DE2619521A1

DE2619521A1 - Neue aktivierte traeger und ein verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2619521A1
Application number: DE19762619521
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr Gribnau; Dietrich Dr Hildebrand
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1976-05-03
Filing date: 1976-05-03
Publication date: 1977-11-24
Also published as: IL51978A0; SE7705063L; JPS52133392A; IL51978A; NL7704869A; GB1527975A; BE854200A; FR2361421A1; US4298395A

Description

Bayer Aktiengesellschaft

2519521

Zentralbereich Patente, Marken und Lizenzen

5090 Leverkusen, Bayerwerk Er/AB

3 0. April 1976

Neue aktivierte Trä'ger und ein Verfahren zu ihrer Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue aktivierte Träger und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus polymeren Trägermaterialien und Halogenpyrimidin-Derivaten.

Es ist bereits bekannt geworden, daß man hydroxylgruppenhaltige Träger mit Bromcyan aktivieren und nachfolgend mit geeigneten Effektoren bzw. Liganden über freie Aminogruppen dieser Effektoren kuppeln kann (Verfahren von R. Axen, j.Porath und S. Ernback Nature 1967, 21_4, 1302 - 1304.

Dieses vorgenannte Verfahren hat jedoch, wie Tesser et al zeigen konnten den Nachteil, drß cie hier vorliegende Isoharnstoffbindung des Effektors an den Träger nicht hydrolysestabil ist (G.I- Tesser et al FEBS Letters (1972) 22, 56) sowie G.I. Tesser et al HeIv. Chim. Acta _5J7, 1718-1730 (1974).

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Ein anderes Verfahren,das auf E. Katchalski, Biochem. 1964 _y 2/1905-1919 zurückgeht,benutzt Polymere mit Anhydridgruppen. Bei diesen Harztypen beruht die Enzymbindung auf der rascheren Umsetzung der Aminogruppen des Enzyms mit den Anhydridgruppen des Harzes gegenüber der konkurrienden Reaktion mit dem umgebenden Wasser.

Wieder andere Verfahren benutzen z. B. die Reaktion von Epoxygruppen an Polymeren mit Aminogruppen, Thiolgruppen und Hydroxylgruppen (L. Sundberg a J.Porath, J. Chromatogr. 1974 90» 87-98), jedoch werden hierbei pH-Werte von 8,5-11 und Reaktionszeiten von 15 bis 48 Stunden benötigt, die für zahlreiche Enzyme denaturierend wirken.

Eine Zusammenfassung der zahlreichen Möglichkeiten gibt z.B. C. Zaborsky in Immobilized Enzymes, CRC-Press, Cleveland 1973.

Cyanurchlorid und andere Triazinderivate wurden von G. Kay und M. Lilly schon 1967 zur Aktivierung von Zellulose und zur Kupplung von Enzymen verwendet. (G. Kay a. E.M. Crook, Nature 1967 216 514; G. Kay, M.D. Lilly, A.K. Sharp a. R.J.H.Wilson, Nature 1968 217,641). Die Bindungsstabilität erfüllte nicht alle Erfordernisse. Der Übergang zu Derivaten des Trichlortriazins (S.Kay a. M.D. Lilly Biochim, Biophys. Acta (1970), 198, 276-285) brachte eine bessere Handhabung der Reaktion mit sich, jedoch keine Verbesserung der beobachteten Instabilität der Bindungen.

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Es wurde nun gefunden, daß aktivierte polymere Träger der Formel 4

12 3 4 in welcher die Substituenten R , R , R und R unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben können:

Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl (C₁-C₄),Alkoxy (C₁-C Alkylthio (C₁-C₄), Acylamino (C₁-C₄), Nitro, Cyano, Carbonamido, Alkylsulfonyl (C₁-C₄), Alkoxycarbonyl (C₂-Cg), Phenyl, Trifluormethyl, Chlormethyl

sowie T-Xf wobei T-X für einen Trägerrest eines polymeren Trägers und X für Sauerstoff, Schwefel, NH, NR (R=Alkyl (C₁-C.)), CONH oder CONR steht, wobei mindestens ein und

14
höchstens zwei der Reste R bis R für T-X steht und

1 4
wobei zwei der Reste R bis R für einen bivalenten Träger

rest _m/ stehen können, außerordentlich hydrolysestabil sind. ^Ä

Weiterhin wurde gefunden, daß man die aktivierten polymeren Träger der Formel (I) herstellen kann, wenn man einen.polymeren Träger, welcher OH, SH, NH₃, NHR (R=Alkyl (C₁-C₄)), CONH2 oder CONHR-Gruppen am Molekül trägt, in einem organischen oder organisch-wäßrigen Lösungsmittel gegebenenfalls unter Zusatz von Basen bei Temperaturen zwischen -10 und +30⁰C mit einem Halogenpyrimidon-derivat der Formel

R²

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12 3 4
in welcher die Reste R , R , R und R unabhängig voneinander eine der folgenden Bedeutungen haben können:

Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl (C₁-C.), Alkoxy (C₁-C₄), Alkylthio (C₁-C.), Acylamino (C₁-C₄), Nitro, Cyano,
Carbonamido, Alkylsulfonyl (C₁-C₄), Alkoxycarbonyl (C₂-Cg), Phenyl, Trifluormethyl, Chlormethyl und wobei mindest zwei

1 4
der Reste R bis R für Halogen stehen, umsetzt.

Überraschenderweise besitzen die neuen erfindungsgemäß
aktivierten Träger der Formel (I) eine wesentlich größere Hydrolysestabilität als bisher bekannte aktivierte Träger verwandter Struktur.

Die erfindungsgemäßen aktivierten Träger sowie das Verfahren zu ihrer Herstellung stellen somit eine große Bereicherung der Technik dar.

Der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch das folgende stark vereinfachte Schema verdeutlicht werden:

T-OH
(Träger)

(Pyrimidinderivat)

Hierbei wurde vereinfachend angenommen, daß jeweils nur eine Gruppe XH (in diesem Falle X=O) eines Trägerrestes mit jeweils einem Pyrimidinderivat reagiert.

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Reagieren jeweils zwei Gruppen XH eines Trägerrestes mit jeweils einem Pyrimidin-Derivat, so läßt sich das Reaktionsschema z.B. wie fclgt darstellen:

OH

F
Cl JL

♦ Λ

F " ρ
- 2 F

Diese Reaktionsweise führt zu. Vernetzungen innerhalb des polymeren Trägermoleküls.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Ausgangsprodukte: polymere Träger und Halogenpyrimidon-Derivate sind bereits bekannt.

Als polymere Träger kommen bei der Herstellung der erfindungsgemäßen neuen aktivierten Träger folgende in Betracht: polymere Trägersubstanzen, vorzugsweise Trägerharze welche als funktioneile Gruppen folgende Gruppen enthalten: Hydroxyl, primäres oder sekundäres Amino, Carbonamido (CONH₂- bzw. CONHR-Reste (R = Alkyl)) oder Sulfhydril. Aus der Vielzahl der Möglichkeiten seien die folgenden beispielhaft aufgeführt:

Agarose,vorzugsweise perlförmige Agarose,geliefert von Pharmacia Fine Chemicals unter der Handelsbezeichnung Sepharose ®, Sorten 2B, 4 B und 6 B, quervernetzte Sepharose Gele, Sorten CL-2B, CL-4B und CL-6B) sowie Dextrane und quervernetzte Dextrane (wie z.B. Sephadex geliefert von

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Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala Schweden/beispielsweise in Sorten G-75, G-100, G-150 und G-200* weiterhin Zellulose (unter anderem auch Baumwolle) und verschiedene Zellulosederivate, Polyacrylamidharze, Ionenaustauscher-Harze mit hydrophilen Gruppen, wie z.B. aminomethylierte Polystyrolharze, Polyvinylalkohole, und andere.

Literatur bezüglich einiger der zitierten Träger: Sepharose ® aus Agarose: Hjerten, Biochimica, Biophysica Acta 79, 393-398 (1968) Sephadex® als quervernetztes Dextran: Dissertation von Per Flodin üppsala 1962.

Die in den Beispielen u.a. verwendeten·Ionenaustauscherharze NKZ 2 und NKZ /sind makroporöse Harze aus Polyvinylbenzylamin und vernetzten! Divinylbenzol, wobei NKZ 2 etwa 8 % und NKZ 4 rund 6 % Divinylbenzol enthält. Andere erfindungsgemäß einsetzbare Ionenaustauscher sind beispieleweise Amberlite®iR 45 (mit primärer Aminogruppe) sowie Lewatite Φ ,beispielweise JLewatit ® MP 600.

Polymere auf der Basis Styrol, Acrylsäure, Methacrylsäure, sowie deren Ester lassen sich ebenfalls aktivieren sofern sie- wenigstens einige der obengenannten funktioneilen Gruppen in ihrem Gerüst besitzen. So lassen sich z.B. schwach basische Anionenaustauscher mit primären oder sekundären Aminen aktivieren. Polyvinylalkohole und auch Polyacrylamide ließen sich ebenfalls aktivieren. Bei weiteren Polymeren kann man mit Hilfe von Sekundär-Reaktionen funktionelle Gruppen einführen und diese dann aktivieren. So kann man z.B. Polymere mit Anhydridgruppen (z.B. Äthylenmaleinsäureanhydrid-Harze) mit Polyalkoholen oder Polyaminen umsetzen und diese anschließend mit Halogenpyrimidinen aktivieren. Auch anorganische Träger, wie poröse Gläser (Glass beads> können mit Verbindungen

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mit geeigneten funktioneilen Gruppen umgesetzt werden oder

(R) sind bereits im Handel erhältlich wie z.B. Glycophase-G von Corning. Sie sind dann ebenfalls zur Aktivierung mit Halogenpyrimidinen geeignet; auch lösliche Polyhydroxyverbindungen wie Dextran, lösliche Stärke, Polyalkohole und Polyamine können mit den halogenierten Pyrimidinen aktiviert werden.

Bei der Herstellung der aktivierten Träger werden besonders bevorzugt folgende Pyrimidinderivate eingesetzt: Cl / „ f Cl '^Cl

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2 4 6-Trifluor- Tetrafluor- Tetrachlorpyrimidin 5-chlorpyrimidin pyrimidin ("TCP")

) ( n_TFPii)

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Daneben können aber auch noch andere Pyrimidinderivate der allgemeinen Formel (I) eingesetzt werden.

Die Herstellung des TCP wurde von H.J.-Schroeder et al in J. org. Chem. 27_, 2580-2584 (1962) beschrieben. Andere Herstellungsmethoden sind in den Patentschriften GB-PS 1 157 948 und GB-PS 1 158 300 zu finden.

Das Tetrachlorpyrimidin (TCP) kann leicht nach S.J. Childress und R.L. Mc Kee, J. Am. Chem. Soc. (1950) T2, 4271-72 hergestellt werden.

Mit diesen beiden vorgenannten Halogenpyrimidinen lassen sich sämtliche Träger mit Hydroylgruppen wie die wichtige, perlförmige Agarose und Dextran-Derivate,aber auch Zellulose und zellulosehaltige Naturstoffe wie Baumwolle umsetzen. Dabei ist es durchaus möglich, daß auch noch andere funktioneile Gruppen wie Carboxymethyl· oder Diäthylaminoacetyl-Gruppen vorhanden sind. Ebenso lassen sich auch Träger mit primären oder sekundären Aminogruppen und sogar mit Amidgruppen wie Polyacrylamid aktivieren. Andere Polymere auf Styrol-Acrylsäure-Methacrylsäure, Basis und ihre Ester lassen sich aktivieren sofern:sie die genannten funktioneilen Gruppen enthalten.

Neben den beiden vorgenannten Pyrimidinen FCP und TCP sind auch noch weitere Pyrimidinderivate der allgemeinen Formel (I) einsetzbar. Beispielhaft seien die folgenden genannt:

2-Fluor-4,5,6-trichlorpyrimidin, 2,4-Difluorpyrimidin, 2,4-Difluor-6-methylpyrimidin, 2,6-Difluor-4-methyl-5-chlorpyrimidin, 2,4,6-Trifluorpyrimidin, 2,4-Difluorpyrimidin-5-äthylsulfon, 2,6-Difluor-4-chlorpyrimidin, 2,4,5,6-Tetrafluorpyrimidin, 2,4,6-Trifluor-5-chlorpyrimidin, 2,6-Difluor-4-methyl-5-brompyrimidin, 2,4-Difluor-5,6-dichlor- oder -dibrompyrimidin, 4,6-Difluor-2,5-dichlor- oder -dibrom-

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pyrimidin, 2,6-Difluor-4-brompyrimidin, 2-4,6-Trifluor-5-brompyr imidin, *., 4,6-Tr if luor-5-chlormethy lpyr imidin, 2,4,6-Trifluor-5-nitropyrimidin, 2,4,6-Trifluor-5-cyanpyrimidin, 2,4,6-Trifluorpyrimidin-5-carbonsäurealkylester oder -5-carbonsäureamide, 2,6-Difluor-5-methyl-4-chlorpyrimidin, 2,6-Difluor-5-chlorpyrimidin, 2,4,6-Trifluor-5-methylpyrimidin, 2,4,5-Trifluor-6-methylpyrimidin, 2,4-Difluor-5-nitro-6-chlorpyrimidin, 2,4-Difluor-5-cyanpyrimidin, 2,4-Difluor-5-methy1 pyrimidin, 6-Trifluormethyl-5-chlor-2,4-difluor-pyrimidin, 6-Phenyl-2,4-difluorpyrimidin, 6-Trifluormethyl-2,4-difluorpyrimidin, 5-Trifluormethyl-2,4,6-trifluorpyrimidin, 5-Trifluormethyl-2,4-difluorpyrimidin und weitere.

Bei der Herstellung der neuen aktivierten Träger der Formel I aus polymeren Trägern und Pyrimidinderivaten der Formel II geht man so vor, daß man den polymeren Träger, das halogenierte Pyrimidin und sofern der Träger nicht selbst eine Base ist, auch noch eine Base zur Bindung des freiwerdenden Halogenwasserstoffes zusammenbringt. Dies kann in organischem Medium z.B. Dioxan, Xylol, Aceton oder Gemischen hiervon, oder auch in organisch-wäßrigen Medien erfolgen. Die Reaktionstemperatur liegt dabei zwischen -10 und +30 C, vorzugsweise zwischen -2 und +6⁰C.

Die von J. Warren, J.D. Reid und C. Hamalainen, Textile Res. Journal 1952, p. 584 - 590, für Arbeiten mit Cyanurchlorid verwendeten Gemische, insbesondere das System Xylol/Diöxan, lassen sich vorteilhaft verwenden.

Bei Verwendung von tetrahalogenierten Pyrimidinen und hydroxylgruppenhaltigen Trägern reagieren je nach den Reaktionsbedingungen 1 bis 2 Halogene mit dem Träger. Man kann damit eine Vernetzung des Trägers erzielen, was sich z.B. im Falle der Agarose (Sepharosö^ äußerst günstig auswirkt, denn diese wird dadurch kochfest.

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Auch die Wahl der Halogensubstitution ist für die Reaktionsfreudigkeit entscheidend. So steigt die Reaktivität vom Brom über Chlor zum Fluor an. Außerdem sind die tetrahalogenierten reaktiver als die tri- oder dihalogenierten Verbindungen. Andere Substituenten am Pyrimidin wie z.B. -OR, -NHR, -SR, wobei R für Alkyl steht, können die Reaktivität erniedrigen, können aber auch die Reaktivität erhöhen, wie z.B. die Alkylsulfonylgruppe oder die Nitrogruppe.

Für den speziellen Fall des Trif luorchlorpyriitiidins (FCP) wurde folgende Reihenfolge des Abreagierens der Halogene gefunden:

(D F,

bzw.

Das letzte Halogen des FCP, das Chlor, nimmt unter den im folgenden geschilderten Bedingungen an der Reaktion nicht teil.

Bei der Aktivierung des Trägers kann die Reaktion auch durch die Menge des zur Neutralisation notwendigen Alkalis begrenzt werden, da bei pH-Werten unter 5 die Reaktion nicht fortschreitet. Eine mögliche Ausnahme bilden hierbei die reaktivsten Pyrimidine wie z.B. das Tetrafluorpyrimidin. Bei den übrigen läßt sich insbesondere nach dem Abreagieren eines Fluoratoms die Reaktion durch Zugabe von Säuren, z.B. Essigsäure oder Phosphorsäure bzw. Phosphatpuffer pH 5 unterbinden. Man kann das benötigte Alkali mit dem Träger

(R)

z.B. Sepharose vorgeben und dann das Halogenpyrimidin zugeben, dabei reagieren dann bei Verwendung von Trifluorchlorpyrimidin (FCP) im Alkali-Überschuß zunächst 2 Fluoratome unter

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Bildung von Vernetzung, die z.B. bewirken, daß die Sepharose ^ gegen Siedetemperaturen stabil wird. Will man einen möglichst hoch aktivierten Träger ohne Vernetzungen, so gibt man entweder Träger und Alkali zusammen zu einem Überschuß des Halogenpyrimidins oder man gibt eine abgemessene Menge Alkali zu dem Gemisch aus Träger und Halogenpyrimidin. In der Wahl der Base ist man nicht gebunden. Neben den Hydroxiden der Alkalimetalle kommen z.B. auch tertiäre oder quarternäre Ammoniumverbindungen infrage. Die für die Aktivierung günstigsten Temperaturen hängen von der Reaktivität des Halogenpyrimidine und der Art der funktioneilen Gruppe am Träger ab. BeimFCP arbeitet man vorteilhaft bei Temperaturen um 0 C, bei dem träger reagierenden Tetrachlorpyrimidin geht man bis Raumtemperatur, wobei natürlich auch die Reaktionszeit mit eingeht. Die Alkylierung der Hydroxylgruppen verläuft im allgemeinen etwas langsamer als diejenige primärer Aminogruppen.

Die neuen erfindungsgemäß hergestellten aktivierten Träger lassen sich mit geeigneten Liganden zu Träger-Liganden-Kupplungsprodukten umsetzen.

Die aktivierten Träger werden am zweckmäßigsten sofort nach der Aktivierung mit dem zu bindenden Liganden umgesetzt. In vielen Fällen kann man jedoch den aktivierten Träger stabilisieren, so daß er nach Tagen oder sogar Monaten noch aktiv und verwendbar ist. Bei Hydroxylgruppen-haltigen Trägern genügt eine gründliche Auswaschung bei niedrigen pH-Werten, etwa 5-6,um sie auch im wasserfeuchten Zustand bei Temperaturen von 0 - 5°C über Monate aktiv zu erhalten. So läßt

I TJ \

sich z.B. eine mit FCP-aktivierte Sepharose ^K ' nach 3 Monaten Lagerung mit Enzymen ohne Einbuße an Kopplungsfähigkeit umsetzen. Bei Trägern mit Aminogruppen ist ein rascherer Rückgang der Bindungsfähigkeit unter den obigen Bedingungen beobachtet worden. In vielen Fällen ist dann eine Trocknung im

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Vakuum und eine Aufbewahrung im getrockneten Zustand vorzuziehen.

Als Liganden kommen für die Umsetzung mit den aktivierten Trägern Substanzen mit niedrigem und hohem Molekulargewicht in Frage:

Agenzien zur Durchführung der Adsorptionchromatographie und der hydrophoben Chromatographie wie z. B. Hexamethylendiamin, Anilin, p-Aminobenzamiden oder Äthy!mercaptan, Enzyme wie z. B. Trypsin, Penicillinase, Subtilisin, Glucoseoxydase oder Asparaginase, andere Proteine wie z. B. Albumin, Hormone, wie z. B. Insulin oder auch Farbstoffe, vorzugsweise Azofarb-r stoffe, die weiterhin mit geeigneten Reduktionsmitteln (z. B. Natriumthionit) reduziert und mit geeigneten Kupplungsreagenzien (z. B. auch Proteinen) umgesetzt werden können.

Die nun folgenden Beispiele sollen die Herstellung der erfindungsgemäßen aktivierten Träger sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Träger-Liganden-Kupplungsprodukten aufzeigen:

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Beispiel 1

Aktivierung von Sepharose ** mit FCP■

25 g feuchte, perlförmige Agarose (Sepharose ^ 4 B Pharmacia) wurde in Wasser suspendiert und in eine Glasfilternutsche G gegossen, an deren Auslauf ein etwa 80 cm langer, nach unten hängender Schlauch eine leichte Absaugung des Wassers bewirkt. Eine an der Nutsche angebrachte Markierung gestattet, die Sepharose bis auf ein Volumen von 24 ml in die Nutsche einzufüllen. Die Sepharose wurde mit 250 ml destiliertem Wasser nachgewaschen. Die abgemessene, feuchte Sepharose wurde mit 50 ml 3M-Natronlauge versetzt und in einem Kolben 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Suspension wurde in derselben Nutsche wie oben abgesaugt und in einem silikordsiertem Rundkolben mit Rührer oder Vibro-Mischer bei O⁰C in 40 ml eines Xylol-Dioxan-Gemisches (1:1, w/w) suspendiert. In diese Suspension läßt man eine Lösung von 2,5 ml Trifluorchlorpyrimidin (FCP, D:1,675.) in 4 ml Xylol/Dioxan-Gemisch so langsam zutropfen, daß die Temperatur nicht über + 0,5°C steigt. Es wurde hierfür eine Stunde benötigt. Nachdem alles FCP zugegeben worden war, wurde die Reaktion durch Zugabe von 4,2 ml konz. Essigsäure gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine Filternutsche gegossen und darin 4 mal mit je 50 ml Xylol/Dioxan-Gemisch, 4 mal mit je 50 ml Dioxan und anschließend mit 1 1 dest. Wasser ausgewaschen. Diese gewaschene, aktivierte Sepharose ist bei 4°C mindestens 3 Monate lagerfähig (siehe Beispiel 13).

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Die FCP aktivierte Sepharose löst sich im Gegensatz zur unbehandelten Sepharose beim Kochen nicht auf.

Zur Kontrolle der Aktivierung wurden Proben verschiedener Ansätze elementaranalytisch untersucht.

Präparat	% N	% Cl	% F
a	4,16	—	—
b	4,43	-	-
C	4,56	5,91	2,88
d	4,72	5,72	2,83
e	4,58	6,00	2,94

Die folgende Zusammensetzung (-Galactose-anhydrogalactose-) (DFP)₂ würde folgende Analyse ergeben:

4,61 % N, 5,84 % Cl und 6,28 % F
DFP = Difluorchlorpyrimidin-Rest

Der verminderte Gehalt an F läßt sich durch die Bildung von Quervernetzungen und eine teilweise Hydrolyse des Fluor erklären (54 %). Der Rest von 40 % verbleibt als reaktives Fluor.

Beispiel 1 a

(R)
Aktivierung von Sepharose^v 'mit FCP

23 g Sepharose^ vorbereitet und mit Alkali nach Beispiel 1 behandelt werden portionsweise zu einer auf 0 - 3°C abge-

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kühlten Lösung von 4 g FCP in 40 ml Xylol/Dioxan-Gemisch (1 : 1, w/w) zugegeben. Es wurde hierfür 45 Min. benötigt. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 4,2 ml konz. Essigsäure gestoppt und wie in Beispiel 1 beschrieben weiter aufgearbeitet.

Elementaranalyse: A) 5,69 % N; 5,05 % P; 6,42 % Cl

Die folgende Zusammensetzung
(-Galactose-Anhydrogalactose). (DFP)₃ würde folgende Analyse ergeben:

5,03 % N; 6,83 % F; 6,38 % Cl

Der etwas verminderte Gehalt an Fluor läßt sich durch die Bildung von Quervernetzungen und eine teilweise Hydroyse des Fluor erklären (24 %). Der Rest von 76 % verbleibt als reaktives Flour.

Beispiel 2

Hexamethylendiamin an Sepharose ^S - FCP

2 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte mit FCP aktivierte Sepharose w 4 B wurde auf der Glasfritte mit 'Wasser gewaschen und in eine Lösung von 400 mg Hexamethylendiamin (HMDA) in 20 ml Wasser eingetragen und gut durchgemischt. Die Suspension wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur rotiert Anschließend wurde die Sepharose mit 200 ml Wasser, 100 ml 0,1N-Natronlauge, 250 ml Wasser und 100 ml Methanol auf der Glasfritte gewaschen, abgesaugt und der Rückstand im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

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- 15 -

Analyse: 5,91, 6,95, 7,59 % N
Dies entspricht folgender Zusammensetzung: (-Galactose-anhydrogalactose-)₃(CP)₂(HMDA)^₂ CP = Monochlorpyrimidinrest

Beispiel 3 Anilin an Sepharose ^ - FCP

2 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP- aktivierte Sepharose ^ 4 B wurde auf der Glasfritte mit Wasser gewaschen und in eine Lösung von 50 mg Anilin in einem 1:1 Gemisch aus Dioxan und MC. Ilvain Puffer pH 7 gegeben. Die Kupplung und weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 2 angegeben. Die Analyse ergab folgenden Stickstoffgehalt: 5,72%,5,98%, 5,42 %

damit ergibt sich folgende Zusammensetzung: (-Galactose-anhydrogalactose-)₃(CP)₂(Anilin^ ₂

Beispiel 4

(R)
p-Aminobenzamidin - Sepharose 4 B

2,15 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP

(R)
aktivierte Sepharose 4 B wurde mit einer Lösung von 102 mg p-Aminobenzamidin-Hcl in 3 ml 0,1 M-Boratpuffer pH 7,0 und 0,5 ml 1N-Natronlauge versetzt. Die Suspension wurde im Rundkolben bei Raumtemperatur 20 Stunden rotiert. Das Kupplungsprodukt wurde abfiltriert und mit 2OO ml 0,1 M-Boratpuffer pH 7 gewaschen. Aus der spektralphotometrischen Bestimmung des p-Aminobenzamidins in den

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Filtraten und Wascalösungen und der eingesetzten Menge ließ sich ein Substitutionsgrad von 86 ,u Mol Benzamidin pro g feuchte Sepharose errechnen.

Beispiel 5

(R)
Äthylmercaptan - Sepharose 4 B

2 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP-aktivierte Sepharose ^l ' 4 B wurde mit 0,1 M-Boratpuffer pH 9,2 und 7 ml Äthanol und 1 ml Äthylmercaptan versetzt. Die Suspension wurde eine Nacht bei Raumtemperatur rotiert. Das Kupplungsprodukt wurde mit 200 ml Äthanol, 500 ml Wasser und 230 ml Äthanol/Wasser (1:1, v/v) in einer Säule gewaschen. Die Elementaranalyse ergäbe einen Gehalt von 2,77 % Schwefel. Zum Vergleich ergab eine nicht aktivierte aber

(R)

sonst gleich behandelte Sepharose 4 B einen Schwefelgehalt von weniger als 0,2 %.

Beispiel 6 Albumin - Sepharose ^ 4 B

3 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP-aktivierte Sepharose^4 B wurde mit 0,1 M-Boratpuffer pH 9,2 kurz gewaschen und in einem Rundkolben mit einer Lösung von 400 mg Rinderserumalbumin in 4 ml 0,1 M-Boratpuffer pH 9,2 22 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abgesaut, mit obigem Puffer gewaschen, dann in 1M Äthanolaminlösung pH 9,1 suspendiert, nach 3 Stunden wieder abfiltriert und mit Puffer gewaschen. Sämtliche Filtrate und Waschlösungen wurden

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vereinigt und in diesem der Proteingehalt bestimmt, Es wurden 280 mg gefunden. Danach waren an die Sepharose 120 mg
Albumin gebunden worden.

Beispiel 7 Albumin - Sepharose ^ 4 B

800 mg Rinderserumalbumin wurden nach Beispiel 6 an 3 g
fuechte, FCP-aktivierte Sepharose 4 B gebunden. Der Proteingehalt der Filtrate und Waschlösungen betrug 669 mg. Danach
waren an die Sepharose 131 mg Albumin gebunden worden.

Beispiel 8

(R)
Insulin - Sepharose 4 B

3 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP-aktivierte Sepharose ^v ' 4 B wurde mit o,1 M-Boratpuffer pH 9,2 kurz
gewaschen und in einem Rundkolben mit einer Lösung von 8P mg Insulin (Rind) in 4,5 ml 0,1 M-Boratpuffer pH 9,2 versetzt
und 22 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Kupplungsprodukt wurde mit obigem Boratpuffer gewaschen und zum vollständigen Abreagieren des aktiven Halogens 17 Stunden bei
Raumtemperatur in 1 M-Äthanolamin pH 9,2 rotierten gelassen. Nach nochmaligem Waschen mit Wasser und Absaugen ergab sich
aus der Aminosäure-analyse ein Substitutionsgrad von 8,54 mg Insulin pro g feuchte Sepharose. Das Präparat zeigt im Fettzell-Test eine Antilipolyse-Wirkung von 85 % der theoretischen Aktivität.

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Der Verlust von gebundenem Insulin, bestimmt durch Radioimmunoaxxay, betrug nach 2,5 Stunden in Krebs, Ringer, Albuminlösung pH 7,4 bei 37°C 0,3°/oo.

Beispiel 9 Kallikrein-Trypsin-Inhibitor Kallikrein-Trypsin-Inhibitor - Sepharose ^ 4 B

2,5 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte FCP-aktivierte Sepharose ^~)wurde in 30 ml 0,1 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und mit 25 mg Kallikrein-Trypsin-Inhibitor aus Rinderlunge (91 U) versetzt. Der Ansatz wurde 20 Stunden bei

TJ

Raumtemperatur gerührt. Der Sepharose -gebundene Inhibitor wurde mit schwachem Unterdruck abgesaugt und mit obigem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid gewaschen. Es
tor erhalten.

TJ

gewaschen. Es wurden 2,48 g feuchte Sepharose mit InhibiHemmkapazität bestimmt durch die Inhibierung von Trypsin mit Benzoylarginin-p-nitroanilid (BAPNA) bei 25°C. Filtrat und Waschwasser 27 U

ρ
Inhibitor an Sepharose 13 U

d. s. 14 % der eingesetzten Hemmkapazität des Inhibitors.

Beispiel 10 Trypsin-Sepharose ^ 4- B

2 g nach Beispiel 1 hergestellte FCP-aktivierte Sepharose

Le A 17 176 _ 1Q -

?09847/006 :

wurde bei 4°C in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und mit 20 mg Trypsin 18,6 U; 0,93 U/mg (Test mit Benzoylarginin-p-nitroanilid = BAPNA) versetzt. Es wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt und anschließend mit 100 ml des obigen Phosphatpuffers gewaschen, der noch 0,5 M-Natriumchlorid enthielt und nochmals mit 100 ml Phosphatpuffer, ohne Natriumchlorid. Das Harz wurde auf einer Glasfritte G 2 mit ganz schwachem Vakuum abgesaugt. Es wurden 1,59 g feuchtes Trypsin-Sepharose ^ erhalten.

Enzymatische Aktivität (BAPNA; 25°C)

im Filtrat und in den Waschpuffern <0,5 ü

im Enzymharz 6,19 ü (3,9 ü/g Feuchtgewicht)

d.s. 33 % der eingesetzten Aktivität.

Beispiel 11

(R)
Penicillinase-Sepharose 4 B - FCP

2 g nach Beispiel 1 hergestellte FCP-aktivierte Sepharose wurde bei Raumtemperatur in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und eine Lösung von 2,5 mg Penicillinase aus B. cereus mit einer Aktivität von 250 U (Benzylpenicillin als Substrat) zugegeben. Der Ansatz wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Enzymharz wurde bei leichtem Vakuum auf einer Glasfritte G 2 abgesaugt und anschließend mit 100 ml des obigen Phosphatpuffers, der noch 0,5 M-Natriumchlorid enthält, gewaschen. Nach einer weiteren Waschung mit 100 ml Phosphatpuffer, jedoch ohne Natriumchlorid, wurde wiederum abgesaugt.

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03S47/O0S

Ausbeute an Enzymiu,rz 1,50 g

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin; 25°C) Filtrat und Waschwasser 28 U

Enzymharz 218 U (145 ü/g Feuchtgewicht)

d..s. 87 % der eingesetzten Aktivität oder 98 % der Aktivität des gebundenen Enzyms.

Ergänzung zu Beispiel 11

Zur Prüfung der Stabilität der Bindung sowie der Enzymaktivität wurde das Enzymharz in einer Säule mit 0,1 M-Phosphatpuffer pH 7,0, der 50 mg Thimerosal pro 1 enthielt, mit einer Geschwindigkeit von 17 ml/h bei Raumtemperatur durchströmt. Nach 68 und 116 Stunden wurden Proben entnommen und auf ihre enzymatische Aktivität geprüft. Nach 68 Stunden wurden 79 %, nach 116 Stunden noch 66 % der Ausgangsaktivität gefunden. In den Eluaten war keine Aktivität nachweisbar.

Beispiel 12 Penicillinase-Sepharose ^ 4 B - FCP

3 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte, FCP-aktive Sepharose ^-«v 4 ml Boratpuffer pH 8,4 nach Palitzsch und 18,7 mg Penicillinase mit einer Aktivität von 1650 U wurden 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Enzymharz wurde leicht abgesaugt und 3mal mit je 10 ml des obigen Puffers nachgewaschen. Zur Inaktivierung eventuell nach vorhandener FCP-aktivierter Sepharose wurde das Harz mit 10 ml auf pH 8,4 eingestellter 1 M-Äthanolaminlösung 5 Stunden bei Raumtemperatur rotieren gelassen. Das Harz wurde darauf in eine

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7Ö9847/G06T

kleine Säule überführt und mit 260 ml 1 M-Natriumchloridlö sung mit 370 ml einer 0,05 %igen Natriumazidlösung nachgewaschen. Nach leichtem Absaugen überschüssiger Waschlösung wurden 4,25 g Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25 C) Enzymharz 907 U (213 ü/g Feuchtgewicht)

d. s. 55 % der eingesetzten Aktivität.

Beispiel 13

Penicillinase-Sepharose ^ 4 B - FCP (Lagerungsfähigkeit aktivierter Sepharose)

Feuchte nach Beispiel 1 hergestellte FCP-aktivierte Sepharose ^ 4 B wurde nach dem Auswaschen bei 4 C 3 Monate gelagert. Nach dieser Zeit wurde eine Probe von 1 g entnommen und wie in Beispiel 11 beschrieben mit 110 U Penicillinase in Puffer bei pH 7 umgesetzt und gewaschen. Es wurden 1,71 g feuchtes Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrat und Waschwasser 1,8 U

Enzymharz 101 U (59 U/g Feuchtgewicht)

d. s. 92 % der eingesetzten Aktivität.

Beispiel 14 Subtilisin-Sepharose 4 B - FCP

1 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte, FCP-aktivierte Sepharose 4 B wurde in 20 ml Phosphatpuffer pH 8,0 suspen-

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709847/0061

diert, mit 10 mg Substilisin (1980 Ü) versetzt und 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel 11 für Penicillinase beschrieben. Es wurden 0,91 g Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Acetyltyrosinäthylester, 25°C) Filtrat und Waschwasser 1611 ü

Enzymharz 272 ü (299 U/g Feuchtgewicht)

d. s. 14,1 % der eingesetzten Enzymaktivität oder 74 % der Aktivität des gebundenen Enzyms.

Beispiel 15 Glucoseoxydase Sepharose ^ FCP

1 g feuchte nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP-aktivierte Sepharose^ 4 β wurde in 20 ml 0,1 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert, 10 mg Glucoseoxydase (1730 U) zugegeben und 18 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Enzymharz wurde abgesaugt und wie üblich mit obigem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid gewaschen. Ausbeute 0,89 g Enzymharz. Enzymatische Aktivität (Test mit Glucose und Peroxydase, bei 25 C) Filtrat und Waschwasser 1290 U Enzymharz 36 U

(32 ^U/g Feuchtgewicht)

d. s. 2,1 % der eingesetzten Enzymaktivität oder 8,2 % des gebundenen Enzyms.

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70984^/006

Beispiel 16

fry

Asparaginase - Sepharose ^ 4 B

3 g feuchte, nach Beispiel 1 hergestellte, mit FCP aktivierte Sepharose ^ 4 B wurde in einem Rundkolben zu einer Lösung von 98,5 mg Asparaginase (19 400 ü) in Boratpuffer nach Palitzsch pH 8,4 gegeben und bei Raumtemperatur 17 Stunden·rotiert. Nach der Kupplung wurde die Sepharose ^ in einer Glasfritte G 2 abfiltriert und 3 mal mit obigem Boratpuffer gewaschen. Anschließend wurde das Enzymharz in 1 M-Äthanolamin-HCL pH 8,4 5 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und in einer Säule mit 260 ml 1 M-Natriumchloridlösung und 370 ml einer 0,05 %igen Natriumchloridlösung gewaschen. Nach dem Abfiltrierten wurden 5,21 g feuchtes Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (L-Asparagin 37°C) des Enzymharzes

850 U (163 ^U/g Feuchtgewicht)

d. s. 4,4 % der eingesetzten Enzymaktivität.

Beispiel 17 Aktivierung von Sepharose ^ mit FCP

"Äquivalentverfahren"

24 g feuchte und wie in Beispiel 1 vorbereitete Sepharose ^ 4 B wurde in 20 ml Xylol und 20 ml Dioxan suspendiert und dabei auf O⁰C abgekühlt. Man gibt 10,9 ml 3-N-Natronlauge (32,6 m Mol) zu und anschließend im Laufe von 1 Stunde eine Lösung von 2,99 ml (5,0 g) FCP (29, 7m Mol) zu. Man rührt noch

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709847/0061

1 Stunde und arbeitet dann wie in Beispiel 1 beschrieben auf.

Elementaranalyse 2,8 % N

Beispiel 18

Penicillinase - Sepharose {-) - FCP

1,17g feuchte nach Beispiel 17 mit FCP aktivierte Sepharose ^ 4 B wurde in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und hierzu eine Lösung von 2,5 mg Penicillinase (aus B. cereus, 250 U) in 1 ml obigen Phosphatpuffers gegeben. Der Ansatz wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wie in Beispiel 3 beschrieben aufgearbeitet. Es wurden 1,63 g feuchts Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25 C) Filtrat und Waschlösungen 118 U
Enzymharz 130 U

80 /g Feuchtgewicht

d. s. 52 % der eingesetzten Aktivität oder 98 % des gebundenen Enzyms.

Beispiel 19

Aktivierung von Sepharose ^mit TFP

Perlförmige Agarose (Sepharose ^ 4 B der Pharmacia) wurden analog Beispiel 1 vorbereitet und mit 3 M-Natronlauge behandelt. Die bis zum ursprünglichen Volumen von 24 ml abgesaugte alkalische Sepharose wurde mit einer Injektions-

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spritze in etwa 12 Minuten in einer auf -3 bis O C abgekühlte Lösung von 5,13 g TFP (Tetrafluorpyrimidin) in 40 ml Xylol/Dioxan (1:1, w/w) eingetragen. Der Ansatz wurde insgesamt 30 Minuten gerührt und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 4,5 ml konz. Essigsäure abgebrochen. Die aktivierte Sepharose wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gewaschen und abgesaugt.

Die TFP-aktivierte Sepharose ist wie die FCP-aktivierte Sepharose so stark quervermetzt, so daß sie sich im Gegensatz zum Ausgangsmaterial beim Kochen nicht auflöst.

Elementaranalyse 7,29 % N

13.19 % F

Beispiel 19 a

Hexamethylendiamin an Sepharose TFP

2 g feuchte, nach Beispiel 19 mit TFP aktivierte Sepharose wurde im Rundkolben mit 5 ml 0,7 M-Hexamethylendiamin 20 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Produkt wurde abgesaugt, mit 250 ml Wasser, 100 ml 0,1 N-Natronlauge, 100 ml Wasser gewaschen und in einer Säule mit weiteren 500 ml Wasser eluiert. Das Produkt wurde abgesaugt. Mit Nitrin erhält man eine starke Färbung. Zur Elementaranalyse wurde das Produkt mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Analyse 6,24 %F
11,65 % N

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261952

Beispiel 19 b

Äthylmercaptan an Sepharose TFP

2 g feuchte nach Beispiel 19 mit TFP aktivierte Sepharose wurde mit Tetrahydrofaran gewaschen und in 3 ml Tetrahydrofaran, 1 ml Triäthylamin, 1 ml Äthylmercaptan gegeben. Der Ansatz wurde im Rundkolben 17 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abgesaugt, mit 100 ml Äthanol, 100 ml Äthanol/Wasser (1:1) gewaschen und schließlich in einer Säule mit 300 ml Äthanol eluiert. Das Produkt wurde abgesaugt und im Vakuum getrocknet.

Lassaigne Test stark positiv
Elementaranalyse 6,51 % S

8,74 % F

Beispiel 19 c

Penicillinase an Sepharose TFP

1 g feuchte nach Beispiel 19 mit TFP (Tetrafluorpyrimidln) aktivierte Sepharose 4 B wurde in 20 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und eine Lösung von 0,5 ml Penicillinase (110 U) zugegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden geschüttelt, dann abgesaugt und mit ogibem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid ausgewaschen. Nach dem Absaugen wurden 1,47 g feuchtes Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrat und Waschlösungen 15 U
Enzymharz 79 U

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(54 /g Feuchtgewicht)
d. s. 72 % der eingesetzten Enzymaktivität 85 % der Aktivität des gebundenen Enzyms

Beispiel 20 Aktivierung von Sepharose ^ mit TCP

Perlförmige Agarose (Sepharose ©4 B der Pharmacia) wurde analog Beispiel 1 vorbereitet und mit 3 M-Natronlauge behandelt. Die bis zum ursprünglichen Volumen von 24 ml abgesaugte, alkalische Sepharose wurde portionsweise in 12 Minuten bei Raumtemperatur in eine Mischung von 4,90 g Tetrachlorpyrimidin (TCP) in 40 ml Xylol/Dioxan (1:1 w/w) gegeben. Die Temperatur stieg hierbei bis auf 32 C. Der Kolben wurde durch einen Luftätrom gekühlt. Der Ansatz wurde noch 15 Minuten gerührt. Durch Zugabe von 4,2 ml konz. Essigsäure wurde die Reaktion gestoppt. Die aktivierte Sepharose ^ wurde abgesaugt und 4 mal mit je 50 ml Dioxan/ Xylol-Gemisch, 4 mal mit je 50 ml Dioxan und 1 1 Wasser ausgewaschen und in feuchter Form aufbewahrt. Eine Probe wurde mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Sie ergab folgende Analyse: 5,71 % Cl

2,23 % N

Beispiel 21 Hexamethylendiamin - Sepharose TCP

1,3 g feuchte, nach Beispiel 20 hergestellte, mit TCP aktivierte Sepharose ^ wurde im Rundkolben mit 10 ml einer wäßrigen Lösung von 0,35 M-Hexamethylendiamin versetzt und

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60 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Produkt wurde abgesaugt und in einer Säule mit 250 ml Wasser, 100 ml 1 M-Natronlauge und 250 ml Wasser ausgewaschen. Die substituierte Sepharose ®wurde abgesaugt, mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Analyse: 4,67 % Cl

3,27 % N Ninhydrin Test positiv.

Beispiel 22 Äthylenmercaptan - Sepharose TCP

1,3 g feuchte, nach Beispiel 20 hergestellte, mit TCP aktivierte Sepharose^ wurde mit Tetrahydrofuran gewaschen, abgesaugt und in 3 ml Tetrahydrofuran, 0,5 ml Triäthylamin und 0,5 ml Äthylmercaptan gegeben. Der Ansatz wurde im Rundkolben 60 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abqesauqt, in einer Säule mit Äthanol gewaschen, abgesaugt und im Vakuum getrocknet.

Lassaigne Test positiv Analyse 4,82 % Cl 1,04 % S

Beispiel 23 Penicillinase - Sepharose 4 B - TCP

1 g feuchte nach Beispiel 20 hergestellte TCP (Tetrachlorpyrimidin) aktivierte Sepharose ^ 4 B wurde in 20 ml 0,05

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Ά.

M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und eine Lösung von 1 ml Penicillinase (110 U) zugegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden gerührt und weiter wie in Beispiel 19 c beschrieben aufgearbeitet. Es wurden 1,36 g feuchtes Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25 C) Filtrat und Waschwasser 9 ü

Enzymharz 84 U (61 ü/g Feuchtgewicht)

d. s. 76 % der eingesetzten Enzymaktivität, 83 % der Aktivität des gebundenen Enzyms.

Beispiel 24 Aktivierung von Sephadex ^ mit FCP

Perlförmiges, vernetztes Dextran (Sephadex v-'G 50 der Pharmacia) wurde wie in Beispiel 1 für Sepharose beschrieben mit FCP aktiviert und aufgearbeitet. Die Elementaranalyse ergab einen Gehalt von 0,38 % N, 0,20 % F und 0,50 % Cl.

Beispiel 25

fr?)

Hexamethylendiamin an Sephadex ^ - FCP

2 g feuchtes, nach Beispiel 24 hergestelltes, FCP-aktiviertes Sephadex^ wurde analog zu Beispiel 2 mit 200 mg Hexamethylendiamin umgesetzt und aufgearbeitet.

Elementaranalyse: N 0,71 %

F 0,10 %
Cl 0,59 %

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709847/OG61

Beispiel 26 Äthy!mercaptan an Sephadex - FCP

2 g feuchts nach Beispiel 24 hergestelltes, FCP-aktiviertes Sephadex wurde analog zu Beispiel 5 mit einer Lösung von 7 ml Äthanol und 1 m-Äthylmercaptan umgesetzt und aufgearbeitet. Die Elementaranalyse ergab einen Gehalt von 0,29 % Schwefel.

Beispiel 27 Penicillinase-Sephadex ^G 50

0,20 g nach Beispiel 24 hergestelltes, getrocknetes, FCP-aktiviertes Sephadex ®G 50 wurde 1 Stunde bei 4° C mit 2 ml Wasser zur Quellung gebracht. Das gequollene Sephadex ©wurde in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und mit 1 ml einer Lösung von Penicillinase mit einer Aktivität von 220 U versetzt. Die Suspension wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Absaugen wurde das Harz mit obigem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid ausgewaschen. Es wurden 1,57 g (feucht) Enzymharz erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtrat und Waschwasser TO,1 ü

Enzymharz 79 ü (62 U/g Feuchtgewicht)

d. s. 44 % der eingesetzten Aktivität.

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TH

Beispiel 28 Aktivierung von Zellulose mit FCP

4 g Zellulose (Whatman CF 11) würde im Rundkolben mit 50 ml 3 M-Natronlauge versetzt und bei Raumtemperatur 18 Stunden rotiert. Die Zellulose wurde auf einer Glasfritte G 3 abgesaugt. Die Gesamtmenge wurde langsam zu einer auf 0 bis + 5 C gekühlten, mit einem Vibromixer gerührten Mischung aus Xylol und Dioxan (1:1, w/w) gegeben, die 7,19 g FCP enthält. Man läßt insgesamt 20 Minuten reagieren, und stoppt dann die Reaktion durch Zugabe von 5 ml konz. Essigsäure. Die aktivierte Zellulose wurde abgesaugt und 4 mal mit je 50 ml Xylol/ Dioxan (1:1), 4 mal je 50 ml Dioxan und 500 ml Wasser und Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum wurde folgende Elementaranalyse erhalten: N: 2,43 %, F: 2,43 %, Cl: 2,42 %

Beispiel 29

Hexamethylendiamin an Zellulose .

1 g feuchte nach Beispiel 28 hergestellte, mit FCP aktivierte Zellulose wurde mit 5 ml 0,35 M-Hexamethylendiamin in Wasser versetzt. Der Rundkolben wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Produkt wurde abgesaugt und mit 250 ml Wasser, 100 ml 1 N-Natronlauge, 250 ml Wasser und 100 ml Aceton gewaschen. Die Zellulose wurde im Vakuum getrocknet. Die Elementaranalyse ergab 3,99 %N, 0,36 % F, 2,51 % Cl

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Beispiel 30 Äthylmercaptan an Zellulose

0;5 g feuchte, nach Beispiel 28 mit FCP-aktivierte Zellulose wurden mit 1 ml Tetrahydrofuran, 0,5 ml Äthylmercaptan und 3 Tropfen Triäthylamin 21 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Produkt wurde abgesaugt, mit 250 ml Äthanol, 50 ml Wasser, 50 ml Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Elementaranalyse: 0,90 % F

2,35 % S

Beispiel 31 Trypsin - Zellulose - FCP

150 g feuchte nach Beispiel 28 hergestellte, FCP aktivierte Zellulose (Whatmann cF-11) wurde bei 4°C mit einer Lösung von 50 mg Trypsin (54, 5 U) in 0,01 M-Benzamidin-HCl, Phosphatpuffer nach Sörensen pH 6,0 susoendiert und 24 Stunden bei 4°C in einem rotierenden Kolben durchmischt. Nach der Kupplung wurde die Zellulose abgesaugt und mit 50 ml der obigen Phosphat-Benzamidinlösung pH 6 gewaschen. Nach erneutem Absaugen wurde die Enzym-Zellulose in 5 ml 1 M-Äthanolamin-HCl 0,01 M-Benzamidin-HCl pH 6 36 Stunden rotiert. Erneutes Absaugen und Waschen mit 0,005 M-Benzamidin-Hd pH 5,5. Es wurden 1,90 g feuchtes Trypsin-Zellulose erhalten. Enzymatische Aktivität (BAPNA, 25°C) Filtrat und Waschlösung 26,4 U

Trypsin-Zellulose 2,9 U (1,53 ü/g Feuchtgewicht) d.s. 5,3 % der eingesetzten Enzymaktivität

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Beispiel 32 Penicillinase-Zellulose

0,40 g nach Beispiel 28 hergestellte, getrocknete, FCP-aktivierte Zellulose wurden 1 Stunde bei 4°C mit 2 ml Wasser stehen gelassen. Die gequollene Zellulose wurde in 30 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und mit 1 ml einer Lösung von Penicillinase mit einer Aktivität von 220 U versetzt. Die Suspension wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Absaugen wurde die Zellulose mit obigem Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid gewaschen. Es wurden 0,76 g Feuchtgewicht Zellulosegebundenes Enzym erhalten.

Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25 C) Enzym; Zellulose-gebunden 95 ü (125 ü/g Feuchtgewicht) d. s. 43 % der eingesetzten Aktivität.

Beispiel 33 Aktivierung von Polyacrylamid mit FCP

1 g perlförmiges Polyacrylamid (Bio-Gel ^R P - 300, 100 200 mesh wet von Bio Rad) wurde 5,5 Stunden in Wasser gequollen, abfiltriert, im Rundkolben mit 80 ml 1 N-Natronlauge versetzt und bei Raumtemperatur 15 Minuten rotiert. Das Harz wurde abgesaugt und portionsweise zu einer Lösung von 4,72 g FCP in 40 ml einer Mischung von Xylol und Dioxan (1:1, w/w) zugefügt. Die Suspension wurde durch einen Vibromischer gerührt und von außen durch einen Luftstrom gekühlt. Das Gel wurde innerhalb von 10 Minuten eingetragen.¹ Die Temperatur stieg hierbei von 23,5 auf 29°C. Nach weiteren 15 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 3 ml konz. Essigsäure abgebrochen. Das Harz wurde 4 ml mit je 50 ml

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Xylol/Dioxan-Gemisch,. dann mit 250 ml Dioxan/Wasser (1:1) gewaschen. Eine dicke Suspension des Harzes in Dioxan/Wasser wurde unter gutem Rühren in Tetrahydrofaran gegossen, abfiltriert und mit Tetrahydrofuran gewaschen. Das Produkt kann im Vakuum getrocknet werden.

Beispiel 34 Äthy!mercaptan an Polyacrylamid - FCP

2,5 g des Tetrahydrofuran-feuchten, nach Beispiel 33 mit FCP aktivierten Polyacrylamid wurden mit 3 ml Tetrahydrofuran, 1 ml Äthylmercaptan und 1 ml Triäthylamin versetzt und 14 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abgesaugt, mit Äthanol gewaschen und in einer Säule weiter mit 250 ml Äthanol extrahiert. Das gewaschene Produkt wurde abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Lassaigne Test positiv
Elementaranalyse: 0,44 % Schwefel

Beispiel 35 Penicillinase an Polyacrylamid - FCP

100 mg trockenes nach Beispiel 33 mit FCP aktiviertes Polyacrylamid wurde in 20 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und 0,5 ml einer Lösung von Penicillinase (110 ü) zugegeben. Die Suspension wurde über Nach bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Enzymharz wurde abgesaugt und mit obigem Phospahtpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid gewaschen. Es wurden 2,59 feuchtes Enzymharz erhalten. Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Filtirat und Waschlösungen 85 U
Enzymharz 22,4 U

(8,6 ü/g Feuchtgewicht)

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d.s. 20 % der eingesetzten Enzymaktivität oder 90 % des gebundenen Enzyms.

Beispiel 36 Aktivierung von Ionenaustauschern mit FCP

20 g mit Methanol und Wasser gewaschener schwach basischer, makroporöser Ionenaustauscher auf Basis Polytyrol mit primären Aminogruppen (NKZ-4) wurde in 150 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 6 suspendiert und das pH mit etwas 1 N-Salzsäure auf 6 eingestellt, unter Rühren bei Raumtemperatur läßt man in

1 Stunde eine Lösung von 2 ml FCP in 20 ml Dioxan zutropfen. Der pH-Wert wurde hierbei durch Zugabe von 0,1 N-Natronlauge auf pH 6 konstant gehalten. Anschließend wurde das Harz noch 30 Min. gerührt, dann abgesaugt und mit einer Lösung von 0,1 M-Essigsäure, 0,5 M-Natriumchlorid und Wasser gewaschen. Ausbeute 2,2 g Harz. Das FCP-aktivierte Harz wird am besten gleich anschließend zur Kupplung verwendet. Bei der Lagerung im fuechten Zustand bei 4°C nimmt die Fähigkeit zur Enzymkupplung um etwa 10 % pro Tag ab.

Beispiel 37 Penicillinase am NKZ-4-FCP

2 g feuchte nach Beispiel 36 hergestellten, mit FCP aktiviertes^ Polystyrolharz (NKZ 4-FCP) wurde in 40 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und mit einer Lösung von 5 mg Penicillinase (440 ü) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 28 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und wie in Beispiel 35 beschrieben aufgearbeitet. Es wurde 2,33 g Enzyharz erhalten.
Enzymatische Aktivität (Benzylpenicillin, 25°C) Enzymharz 180 U

(77 ü/g Feuchtgewicht) d.s. 41 % der eingesetzten Enzymaktivität.

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Beispiel 38 Aktivierung von Ionenaustauschern mit FCP

Aminomethyliertes Polystyrolharz (NKZ-2) wurde 2 Tage bei 40°C und anschließend 2 Tage im Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet. 10 g trockenes Harz wurden bei 0-5 C zu einer Lösung von 10 g FCP in 50 ml Toluol gegeben. Das Harz wurde mit einem Vibromischer suspendiert und 5,55 ml Triäthylamin zugetropft. Nach insgesamt 1 Stunde wurde die Reaktion durch Zugabe von 3 ml konz. Essigsäure abgebrochen. Das Harz wurde abfiltriert, 5 mal mit je 50 ml Toluol, 5 mal mit je 50 ml Diäthylather gewaschen, abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Das trockene Harz wurde im Kühlschrank gelagert.

Beispiel 39 Äthylmercaptan an aminomethyliertes Polystyrol - FCP

2 g trockenes nach Beispiel 38 mit FCP aktiviertes aminomethyliertes Polystyrolharz (NKZ-2) wurde mit 3 ml Tetrahydrofuran, 1,5 ml fithylmercaptan, und 1,6 ml Triäthylamin versetzt und 28 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Harz wurde abgesaugt und mit Äthanol und Diäthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Elementaranalyse: 0,44 % Schwefel.

Beispiel 40 Penicillinase an NK Z-2-FCP

3 g nach Beispiel 38 hergestelltes, mit FCP aktiviertes, getrocknetes Polystyrolharz (NKZ-2-FCP) wurde in 25 ml Phosphatpuffer pH 7,0 nach Sörensen suspendiert und eine Lösung von 10 mg Penicillinase (880 U) zugegeben. Das Reaktionsge-

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misch wurde 28 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Harz wurde abgesaugt, mit obigem Puffer gewaschen und zur vollständigen Entfernung des reaktiven Halogens noch 1 Stunde in 25 ml einer 1 M-Äthanolaminlösung pH 8,0 bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Harz wurde abgesaugt und wie üblich mit Phosphatpuffer mit und ohne Zusatz von 0,5 M-Natriumchlorid ausgewaschen. Es wurde 6,4 g Enzymharn erhalten. Enzymatische Aktivität {Benzylpenicillin, 25°C) Filtrate und Waschlösungen 13 U

Enzymharz 163 ü (25,5 ü/g Feuchtgewicht)

d.s. 18,5 % der eingesetzten Enzymaktivität.

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709847/006]

Claims

Patentansprüche

12 3 4 in welcher die Sübstituenten R , R , R und R unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben können: Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl (C₁-C₄),Alkoxy (C₁-C₄), Alkylthio (C₁-C₄), Acylamino (C₁-C₄), Nitro, Cyano, Carbonamido, Alkylsulfonyl (C₁-C₄), Alkoxycarbonyl (C₂-Cg),Phenyl, Trifluormethyl, Chlormethyl sowie T-X,wobei T-X einen Trägerrest eines polymeren Trägers und X für Sauerstoff, Schwefel, NH, NR (R=Alkyl (C₁-C.)), CONH oder CONR steht, wobei mindestens ein

14 und höchstens zwei der Reste R bis R für T-X steht

1 4 und wobei zwei der Reste R bis R für einen bivalenten

Trägerrest _x stehen können.
^NX

2. Aktivierte polymere Träger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Trägerresten T-X bzw. /^X

TC^ um mono- bzw. bivalente Reste folgender Trägerstoffe handelt: Agarose, quervernetztes Dextran, Zellulose, Polyacrylamid, aminomethyliertes Polystyrolharz.

(^3^/Verfahren zur Herstellung von aktivierten polymeren Trägern der Formel

(D

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INSPECTED

12 3 4 in welcher die Substituenten R , R , R und R unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben können: £ Q I 3 Q 4 I Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl (C₁-C₄), Alkoxy (C₁-C₄), Alkylthio (C₁-C₄), Acylamino (C₁-C₄), Nitro, Cyano, Carbonamido, Alkylsulfonyl (C₁-C₄), Alkoxycarbonyl (C₂-C_g), Phenyl, Trifluormethyl, Chlormethyl

sowie T-X/wobei T-X für einen Trägerrest eines polymeren Trägers und X für Sauerstoff, Schwefel, NH, NR (R=Alkyl (C₁-C₄)) ein und höchstens zwei der Reste R bis R für T-X steht und

•I A

wobei zwei der Reste R bis R für einen bivalenten Trägerrest T stehen können, dadurch gekennzeichnet, daß man einen ^

polymeren OH-, -SH, -NH₃, -NHR (R=Alkyl (C₁-C₄J)₇-CONH₂ oder -CONHR-Gruppen-haltigen polymeren Träger in einem organischen oder organisch-wäßrigen Lösungsmittel gegebenenfalls unter Zusatz von Basen bei Temperaturen zwischen -10 und +30 C mit einem Halogenpyrimidin-Derivat der Formel

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in welcher die Reste R , R ,R und R unabhängig voneinander eine der folgenden Bedeutungen haben können:

Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl (C₁-C₄), Alkoxy (C₁-C₄), Alkylthio (C₁-C₄), Acylamino (C₁-C₄), Nitro, Cyano, Carbonamido, Alkylsulfonyl (C₁-C₄), Alkoxycarbonyl (C₂-Cg), Phenyl, Trifluormethyl, Chlormethyl;

1 L und wobei mindest zwei der Reste R bis P. für Halogen stehen, umsetzt.

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