JPH0747602B2 - 重合体担体の活性化方法 - Google Patents
重合体担体の活性化方法Info
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- JPH0747602B2 JPH0747602B2 JP28959893A JP28959893A JPH0747602B2 JP H0747602 B2 JPH0747602 B2 JP H0747602B2 JP 28959893 A JP28959893 A JP 28959893A JP 28959893 A JP28959893 A JP 28959893A JP H0747602 B2 JPH0747602 B2 JP H0747602B2
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- C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
- C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有機リガンドを重合体
担体に共有結合させる方法に関する。より詳細には、本
発明は、１又はそれ以上の第一或いは第二アミノ基、或
いはスルフヒドリル基を含有する有機リガンドを重合体
ゲルに共有結合させる新規な方法に関する。
担体に共有結合させる方法に関する。より詳細には、本
発明は、１又はそれ以上の第一或いは第二アミノ基、或
いはスルフヒドリル基を含有する有機リガンドを重合体
ゲルに共有結合させる新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】生物学的に活性な材料を簡
便な方法で精製する必要性は長い間重視されてきてい
る。例えば、酵素を精製する為の初期の方法は、煩雑で
あり且つ多くの時間を要するものであった。最近になっ
て、酵素その他の生物学的に活性な材料は、次の様な工
程によって精製され得ることがわかった。すなわち、こ
こではリガンドとして言及される酵素その他の生物学的
に活性な材料を固定化し、次に固定化されたリガンドを
それの存在する混合物から分離するということを含む工
程である。リガンドは、必要に応じ、固定化された状態
で使用し得るし、或いは、適当な化学処理によってその
固定化された担体からはずして固定化されていない状態
でも用いることができる。リガンドを重合体担体に共有
結合させる方法の発見は、酵素学、免疫学、そして他の
様々な生物学的技術を発展させた。
便な方法で精製する必要性は長い間重視されてきてい
る。例えば、酵素を精製する為の初期の方法は、煩雑で
あり且つ多くの時間を要するものであった。最近になっ
て、酵素その他の生物学的に活性な材料は、次の様な工
程によって精製され得ることがわかった。すなわち、こ
こではリガンドとして言及される酵素その他の生物学的
に活性な材料を固定化し、次に固定化されたリガンドを
それの存在する混合物から分離するということを含む工
程である。リガンドは、必要に応じ、固定化された状態
で使用し得るし、或いは、適当な化学処理によってその
固定化された担体からはずして固定化されていない状態
でも用いることができる。リガンドを重合体担体に共有
結合させる方法の発見は、酵素学、免疫学、そして他の
様々な生物学的技術を発展させた。
【０００３】生物学的リガンドの固定方法のうち最初の
ものの１つに、ヒドロキシル基を含有する重合体を臭化
シアン（ＣＮＢｒ）などの活性化剤で処理する方法があ
った。活性化された重合体は、共有結合によって種々の
生物学的リガンドを直接結合させるのに使用し得たので
ある。ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）らは、ＣＮＢｒ法を含む
いくつかの化学的活性化方法について記している（ポラ
ス他、イモービライズド・エンザイムズ（Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）メソッズ・イン・エンザ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）モスバッチ（Ｍｏｓｂａｃｈ）編、第４４巻、１
９−４５頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）、（１９７６））。ヒドロキシル基を含
有する重合体の活性方法の初期のものの殆どは、不利な
点が生じ易い為に実際的には広く普及しなかった。とり
わけＣＮＢｒによる活性化工程には次のような欠点がつ
きものである。すなわち、（１）ＣＮＢｒで活性化され
たヒドロキシル基含有重合体と活性化された重合体と反
応するリガンドのアミノ基との間に生ずる結合は化学的
に不安定であること、（２）活性化された重合体とリガ
ンドとの反応は、しばしば電荷を導入し、そのことが親
和吸収における反応産物の利用を妨げること、（３）Ｃ
ＮＢｒは有毒で、催涙性を有する有害な化学物質である
ので、取扱いの際に特別な配慮を必要とすること、であ
る。
ものの１つに、ヒドロキシル基を含有する重合体を臭化
シアン（ＣＮＢｒ）などの活性化剤で処理する方法があ
った。活性化された重合体は、共有結合によって種々の
生物学的リガンドを直接結合させるのに使用し得たので
ある。ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）らは、ＣＮＢｒ法を含む
いくつかの化学的活性化方法について記している（ポラ
ス他、イモービライズド・エンザイムズ（Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）メソッズ・イン・エンザ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）モスバッチ（Ｍｏｓｂａｃｈ）編、第４４巻、１
９−４５頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）、（１９７６））。ヒドロキシル基を含
有する重合体の活性方法の初期のものの殆どは、不利な
点が生じ易い為に実際的には広く普及しなかった。とり
わけＣＮＢｒによる活性化工程には次のような欠点がつ
きものである。すなわち、（１）ＣＮＢｒで活性化され
たヒドロキシル基含有重合体と活性化された重合体と反
応するリガンドのアミノ基との間に生ずる結合は化学的
に不安定であること、（２）活性化された重合体とリガ
ンドとの反応は、しばしば電荷を導入し、そのことが親
和吸収における反応産物の利用を妨げること、（３）Ｃ
ＮＢｒは有毒で、催涙性を有する有害な化学物質である
ので、取扱いの際に特別な配慮を必要とすること、であ
る。
【０００４】リガンドをヒドロキシル含有重合体に結合
させる為の方法として、ＣＮＢｒ法以外を捜す努力がさ
れた結果、三塩化トリアジン、Ｎ−ヒドロキシサクシミ
ド、１，１′−カルボニルジイミダゾール、及びエポキ
シ化合物を含む幾つかの反応物を使用する方法が案出さ
れた。エポキシ化合物の使用については、アクセン（Ａ
ｘｅｎ）他Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ Ｂ２９：
４７１−４７４（１９７５）に記載されている。エピク
ロロヒドリン、或いは、１，４−ビス（２，３−エポキ
シプロポキシ）ブタンは、アガロースゲルのヒドロキシ
ル基と反応して、エポキシドゲルを生成する。このエポ
キシドゲルは、チオ硫酸ナトリウムと反応し、チオ硫酸
エステルを生じ、更にそれは、ジチオトレイトールによ
り還元され、チオール基を含有する修飾されたアガロー
スゲルを生成する。チオールゲルとしばしば呼ばれてい
るこのゲルは、２，２′−ジピリジルスルフィドによっ
て、２−ピリジルジスルフィドゲルに変換される。そし
てこのジスルフィドゲルのカラムにウレアーゼの溶液を
通すと、蛋白含有量が高く、高い触媒作用を有する酵素
の結合物が得られる。この方法の一つの欠点は、エポキ
シ置換重合体が充分安定でない為に保存がしにくいとい
うことである。
させる為の方法として、ＣＮＢｒ法以外を捜す努力がさ
れた結果、三塩化トリアジン、Ｎ−ヒドロキシサクシミ
ド、１，１′−カルボニルジイミダゾール、及びエポキ
シ化合物を含む幾つかの反応物を使用する方法が案出さ
れた。エポキシ化合物の使用については、アクセン（Ａ
ｘｅｎ）他Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ Ｂ２９：
４７１−４７４（１９７５）に記載されている。エピク
ロロヒドリン、或いは、１，４−ビス（２，３−エポキ
シプロポキシ）ブタンは、アガロースゲルのヒドロキシ
ル基と反応して、エポキシドゲルを生成する。このエポ
キシドゲルは、チオ硫酸ナトリウムと反応し、チオ硫酸
エステルを生じ、更にそれは、ジチオトレイトールによ
り還元され、チオール基を含有する修飾されたアガロー
スゲルを生成する。チオールゲルとしばしば呼ばれてい
るこのゲルは、２，２′−ジピリジルスルフィドによっ
て、２−ピリジルジスルフィドゲルに変換される。そし
てこのジスルフィドゲルのカラムにウレアーゼの溶液を
通すと、蛋白含有量が高く、高い触媒作用を有する酵素
の結合物が得られる。この方法の一つの欠点は、エポキ
シ置換重合体が充分安定でない為に保存がしにくいとい
うことである。
【０００５】更に最近になると、種々の有機スルホン酸
塩が、固定化親和リガンドを調製する上で広く使用され
得ることがわかった。例えば、ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏ
ｎ）他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１２：３９
７−４０２（１９８０）には、ｐ−トルエンスルホニル
クロリドによる幾つかの生物由来分子のアガロースゲル
への結合について記されている。使用された生物由来分
子は、核酸及び酵素を含むものである。
塩が、固定化親和リガンドを調製する上で広く使用され
得ることがわかった。例えば、ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏ
ｎ）他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１２：３９
７−４０２（１９８０）には、ｐ−トルエンスルホニル
クロリドによる幾つかの生物由来分子のアガロースゲル
への結合について記されている。使用された生物由来分
子は、核酸及び酵素を含むものである。
【０００６】その他の有機ハロゲン化スルホニルの使用
や、他のヒドロキシル基を持つ支持体の使用について
は、ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１０２：４４９
−４５７（１９８１）に記載されている。最も活性の高
いハロゲン化スルホニルは、２，２，２−トリフルオロ
エタンスルホニルクロリド（トレシルクロリド）である
と思われる。この文献で言及されている他のヒドロキシ
ル基を持つ支持体は、セルロース、ジオール−シリカ、
グリコファーゼ−グラス、及びヒドロキシエチルメタク
リレートである。
や、他のヒドロキシル基を持つ支持体の使用について
は、ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１０２：４４９
−４５７（１９８１）に記載されている。最も活性の高
いハロゲン化スルホニルは、２，２，２−トリフルオロ
エタンスルホニルクロリド（トレシルクロリド）である
と思われる。この文献で言及されている他のヒドロキシ
ル基を持つ支持体は、セルロース、ジオール−シリカ、
グリコファーゼ−グラス、及びヒドロキシエチルメタク
リレートである。
【０００７】モスバッチらによる米国特許第４，４１
５，６６５号は、重合体物質の反応性に富むスルホン酸
塩誘導体を作成し、次にこうして活性化した重合体物質
を生物学的に活性な有機物質と直接反応させることによ
って、アミノ、チオール、或いは、芳香ヒドロキシル基
を直接、少なくとも一つのヒドロキシル基を含有する重
合体物質に共有結合させる方法を教示している。ハロゲ
ン化スルホニルの使用は、多くの面で利点を有するもの
であることは証明されているが、更に活性の高い有機ハ
ロゲン化スルホニルを得ることはコストの面で難しく、
又、トレシルクロリドは、液体である為、取り扱いが簡
便ではない。
５，６６５号は、重合体物質の反応性に富むスルホン酸
塩誘導体を作成し、次にこうして活性化した重合体物質
を生物学的に活性な有機物質と直接反応させることによ
って、アミノ、チオール、或いは、芳香ヒドロキシル基
を直接、少なくとも一つのヒドロキシル基を含有する重
合体物質に共有結合させる方法を教示している。ハロゲ
ン化スルホニルの使用は、多くの面で利点を有するもの
であることは証明されているが、更に活性の高い有機ハ
ロゲン化スルホニルを得ることはコストの面で難しく、
又、トレシルクロリドは、液体である為、取り扱いが簡
便ではない。
【０００８】連続的チオール−ジスルフィド交換反応を
用いた酵素の精製については、カールソン（Ｃａｒｌｓ
ｓｏｎ）他、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，Ｂ３
０：１８０−１８２（１９７６）に記載されて居り、そ
こでは、アガロース−２−ピリジルジスルフィドにウレ
アーゼが共有結合されている。この方法は、共有クロマ
トグラフによるウレアーゼの精製には効果的ではある
が、アガロース−２−ピリジルスルフィドを取得するの
には、不安定なエポキシド誘導体を利用する工程を組合
せなければならない。
用いた酵素の精製については、カールソン（Ｃａｒｌｓ
ｓｏｎ）他、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，Ｂ３
０：１８０−１８２（１９７６）に記載されて居り、そ
こでは、アガロース−２−ピリジルジスルフィドにウレ
アーゼが共有結合されている。この方法は、共有クロマ
トグラフによるウレアーゼの精製には効果的ではある
が、アガロース−２−ピリジルスルフィドを取得するの
には、不安定なエポキシド誘導体を利用する工程を組合
せなければならない。
【０００９】ムカイヤマらは、種々の２−ピリジル硫化
物を取得する為の反応物として、１−メチル−２−アル
コキシピリジニウム塩の使用を開示している（Ｃｈｅ
ｍ．Ｌｅｔｔ．，１１５９−１１６２（１９７５））。
物を取得する為の反応物として、１−メチル−２−アル
コキシピリジニウム塩の使用を開示している（Ｃｈｅ
ｍ．Ｌｅｔｔ．，１１５９−１１６２（１９７５））。
【００１０】ホージョーらは、アルコールを１−メチル
−２−フルオロピリジニウム塩及びＮ，Ｎ−ジメチルチ
オカルバミン酸ナトリウムと反応させた後、還元的クリ
ーブによって、種々のアルコールのそれらに対応するチ
オールアルコールへの変換を示すことに成功した。炭水
化物やステロイドを含め、これらの著者によって例示さ
れているアルコールは、低分子量の単量体のアルコール
である（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，４３７−４４０（１９
７７））。
−２−フルオロピリジニウム塩及びＮ，Ｎ−ジメチルチ
オカルバミン酸ナトリウムと反応させた後、還元的クリ
ーブによって、種々のアルコールのそれらに対応するチ
オールアルコールへの変換を示すことに成功した。炭水
化物やステロイドを含め、これらの著者によって例示さ
れているアルコールは、低分子量の単量体のアルコール
である（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，４３７−４４０（１９
７７））。
【００１１】
【課題を解決するための手段】２−フルオロ−１−メチ
ルピリジニウムトルエン−４−スルホネート（ＦＭＰ）
との反応によって活性化された、ヒドロキシル含有重合
体を利用する共有クロマトグラフのマトリックスを作製
する為の便利な方法が、今や得られた。活性化されたヒ
ドロキシル含有重合体は、アミノ及びスルフヒドリル基
を含有する様々なリガンドとの共有結合を形成するのに
用いられ得る。しかしながら、共有結合されたリガンド
は、重合体マトリックスから除去するのが難しい。した
がって、リガンドを望ましい時にいつでも除去可能な様
に重合体へ結合させることが望ましい。この方法は、活
性化された重合体のチオールゲルへの変換、すなわち、
スルフヒドリル基含有重合体への変換を含むものであ
る。このチオールゲルを２，２′−ジピリジルスルフィ
ドと反応させ、重合体の２−ピリジルジスルフィド誘導
体を生成し得る。スルフヒドリル基含有リガンドのチオ
ール−ジスルフィド交換によって、リガンドは、ジスル
フィド結合により重合体に結合する。ジチオトレイトー
ルのようなチオールでジスルフィド結合を還元すること
により、リガンドは、いつでも必要な時に除去されるよ
うになる。
ルピリジニウムトルエン−４−スルホネート（ＦＭＰ）
との反応によって活性化された、ヒドロキシル含有重合
体を利用する共有クロマトグラフのマトリックスを作製
する為の便利な方法が、今や得られた。活性化されたヒ
ドロキシル含有重合体は、アミノ及びスルフヒドリル基
を含有する様々なリガンドとの共有結合を形成するのに
用いられ得る。しかしながら、共有結合されたリガンド
は、重合体マトリックスから除去するのが難しい。した
がって、リガンドを望ましい時にいつでも除去可能な様
に重合体へ結合させることが望ましい。この方法は、活
性化された重合体のチオールゲルへの変換、すなわち、
スルフヒドリル基含有重合体への変換を含むものであ
る。このチオールゲルを２，２′−ジピリジルスルフィ
ドと反応させ、重合体の２−ピリジルジスルフィド誘導
体を生成し得る。スルフヒドリル基含有リガンドのチオ
ール−ジスルフィド交換によって、リガンドは、ジスル
フィド結合により重合体に結合する。ジチオトレイトー
ルのようなチオールでジスルフィド結合を還元すること
により、リガンドは、いつでも必要な時に除去されるよ
うになる。
【００１２】チオールゲルを得る方法として、二つの異
なったルートが可能である。その一つは、本発明のジメ
チルジチオカルバミン酸ナトリウムを用いて、活性化重
合体をその対応するジメチルジチオカルバミル誘導体に
変換し、これを還元的クリーブ（ｃｌｅａｖｅ）によっ
て任意のスルフヒドリル置換重合体（ＤＳゲルと以下呼
ぶ）に変換するというルートである。
なったルートが可能である。その一つは、本発明のジメ
チルジチオカルバミン酸ナトリウムを用いて、活性化重
合体をその対応するジメチルジチオカルバミル誘導体に
変換し、これを還元的クリーブ（ｃｌｅａｖｅ）によっ
て任意のスルフヒドリル置換重合体（ＤＳゲルと以下呼
ぶ）に変換するというルートである。
【００１３】本発明に含まれないが、チオールゲルを得
るもう一方のルートは、ＦＭＰ活性化重合体をジチオト
レイトールで処理して、以下ＤＴＴゲルと略称するとこ
ろのチオールゲル、ジチオトレイチルゲルを生成する工
程を含むものであり、フリーなスルフヒドリル基は、重
合体へのチオエーテル結合から４個の炭素原子で隔たっ
ている。
るもう一方のルートは、ＦＭＰ活性化重合体をジチオト
レイトールで処理して、以下ＤＴＴゲルと略称するとこ
ろのチオールゲル、ジチオトレイチルゲルを生成する工
程を含むものであり、フリーなスルフヒドリル基は、重
合体へのチオエーテル結合から４個の炭素原子で隔たっ
ている。
【００１４】共有クロマトグラフのマトリックスを特に
どういった場合に応用するかによって、ＤＳ−ゲルか又
はＤＴＴゲルが、理想的に特定のクロマトグラフの各手
順に適したものに使い分けられ得る。例えば、ＤＴＴゲ
ルは、リガンドが大きな原子団を含んで居り、介在する
炭素の４原子鎖によって重合体表面とジスルフィド結合
との間にスペースが存在しなければ、重合体に充分近づ
いてジスルフィド結合を攻撃することが容易でない場合
に特に適用され得る。
どういった場合に応用するかによって、ＤＳ−ゲルか又
はＤＴＴゲルが、理想的に特定のクロマトグラフの各手
順に適したものに使い分けられ得る。例えば、ＤＴＴゲ
ルは、リガンドが大きな原子団を含んで居り、介在する
炭素の４原子鎖によって重合体表面とジスルフィド結合
との間にスペースが存在しなければ、重合体に充分近づ
いてジスルフィド結合を攻撃することが容易でない場合
に特に適用され得る。
【００１５】重合体担体は、水溶性でも水不溶性の重合
体物質でもよく、本発明の方法を遂行する上では担体の
選択は決定的なものではない。重合体としての性質を有
し、炭素原子に結合している、活性化や結合を可能にす
る少なくとも一つのヒドロキシル基を含有するものであ
れば、原則としてどのタイプの担体でも使用し得る。担
体は、個々の状況に於ける必要に応じ、先ず第一に、結
合させるリガンドのタイプ、そして結合産物の用途に応
じて選択される。担体は、ヒドロキシル基を含有した、
天然、半合成、或いは合成によるものであっても良い。
重要な担体材料は、多糖類及び多糖類を含有する材料で
あり、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン
及びその架橋結合物である。合成担体としては、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリヒドロ
キシエチルメチルアクリレート等が例示される。当然の
ことながら、通常ヒドロキシル基を含有しない担体を使
用することも可能であるが、その場合は、適切な処理を
することによってそうした基を付与することができる。
その一つの例がシリカ粒子であり、その表面に炭素原子
に結合している少なくとも一つのヒドロキシル基を含有
する原子団が結合されている。
体物質でもよく、本発明の方法を遂行する上では担体の
選択は決定的なものではない。重合体としての性質を有
し、炭素原子に結合している、活性化や結合を可能にす
る少なくとも一つのヒドロキシル基を含有するものであ
れば、原則としてどのタイプの担体でも使用し得る。担
体は、個々の状況に於ける必要に応じ、先ず第一に、結
合させるリガンドのタイプ、そして結合産物の用途に応
じて選択される。担体は、ヒドロキシル基を含有した、
天然、半合成、或いは合成によるものであっても良い。
重要な担体材料は、多糖類及び多糖類を含有する材料で
あり、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン
及びその架橋結合物である。合成担体としては、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリヒドロ
キシエチルメチルアクリレート等が例示される。当然の
ことながら、通常ヒドロキシル基を含有しない担体を使
用することも可能であるが、その場合は、適切な処理を
することによってそうした基を付与することができる。
その一つの例がシリカ粒子であり、その表面に炭素原子
に結合している少なくとも一つのヒドロキシル基を含有
する原子団が結合されている。
【００１６】ヒドロキシル含有重合体担体の活性化は、
アセトニトリル、アセトン、或いは、テトラヒドロフラ
ンの様な極性の乾燥有機溶媒中において、トリエチルア
ミンやトリブチルアミンなどの第三アミンがわずかに過
剰に存在する状態で行なわれる。ＦＭＰは、通常約１〜
１５分の速さで、周囲の温度（約２２−３５℃）及び圧
力で、種々の重合体材料と反応し、２−アルコキシ−１
−メチルピリジニウム塩を生成し、それが、アフィニテ
ィリガンドとして適切な様々な求核物質のアミノ或いは
スルフヒドリル基と直ぐに反応する。２−クロロ−１−
メチルピリジニウム塩の様な２−ハロ−１−メチルピリ
ジニウム塩も使用され得るが、その大きな反応性から、
２−フルオロ−１−メチルピリジニウム塩のほうが、よ
り望ましい。
アセトニトリル、アセトン、或いは、テトラヒドロフラ
ンの様な極性の乾燥有機溶媒中において、トリエチルア
ミンやトリブチルアミンなどの第三アミンがわずかに過
剰に存在する状態で行なわれる。ＦＭＰは、通常約１〜
１５分の速さで、周囲の温度（約２２−３５℃）及び圧
力で、種々の重合体材料と反応し、２−アルコキシ−１
−メチルピリジニウム塩を生成し、それが、アフィニテ
ィリガンドとして適切な様々な求核物質のアミノ或いは
スルフヒドリル基と直ぐに反応する。２−クロロ−１−
メチルピリジニウム塩の様な２−ハロ−１−メチルピリ
ジニウム塩も使用され得るが、その大きな反応性から、
２−フルオロ−１−メチルピリジニウム塩のほうが、よ
り望ましい。
【００１７】ＦＭＰのような活性化剤の反応しなかった
ものは、希塩酸（例えば２ｍＭ ＨＣｌ）の様な希酸で
容易に重合体担体より洗い去ることができ、それによっ
て、活性化ヒドロキシル基に加水分解を起こさせること
なく活性化重合体を精製し、安定化させる。
ものは、希塩酸（例えば２ｍＭ ＨＣｌ）の様な希酸で
容易に重合体担体より洗い去ることができ、それによっ
て、活性化ヒドロキシル基に加水分解を起こさせること
なく活性化重合体を精製し、安定化させる。
【００１８】ＦＭＰ活性化重合体担体は、２ｍＭ ＨＣ
ｌに４℃で保存すると少なくとも４ケ月は安定である。
活性化した重合体担体は、薄い無機酸、例えば、２ｍＭ
リン酸中でも、或いは、必要ならば乾燥させた形態でも
保存が可能がある。通常、１ｍｌのゲルに対し４〜７マ
イクロモルという活性密度が得られる。
ｌに４℃で保存すると少なくとも４ケ月は安定である。
活性化した重合体担体は、薄い無機酸、例えば、２ｍＭ
リン酸中でも、或いは、必要ならば乾燥させた形態でも
保存が可能がある。通常、１ｍｌのゲルに対し４〜７マ
イクロモルという活性密度が得られる。
【００１９】本発明の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）方法
は、上記したアミノ或いはスルフヒドリル基を含有する
有機リガンドに全般的に応用され得る。例えば、第一ア
ミノ、第二アミノ或いは、スルフヒドリル基は活性化さ
れたヒドロキシル含有重合体への結合に用いられ得る。
同様にそのＮａ塩の様なスルフヒドリル基を含有する化
合物の塩もこの目的の為に有用である。一般に結合の為
に選択される生成物は、結合反応を円滑に行える様に、
良好な求核物質であるべきである。重合体から、１−メ
チル−２−ピリドキシ基を置換し得る基ならいかなるも
のも充分リガンドとして使用され得る。そこで、結果的
にリガンドが、結合に使用され得る官能基を有するので
あれば、リガンドは、あらゆる脂肪族、芳香族、複素
環、ヘテロ芳香族ラジカル又は、それらの組合わせより
成るあらゆるラジカルを含んで良い。特に興味深いもの
は、生物学的に活性なリガンドであり、例えば、酵素等
の蛋白質、抗体及び抗原、アミノ酸、チオール化合物、
コファクタ、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ハプテ
ン及びその他の多くの生物学的に活性なリガンドであ
り、特に、例えば、アフィニティークロマトグラフィー
に使用され得る、他の物質に生物学的に特異的な親和性
を有するものが挙げられる。
は、上記したアミノ或いはスルフヒドリル基を含有する
有機リガンドに全般的に応用され得る。例えば、第一ア
ミノ、第二アミノ或いは、スルフヒドリル基は活性化さ
れたヒドロキシル含有重合体への結合に用いられ得る。
同様にそのＮａ塩の様なスルフヒドリル基を含有する化
合物の塩もこの目的の為に有用である。一般に結合の為
に選択される生成物は、結合反応を円滑に行える様に、
良好な求核物質であるべきである。重合体から、１−メ
チル−２−ピリドキシ基を置換し得る基ならいかなるも
のも充分リガンドとして使用され得る。そこで、結果的
にリガンドが、結合に使用され得る官能基を有するので
あれば、リガンドは、あらゆる脂肪族、芳香族、複素
環、ヘテロ芳香族ラジカル又は、それらの組合わせより
成るあらゆるラジカルを含んで良い。特に興味深いもの
は、生物学的に活性なリガンドであり、例えば、酵素等
の蛋白質、抗体及び抗原、アミノ酸、チオール化合物、
コファクタ、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ハプテ
ン及びその他の多くの生物学的に活性なリガンドであ
り、特に、例えば、アフィニティークロマトグラフィー
に使用され得る、他の物質に生物学的に特異的な親和性
を有するものが挙げられる。
【００２０】反応の図式は、図１に示されている。図
中、−ＣＨ2 −ＯＨというシンボルは、少なくとも一つ
の−ＣＨ2 −ＯＨ基を有する重合体担体を表し、ＴｓＯ
- は、トルエン−４−スルホネートイオンを表し、ＴＥ
Ａは、トリエチルアミンを、Ｌ−ＮＨ2 は、アミノ基含
有リガンドを、Ｌ−ＳＨは、スルフヒドリル基含有リガ
ンドを、夫々示す。
中、−ＣＨ2 −ＯＨというシンボルは、少なくとも一つ
の−ＣＨ2 −ＯＨ基を有する重合体担体を表し、ＴｓＯ
- は、トルエン−４−スルホネートイオンを表し、ＴＥ
Ａは、トリエチルアミンを、Ｌ−ＮＨ2 は、アミノ基含
有リガンドを、Ｌ−ＳＨは、スルフヒドリル基含有リガ
ンドを、夫々示す。
【００２１】結合は、様々な温度及びｐＨに於いて行な
い得、極性有機溶媒中だけでなく、水性の反応媒体中で
も可能である。反応条件は、活性化の段階でも結合の段
階でも決定的なものではなく、先ず、反応体の感受性及
び実際上の便宜上によって選択される。穏やかな反応条
件が望ましい。例えば、常温及び常圧下で行うのが適切
で、水性の反応媒体の場合、ｐＨは中性付近、例えば、
ｐＨ８〜９である。担体のヒドロキシル基への結合の度
合は、化学量論上の調節で実質的にすべての使用し得る
ヒドロキシル基を使用する必要があるか、そのどの程度
の部分を必要とするかによって様々である。７０〜８０
％の結合効率が、通常実現される。
い得、極性有機溶媒中だけでなく、水性の反応媒体中で
も可能である。反応条件は、活性化の段階でも結合の段
階でも決定的なものではなく、先ず、反応体の感受性及
び実際上の便宜上によって選択される。穏やかな反応条
件が望ましい。例えば、常温及び常圧下で行うのが適切
で、水性の反応媒体の場合、ｐＨは中性付近、例えば、
ｐＨ８〜９である。担体のヒドロキシル基への結合の度
合は、化学量論上の調節で実質的にすべての使用し得る
ヒドロキシル基を使用する必要があるか、そのどの程度
の部分を必要とするかによって様々である。７０〜８０
％の結合効率が、通常実現される。
【００２２】結合反応の後に残った未反応の活性化原子
団は、結合の終った重合体の利用を妨げる可能性がある
ので、結合の終った重合体をｐＨ９、０．２Ｍトリス−
ＨＣｌに室温で、２時間、懸濁して除去することができ
る。エタノールアミンやメルカプトエタノールの様な他
の求核物質もまた、この目的に使用され得る。
団は、結合の終った重合体の利用を妨げる可能性がある
ので、結合の終った重合体をｐＨ９、０．２Ｍトリス−
ＨＣｌに室温で、２時間、懸濁して除去することができ
る。エタノールアミンやメルカプトエタノールの様な他
の求核物質もまた、この目的に使用され得る。
【００２３】チオールゲルの使用を含む本発明の望まし
い結合方法については、図４を参照して詳細に述べられ
る。図４中には、全体の反応に於ける様々なステップが
示されている。
い結合方法については、図４を参照して詳細に述べられ
る。図４中には、全体の反応に於ける様々なステップが
示されている。
【００２４】示されている過程の最初の工程は、少なく
とも一つの反応性ヒドロキシル基を有するヒドロキシル
含有重合体（式１）の２−フルオロ−１−メチルピリジ
ニウムトルエン−４−スルホネート（式２）との反応で
あり、既に上に記した。結果として得られる２−アルコ
キシ−１−メチルピリジニウム塩（式３）は、時おり活
性化重合体、或いは、活性化ゲルとして言及される。１
−メチル−２−ピリドキシ基は、リガンドによる求核的
置換の際に直ぐに１−メチル−２−ピリドン（式４）に
変換される優良な離れ易い原子団である為、活性化重合
体は直ぐに求核物質によって攻撃される。
とも一つの反応性ヒドロキシル基を有するヒドロキシル
含有重合体（式１）の２−フルオロ−１−メチルピリジ
ニウムトルエン−４−スルホネート（式２）との反応で
あり、既に上に記した。結果として得られる２−アルコ
キシ−１−メチルピリジニウム塩（式３）は、時おり活
性化重合体、或いは、活性化ゲルとして言及される。１
−メチル−２−ピリドキシ基は、リガンドによる求核的
置換の際に直ぐに１−メチル−２−ピリドン（式４）に
変換される優良な離れ易い原子団である為、活性化重合
体は直ぐに求核物質によって攻撃される。
【００２５】チオールゲルの製造に導く一連の反応で
は、スルフヒドリル基が直接重合体の炭素原子に結合し
ているのであるが、求核的置換によって活性化重合体と
反応し、重合体のジメチルジチオカルバミル誘導体（式
６）を生成するのにジメチルジチオカルバミル酸ナトリ
ウム（式５）が用いられる。活性化ゲルのジメチルジチ
オカルバミン酸との反応は、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルム
アミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒中で起きる。使用し得る
他の溶媒は、アセトニトリル、アセトン、及びテトラヒ
ドロフランを含むものである。その反応は、周囲の温度
及び圧力下で１２〜２０時間行なわれる。
は、スルフヒドリル基が直接重合体の炭素原子に結合し
ているのであるが、求核的置換によって活性化重合体と
反応し、重合体のジメチルジチオカルバミル誘導体（式
６）を生成するのにジメチルジチオカルバミル酸ナトリ
ウム（式５）が用いられる。活性化ゲルのジメチルジチ
オカルバミン酸との反応は、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルム
アミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒中で起きる。使用し得る
他の溶媒は、アセトニトリル、アセトン、及びテトラヒ
ドロフランを含むものである。その反応は、周囲の温度
及び圧力下で１２〜２０時間行なわれる。
【００２６】ゲルのジメチルジチオカルバミル誘導体の
還元の結果、ゲルの炭素原子に直接結合しているスルフ
ヒドリル基を有するチオールゲル（式７）を生成する。
還元は、水素化ホウ素ナトリウム、リチウムアルミニウ
ムヒドリド或いは、ジチオナイトナトリウム等の標準の
還元剤を用いて、容易に為され得る。反応は、周囲の温
度及び圧力（常温、常圧）下、６から１２時間の間に行
なわれる。結果として得られるＤＳ−ゲルは、乾燥ゲル
１グラム当り５〜１５マイクロモルのスルフヒドリル基
含量を有する。
還元の結果、ゲルの炭素原子に直接結合しているスルフ
ヒドリル基を有するチオールゲル（式７）を生成する。
還元は、水素化ホウ素ナトリウム、リチウムアルミニウ
ムヒドリド或いは、ジチオナイトナトリウム等の標準の
還元剤を用いて、容易に為され得る。反応は、周囲の温
度及び圧力（常温、常圧）下、６から１２時間の間に行
なわれる。結果として得られるＤＳ−ゲルは、乾燥ゲル
１グラム当り５〜１５マイクロモルのスルフヒドリル基
含量を有する。
【００２７】本発明には含まれないが、チオールゲルを
生成するもう一つのルートは、活性化ゲル（式３）のジ
チオトレイトール（式８）との反応を含み、これにより
ＤＴＴ−ゲル（式９）を生成する。チオールゲルは、重
合体へのチオエーテル結合から４炭素原子鎖によって隔
てられているスルフヒドリル基を有する。活性化ゲルと
ジチオトレイトールとは、重炭酸ナトリウムの様な塩基
或いは、トリエチルアミンやトリブチルアミンなどの第
三アミンの存在下で混合することにより容易に反応す
る。この反応は、周囲の温度及び圧力で、４〜８時間で
完了する。
生成するもう一つのルートは、活性化ゲル（式３）のジ
チオトレイトール（式８）との反応を含み、これにより
ＤＴＴ−ゲル（式９）を生成する。チオールゲルは、重
合体へのチオエーテル結合から４炭素原子鎖によって隔
てられているスルフヒドリル基を有する。活性化ゲルと
ジチオトレイトールとは、重炭酸ナトリウムの様な塩基
或いは、トリエチルアミンやトリブチルアミンなどの第
三アミンの存在下で混合することにより容易に反応す
る。この反応は、周囲の温度及び圧力で、４〜８時間で
完了する。
【００２８】結果として得られるＤＴＴ−ゲルは、ＤＳ
−ゲルと同様、共有クロマトグラフのマトリックスとし
て使用され得る。しかしながら、この使用に進む前に、
未反応の１−メチルピリドキシ活性原子団をＤＳ−ゲル
或いはＤＴＴ−ゲルから除去し、共有クロマトグラフの
主体であるリガンドとの望ましい反応の進行が得られる
様にコントロールすることが重要である。未反応の活性
原子団の除去は、トリス−ＨＣｌ、例えば、０．２Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ９）、エタノールアミン、メルカプ
トエタノール等の反応性リガンド、或いは、チオールゲ
ルのスルフヒドリル基とは反応しない他の適当な反応性
リガンドを用いることにより容易に達成される。
−ゲルと同様、共有クロマトグラフのマトリックスとし
て使用され得る。しかしながら、この使用に進む前に、
未反応の１−メチルピリドキシ活性原子団をＤＳ−ゲル
或いはＤＴＴ−ゲルから除去し、共有クロマトグラフの
主体であるリガンドとの望ましい反応の進行が得られる
様にコントロールすることが重要である。未反応の活性
原子団の除去は、トリス−ＨＣｌ、例えば、０．２Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ９）、エタノールアミン、メルカプ
トエタノール等の反応性リガンド、或いは、チオールゲ
ルのスルフヒドリル基とは反応しない他の適当な反応性
リガンドを用いることにより容易に達成される。
【００２９】チオールゲルは、所望のリガンドをゲルに
結合する役割を果たすチオール−ジスルフィド交換反応
を行う為に活性化される。活性化は、チオールゲルを
２，２′ピリジルジスルフィド（式１０）と反応させる
ことにより最も容易に達成される。反応は、周囲の温度
及び圧力の条件で進行し、１〜３時間で完了する。
結合する役割を果たすチオール−ジスルフィド交換反応
を行う為に活性化される。活性化は、チオールゲルを
２，２′ピリジルジスルフィド（式１０）と反応させる
ことにより最も容易に達成される。反応は、周囲の温度
及び圧力の条件で進行し、１〜３時間で完了する。
【００３０】活性化されたＤＳ−ゲル（第１１式）又
は、活性化されたＤＴＴ−ゲル（第１２式）は、任意の
リガンド（第１図では、フリーなスルフヒドリル基を有
する酵素として示されているが）と反応し、ゲルと酵素
との間にジスルフィド結合を形成する。ＤＳ−ゲルの場
合は、ジスルフィド結合が酵素をゲルの炭素原子に直接
結合させている（第１４式）が、一方、ＤＴＴ−ゲルの
場合、酵素は、イオウ原子によってゲルの炭素原子に結
合している４炭素原子鎖に、ジスルフィド結合している
（式１５）。いずれの場合でも、２−チオピリドン（式
１６）が、活性化されたチオールゲルから置換されてい
る。第１４及び１５式は、固定化された酵素を示す。上
記の方法に従って、他の多くのリガンドが、同様に固定
化され得ることは、評価されるべきである。リガンドの
活性化チオールゲルとの反応は、周囲の温度及び圧力の
条件下、適当に精製された緩衝液で調整されたリガンド
を用いて、容易に行なわれる。反応は２−６時間で完了
する。
は、活性化されたＤＴＴ−ゲル（第１２式）は、任意の
リガンド（第１図では、フリーなスルフヒドリル基を有
する酵素として示されているが）と反応し、ゲルと酵素
との間にジスルフィド結合を形成する。ＤＳ−ゲルの場
合は、ジスルフィド結合が酵素をゲルの炭素原子に直接
結合させている（第１４式）が、一方、ＤＴＴ−ゲルの
場合、酵素は、イオウ原子によってゲルの炭素原子に結
合している４炭素原子鎖に、ジスルフィド結合している
（式１５）。いずれの場合でも、２−チオピリドン（式
１６）が、活性化されたチオールゲルから置換されてい
る。第１４及び１５式は、固定化された酵素を示す。上
記の方法に従って、他の多くのリガンドが、同様に固定
化され得ることは、評価されるべきである。リガンドの
活性化チオールゲルとの反応は、周囲の温度及び圧力の
条件下、適当に精製された緩衝液で調整されたリガンド
を用いて、容易に行なわれる。反応は２−６時間で完了
する。
【００３１】固定化された酵素は、ジステイン、ジチオ
トレイトール、或いはメルカプトエタノール等の還元剤
（式１７）で処理することにより、酵素（式１３）を離
脱する。周囲の温度及び圧力の条件によって酵素は容易
に離脱する。
トレイトール、或いはメルカプトエタノール等の還元剤
（式１７）で処理することにより、酵素（式１３）を離
脱する。周囲の温度及び圧力の条件によって酵素は容易
に離脱する。
【００３２】実施例１ ２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−
スルホネート（ＦＭＰ）による架橋結合アガロースの活
性化 セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂを、ゲ
ルの容積の２０倍の蒸留水、容積比２５：７５、５０：
５０、７５：２５のアセトンと水の混合物、及び１００
％アセトン、最後に、ゲルの容積の１０倍のドライアセ
トンで、順に継続して洗浄した。５０ｇ量の洗浄された
ゲルを、１ｍｌのトリエチルアミンの混合したドライア
セトニトリル５０ｍｌに懸濁し、室温で、激しく攪拌し
た。ゲル懸濁液に、４０ｍｌのドライアセトニトリル及
び１．５ｍｌのドライトリエチルアミンに３ｇのＦＭＰ
を溶解させた溶液を５ｍｌに分けて加えた。１０分後、
ゲルを、ゲルの１０倍容積のアセトンと２ｍＭ ＨＣｌ
との混合物を、容積比で、７５：２５、５０：５０、２
５：７５、そして希釈しない２ｍＭ ＨＣｌを用いて順
次洗浄した。
スルホネート（ＦＭＰ）による架橋結合アガロースの活
性化 セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂを、ゲ
ルの容積の２０倍の蒸留水、容積比２５：７５、５０：
５０、７５：２５のアセトンと水の混合物、及び１００
％アセトン、最後に、ゲルの容積の１０倍のドライアセ
トンで、順に継続して洗浄した。５０ｇ量の洗浄された
ゲルを、１ｍｌのトリエチルアミンの混合したドライア
セトニトリル５０ｍｌに懸濁し、室温で、激しく攪拌し
た。ゲル懸濁液に、４０ｍｌのドライアセトニトリル及
び１．５ｍｌのドライトリエチルアミンに３ｇのＦＭＰ
を溶解させた溶液を５ｍｌに分けて加えた。１０分後、
ゲルを、ゲルの１０倍容積のアセトンと２ｍＭ ＨＣｌ
との混合物を、容積比で、７５：２５、５０：５０、２
５：７５、そして希釈しない２ｍＭ ＨＣｌを用いて順
次洗浄した。
【００３３】参考例１ Ｎ，ε−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リシンの活性
化ゲルへの結合 １００ｍｇ量のＮ，ε−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ
−リシンを０．２ＭＮａＨＣＯ3 ３０ｍｌに溶解した。
この溶液に実施例１の方法に従って得たＦＭＰ−活性化
ゲル５ｇを加えた。その結果得られた懸濁液を室温で１
５時間、振盪した。次にゲルを懸濁液から除去し、５０
０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3 で洗浄し、１００ｍｌ
の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再び懸濁し、室温
で２時間、振盪した。ゲルを５００ｍｌの１Ｍ ＮａＣ
ｌ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ７．５の０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）を洗浄した。
化ゲルへの結合 １００ｍｇ量のＮ，ε−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ
−リシンを０．２ＭＮａＨＣＯ3 ３０ｍｌに溶解した。
この溶液に実施例１の方法に従って得たＦＭＰ−活性化
ゲル５ｇを加えた。その結果得られた懸濁液を室温で１
５時間、振盪した。次にゲルを懸濁液から除去し、５０
０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3 で洗浄し、１００ｍｌ
の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再び懸濁し、室温
で２時間、振盪した。ゲルを５００ｍｌの１Ｍ ＮａＣ
ｌ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ７．５の０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）を洗浄した。
【００３４】参考例２ トブラマイシンの活性化ゲルへの結合 実施例１によって得た、２ｍＭリン酸溶液中で保存した
ＦＭＰ−活性化ゲルをリン酸から除去し、その２０ｍｌ
量を０．２ミリモルのトブラマイシンを含む１０ｍｌの
０．５Ｍ ＮａＨＣＯ3 に加えた。
ＦＭＰ−活性化ゲルをリン酸から除去し、その２０ｍｌ
量を０．２ミリモルのトブラマイシンを含む１０ｍｌの
０．５Ｍ ＮａＨＣＯ3 に加えた。
【００３５】ゲル懸濁液を室温で２４時間、ゆるやかに
振盪した後、５００ｍｌのリン酸緩衝液食塩水（ＰＢ
Ｓ）で洗浄した。洗浄されたゲルを１５分間、０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ中に懸濁し、未反応の活性化ヒドロキシル基
を不活性化した。次にゲルをＰＢＳ５００ｍｌ、１Ｍ
ＮａＣｌ含有ＰＢＳ１０００ｍｌ、そして最後にＰＢＳ
５００ｍｌで洗浄した。
振盪した後、５００ｍｌのリン酸緩衝液食塩水（ＰＢ
Ｓ）で洗浄した。洗浄されたゲルを１５分間、０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ中に懸濁し、未反応の活性化ヒドロキシル基
を不活性化した。次にゲルをＰＢＳ５００ｍｌ、１Ｍ
ＮａＣｌ含有ＰＢＳ１０００ｍｌ、そして最後にＰＢＳ
５００ｍｌで洗浄した。
【００３６】重合体担体のヒドロキシル基の活性の度合
を測定する為に１ｍｌのゲルにつき、マイクロモル単位
で、活性化の密度を測定した。１−メチル−２−ピリド
ンは、求核物質との結合の際に活性化ゲルから離脱する
ので、結合反応が行なわれている溶液の２９７ｎｍに於
ける吸収（吸光度）によって活性化の密度を量的に測定
することが可能である。この波長では、０．２Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９中で、１−メチル−２−ピリドン
は、５９００のモル吸光を有する。活性の密度は、１ｍ
ｌの活性化ゲルを２ｍｌの０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ、ｐＨ９に懸濁し、１０時間室温で、ゆるやかに振盪
することによって測定され得る。結果として得られるゲ
ル懸濁液の遠心の際に２９７ｎｍでの上清の吸収を測定
し、既知濃度の１−メチル−２−ピリドンの溶液の吸収
と比較する。ここに記述した活性化方法を用い、活性密
度４０−７０ｍｉｃｒｏｍｏｌｅｓ／ｍｌのセファロー
ズＣＬ−４Ｂの活性化ゲルが得られた。
を測定する為に１ｍｌのゲルにつき、マイクロモル単位
で、活性化の密度を測定した。１−メチル−２−ピリド
ンは、求核物質との結合の際に活性化ゲルから離脱する
ので、結合反応が行なわれている溶液の２９７ｎｍに於
ける吸収（吸光度）によって活性化の密度を量的に測定
することが可能である。この波長では、０．２Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９中で、１−メチル−２−ピリドン
は、５９００のモル吸光を有する。活性の密度は、１ｍ
ｌの活性化ゲルを２ｍｌの０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ、ｐＨ９に懸濁し、１０時間室温で、ゆるやかに振盪
することによって測定され得る。結果として得られるゲ
ル懸濁液の遠心の際に２９７ｎｍでの上清の吸収を測定
し、既知濃度の１−メチル−２−ピリドンの溶液の吸収
と比較する。ここに記述した活性化方法を用い、活性密
度４０−７０ｍｉｃｒｏｍｏｌｅｓ／ｍｌのセファロー
ズＣＬ−４Ｂの活性化ゲルが得られた。
【００３７】実施例１及び上記参考例によって得られる
結合産物は、親和精製、共有クロマトグラフィー、及び
共有結合による生体分子の可逆的及び不可逆的固定化な
ど、生物学的に活性な材料等のリガンドを重合体担体に
付着させて固定化することが望まれ場合に、様々な応用
が可能である。以下の参考例で、アフィニティークロマ
トグラフィーに於ける結合産物の使用について例示す
る。
結合産物は、親和精製、共有クロマトグラフィー、及び
共有結合による生体分子の可逆的及び不可逆的固定化な
ど、生物学的に活性な材料等のリガンドを重合体担体に
付着させて固定化することが望まれ場合に、様々な応用
が可能である。以下の参考例で、アフィニティークロマ
トグラフィーに於ける結合産物の使用について例示す
る。
【００３８】参考例３ アフィニティ−マトリックスとしてＮ，ε−２，４−ジ
ニトロフェニル−Ｌ−リシン結合セファローズＣＬ−４
Ｂを用いた、２，４−ジニトロフェニルウシ血清アルブ
ミンに対するウサギ抗血清の精製 ２ｍｌ量のウサギ抗−ＤＮＰ血清を遠心に対し、小片を
除去した。その上清を参考例１に従って作製した０．５
×２０ｃｍカラムのＮ，ε−２，４−ジニロフェニル−
Ｌ−リシン結合セファローズＣＬ−４Ｂに流した。抗血
清を流した後、カラムを流出物の２８０ｎｍの吸光度が
０．０２未満になる迄ＰＢＳで充分に洗浄した。そし
て、容積で１０％のテトラヒドロフランを含む０．１Ｍ
のグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を流出液として用い
た。抗体は、グリシン−ＨＣｌ緩衝液を流した後３番目
の５ｍｌ画分に現れた。この実験の結果を図２に示す。
ニトロフェニル−Ｌ−リシン結合セファローズＣＬ−４
Ｂを用いた、２，４−ジニトロフェニルウシ血清アルブ
ミンに対するウサギ抗血清の精製 ２ｍｌ量のウサギ抗−ＤＮＰ血清を遠心に対し、小片を
除去した。その上清を参考例１に従って作製した０．５
×２０ｃｍカラムのＮ，ε−２，４−ジニロフェニル−
Ｌ−リシン結合セファローズＣＬ−４Ｂに流した。抗血
清を流した後、カラムを流出物の２８０ｎｍの吸光度が
０．０２未満になる迄ＰＢＳで充分に洗浄した。そし
て、容積で１０％のテトラヒドロフランを含む０．１Ｍ
のグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を流出液として用い
た。抗体は、グリシン−ＨＣｌ緩衝液を流した後３番目
の５ｍｌ画分に現れた。この実験の結果を図２に示す。
【００３９】参考例４ アフィニティ−マトリックスにトブラマイシン結合セフ
ァローズＣＬ−４Ｂを用いた、ウサギ抗トブラマイシン
血清の親和精製 １ｍｌ量のウサギ抗トブラマイシン血清をＰＢＳで１０
倍に希釈した。希釈した血清を２０００ｒｐｍで３０分
間、遠心に付し、小片を除いた。上清全体を参考例２に
記した様に調製したトブラマイシン結合Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ＣＬ−４Ｂの０．５×２０ｃｍカラムに流した。
流出物の２８０ｎｍでの吸光度が、０．０２未満になる
迄、カラムをＰＢＳで洗浄した。抗体を１０％テトラヒ
ドロフラン含有０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５
と共に７ｍｌ画分に流出させた。結果を図３に示す。
ァローズＣＬ−４Ｂを用いた、ウサギ抗トブラマイシン
血清の親和精製 １ｍｌ量のウサギ抗トブラマイシン血清をＰＢＳで１０
倍に希釈した。希釈した血清を２０００ｒｐｍで３０分
間、遠心に付し、小片を除いた。上清全体を参考例２に
記した様に調製したトブラマイシン結合Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ＣＬ−４Ｂの０．５×２０ｃｍカラムに流した。
流出物の２８０ｎｍでの吸光度が、０．０２未満になる
迄、カラムをＰＢＳで洗浄した。抗体を１０％テトラヒ
ドロフラン含有０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５
と共に７ｍｌ画分に流出させた。結果を図３に示す。
【００４０】上記参考例３及び４に示される通り、実施
例１及び上記参考例の方法に従って得られるリガンド結
合重合体担体は、リガンド結合重合体との間に親和結合
（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｏｎｄ）を形成し得る様々な材
料を精製する為の親和吸収材として有用である。例え
ば、リガンド結合重合体は、抗体の精製に使用し得、そ
の場合、アフィニティーマトリックスに吸収された抗体
をマトリックスから、リガンドを漏らすことなく流出さ
せることが可能である。リガンド結合マトリックスはま
た、保存中に於けるその安定性でも特徴づけられる。例
えば、Ｎ，ε−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リシン
結合セファローズＣＬ−４Ｂは、リン酸緩衝液食塩水
中、４℃で、リガンド結合マトリックスからのリガンド
の漏出なくして、保存される。
例１及び上記参考例の方法に従って得られるリガンド結
合重合体担体は、リガンド結合重合体との間に親和結合
（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｏｎｄ）を形成し得る様々な材
料を精製する為の親和吸収材として有用である。例え
ば、リガンド結合重合体は、抗体の精製に使用し得、そ
の場合、アフィニティーマトリックスに吸収された抗体
をマトリックスから、リガンドを漏らすことなく流出さ
せることが可能である。リガンド結合マトリックスはま
た、保存中に於けるその安定性でも特徴づけられる。例
えば、Ｎ，ε−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リシン
結合セファローズＣＬ−４Ｂは、リン酸緩衝液食塩水
中、４℃で、リガンド結合マトリックスからのリガンド
の漏出なくして、保存される。
【００４１】上述した様に、実施例１及び上記参考例の
結合方法の重要な利点は、結合した物質、すなわち、リ
ガンドが重合体担体の炭素原子に直接共有結合し、加水
分解による分裂を不可能にする点である。更には、先行
技術の結合方法の幾つかに於いてそうである様に、結合
反応の間に付加的な電荷が導入されることはない。担体
材料の交差結合は、従来可能な結合方法に於いてよくあ
る、また、望ましくない副作用であるが、本発明の結合
方法によれば、それを避けることができる。
結合方法の重要な利点は、結合した物質、すなわち、リ
ガンドが重合体担体の炭素原子に直接共有結合し、加水
分解による分裂を不可能にする点である。更には、先行
技術の結合方法の幾つかに於いてそうである様に、結合
反応の間に付加的な電荷が導入されることはない。担体
材料の交差結合は、従来可能な結合方法に於いてよくあ
る、また、望ましくない副作用であるが、本発明の結合
方法によれば、それを避けることができる。
【００４２】実施例２ チオールゲルの作製 ジメチルジチオカルバメート法（ＤＳ−ゲル） 実施例１の乾燥活性化ゲル１ｇのサンプルを１００ｍｌ
の乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄
し、１．８ｇジメチルジチオカルバミン酸ナトリウム含
有ＤＭＦ１００ｍｌに加えた。そのゲル懸濁液を室温で
１６時間、振盪した。そして１００ｍｌのドライＤＭＦ
で洗浄し、５０ｍｌの乾燥ＤＭＦに再び懸濁した。懸濁
液に、水素化ホウ素ナトリウムを加えた。懸濁液を室温
で、更に４時間、振盪し、２００ｍｌ ＤＭＦ、１００
０ｍｌ ２ｍＭ ＨＣｌ、５００ｍｌ ０．５Ｎ Ｎａ
Ｃｌ、及び５００ｍｌ ２ｍＭ ＨＣｌで、ゲルを洗浄
した。チオールゲルのスルフヒドリル含量を、ジー・エ
ル・エルマン（Ｇ．Ｌ．Ｅｌｌｍａｎ）、Ａｒｃｈ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，８２：７０−７７（１
９５９）に記載の通り、５，５′−ジチオビス（２−ニ
トロ安息香酸）によって測定した結果、乾燥ゲル１ｇに
対し、９マイクロモルであった。
の乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄
し、１．８ｇジメチルジチオカルバミン酸ナトリウム含
有ＤＭＦ１００ｍｌに加えた。そのゲル懸濁液を室温で
１６時間、振盪した。そして１００ｍｌのドライＤＭＦ
で洗浄し、５０ｍｌの乾燥ＤＭＦに再び懸濁した。懸濁
液に、水素化ホウ素ナトリウムを加えた。懸濁液を室温
で、更に４時間、振盪し、２００ｍｌ ＤＭＦ、１００
０ｍｌ ２ｍＭ ＨＣｌ、５００ｍｌ ０．５Ｎ Ｎａ
Ｃｌ、及び５００ｍｌ ２ｍＭ ＨＣｌで、ゲルを洗浄
した。チオールゲルのスルフヒドリル含量を、ジー・エ
ル・エルマン（Ｇ．Ｌ．Ｅｌｌｍａｎ）、Ａｒｃｈ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，８２：７０−７７（１
９５９）に記載の通り、５，５′−ジチオビス（２−ニ
トロ安息香酸）によって測定した結果、乾燥ゲル１ｇに
対し、９マイクロモルであった。
【００４３】参考例５ チオールゲルの作製 ジチオトレイトール法（ＤＴＴ−ゲル） 実施例１の乾燥活性化ゲル１ｇを０．２Ｍ ＮａＨＣＯ
3 に１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）を溶解し、攪拌
した溶液に加えた。この懸濁液を室温で５時間、振盪し
た。次にゲルを５００ｍｌ ０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3 、
５００ｍｌ蒸留水、及び１０００ｍｌ ２ｍＭ ＨＣｌ
で、洗浄した。スルフヒドリル含量は、１ｇの乾燥ゲル
につき、６マイクロモルであった。
3 に１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）を溶解し、攪拌
した溶液に加えた。この懸濁液を室温で５時間、振盪し
た。次にゲルを５００ｍｌ ０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3 、
５００ｍｌ蒸留水、及び１０００ｍｌ ２ｍＭ ＨＣｌ
で、洗浄した。スルフヒドリル含量は、１ｇの乾燥ゲル
につき、６マイクロモルであった。
【００４４】実施例３ 活性化チオールゲルの作製 実施例２のＤＳ−ゲル又は参考例５のＤＴＴ−ゲルをエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中の６０％アセトン
−４０％０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ3 １ｍＭで洗浄した。
洗浄されたゲルは、０．３Ｍ ２，２′−ジピリジルジ
スルフィドと反応させた。
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中の６０％アセトン
−４０％０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ3 １ｍＭで洗浄した。
洗浄されたゲルは、０．３Ｍ ２，２′−ジピリジルジ
スルフィドと反応させた。
【００４５】参考例６ ウレアーゼの共有クロマトグラフィーによる精製 １ｇ量の部分精製したタチナタマメウレアーゼを、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及び５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）
を含む４０ｍｌ ０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
４に加えた。結果として得られる懸濁液を４℃で１時
間、攪拌し、遠心分離で小片を含む画分を除去した。５
ｍｌの曇った上清を０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．０
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化したセフ
ァーデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０Ｃ １×５
０ｃｍカラムに通した。こうした処理によって存在する
全てのジチオトレイトールが除去され、次の共有クロマ
トグラフィーの段階での邪魔を防ぐことができる。
Ｍ ＥＤＴＡ及び５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）
を含む４０ｍｌ ０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
４に加えた。結果として得られる懸濁液を４℃で１時
間、攪拌し、遠心分離で小片を含む画分を除去した。５
ｍｌの曇った上清を０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．０
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化したセフ
ァーデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０Ｃ １×５
０ｃｍカラムに通した。こうした処理によって存在する
全てのジチオトレイトールが除去され、次の共有クロマ
トグラフィーの段階での邪魔を防ぐことができる。
【００４６】ＤＴＴを除いた５ｍｌの流出物を実施例３
の活性化ＤＳ−ゲルの０．５×２０ｃｍカラムに流し
た。次にカラムを流出物の２８０ｎｍでの吸光度が０．
１未満になる迄、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．０５
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗い、そして、０．０
５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５Ｍ ＮａＣｌを含む０．
０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で、吸収が０．０２
未満になる迄洗浄した。酵素ウレアーゼは、０．０５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及び２０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）を含有する０．０５ｍＭトリス−ＨＣｌによってカ
ラムから流出した。ウレアーゼ活性は、グルタミックデ
ヒドロゲナーゼ連結反応により、ＮＡＤＨの３４０ｎｍ
吸収の消失率を測定して分析された。使用した基質の溶
液は、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４：０．５
ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＡＤＰ；１ｍＭアルファーケ
トグルタレート；５０ｍＭ尿素及び５０Ｕグルタミック
デヒドロゲナーゼを含有していた。アッセイは、２ｍｌ
の基質溶液に５〜１０マイクロリットルの酵素溶液を加
えることにより開始される。ウレアーゼのカラムへの固
定化及びカラムからの流出の結果を図５に示す。図５の
実線から、ＵＶ吸収物質のほとんどが、遅滞無くカラム
を通過することがわかる。これらの物質は、最初の１１
画分に流出していた。高濃度のＮａＣｌを含有する緩衝
液を流すと、第１５〜２０画分に少量のＵＶ吸収物質が
更に流出した。破線は、ウレアーゼ活性を示し、ＤＴＴ
がカラムに流される迄、ウレアーゼ活性は検出されなか
ったことを示す。曲線に示される通り、ＤＴＴが流され
た後、（第２４画分から開始）第２９−３３画分に強い
ＵＶ吸収物質が流出していた。ＤＴＴを加えると酵素だ
けでなく、２−チオピリドンも離脱し、それも２８０ｎ
ｍで強い吸収を示す。ＵＶ吸収物質のほとんど（９０％
近く）は２−チオピリドンで構成されているということ
は、これらの画分を０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ中の０．
０５ｍＭ ＥＤＴＡ２０００ｍｌに対して透析を行な
い、それらのＵＶ吸収に於いて、３４倍の縮少となった
ことから確実とされた。ウレアーゼ活性は、ＵＶ吸収の
増加と同時に増加した。酵素溶液を単独で、活性化チオ
ールゲルに通した結果、酵素全体の８３％が、１１倍の
精製率で回収された。精製された酵素は、７７０単位／
ｍｇの特異的活性を有することがわかった。実施例３の
活性化ＤＴＴ−ゲルを用いても類似の結果が得られる。
の活性化ＤＳ−ゲルの０．５×２０ｃｍカラムに流し
た。次にカラムを流出物の２８０ｎｍでの吸光度が０．
１未満になる迄、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．０５
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗い、そして、０．０
５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５Ｍ ＮａＣｌを含む０．
０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で、吸収が０．０２
未満になる迄洗浄した。酵素ウレアーゼは、０．０５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及び２０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）を含有する０．０５ｍＭトリス−ＨＣｌによってカ
ラムから流出した。ウレアーゼ活性は、グルタミックデ
ヒドロゲナーゼ連結反応により、ＮＡＤＨの３４０ｎｍ
吸収の消失率を測定して分析された。使用した基質の溶
液は、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４：０．５
ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＡＤＰ；１ｍＭアルファーケ
トグルタレート；５０ｍＭ尿素及び５０Ｕグルタミック
デヒドロゲナーゼを含有していた。アッセイは、２ｍｌ
の基質溶液に５〜１０マイクロリットルの酵素溶液を加
えることにより開始される。ウレアーゼのカラムへの固
定化及びカラムからの流出の結果を図５に示す。図５の
実線から、ＵＶ吸収物質のほとんどが、遅滞無くカラム
を通過することがわかる。これらの物質は、最初の１１
画分に流出していた。高濃度のＮａＣｌを含有する緩衝
液を流すと、第１５〜２０画分に少量のＵＶ吸収物質が
更に流出した。破線は、ウレアーゼ活性を示し、ＤＴＴ
がカラムに流される迄、ウレアーゼ活性は検出されなか
ったことを示す。曲線に示される通り、ＤＴＴが流され
た後、（第２４画分から開始）第２９−３３画分に強い
ＵＶ吸収物質が流出していた。ＤＴＴを加えると酵素だ
けでなく、２−チオピリドンも離脱し、それも２８０ｎ
ｍで強い吸収を示す。ＵＶ吸収物質のほとんど（９０％
近く）は２−チオピリドンで構成されているということ
は、これらの画分を０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ中の０．
０５ｍＭ ＥＤＴＡ２０００ｍｌに対して透析を行な
い、それらのＵＶ吸収に於いて、３４倍の縮少となった
ことから確実とされた。ウレアーゼ活性は、ＵＶ吸収の
増加と同時に増加した。酵素溶液を単独で、活性化チオ
ールゲルに通した結果、酵素全体の８３％が、１１倍の
精製率で回収された。精製された酵素は、７７０単位／
ｍｇの特異的活性を有することがわかった。実施例３の
活性化ＤＴＴ−ゲルを用いても類似の結果が得られる。
【００４７】次の実施例では、本発明の活性化チオール
ゲルにジスルフィドブリッヂで結合した共有結合による
生物学的活性物質の可逆的な固定化について例示する。
生物学的活性物質を使用に便利な形態で提供する目的で
あれば、そうした物質の固定化については、その生物学
的活性物質の活性に本質的に関わらないスルフヒドリル
基を利用してジスルフィド結合を形成すべきであること
を指摘しなければならない。
ゲルにジスルフィドブリッヂで結合した共有結合による
生物学的活性物質の可逆的な固定化について例示する。
生物学的活性物質を使用に便利な形態で提供する目的で
あれば、そうした物質の固定化については、その生物学
的活性物質の活性に本質的に関わらないスルフヒドリル
基を利用してジスルフィド結合を形成すべきであること
を指摘しなければならない。
【００４８】参考例７ ベータガラクトシダーゼの可逆的固定化 大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ベータ−ガラクトシダーゼ５ｍ
ｇを１０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に溶解させた。その酵素
溶液に実施例８の方法に従って作製した水分を含む活性
化ＤＴＴ−ゲル２．５ｇを加えた。得られた懸濁液を室
温で攪拌した。ある間隔をおいて、０．１ｍｌのゲル懸
濁液を取り出して、２５００ｒｐｍで１分間、遠心分離
に付した。その上清をリン酸緩衝液で５０倍に希釈し、
０．２５ｍｌの希釈上清について、２ｍｌ ｏ−ニトロ
フェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液中、ベ
ータ−ガラクトシダーゼのアッセイを行った。室温で４
時間インキュベートした後、充分な活性を有するベータ
ーガラクトシダーゼの固定化が全て実現した。その時、
０．０５Ｍリン酸塩、ｐＨ７．７中の２０ｍＭ ＤＴＴ
を固定化された酵素と混合してサンプルを取り出し、ベ
ーターガラクトシダーゼについてアッセイを行なった。
図６に示される通り、ベーターガラクトシダーゼ活性
は、反応８時間で酵素が全て回収される迄増大した。
ｇを１０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に溶解させた。その酵素
溶液に実施例８の方法に従って作製した水分を含む活性
化ＤＴＴ−ゲル２．５ｇを加えた。得られた懸濁液を室
温で攪拌した。ある間隔をおいて、０．１ｍｌのゲル懸
濁液を取り出して、２５００ｒｐｍで１分間、遠心分離
に付した。その上清をリン酸緩衝液で５０倍に希釈し、
０．２５ｍｌの希釈上清について、２ｍｌ ｏ−ニトロ
フェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液中、ベ
ータ−ガラクトシダーゼのアッセイを行った。室温で４
時間インキュベートした後、充分な活性を有するベータ
ーガラクトシダーゼの固定化が全て実現した。その時、
０．０５Ｍリン酸塩、ｐＨ７．７中の２０ｍＭ ＤＴＴ
を固定化された酵素と混合してサンプルを取り出し、ベ
ーターガラクトシダーゼについてアッセイを行なった。
図６に示される通り、ベーターガラクトシダーゼ活性
は、反応８時間で酵素が全て回収される迄増大した。
【００４９】本発明に関する上の記述は、説明及び例示
を目的として特に望ましい具体化の記述に向けられたも
のである。しかしこの技術の分野に精通する者ならば、
本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく、方法や材
料について多くの改良、改変が為され得ることは、明ら
かであろう。例えば、他のヒドロキシル含有重合体担体
及び他のリガンドが使用されるかもしれない。ここに記
された特定のアフィニティーシステムは、便宜上選択さ
れたものであり、限定を意図したものではない。出願人
は、特許請求の範囲が、そういったすべての均等な改良
物やバリエーションをカバーするものであり、それら
は、本発明の真の範囲及び主旨に含まれることを意図し
ている。
を目的として特に望ましい具体化の記述に向けられたも
のである。しかしこの技術の分野に精通する者ならば、
本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく、方法や材
料について多くの改良、改変が為され得ることは、明ら
かであろう。例えば、他のヒドロキシル含有重合体担体
及び他のリガンドが使用されるかもしれない。ここに記
された特定のアフィニティーシステムは、便宜上選択さ
れたものであり、限定を意図したものではない。出願人
は、特許請求の範囲が、そういったすべての均等な改良
物やバリエーションをカバーするものであり、それら
は、本発明の真の範囲及び主旨に含まれることを意図し
ている。
【図１】本発明による活性化重合体の製造方法の一部の
工程を示す概略模式図である。
工程を示す概略模式図である。
【図２】アフィニティーマトリックスとして２，４−Ｄ
ＮＰ−リシン結合セファローズＣＬ−４Ｂを用いた２，
４−ジニトロフェニルウシ血清アルブミンに対するウサ
ギ抗血清のアフィニティー精製を示す流出曲線である。
ＮＰ−リシン結合セファローズＣＬ−４Ｂを用いた２，
４−ジニトロフェニルウシ血清アルブミンに対するウサ
ギ抗血清のアフィニティー精製を示す流出曲線である。
【図３】トブラマイシン結合セファローズＣＬ−４Ｂを
アフィニティーマトリックスとして用いたウサギ抗トブ
ラマイシン血清のアフィニティー精製を示す流出曲線で
ある。
アフィニティーマトリックスとして用いたウサギ抗トブ
ラマイシン血清のアフィニティー精製を示す流出曲線で
ある。
【図４】チオールゲルの種々の製造ルートを示す概略模
式図である。
式図である。
【図５】共有クロマトグラフィーによるタチナタマメウ
レアーゼの精製中に生じた流出物の色々な画分の吸収を
示す流出曲線である。
レアーゼの精製中に生じた流出物の色々な画分の吸収を
示す流出曲線である。
【図６】大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼの２，２′−
ジチオジピリジル活性化チオール（ＤＴＴ）ゲルへの固
定化の進行及び、ジチオトレイトール付加による逆反応
の反応曲線である。
ジチオジピリジル活性化チオール（ＤＴＴ）ゲルへの固
定化の進行及び、ジチオトレイトール付加による逆反応
の反応曲線である。
Claims (3)
- 【請求項１】 少なくとも１つ以上のスルフヒドリルで
置換された重合体を２，２−ジピリジルジスルフィドと
反応させることから成る、２−ピリジルジスルフィドで
置換された重合体を製造する方法。 - 【請求項２】 少なくとも１つ以上のジメチルジチオカ
ルバミルで置換された重合体を還元して、このジメチル
ジチオカルバミル基をスルフヒドリル基に転化し、得ら
れたスルフヒドリルで置換された重合体を２，２−ジピ
リジルジスルフィドと反応させることから成る、２−ピ
リジルジスルフィドで置換された重合体を製造する方
法。 - 【請求項３】 重合体の炭素原子に結合した少なくとも
１つ以上のヒドロキシ基を含有する重合体に２−フルオ
ロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネー
トを反応させ、前記重合体のヒドロキシ基の少なくとも
１つ以上が１−メチル−２−ピリドキシ基に転化した生
成物を得、この生成物にジメチルジチオカルバミン酸塩
を反応させ、得られるジメチルジチオカルバミルで置換
された重合体を還元してこのジメチルジチオカルバミル
基をスルフヒドリル基に転化し、得られたスルフヒドリ
ルで置換された重合体を２，２−ジピリジルジスルフィ
ドと反応させることから成る、２−ピリジルジスルフィ
ドで置換された重合体を製造する方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67916784A | 1984-12-07 | 1984-12-07 | |
| US679167 | 1984-12-07 | ||
| US06/679,525 US4582875A (en) | 1984-12-07 | 1984-12-07 | Method of activating hydroxyl groups of a polymeric carrier using 2-fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate |
| US679525 | 1984-12-07 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27484185A Division JPH074240B2 (ja) | 1984-12-07 | 1985-12-06 | 重合体担体の活性化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06340707A JPH06340707A (ja) | 1994-12-13 |
| JPH0747602B2 true JPH0747602B2 (ja) | 1995-05-24 |
Family
ID=27102167
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27484185A Expired - Lifetime JPH074240B2 (ja) | 1984-12-07 | 1985-12-06 | 重合体担体の活性化方法 |
| JP28959893A Expired - Lifetime JPH0747602B2 (ja) | 1984-12-07 | 1993-11-18 | 重合体担体の活性化方法 |
| JP5289599A Expired - Fee Related JPH0747603B2 (ja) | 1984-12-07 | 1993-11-18 | 重合体担体の活性化方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27484185A Expired - Lifetime JPH074240B2 (ja) | 1984-12-07 | 1985-12-06 | 重合体担体の活性化方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5289599A Expired - Fee Related JPH0747603B2 (ja) | 1984-12-07 | 1993-11-18 | 重合体担体の活性化方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0184361B1 (ja) |
| JP (3) | JPH074240B2 (ja) |
| AU (1) | AU581947B2 (ja) |
| CA (1) | CA1239357A (ja) |
| DE (1) | DE3581069D1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4753983A (en) * | 1986-05-07 | 1988-06-28 | Bioprobe International, Inc. | Polymeric matrix for affinity chromatography and immobilization of ligands |
| GB2267502B (en) * | 1992-05-28 | 1997-01-22 | Aligena Ag | Polymeric reaction products for use in immobilized buffered gels and membranes |
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