPH0747602B2 (ja) | 1984-12-07 | 1993-11-18 | 重合体担体の活性化方法 |
| JP5289599A Expired - Fee Related JPH0747603B2 (ja) | 1984-12-07 | 1993-11-18 | 重合体担体の活性化方法 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28959893A Expired - Lifetime JPH0747602B2 (ja) | 1984-12-07 | 1993-11-18 | 重合体担体の活性化方法 |
| JP5289599A Expired - Fee Related JPH0747603B2 (ja) | 1984-12-07 | 1993-11-18 | 重合体担体の活性化方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0184361B1 (ja) |
| JP (3) | JPH074240B2 (ja) |
| AU (1) | AU581947B2 (ja) |
| CA (1) | CA1239357A (ja) |
| DE (1) | DE3581069D1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4753983A (en) * | 1986-05-07 | 1988-06-28 | Bioprobe International, Inc. | Polymeric matrix for affinity chromatography and immobilization of ligands |
| GB2267502B (en) * | 1992-05-28 | 1997-01-22 | Aligena Ag | Polymeric reaction products for use in immobilized buffered gels and membranes |
| AU757078B2 (en) | 1998-11-30 | 2003-01-30 | Dr. Gottschall Instruction Gesellschaft Fur Technische Chromatographie Mbh | Method of producing a polymer network |
| DE19855173C2 (de) * | 1998-11-30 | 2001-03-15 | Gottschall Instruction Ges Fue | Verfahren zur Herstellung derivatisierter Polymere und Derivate von funktionelle Gruppen aufweisende Polymere sowie Verfahren zur Substratbindung |
| JP3774888B2 (ja) * | 2001-11-28 | 2006-05-17 | 日本化薬株式会社 | ステロイド類化合物のｌｃ−ｍｓによる高感度検出法 |
| WO2011039259A2 (de) * | 2009-09-30 | 2011-04-07 | Thiomatrix Forschungs- Und Beratungs Gmbh | Mukoadhäsive polymere mit vitamin b-teilstrukturen |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE420733B (sv) * | 1974-05-30 | 1981-10-26 | Exploaterings Ab Tbf | Gelprodukt, innehallande tiosulfatgrupper samt sett for framstellning derav |
| US4195128A (en) * | 1976-05-03 | 1980-03-25 | Bayer Aktiengesellschaft | Polymeric carrier bound ligands |
| US4415665A (en) * | 1980-12-12 | 1983-11-15 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Method of covalently binding biologically active organic substances to polymeric substances |
| NZ213819A (en) * | 1984-10-31 | 1988-05-30 | Kanegafuchi Chemical Ind | Lipoprotein adsorbent using hydroxy-containing polymer gel |
-
1985
- 1985-11-19 CA CA000495612A patent/CA1239357A/en not_active Expired
- 1985-11-22 EP EP19850308501 patent/EP0184361B1/en not_active Expired
- 1985-11-22 DE DE8585308501T patent/DE3581069D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-06 JP JP27484185A patent/JPH074240B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-06 AU AU50881/85A patent/AU581947B2/en not_active Ceased
-
1993
- 1993-11-18 JP JP28959893A patent/JPH0747602B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-18 JP JP5289599A patent/JPH0747603B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0747602B2 (ja) | 1995-05-24 |
| EP0184361A3 (en) | 1987-11-04 |
| JPH074240B2 (ja) | 1995-01-25 |
| AU581947B2 (en) | 1989-03-09 |
| JPH0747603B2 (ja) | 1995-05-24 |
| EP0184361B1 (en) | 1991-01-02 |
| CA1239357A (en) | 1988-07-19 |
| DE3581069D1 (de) | 1991-02-07 |
| JPH06340708A (ja) | 1994-12-13 |
| JPH06340707A (ja) | 1994-12-13 |
| AU5088185A (en) | 1986-06-12 |
| EP0184361A2 (en) | 1986-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4232119A (en) | Reagent for use in immunochemical assay methods | |
| US4330440A (en) | Activated matrix and method of activation | |
| Axen et al. | Preparation of modified agarose gels containing thiol groups | |
| KR100537386B1 (ko) | 신규의 친화성 리간드 및 그것의 사용 | |
| US4231999A (en) | Method in assaying methods involving biospecific affinity reactions and reagent for use in said method | |
| US4048416A (en) | Thiopolymers, their derivatives and methods for their preparation and use | |
| Ngo | Facile activation of Sepharose hydroxyl groups by 2-fluoro-1 methylpyridinium toluene-4-sulfonate: preparation of affinity and covalent chromatographic matrices | |
| US4224439A (en) | Activated matrix and method of activation | |
| US5085779A (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
| US4582875A (en) | Method of activating hydroxyl groups of a polymeric carrier using 2-fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate | |
| JPS61181966A (ja) | カルボキシル基でつながれた固定化抗体 | |
| US4886755A (en) | Preparation of polymeric thiol gels for covalent bonding of biologically active ligands | |
| JPS5853757A (ja) | 免疫アフイニテイクロマトグラフイ−用吸着体及びその製法 | |
| JPS61173778A (ja) | 重合体担体の活性化方法 | |
| Miron et al. | Polyacrylhydrazido-agarose: Preparation via periodate oxidation and use for enzyme immobilization and affinity chromatography | |
| CA1332598C (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
| US4279998A (en) | Regenerable insoluble support for protein immobilization | |
| EP0057600A2 (en) | Affinity resins and their use in isolating bacterial luciferase | |
| JPH06504043A (ja) | ポリマーの活性化によるチオール化合物の固定化方法、活性化されたポリマー、及びこの方法により得られる生成物 | |
| Goldstein | [6] Polymers bearing isonitrile functional groups as supports for enzyme immobilization | |
| US4626581A (en) | Dihydroxyacryl | |
| Ngo | Facile activation of Trisacryl gels with 2-fluoro-1-methylpyridinium salt (FMP): Applications in affinity chromatography and enzyme immobilization | |
| JPS599153B2 (ja) | 生物学的活性化合物の製造方法 | |
| SU883052A1 (ru) | Иммуносорбент | |
| US4584402A (en) | Dihydroxyacryl |