JP2528486B2 - アフィニティ―クロマトグラフィ―・マトリックスの製造方法 - Google Patents

アフィニティ―クロマトグラフィ―・マトリックスの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアフィニティークロマトグラフィーに係わ
り、特にアフィニティークロマトグラフィーにおいてリ
ガントを固定化するために有用なマトリックス（基質）
に関する。
〔従来の技術〕
種々の生物学的に活性な物質を容易に精製する必要性
について長い間求められてきた。例えば酵素精製におけ
る初期の方法は面倒であり、かつ長時間を要するもので
あった。ところが、最近、生物学的に活性な物質（本明
細書中、リガンドと呼ぶ）を適当な重合体マトリックス
上に固定化し、ついで、この固定化されたリガンドをそ
の混合物中から単離することからなる生物学的活性物質
の精製法が見出された。このリガンドはその固定化され
た形でも使用することができるが、所望により適当な化
学的処理により固定化されているマトリックスからリガ
ンドを開放し、非固定化の状態で使用することもでき
る。このようにリガンドを重合体マトリックスに共有結
合的に固定する方法の発見は酵素学、免疫学および他の
種々の生物学的技法の実行を前進させた。
生物学的リガンドを固定化する最初の方法の一つとし
て水酸基を有するポリマーを臭化シアン（CNBr）等の活
性化剤で処理することがおこなわれた。この活性化され
たポリマーは、ついで種々の生物学的リガンドを共有結
合により直接的に結合するのに用いられた。ポラス（Po
rath）等は文献、「Methods in Enzymology」，“固定
化酵素",K.Mosbach,Ed.,Vol.,44,第19−45頁、アカディ
ミック・プレス（Acadimic Press）ニューヨーク、米国
（1976）に、上記のCNBr法を含め、いくつかの化学的活
性法を提示している。
水酸基を有するポリマーを活性化する初期の方法の殆
んどは広範な使用に適していなかった。特に、CNBr活性
化法は次のような欠点を有するものであった。即ち、
（１）CNBr活性化水酸基含有ポリマーと、この活性化ポ
リマーと反応するリガンドのアミノ基との間に形成され
た結合は不安定である； （２）この活性化ポリマーとリガンドとの間の反応はし
ばしば親和性吸着における反応生成物の利用を妨害する
荷電された種の導入をともなう； （３）CNBrは有害な催涙性を示す有毒化学物質であり、
その取扱いに特別の注意を要する。
水酸基を有するポリマーにリガンドを結合させるた
め、上記のCNBr法以外の方法を見出すための努力がなさ
れ、その結果、三塩化トリアジン、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド、1,1−カルボニルジイミダゾールおよび或
る種のエポキシ化合物などの多くの異なった試薬の使用
が提案されている。２−フルオロ−１−メチルピリジニ
ウムトルエン−４−スルホネート（FMP）との反応によ
り活性化された水酸基含有ポリマーを用いた共有結合ク
ロマトグラフィー・マトリックスの製造方法が米国特許
No.4,582,875に開示されている。しかし、例えばアミノ
基、チオール基、又はヒドロキシアリール基を有する生
物学的活性物質を直接、重合体物質に共有結合により結
合させると、立体性に問題が生じ、共有結合された物質
の生物学的活性に悪影響を与える。
ポリマー表面とリガンドとの間に配合させることがで
きるスペーサ、即ち有機化合物はポリマーマトリックス
に対して接近して結合されたリガンドに基づく立体妨害
を解消するのに役立つ。これを目的として直鎖型スペー
サおよび分岐型スペーサの双方を用いることができる。
文献、「固定化酵素およびタンパク質の生物医学的応用
（Biomedical Applications of Immobilized Enzymes a
nd Proteins）」“分析におけるナイロンチューブに付
着した酵素の電位",Vol.2,T.M.S.Chang,Ed.,第317−340
頁,Plenum Press,ニューヨーク，米国（1977）にはポリ
リジン・スペーサの使用が説明されている。（第323頁
参照）。
文献、「タンパク質および酵素の生物工学的応用（Bi
otechnological Applications of Proteins and Enzyme
s）」，“分析における固定化酵素の応用",Z.Bohakおよ
びN.Sharon,Ed.,第267−278頁,Acadimic Press,ニュー
ヨーク，米国（1977）には酵素の共有結合による付着の
ため、ペクチンアミン、即ち1,3−ジアミノプロパン−
２−オールおよびペクチンから誘導されるポリアミンの
使用が開示されている（第271頁参照）。
米国特許No.4,152,411にはマーク付き脊椎診断具、例
えばチロキシン、ポリ−１−リジンおよびわさびペルオ
キシダーゼを含むものの製造および使用が開示されてい
る。
スペーサ・アームの概念が文献、ケミカル・エンジニ
アリング・ニュース（Chem.Eng.News.）,1985年８月26
日，第17−32頁、“アフィニティー・クロマトグラフィ
ー”に論ぜられている。この文献において、短かいアル
キル鎖のスペーサ・アーム、例えばヘキサメチレンジア
ミン、およびリジンとアラニンとの枝分れコポリマーを
多官能性アンカー剤スペーサとして使用することが開示
されている。
〔発明が解決しようとする問題点） 本発明は広範な有機質リガンドに対し使用することが
できるクロマトグラフィー・マトリックスを提供するこ
とを主目的とする。
さらに本発明はスペーサを有するアフィニティークロ
マトグラフィ・マトリックスを提供することを目的とす
る。
さらに本発明は生物学的活性に悪影響を及ぼすおそれ
がないクロマトグラフィー感応性生物学的物質について
の手段を提供することを目的とする。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明はアフィニティークロマトグラフィーおよびリ
ガンド固定化に有用なマトリックスおよびその製造方法
を提供するものであって、生物学的に不活性の重合体ス
ペーサを用いることを特徴とする。この用いられるスペ
ーサはポリエチレンイミンである。本発明のマトリック
スは、水酸基を有するポリマーを２−フルオロ−１−メ
チルピリジニウムトルエン−４−スルホネート（FMP）
と反応させて、このポリマー中の水酸基の少なくともい
くつかが置換されて１−メチル−２−ピリドキシトルエ
ン−４−スルホネート基を形成した活性化ポリマーを生
成させる工程と、この１−メチル−２−ピリドキシ置換
ポリマーをポリエチレンイミンと反応させて、このポリ
マー中の１−メチル−２−ピリドキシ基の少なくともい
くつかがポリエチレンイミンにより置換されたアフィニ
ティークロマトグラフィー・マトリックスを生成させる
工程とを含む方法により製造することができる。
〔実施例〕
本発明は広範囲の有機質リガンド、例えば酵素、核タ
ンパク質、抗原、抗体、ハプチン、ホルモン、ビタミ
ン、ポリペプチド、その他の生物学的に活性な化合物を
固定化又は共有結合的にクロマトグラフィー分離する手
段を提供する。生物学的活性を有するリガンドは通常の
環境下ではクロマトグラフィー・マトリックスとの立体
的相互反応により生物学的活性が損失され易い。ポリエ
チレンイミンスペーサの使用により、そのような損失を
防止することができる。ポリエチレンイミンと反応し得
る求電子基を有するリガンドはこの方法により容易にク
ロマトグラフィー分離することができる。このようなリ
ガンドの例としてはアシル化剤、例えばカルボン酸、ハ
ロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド、Ｐ−ニトロベンゾエートの如き活性
エステル、イミドエステル、アルデヒド、エポキシド、
チオエポキシド、ジビニルスホネート等である。対象の
リガンドが求電子基を有していない場合、又は問題の基
そのものがリガンドの生物学的活性に関与する場合、例
えば、そのような基が酵素の活性部位又はその近傍にあ
る場合は、ポリエチレンイミンスペーサを誘導してリガ
ンドがその生物化学的活性に悪影響を受けることなく反
応し得る官能基を形成させるようにすることが望まし
い。
以下、本発明を第１図および第２図を参照して説明す
る。これら図には全体の反応課程における種々の工程が
示されている。
本発明の方法の最初の工程は少なくとも１個の反応性
水酸基を有するポリマー（構造式１）を２−フルオロ−
１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネート
（構造式２）と第１図に示すように反応させることであ
る。
反応性水酸基を少なくとも１個有するものであれば種
々の重合体物質を用いることができよう。そのうち、有
用な主なポリマーとしては多糖類、例えばセルロース
（紙など）；デキストランおよび架橋化デキストラン；
アガロースおよび架橋化アガロースである。他の有用な
重合体物質の例としては天然、半合成および合成物質で
あって水酸基を有するものである。例えば、ポリエチレ
ングリコール；ポリビニルアルコール例えばFRACTOGELT
SK（商標、親水性ビニルポリマーから合成された多孔半
硬質球状グルであって、C,HおよびＯ原子のみから構成
されているもの、E.Merk社（西独）製）；ポリアクリレ
ート（例えばポリヒドロキシメチルメチルアクリレー
ト）又はTRISACRYL GF 2000（商標、Ｎ−アクリロイル
−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−1,3−プロパン
ジオール、Reactifs IBF社（フランス）製）；およびグ
リコファーゼガラスおよびシリカの粒体であって、炭素
原子に結合された水酸基を少なくとも１個有する基を結
合してなるものである。以下、このようなポリマーをゲ
ルとも呼ぶ。このポリマーは必要に応じ、ビーズ状、そ
の他任意の形状で提供することができる。
FMP以外に他の２−ハロ−１−メチルピリジニウム塩
として、例えば２−クロロ−１−メチルピリジニウム塩
として用いることもできる。しかし、２−フルオロ−１
−メチルピリジニウム塩が活性の大きいことから好まし
い。
水酸基含有ポリマーと、FMP又は他の２−ハロ−１−
メチルピリジニウム塩との間の反応は水性溶液又は極性
有機溶媒、例えばアセトニトリル、アセトン、ジメチル
ホルムアミド又はテトラヒドロフラン中で、第３アミン
（例えばトリエチルアミン（TEA）又はトリブチルアミ
ン（TBA）等の塩基が存在下でおこなうことができる。
常温、常圧のゆるやかな条件下で、水酸基含有ポリマー
とFMPとの間の反応は急激かつ円滑におこなうことがで
き、約１ないし15分間で終了する。その結果得られる２
−アルコキシ−１−メチルピリジニウム塩（構造式３）
は以下、活性化ポリマー又は活性化ゲルとも呼ぶ。この
活性化ポリマーは求核試薬、例えばポリエチレンイミン
（構造式４）により容易に攻撃される。なぜならば、こ
の１−メチル−２−ピリドキシ基は良好な脱離基であ
り、求核置換により容易に１−メチル−２−ピリドン
（構造式 ）に変換されるからである。
２−アルコキシ−１−メチルピリジニウム塩（構造式
３）とポリエチレンイミン（構造式４）との反応は第１
図に説明されている。ポリエチレンイミンは分子量が約
1,000ないし20,000の範囲のものを使用することができ
る。しかし、分子量約1,000ないし20,000の範囲のもの
が好ましい。ポリエチレンイミンはその分岐度に関して
も種々異なる。分岐度が増えれば反応に供し得るアミノ
基の数も増える。構造式４および５においては分岐が１
個の場合のみが示されている。反応は適当な極性有機溶
媒、例えばアセトニトリル、アセトン又はテトラヒドロ
フラン中でおこなわれる。得られる反応生成物は末端ア
ミノ基を有する（本明細書で、これをアミノ−末端ゲル
とも呼ぶ）。
対象となるリガンドがアミノ−末端ゲルのアミノ基と
反応し得る求電子基を有する場合、非修飾アミノ−末端
ゲルがそのような求電子リガンドのためのアフィニティ
−クロマトグラフィー・マトリックスとして役立つ。他
方、対象となるリガンドがポリエチレンイミンのアミノ
基と容易に反応する基を有しない場合、例えばリガンド
自身が反応性アミノ基を有する場合は、アミノ−末端ゲ
ルを適当な誘導化剤又は求電子リガンドと反応させて誘
導化し、上記ゲルに、第２図に示す如く、対象となるリ
ガンドの活性官能基と容易に反応し得る基を与えること
が好ましい。
例えば、アミノ−末端ゲルは硫化エチレン（構造式
７）との反応により容易にチオールゲル（構造式８）に
変換させることができる。このチオールゲルは2,2−ジ
チオピリジン（構造式13）との反応により活性化され、
活性化チオールゲル（構造式14）となり、これはスルフ
ヒドリル含有リガンド、例えばスルフヒドリル含有酵素
についてのクロマトグラフィー・マトリックスとして用
いることができる。アミノ−末端ゲルをアラルキルカル
ボン酸（構造式９）と反応させてフェニル−末端ゲル
（構造式10）に変換すること、又はアミノ−末端ゲルを
適当な無水物、例えば無水コハク酸（構造式11）と反応
させてカルボキシ−末端ゲル（構造式12）に変換するこ
とも容易におこなうことができる。これら又はその他の
誘導化アミノ−末端ゲルは適当なリガンドについてのア
フィニティークロマトグラフィー・マトリックスとして
使用することができる。
構造式8,10および12においては、誘導化剤との反応が
構造式５に示すアミノ−末端ゲル第１アミノ基において
生起する例について記載されている。しかし、アミノ−
末端ゲルと誘導化剤との反応は存在し得る如何なる第２
又は第３アミノ基においても生起し得る。
以下、具体的な実施例について説明するが、これらは
本発明の範囲を限定することを意図するものでないこと
を理解されるべきである。
実施例１ 水性溶液中で２−フルオロ−１−メチルピリジニウムト
ルエン−４−スルホネート（FMP）によるセファロース
（SEPHAROSE）CL−4Bの活性化 セファロースCL−4B（架橋化アガロースゲル、Pharma
cia Fine Chemicals社、スウェーデン国）5mlを200mlの
蒸留水で５回洗った。この洗ったゲルを1.2ミリモルの
４−ジメチルアミノピリジンを含む蒸留水5ml中に懸濁
させた。このゲル懸濁液を室温で５分間撹拌した。この
懸濁液にFMPを1.0ミリモル加えた。このゲル溶液をさら
に15分間連続的に撹拌したのち、200mlの蒸留水で５回
洗い、1M NaCl 200mlで５回、さらに蒸留水200mlで５回
洗った。
実施例２ アセトン中での２−フルオロ−１−メチルピリジニウム
トルエン−４−スルホネート（FMP）を用いたTRISACRYL
GF2000ゲルの活性化 FMPによる活性化に先立ち、TRISACRYL GF 2000ゲル
（1200ml）を、1600mlの蒸留水で５回、1600mlのエチル
アルコールで３回、1600mlの乾燥アセトンで１回、連続
的に洗滌した。ついで、真空過によい過剰のアセトン
を除去したのち、そのゲルを1600mlの乾燥アセトン中に
懸濁させ、10分間撹拌した。このゲルを1600mlの乾燥ア
セトンで再度洗滌したのち、質空過により過剰の溶媒
を除去した。次に、この乾燥ゲルを最初に80℃に加熱さ
れた乾燥用オーブンに５時間収容し、ついで80℃に加熱
された真空オーブン中に14時間放置した。そののち、こ
の乾燥ゲルを2.6mlの乾燥トリエチルアミン（TEA）を含
有する乾燥アセトン500ml中に懸濁させ、50gのFMPおよ
び乾燥N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）750ml中にTEA
75ml溶解したものと混合し、これらを室温にて0.5ない
し３時間撹拌した。未反応のFMPを別したのち、この
ゲルを１の乾燥DMFで洗滌し、ついで乾燥DMF 1中に
10分間の撹拌により懸濁させた。このFMP−活性化ゲル
を次に、1000mlの乾燥アセトンで２回、4mM HClを含む1
000mlのアセトンで１回、1000mlの4mM HClで２回、さら
に1000mlの乾燥アセトンで２回、連続的に洗滌した。こ
の洗滌したFMP−活性化ゲルを室温、真空下で乾燥させ
た。
実施例３ ジメチルホルムアミド（DMF）中での２−フルオロ−１
−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネート（FM
P）を用いたFRACTOGEL TSKの活性化 乾燥FRACTOGEL TSK HW 75（Ｆ）6gを４−ジメチルア
ミノピリジン２ミリモル（244mg）含む乾燥DMF 25ml中
に懸濁させた。この懸濁物中に、５ミリモル（1.42g）
のFMPおよび5.5ミリモル（671mg）の４−ジメチルアミ
ノピリジンを含む乾燥DMF20mlを添加した。この懸濁物
を室温で１〜２時間撹拌した。この活性化ゲルをついで
250mlのDMFで４回、250mlの乾燥アセトンで３回、連続
的に洗滌した。この洗滌された活性化ゲルを真空下、室
温にて乾燥させ、４℃にて保存した。
実施例４ ジメチルホルムアミド（DMF）中での２−フルオロ−１
−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネート（FM
P）を用いた紙の活性化 ホワットマン（Whatman）紙No.54（直径9cm）、５
枚を75℃にセットした真空オーブン中に24時間放置し
た。ついで室温まで冷却したのち、これら紙を200ml
のDMFを収容した結晶化皿中に浸漬した。次に、この皿
を100rpmにて10分間振とうさせたのち、中のDMFを流出
させた。ついで、この皿に４ミリモルの４−ジメチルア
ミノピリジン（DMAP）を含む乾燥DMF100mlを加え、再び
５分間、100rpmにて撹拌した。次に、10ミリモルの２−
フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スル
ホネート（FMP）および10.1ミリモルのDMAPを含むDMF10
0mlをこの皿に添加した。室温にて２時間、100rpmでこ
の皿を振とうさせた。次に、溶液を除去したのち、乾燥
DMFを加え、この皿を100rpmにて10分間振とうさせ、洗
滌をおこなった。この洗滌操作をさらに２回繰り返し
た。DMFを傾斜により流出させたのち、250mlの乾燥アセ
トンを皿中の紙に添加し、皿を100rpmにて10分間振と
うさせた。この乾燥アセトンによる洗滌をさらに２回繰
り返した。最後に、これら紙を室温にて風乾し、４℃
の乾燥雰囲気中に保存した。
実施例５ アミノ−末端ゲルの製造 ポリエチレンイミン（分子量、1800）14gを100mlのア
セトニトリル中に溶解させた。この溶液に実施例２のFM
P−活性化ゲル20gを加えた。得られた懸濁物を室温にて
15〜24時間撹拌した。このゲルを次にこの懸濁物から除
去し、さらに200mlの蒸留水に再び懸濁させ、室温にて
１時間撹拌した。この最後の工程をさらに２回繰り返し
た。次に、このゲルを1000mlの蒸留水で３回、1M NaCl
1000mlで３回、1000mlの蒸留水で３回、600mlのアセト
ニトリルで３回、600mlの乾燥アセトンで３回、連続的
に洗滌した。得られたアミノ−末端ゲルを真空下、室温
で乾燥させた。
実施例６ チオールゲルの製造 実施例５の方法によりつくられた乾燥状態のアミノ−
末端ゲル20gを乾燥アセトン120ml中に懸濁させた。この
懸濁液に硫化エチレン4mlを加えた。得られた混合物を
室温で18時間撹拌した。次にこのゲルを1000mlの蒸留水
で３回、600mlのアセトンで３回、1000mlの蒸留水で３
回、1000mlのアセトンで３回、1000mlの1M NaClで３
回、1000mlの蒸留水で３回、600mlのアセトンで３回、
連続的に洗滌した。
この得られたチオールゲルはそのままアフィニティー
クロマトグラフィー・マトリックスとして使用すること
もできるが、2,2−ジチオピリジンで処理して遊離スル
フヒドリル基を有するリガンドに対して使用することも
できる。
実施例７ 活性化チオールゲルの製造 実施例６の別されたチオールゲルを20mMのジチオト
レイトール100ml中に懸濁させ、２時間撹拌した。この
チオールゲルを1000mlの蒸留水で３回、1000mlの1M NaC
lで３回、600mlのアセトンで３回、1mMのEDTAを含む0.0
5Mの重炭酸ナトリウムとアセトンとの混合物（60−40v/
v）500mlで２回洗滌した。この洗滌したゲルを0.3Mの2,
2−ジチオピリジン40ml中に懸濁させ、これを24〜48時
間撹拌した。この活性化されたチオールゲルを600mlの6
0％アセトンで３回、400mlの1mM EDTAで５回、1000mlの
0.5M NaClで５回、連続的に洗滌した。この活性化した
チオールゲルをりん酸塩で緩衝した食塩水中にて４℃で
保存した。
この活性化したチオールゲルは例えばタチナタマメウ
レアーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ等の複離スルフヒド
リル基を有する酵素を固定化するのに用いることができ
る。
実施例８ フェニルゲルの製造 ４−フェニル酪酸3284mg（20ミリモル）;N−ヒドロキ
シスクシンイミド2300mg（20ミリモル）;N,N−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド4130mg（25ミリモル）および25
mlの乾燥トリエチルアミンを乾燥DMF300ml中に溶解さ
せ、室温で20時間撹拌した。析出物を除去したのち、上
澄液を、100mlの乾燥アセトンおよび7mlの乾燥トリエチ
ルアミン中に懸濁させた実施例５の乾燥アミノ−末端ゲ
ル20gを加え、ついで室温で24時間撹拌した。次に、こ
のゲルを200mlのDMFで５回、200mlの0.5M NaClで５回、
1mMのNaOHに溶かした0.5M NaCl溶液200mlで５回、1mMの
HClに溶かした0.5M NaCl溶液200mlで５回、1mMのNaOH 2
00mlで５回、蒸留水200mlで５回、連続的に洗滌した。
洗滌後、このゲルを、1Mの硫酸アンモニウムを含むpH7.
0のりん酸ナトリウム緩衝液（0.01M）中にて保存した。
このフェニルゲルは重合体キャリヤーから立体的に
（sterically）に除去された疎水性連鎖を有し、タンパ
ク質、例えば血清アルブミンの精製に使用することがで
きる。
実施例９ カルボキシ−末端ゲルの製造 実施例５のアミノ−末端ゲル45gをテトラヒドロフラ
ン300ml中に懸濁させ、これに４−ジメチルアミノピリ
ジン３ミリモル（0.37g）、無水コハク酸15ミリモル
（1.5g）およびトリエチルアミン4.5mlを加えた。この
得られた懸濁液を室温にて24時間、撹拌した。次に、こ
のゲルを30mlの蒸留水で５回、600mlの0.5M NaClで２
回、300mlの蒸留水で５回、連続的に洗滌した。このゲ
ルをりん酸緩衝食塩水中にて４℃で、懸濁、保存した。
このカルボキシ−末端ゲルはアミノ基含有リガンド、
例えば酵素、抗原、抗体、ハプテン、タンパク質、核タ
ンパク質、ホルモン、ビタミン等の精製のためのアフィ
ニティークロマトグラフィー・マトリックスとして使用
することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の重合体マトリックスの製造を説明する
ための概略的フローシート図、第２図は本発明のマトリ
ックスを用いた種々の誘導化反応を説明する概略的フロ
ーシート図である。

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも１個の水酸基を有する重合体物
    質を２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−
    ４−スルホネートと反応させて、上記水酸基の少なくと
    もいくつかが１−メチル−２−ピリドキシ基に変換され
    た活性化ポリマーを形成させる工程と； この１−メチル−２−ピリドキシ置換ポリマーをポリエ
    チレンイミンと反応させて、上記１−メチル−２−ピリ
    ドキシ基の少なくともいくつかが上記ポリエチレンイミ
    ンにより置換されたアフィニティークロマトグラフィー
    ・マトリックスを形成する工程と； を具備してなるアフィニティークロマトグラフィー・マ
    トリックスの製造方法。
  2. 【請求項２】上記重合体物質が多糖類である特許請求の
    範囲第１項記載の製造方法。
  3. 【請求項３】上記多糖類がデキストランである特許請求
    の範囲第２項記載の製造方法。
  4. 【請求項４】上記多糖類が架橋化デキストランである特
    許請求の範囲第２項記載の製造方法。
  5. 【請求項５】上記多糖類がアガロースである特許請求の
    範囲第２項記載の製造方法。
  6. 【請求項６】上記多糖類が架橋化アガロースである特許
    請求の範囲第２項記載の製造方法。
  7. 【請求項７】上記多糖類がセルロースである特許請求の
    範囲第２項記載の製造方法。
  8. 【請求項８】重合体物質がゲル状のものである特許請求
    の範囲第１項記載の製造方法。
  9. 【請求項９】重合体物質がＮ−アクリロイル−２−アミ
    ノ−２−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオールの
    重合体である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
  10. 【請求項１０】重合体物質がポリビニルアルコールであ
    る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】重合体物質が紙である特許請求の範囲第
    １項記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】重合体物質を上記２−フルオロ−１−メ
    チル−ピリジウムトルエン−４−スルホネートと水性溶
    液中で反応させる特許請求の範囲第１項記載の製造方
    法。
  13. 【請求項１３】重合体物質を上記２−フルオロ−１−メ
    チル−ピリジニウムトルエン−４−スルホネートと極性
    有機溶媒中で反応させる特許請求の範囲第１項記載の製
    造方法。
  14. 【請求項１４】少なくとも１個の水酸基を有する重合体
    物質を２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン
    −４−スルホネートと反応させて、上記水酸基の少なく
    ともいくつかが１−メチル−２−ピリドキシ基に変換さ
    れた活性化ポリマーを形成させる工程と； この１−メチル−２−ピリドキシ置換ポリマーをポリエ
    チレンイミンと反応させて、上記１−メチル−２−ピリ
    ドキシ基の少なくともいくつかが上記ポリエチレンイミ
    ンにより置換されたポリエチレンイミン置換ポリマーを
    形成させる工程と； このポリエチレンイミン置換ポリマーを、そのうちのア
    ミノ基と反応し得る求電子リガンドと反応させる工程
    と； を具備してなるアフィニティークロマトグラフィー・マ
    トリックスの製造方法。
  15. 【請求項１５】上記求電子リガンドがアラルキルカルボ
    ン酸である特許請求の範囲第14項記載の製造方法。
  16. 【請求項１６】上記求電子リガンドが硫化エチレンであ
    る特許請求の範囲第14項記載の製造方法。
  17. 【請求項１７】上記求電子リガンドが硫化エチレンであ
    って、上記ポリエチレンイミン置換ポリマーと硫化エチ
    レンとの反応生成物を2,2−ジチオピリジンと反応させ
    る特許請求の範囲第14項記載の製造方法。
  18. 【請求項１８】求電子リガンドが無水カルボン酸である
    特許請求の範囲第14項記載の製造方法。
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