JPS58872B2 - フヨウセイ ノ セイブツガクテキカツセイカゴウブツ ノ セイゾウホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、不溶性の生物学的に活性な化合物の製造方法
に関するものである。

多孔質ガラス、セルロースおよびその誘導体、澱粉、ポ
リスチレン誘導体、無水マレイン酸とエチレンとの共重
合体、ポリアクリルアミドおよび多糖類は、酵素、補酵
素、酵素抑制体、ホルモン、抗原、免疫活性化合物など
の生物学的に活性な化合物の不溶化に使用されてきた。

しかしながら、これらの材料のほとんどは、機械的強度
および加水分解安定性が低く、また担体表面が疎水性で
あるという欠点を有している。

この低い機械的強度のため、ゲルカラムを通過する高い
流速のための条件である加圧下での運転が不可能となる
。

多糖類の他にも、生物学的活性化合物が埋装された僅か
に架橋した三次元網状重合体もまた低い機械的強度を有
している。

さらに、三次元網状構造は拡散プロセスのために埋装さ
れた化合物の生物学的活性にしばしば強く影響する。

例えば多糖類などの低い加水分解安定性は、酵素の不溶
化の場合には望ましくない。

基質と担体に結合した生物学的活性化合物との反応が、
（例えばポリスチレンにおける）担体表面の不充分な親
水性により、あるいはその表面における不特定の収着に
より複雑となるような場合も知られている。

固定された生物学的活性化合物の利点を、不溶性酵素を
例にとって示す。

医薬品および食品工業における化学反応の触媒として使
用される酵素の世界中の年間生産量は千トン以上である
。

しかし、その製造の困難性、比較的高価であること、安
定性が低いことおよび特に不経済な利用方法のために、
工業的規模でのその広範な利用が妨げられている。

これは、最近の方法がいったん使用した酵素の回収がで
きないからである。

酵素の回収および反復使用は、回分方法においてもまた
連続方法においても、可溶性酵素を重合体担体に結合す
ることによって可能となる。

本発明は、実質的に疎水性の巨大多孔質重合体もしくは
共重合体の薄い表面層においてのみ、表面的な加水分解
およびその後の活性化処理により、重合体担体に生物学
的活性絡合物と結合しうる活性無水物基を形成せしめ、
引き続いて該担体を生物学的活性化合物と反応せしめる
ことからなる。

上記活性化処理は、減圧下での加熱により、または脱水
剤の作用により、遊離のカルボキシル基を無水物基に変
換することからなる。

本発明によれば、不溶性の生物学的活性化合物は、アル
キレンジアクリレート、アルキルメタりリレート、オリ
ゴ−もしくはポリグリコールジアクリレート、オリゴ−
もしくはポリグリコールジアクリレート、アルキレンジ
アクリルアミド、ヒドロキシアルキルアクリレート、ヒ
ドロキシアルキルメタクリレート、アルキルメタクリレ
ート、オリゴ−もしくはポリグリコールモノアクリレー
ト、オリゴ−もしくはポリグリコールモノメタクリレー
ト、アルキルメタクリレート、アクリロニトリル、メタ
クリレ−ドリルの重合体もしくは共重合体、さらに上記
単量体とビニルアニリン、ビニルピリジン、ビニルカル
バゾールなどのビニル単量体との共重合体からなり、表
面的に親水性化された実質的に疎水性で非膨潤性の巨大
多孔質重合体担体と結合させることによって製造できる
。

このような巨大多孔質重合体もしくは共重合体は、部分
加水分解によって表面的に親水性化され、ついでヒドロ
キシル基、アミノ基もしくはカルボキシル基と反応する
化合物、例えば臭化シアン、カルボン酸の無水物もしく
は塩化物、ジイソシアネートまたはインチオシアネート
により処理することによって、あるいは隣接するカルボ
キシル基を無水物基へ変換する処理によって活性化する
。

このようにして得られた親水性化および活性化されたゲ
ルは、ついで可溶性の生物学的活性化合物と反応せしめ
、該化合物の全活性を保持したまま、共有結合によって
不溶化せしめる。

上記加水分解は、酸性またはアルカリ性媒体中で行なわ
れる。

アルカリ性媒体中で行なう場合には、６０〜１３０℃、
３０〜１２０分間の条件で２〜ＩＯＭ水酸化ナトリウム
が好適に使用される。

本発明は、無水物の反応性基を有する重合体に関するも
のであるが、特にその範囲を限定されるものではない。

カルボン酸無水物は、低分子量化合物の有機化学におい
て重要なアシル化剤であり、その応用は例えばヒドロキ
シル基またはチオール基の反応において見い出されてい
る。

無水物への変換は、親水性化された重合体もしくは共重
合体を、０．２〜０．０１Ｔｏｒｒの圧力下２００〜２
５０℃の温度で３０〜３００分間加熱することによって
できる。

これらの反応の高分子同族体については、はんのわずか
に研究されているにすぎない（米国特許第２，９６７．
１７５号明細書、英国特許第８１５，８２１号明細書お
よび西独特許第１，１０９，３７３号明細書）。

現在までに発表されている研究は全て、重合体無水物に
相当する単量体、即ち無水マレイン酸、アクリル酸もし
くはメタクリル酸の無水物から製造された重合体無水物
だけが使用されている。

これに対し、本発明によれば、高濃度の重合体無水物が
通常の重合体即ちポリアクリル酸もしくはポリメタクリ
ル酸のエステルもしくはニトリルからなる重合体の親水
性化された表面層において生成される。

一方、本発明の出発物質である実質的に疎水性（疎水性
もしくは低親水性）の重合体は親水性重合体に比べて機
械的性質において優れている。

したがって、本発明においては、該機械的性質に優れた
疎水性重合体の表面層を親水性化し、また隣接するカル
ボキシル基を無水物基に変換して活性化するため、該親
水性化された表面と反応性基を有する重合体担体が生物
学的活性化合物と良好に結合するだけでなく、その容易
かつ効果的な利用が可能となる。

すなわち、本発明によって製造される最終重合体担体は
、疎水性出発材料の良好な機械的性質と親水性化層の良
好な反応性を併せ持つという顕著な利点を有する。

なお、前記のように処理して形成された反応性無水物基
は第一アミン基と共有結合によって結合することができ
、この第一アミン基を常に有するタンパク質から形成さ
れる生物学的活性化合物、例えば酵素、補酵素、酵素抑
制体、抗原、ホルモン、免疫活性化合物、抗生物質など
は本発明に従って不溶化することができる。

本発明の方法には、高度に架橋した重合体が最も適して
いる。

しかしながら、ある種の完全に非膨潤性の重合体、例え
ばポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレートな
ども非架橋状態または僅かに架橋した状態で使用できる
。

架橋は、架橋剤の添加によるだけでなく、特にアクリロ
ニトリルにおいては連鎖移動によっても達成される。

種々の濃度の無水物基を有する重合体が、本発明に従っ
て簡単な方法で製造できる。

たとえば、重合体エステルまたはニトリルは、８０〜１
３０℃の温度で２〜９Ｍの水酸化ナトリウムの作用によ
り０．５〜２時間で所望の程度まで加水分解される。

この反応は、微小ブロック、有利にはアイツタクチイッ
ク構造を有する領域で進行することが知られている。

好ましい六員の無水物環に閉環する能力を有する個所が
、このようにして表面の親水性化された層内に生成する
。

これは単量体酸の共重合によっては達成できない。

なぜならば、単量体酸の共重合によれば鎖中のカルボキ
シル基の生成がランダムであり、環状無水物の生成可能
性が抑制されるためである。

本発明の一方法によれば、部分アルカリ加水分解に続け
て酸処理がなされ、これによりカルボキシル基がＨ十型
に変えられる。

最終的には０．ＩＴｏｒｒ以下の圧力および２００〜２
５０℃の温度での加熱脱水による無水物の形成、あるい
は公知の脱水剤、例えば２０〜１４０℃の無水酢酸また
は一１０〜＋２０℃のチオニルクロライドによる処理が
行なわれる。

後者の二つの反応は、好ましくはピリジンまたはその他
の酸アルカリ触媒により促進される。

生成した反応性無水物基は、赤外線スペクトル（１７８
５Ｃｍ−１および１０５０ｃｍ−１における帯域）によ
り確認できる。

以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明は下記実施例により何ら限定されるものではな
いことはもとよりである。

実施例１ ９０重量％のエチレンジメククリレートおよび１０重量
％の２−ヒドロキシエチルメタクリレートよりなり、２
０９ｍ／ｇの比表面積を有する低親水性巨大多孔質ゲル
２．５部を、１０部の９Ｍ水酸化ナトリウムとともに１
２５℃で１時間加熱して親水性化した。

このようにしてえられた表面的に親水性化されたゲルを
瀘過し、２００部の２Ｍ塩酸でＨ＋型に転換し、完全に
水洗し、真空炉内で乾燥した。

反応性無水物基は、表面的に親水性化された共重合体を
０．ＩＴｏｒｒの圧力に２３０℃の温度で４時間加熱さ
せることにより生成した。

この脱水されたゲルは、ｐＨ７，５の２Ｍのリン酸緩衝
溶液７５部中で膨潤させ、その混合物を冷却し、撹拌し
ながら２５部の２Ｍのリン酸塩緩衝溶液に１部のキモト
リプシンを加えた溶液中に添加した。

反応混合物を撹拌し、氷を用いて４℃に２４時間冷却し
た。

化学的に酵素と結合したこのゲルを、ついで吸引し、緩
衝溶液および水で洗浄し、４ｏ。

部の０．１Ｍのホウ酸ナトリウム溶液およびＩＭの食塩
溶液（ｐＨ８，５）およびさらに３００部のｏ、ｏＩＭ
の酢酸ナトリウム（ｐＨ４，１）で洗浄して活性化した
。

この方法で調製された不溶化された酵素の濃度は、１ｍ
ｌのゲル当り３ｍ９であった。

結合した酵素は、エステラーゼおよびたんばく質活性を
示した。

Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンエチルエステルにより測定
した不溶化酵素のエステラーゼ活性は４２０μｍｏｌ／
ｍｉｎ・１ｍｌであった。

実施例２ 粒径０．１〜０．２ ｍｍの低親水性巨大多孔質ポリ（
エチレンジクリレート）２．４部を、１０部の９Ｍ水酸
化ナトリウム中で膨潤し、１３０℃の温度に０．５時間
加熱して加水分解した。

ついて、これをＨ＋型に変え、０．１Ｔｏｒｒの圧力下
に２２５℃で４時間加熱して脱水しだ。

キモトリプシンを、実施例１と同様の方法で１ｍｌのゲ
ル当り１．５ｍ９だけ、このゲルに結合させた。

そのエステラーゼ活性は２１０μｍｏｌ／ｍｉｎ。

１ｍｌであった。

実施例３ エチレンジメタクリレートと５０重量％の２−ヒドロキ
シエチルメタクリレートよりなり、９７．２ｍ３／ｇの
比表面積を有する低親水性巨大多孔質共重合体２．５重
量部を、９Ｍの水酸化ナトリウムにより１２５℃で２時
間加水分解した。

このゲルをＨ＋型に変え、０．０５Ｔｏｒｒの圧力下に
２００℃の温度で４時間加熱して表面の無水物層を形成
させた。

キモトリプシンを、実施例１と同様の方法で１ｍｌのゲ
ル当り７．６■の活性化酸素となるようこの活性ゲルに
結合させた。

そのエステラーゼ活性は１０６４μｍｏｌ／ｍｉｎ。

１ｍｌであった。

実施例４ ジエチレンゲルコールジメタクリレート５０重量％を含
有するジエチレングリコールメタクリレートゲル２．５
重量部を、１０部の９Ｍ水酸化ナトリウムにより８０℃
で２時間加水分解した。

反応終了後、このゲルを濾過し、２００部の２Ｍ塩酸に
よりＨ＋型に変え、水洗し、０．０５Ｔｏｒｒで７８０
℃で乾燥した。

表面的に加水分解されたゲルを、２．５部のピリジンを
含有する２００部のジエチルエーテル中に分散させた。

１０部のジエチルエーテル中の２．５部の無水酢酸を前
記分散液に加え、室温で４時間撹拌した。

ついで、このゲルをガラスフィルター上で吸引し、１０
０部の氷水および１０部のエタノールで洗浄し、吸引濾
過し、真空乾燥するか、あるいは実施例１と同様の方法
で直ちに転化した。

実施例５ エチレンジアクリレートおよび５０重量％の２−ヒドロ
キシエチルメタクリレートより調製された巨大多孔質共
重合体２．５重量部を、実施例１と同様の方法で加水分
解し、表面的に加水分解されたゲルを、洗浄し、さらに
化学的処理を施すことなく乾燥したのち、還流しながら
５部の無水酢酸とともに１１８〜１４０℃に加熱した。

反応終了後、分散液を０℃に冷却し、濾過し、ゲルを１
００部の氷水およびエタノールで洗浄し、真空乾燥した
。

このようにして活性化されたゲルを、７５部のリン酸塩
緩衝溶液（ｐＨ７，５）中で膨潤し、その混合物を冷却
し、２５部の緩衝溶液に１部のトリプシンを加えた溶液
を撹拌しながら添加した。

この混合物を４℃で２４時間撹拌し、ついで実施例１と
同様の方法で親液化した。

実施例６ ７５重量％のエチレンジメタクリレートおよび２５重量
％の２−ヒドロキシエチルメタクリレートよりなり、１
５９．７ｍ２／９の比表面積を有する低親水性巨大多孔
質ゲル２．５重量部を１０部の９Ｍ水酸化ナトリウム中
で膨潤させ、１００℃の温度で２時間にわたって表面的
に加水分解した。

ついで、このゲルを完全に水洗し、恒量になるまで乾燥
した。

転化されたゲルを、２０部のジエチルエーテル中に分散
した。

この分散液を一１０℃に冷却し、５部のジエチルエーテ
ルに０．５部のチオニルクロライドを加えた溶液を撹拌
しながら滴下した。

チオニルクロライド溶液添加後、直ちに食塩が沈澱した
。

このゲルをさらに一１０℃で撹拌し、ガラスフィルター
上で吸引ア過し、１００部の氷水および１０部のエタノ
ールで洗浄し、吸引濾過し、真空乾燥するか、あるいは
実施例１に記載した転化操作を行なうことなく使用した
。

実施例７ エチレンジメタクリレートと１０重量％の２−ヒドロキ
シエチルメタクリレートより調製された低親水性巨大多
孔質ゲル２．５重量部を、１０部の９Ｍ水酸化ナトリウ
ムとともに１２５℃の温度で１時間加熱して親水性化し
た。

このようにして調製された親水性化ゲルを沢過し、２０
０部の２Ｍ塩酸でＨ＋型に変え、水で完全に洗浄した。

ついで、このゲルを１０部の蒸留水中に撹拌添加し、使
用直前に調製した１０部の１０％臭化シアン水溶液を、
連続的に撹拌しながら分散液中に滴下した。

臭化シアン溶液添加後、この分散液を、４Ｍの水酸化ナ
トリウムでｐＨ１１に調節し、室温で連続的に撹拌しな
がら４Ｍの水酸化ナトリウムをさらに添加して１２分間
このｐＨを保持した。

ついで、この分散液をできるだけ速く濾過し、２００部
の氷冷した０、１Ｍの炭酸水素ナトリウムを用いてガラ
スフィルター上で洗浄した。

このゲルを吸引濾過し、１０ｍ１の０．１Ｍの炭酸水素
ナトリウム中に分散し、１ｇの個体状キモトリプシン添
加後、４℃で２４時間撹拌した。

酸素と化学的に結合したゲルヲ、ツいで、吸引濾過し、
４００部の０．１Ｍのホウ酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，
１）、３００部の０．１Ｍの酢酸ナトリウム−１Ｍ塩化
ナトリウム（ｐＨ４０４）および３００部の０．０１Ｍ
の酢酸ナトリウム（ｐＨ４，１）で洗浄して活性化した
。

この方法で不溶化された酵素は、エステラーゼおよびた
んばく質の両活性を示した。

実施例８ 粒径１００〜２００μを有する疎水性巨大多孔質メチル
メタクリレート−エチレンジメタクリレート共重合体を
、表面的に親水性化し、活性化し、実施例１の方法によ
りキモトリプシン不溶化に使用した。

結合した酵素の濃度は、１ｍｌの酵素当り１．４ｍ９で
あった。

そのエステラーゼ活性は３２２μｍｏｌ／ｍｉｎ・１ｍ
ｌであった。

実施例９ ５０重量％のアクリロニトリルおよび５０重量％のエチ
Ｌンジメタクリレートよりなる巨大多孔質疎水性共重合
体を、実施例１の方法により親水性化し、かつ、活性化
し、酵素の不溶化に使用した。

実施例１０ ５３重量部のアクリロニトリルおよび４７重量部の６５
％の無色硝酸の混合物を、０．１ｇのアンモニウムパー
オキソジサルフエート、０．３ｇのジメチルアミノエチ
ルアセテートおよび０．００５ｇ硝酸銀で開始し、パー
オキソジサルフエートと硝酸銀とは１０％の水溶液とし
て使用した。

重合は、酸素を除去したガラス管中で１５℃で５日間行
ない、溶液は白色の塊状物に変わり、これは重合中の収
縮により前記管から容易に除去できた。

筒状の多孔性ポリアクリロニトリルを、最初流水で１日
間洗浄し、ついで、このような方法で１％炭酸水素ナト
リウム溶液を数回変え、洗浄液をポリエチレンジャケッ
トで厳重に囲まれた管を通して吸引した。

ついで、アルカリ性加水分解を、多孔性カラムを通して
９０℃に緩めた６Ｍの水酸化ナトリウム溶液を吸引し、
つづいて蒸留水を吸引して行なった。

ついで、温風を通してカラムを通し、冷却し、冷却ジエ
チルエーテルで一１０℃で洗浄し、かつ、−１０℃に冷
却しながら冷却した１０％のエーテル性チオニルクロラ
イド溶液とともに吸引により浸漬し、活性な無水物基を
形成させた。

ついで、エーテルを吸引炉別し、蒸留水をカラムに通し
て吸引して中性反応にした。

このカラムは、この状態で前記実施例に記載した方法に
より生物学的活性化合物の固定用に使用された。

実施例１１ ３０部のアクリロニトリル、２０部のメチルメタクリレ
ート、１０部のジビニルベンゼンおよび４０部のトルエ
ンよりなる混合物を、０．２部のアブビスイソブチロニ
トリルで開始し、７５℃で飽和食塩水中で懸濁共重合を
行なった。

８時間後に、この懸濁物を分離し、エーテルで洗浄し、
乾燥し、カラム中に充填し、これに１００℃の暖めた５
Ｍ水酸化ナトリウムを閉回路で１時間循環した。

ついで、この重合体を、カラム中で蒸留水で洗浄して中
性反応にし、温風を吸引して乾燥し、冷却エーテルおよ
びチオニルクロライド溶液で洗浄し、さらに実施例１０
により処理した。

疎水性重合体の表面における加水分解層の厚さは、加水
分解剤の濃度および処理温度および時間の両者に左右さ
れる。

したがって、これらの条件は、公知の原理、たとえば、
温度が高ければ高いほど低い薬剤濃度が用いられるか、
あるいは処理時間が短かければ短かいほど高い温度が用
いられるような方法で任意に変えることができる。

本発明は、前記実施例により与えられた条件になんら限
定されるものではない。

アルカリ性加水分解の他に、酸性加水分解も、硫酸また
は塩酸のような強酸を用いて行なうことができる。

この場合、重合体のＨ十型への転化は省略できる。

しかしながら、より希薄な酸および高温をニトリル基の
加水分解には使用しなければならず、さもなければ、ア
ミド基が圧倒的に生成する。

したがって、ニトリルよりも不飽和酸のエステル重合体
に酸性加水分解はより適している。

本発明は、つぎの実施の態様を包含するものである。

（１）表面的加水分解は、アルカリ性媒体中で重合体技
体を加熱することにより行なわれる特許請求の範囲記載
の方法。

（２）表面的加水分解は、２〜ＩＯＭの水酸化ナトリウ
ム濃度で行なわれる特許請求の範囲記載の方法。

（３）表面的加水分解は、６０〜１３５℃の温度で３０
〜１２０分間行なわれる前記第２項記載の方法。

（４）遊離のカルボキシル基が、０．２〜０．０１Ｔｏ
ｒｒの圧力下に２００〜２５０℃の温度で親水性化され
た重合体または共重合体を加熱することにより無水物基
に転化される特許請求の範囲記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルキレンジアクリレート、アルキレンジメタクリ
   レート、オリゴ−もしくはポリグリコールジアクリレー
   ト、オリゴ−もしくはポリグリコールジメタクリレート
   、アルキレンジアクリルアミド、ヒドロキシアルキルア
   クリレート、ヒドロキシアルキルアクリレート、オリゴ
   −もしくはポリグリコールモノアクリレート、オリゴ−
   もしくはポリグリコールモノメタクリレート、アルキル
   メタクリレート、アクリロニトリル、メタクリレ−ドリ
   ルの重合体もしくは共重合体およびさらに前記化合物と
   ビニル化合物との共重合体から選ばれた疎水性もしくは
   低親水性の重合体または共重合体である巨大多孔質重合
   体担体を表面的に加水分解し、上記巨大多孔質重合体担
   体の薄い表面層を親水性化せしめ、 このように表面的に親水性化した担体を、減圧下で加熱
   することによって、あるいは臭化シアン、カルボン酸の
   無水物および塩化物、ジイソシアネート、インチオシア
   ネートからなる群から選ばれヒドロキシル基、アミン基
   もしくはカルボキシル基と反応する化合物または脱水剤
   で処理することによって活性化処理し、上記担体の薄い
   表面層において遊離のカルボキシル基を生物学的に活性
   な化合物を結合しうる無水物基に変換せしめ、ついで親
   水性化しまた活性化した重合体担体を、第一アミン基を
   含有するタンパク質から形成されて成る生物学的に活性
   な化合物と反応せしめ、共有結合を通じて上記生物学的
   に活性な化合物を不溶化せしめる ことを特徴とする生物学的活性化合物と巨大多孔質重合
   体担体との共有結合によって結合された不溶性の生物学
   的活性化合物の製造方法。