JPH0816135B2 - 生物学的に活性な物質の固定化用担体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、主として球状の多孔性粒子の形態であり、
その構造がエポキシド基を含有している単量体、架橋用
単量体、および適宜その他のモノエチレン状不飽和単量
体を基礎としている架橋重合体に関する。この種の重合
体は生物学的に活性な物質の固定化（immobilization）
用の担体物質として特に適している。

〔従来の技術〕 生物学的に活性な物質（例えば、酵素、抗体、抗原、
ホルモンなど）の重合体からなる担体物質上での、それ
らの活性を保持したままの、共有結合を介しての固定化
（この手段により、例えば酵素を安定化または精製する
かこれらを水に不溶にする）は公知である。この方法で
固定化した生物学的に活性な物質は可溶性の形態のもの
と比べてかなりの利点をもたらす：一つは、反応の完了
後の、沈降による取出し（removability）が平易にな
り、他方生成物の安定性と再使用性が増大する。

生物学的に活性な物質の結合に使用できるオキシラン
基の親水性重合体への導入も公知である（西独国特許出
願公開第2,102,514号を参照）。該親水性重合体はアク
リルアミド基を含有しているものを含む。しかしなが
ら、これらの担体はビーズ状の形態と多孔性構造を欠
く。よつて、例えば、これらはカラム法に使用するには
適さない。

反応基を含有している単量体、架橋用単量体、および
親水性単量体の共重合によつて得られる膨潤性の架橋し
たビーズ状重合体も担体物質として記載されている（西
独国特許出願公告第2,237,316号を参照）。この中に記
載されている反応基はハロゲノアルキル、エポキシド、
塩化カルボニル、カルボン酸無水物、カルボニルアジ
ド、カルボン酸フエニルエステル；およびヒドロキサム
酸基である。しかしながら、これらの担体物質は多くの
欠点を有している；たとえば、これらのいくつかによる
生物学的に活性な物質の固定化はどちらかというと冗長
な方法である；これらのいくつかの活性度は不十分で、
さらには酸無水物の変異体を使用するとき、望ましくな
いカルボキシル基の形成が起る。

さらに、（メタ）アクリルアミドおよび／またはメチ
レンビス（メタ）アクリルアミド、および適宜、さらに
ラジカル重合を受けることができる共単量体からなる架
橋ホモまたは共重合体から成るビーズ状重合体（西独国
特許出願公告第2,722,751号を参照）が公知である。こ
れらの重合体も、重合して含まれた例えば、グリシジル
メタクリレートまたはアリルグリシジルエーテルのため
に、生物学的に活性な化合物用の担体として有用であ
る。しかしながら、これらは有機溶媒をこれらの製造に
おける懸濁剤として使用されるべきであることと水中で
機能することが不可能であるという欠点がある。

グリシジルエステルおよびグリシジルエーテルを含有
している親水性ラテツクス粒子は、同様に生物学的およ
び／または免疫的に活性な物質の共役結合に適すること
も公知である（欧州特許出願公開第0,054,685号を参
照）。しかしながら、多くの目的にとつてこれらのラテ
ツクス粒子は、例えばカラム法で容易に使用できるビー
ズ状の重合体よりも適当なものではない。

同様に公知のものは、グリシジルアクリレート、グリ
シジルメタアクリレート、およびアリルグリシジルエー
テルを同じく含有し、かつトリビニル単量体で架橋され
た重合体である（欧州特許第0,146,329号を参照）。し
かしながら、酵素を結合するこれらの能力はごく弱い。

欧州特許第0,058,767号はビーズ状で、かつオキシラ
ン基を含有している重合体の製法であつて、その中では
単量体が特殊な溶媒混合物中で重合化されるものを開示
している。しかしながら、不利な逆（inverse）ビーズ
重合を使用することが再度必要である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従つて、非常に回りくどくない方法で製造でき、かつ
生物学的に活性な化合物を結合する非常に優れた能力を
もつところの、生物学的に活性な物質、例えば酵素、の
固定化のための重合体を発見することが課題であつた。

これはエポキシド基を含有している単量体、架橋用重
合体、および適宜その他のモノエチレン性不飽和単量体
から製造された架橋重合体の使用によつて達成された。

よつて、本発明は、Ａ）グリシジルアクリレート、グ
リシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、
および／またはビニルグリシジルエーテルに由来する単
位の１〜70重量％、Ｂ）N,N′−ジビニルエチレン尿素
および／またはN,N′−ジビニルプロピレン尿素に由来
する単位の99〜30重量％から実質的になり、この単位の
合計は常に100重量％であり、重合体粒子が本質的に球
形で、10〜600μｍの平均粒度、および５〜1,000nmの平
均孔径をもつ架橋重合体に関する。

本発明は、また、重合条件下で単量体と重合体を溶解
しない液体分散剤中における遊離ラジカル開始剤とその
他の助剤、および容易に単量体に溶解するか混合できる
が、分散剤に事実上不溶である物質（不活性剤）の存在
下での単量体の共重合による架橋重合体の製造方法であ
つて、Ａ′）グリシジルアクリレート、グリシジルメタ
クリレート、アリルグリシジルエーテル、および／また
はビニルグリシジルエーテルを単量体混合物を基準とし
て１〜70重量％と、Ｂ′）N,N′−ジビニルエチレン尿
素および／またはN,N′−ジビニルプロピレン尿素を単
量体混合物を基準として99〜30重量％との、全単量体を
基準として50〜300重量％の不活性剤の存在下における
共重合から成る該重合体の製造方法に関する。

最後に、本発明は、また、担体結合した生物学的に活
性な物質の製造のための担体物質用のこのようにして得
られた重合体に関する。

本発明の重合体は、Ａ）エポキシド基を含有している
単量体Ａ′）に由来する単位１〜70重量％、好ましくは
５〜50重量％、特に10〜40重量％、Ｂ）架橋用単量体
Ｂ′）に由来する単位30〜99重量％、好ましくは40〜95
重量％、特に45〜90重量％、そして、適宜、Ｃ）モノエ
チレン性不飽和の、非親水性かつ非架橋用単量体Ｃ′）
に由来する単位0.1〜20重量％、好ましくは0.1〜10重量
％から成る。なお上記各場合とも重量％は全重合体を基
準としている。

エポキシド基を含有している好適な単量体Ａ′）の例
は、グリシジルアクリレート好ましくはグリシジルメタ
クリレートおよびアリルグリシジルエーテル、特にビニ
ルグリシジルエーテルの単独または混合物である。

適当な架橋用単量体Ｂ′）の例は、N,N′−ジビニル
プロピレン尿素、好ましくはN,N′−ジビニルエチレン
尿素、の単独または混合物である。

適当なモノエチレン状不飽和の、非親水性の、架橋用
単量体Ｃ′）は、ビニルアルカノエート、アルキルアク
リレート、アルキルメタクリレート、スチレンおよびス
チレン誘導体、好ましくは酢酸ビニル、メタクリル酸メ
チル，アクリル酸ブチルおよびスチレン、の単独または
混合物である。

本発明の重合体の製造のための本発明の方法におい
て、単量体は懸濁、溶液、あるいは沈殿重合法において
遊離ラジカル開始剤および別の助剤の存在下で重合され
る。懸濁化剤としての水中での20〜120℃、好ましくは2
5〜90℃の懸濁重合が好ましい。

適当な遊離ラジカル開始剤は、単量体相に易溶性で、
かつ水に溶解性が乏しいものである。これらの例は、ジ
−ｔ−ブチルペルオキシド、ジベンゾイルペルオキシ
ド、ビス（ｏ−メチルベンゾイル）ペルオキシド、ｔ−
ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシ
ド、ジイソプロピルペルオキシドカーボネート、および
シクロヘキサノンペルオキシドなどの有機ペルオキシ
ド、またはα，α′−アゾジイソブチロニトリル、アゾ
ビスシアノ吉草酸、1,1′−アゾシクロヘキサン−1,1−
ジカルボニトリル、およびアゾジカルボンアミドなどの
脂肪酸アゾ化合物である。

安定剤および／または分散助剤は懸濁重合に使用され
るもので、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリアクリ
ルアミド、ポリビニルアルコール、またはヒドロキシエ
チルセルロースである。

できるだけの高多孔度のビーズ状重合体を得るため
に、ある種の不活性の、液体成分（不活性剤）が重合系
に、あるいは、好ましくは単量体に、加えられる。これ
らの成分はその中に単量体が容易に溶解するか、それに
単量体が混合可能であり、しかし、他方で分散剤に事実
上不溶性であり、故にそれと混合できないそれらの物質
であると理解すべきである。適切な共重合体に対するこ
れらの挙動に従つて、不活性剤は膨潤および／または沈
殿剤に分けることができる。不活性剤は重合に関与しな
いが、重合体によつて被覆され、仕上げ（work−up）中
に再度溶出する。これは永久的な孔を作る。孔径は不活
性剤の種類と量によつて影響を受け得るが、さらに架橋
用成分の量にも依存している。

重合に使用され、かつその中に単量体が溶解される不
活性剤は、本発明の場合は単量体のエチレン系二重結合
およびエポキシド基と反応してはならない。

好ましい不活性剤は、ペンタノール、ヘプチルアルコ
ール、２−エチルヘキサノール、ノニルアルコール、デ
シルアルコール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノ
ール、およびオキソアルコール、例えばTCDアルコール
Ｍ である。

不活性剤は、使用される単量体の全量を基準として、
50〜300重量％、好ましくは100〜250重量％、特に125〜
200重量％の量で使用する。

本発明の方法は、攪拌器具を備えた反応容器中で便利
に行なわれる。ビーズ状重合体の粒度は攪拌速度と相比
（phase ratio）によつて公知の手段で調整する。平ら
な底を有し、その軸が容器の底にはほとんど達する共軸
状に配置された攪拌具を備えた垂直円筒状容器を使うこ
とが特に有利である。

反応容器は、好ましくは真空密にし、かつ還流凝縮
器、滴下漏斗、ガス導入管、および温度計を備えること
ができる。容器の加熱と冷却は、液浴、例えば油浴また
は水浴、によつて通常は行なわれる。

大気中の酸素を排除して本発明の方法を実行するのが
有利である。よつて、開始前に、反応容器を不活性ガ
ス、好ましくは窒素でさつと洗う。

重合反応の完了後、未反応の単量体は反応容器から、
例えば減圧下、好ましくは0.1〜15トールの圧力下、の
蒸発によつて、除去される。残留単量体を除去後に、分
散剤を、例えばデカンテーション、過、あるいは上澄
みの吸引によつて固体重合体から分離する。重合体は次
に、必要により、低沸点有機溶剤、例えば炭化水素、低
級アルコールやアセトン、で洗浄し、最後に乾燥する。
重合体は20〜100℃、好ましくは40〜80℃の温度で通常
は乾燥する。減圧下の乾燥が本方法では得策である。

本発明のビーズ状重合体は、乾燥、非膨潤状態での平
均粒度が10〜600μｍ、好ましくは20〜400μｍで、好ま
しくは狭い粒度分布をもつ球形の粒子から主として成
る。重合体の特定の最適な粒度は、特に、特定の用途分
野に依存する。例えば、大気圧下で実行されるカラム法
では、高温下の方法の場合よりも対応して大きくすべく
上述した範囲内で粒度を選択することが可能である。本
発明のビーズ状重合体のビーズはマクロ多孔性ビーズと
して主として形成される。このことは、本発明によつて
生じる平均孔径が５〜1,000nm、好ましくは10〜800nmの
範囲内であることによつて明白である。

孔径（孔容積）の測定は第１に孔容積が毛管圧法（水
銀ポロシメトリー）によつて測定されるようなやり方で
行なわれる。加えて、孔寸法の測定は走査電子顕微鏡法
によつても可能である。

本発明の重合体は、生物学的に活性な物質の共役結合
の形成による固定化に好適である。しかしながら、エポ
キシド基の不活性化後適宜、その他の目的、例えば親和
クロマトグラフイーなど、にも好適である。

「生物学的に活性な物質」という用語は、生体内また
はガラス器内で活性である公知の天然または合成により
製造した物質、例えば酵素、活性剤、抑制剤、抗原、抗
体、ビタミン、ホルモン、エフエクター、抗生物質、お
よびタンパク質、であると理解されるべきである。この
文脈において、タンパク質という用語は、ある種の非タ
ンパク質置換体、例えば金属イオン、ポリサツカライ
ド、ポリフイリン基、アデニンジヌクレオチド、リボ核
酸、リン脂質など、をもつタンパク質も含む。ポリペプ
チド断片、例えば酵素分子の活性な部分、も「生物学的
に活性な物質」という用語に含まれる。

上記した生物学的に活性な物質の中では酵素が好まし
い。酵素の例は、ペニシリンアシラーゼ、Ｄアミノ酸オ
キシターゼ、アデニルデアミナーゼ、アルコールデヒド
ロゲナーゼ、アスパラギナーゼ、カルボキシペプチダー
ゼ、キモトリプシン、ジホスホエステラーゼ、α−グル
コシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、
ヘキソキナーゼ、インベルターゼ、β−ラクタマーゼ、
ラクターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、種々のレクチン、
NADキナーゼ、ノイラミダーゼ、パパイン、ペルオキシ
ダーゼ、ホスフアターゼ（アルカリおよび酸）、５′−
ホスフオジエステラーゼ、ピルベートキナーゼ、リボヌ
クレアーゼ、およびトリプシンである。

その他の生物学的に活性な物質の例は、ホルモン、例
えばインシュリンおよびさまざまな下垂体ホルモン、ガ
ンマ−グロブリン断片のタンパク質、例えば抗血友病因
子、血液凝固因子、特定の抗体、例えば肝炎、灰白髄
炎、麻疹、おたふくかぜ、インフルエンザ、またはウサ
ギ抗体、適当な抗体反応の浄化または刺激のための肝
炎、灰白髄炎、麻疹、おたふくかぜ、インフルエンザ、
またはウサギ抗原などの抗原−この抗原は（不溶にされ
た後）不溶性の状態で残存し、引き続いて体内に侵入し
てそれを害することが不可能である−ならびにヘモグロ
ビンまたはアルブミンなどの一般的な体（body）タンパ
ク質である。

生物学的に活性な物質の重合体担体物質への結合は、
それ自体公知であり、例えば、緩衝溶液、例えばリン酸
カリウム1.5モル水溶液、を用いて特定のpHに調整され
た酵素溶液に乾燥担体物質が添加されるようなやり方で
一般に行なわれる。固定化時間、これは１〜72時間であ
り得る、の後に担体物質は特定の温度（例えば23℃）で
１モルの塩化ナトリウム溶液および緩衝溶液で完全に洗
浄される。湿つた担体物質上の比活性度が裂かれるべき
基体の添加後に、例えば自動適定によつて次に測定され
る。

本発明の新規な重合体は下記の利点をもつ。

これらは低価格の商業的に入手できる出発物質から製
造できる。懸濁重合における懸濁化剤として水を使用す
ることが可能である。逆懸濁重合において必要な炭化水
素と塩化炭化水素が避けられる。

ビーズ状の重合体は生物学的に活性な物質を結合する
非常に優れた能力を有している。

〔実施例〕

実施例１〜11 脱塩水200ml、リン酸水素ナトリウム3.2g、および分
子量360,000のポリビニルピロリドン2.0gを最初に還流
凝縮器、攪拌器、温度計、および窒素導入管をもつ丸底
フラスコに入れ、この混合物を次にポリビニルピロリド
ンが完全に溶解するまで約20分間25℃で攪拌した。次
に、各ケースで、成分Ａ′）,B′）、および適宜Ｃ′）
からなる溶液を不活性剤およびアゾイソブチロニトリル
2gと共に添加した（第１表参照）。この混合物を次に攪
拌し、窒素でプランケツテイングしながら70℃の温度に
徐々に加熱し、温度自動調節用油浴によつて８時間この
温度に維持した。この混合物を約25℃に冷却した後、ビ
ーズ状重合体を吸引により別し、１の水で各回30分
３回攪拌し、吸引により別し、１のメタノールで各
回30分４回攪拌し、吸引により別し、１のアセトン
で各回30分２回攪拌し、吸引で別した。アセトンで湿
つたまま得られたビーズ状重合体はふるいにかけ、0.26
バールの窒素下で50℃で乾燥炉中で一晩乾燥した。

収率、ふるい分析によつて判明した粒度分布および適
宜平均孔径およびそれらの測定のために必要とされる孔
容積を第１表に表示する。

実施例12〜18 生物学的に活性な物質の1.5モル、リン酸カリウム溶
液（緩衝液）でpH7.6のものを各実施例の一つにおける
と同様に0.2gの担体物質に添加した（実施例17の緩衝溶
液は１モルのリン酸カリウムと1.6×10^-2モルのベンズ
アミジン、pH7.8;実施例18は１モルのリン酸カリウム、
pH8）。23℃で72時間（実施例18:固定化時間は16時間）
の固定化後ビーズを１モルの塩化ナトリウム溶液と緩衝
溶液で完全に洗浄した。ペニシリン酸カリウムを基体と
して（実施例17:基体はＮ′−ベンゾイル−Ｌ−アルギ
ニンエチルエステルヒドロクロライド（BAEE）、pH8.1;
実施例18:基体は尿素、pH6.1、温度30℃）37℃、pH7.8
で自動滴定器を用いて測定された吸引フイルターからの
湿つた物質の収率、対応する乾燥重量、および当初の活
性度と洗浄水中の活性度を平衡させた後に測定した固定
化収率（＝担体上の活性度と利用可能にされた活性度の
間の比）、η値（η＝判明した活性度／利用可能にされ
た活性度−洗浄水中の活性度）を第２表に表示する。活
性度（Ｕ）は１分当りの１μmolの物質の転化率、 である。

実施例19 pH9.0の1Mリン酸カリウム緩衝液に310単位/mlをもつ
カルボキシペプチダーゼ0.5mlを実施例８におけると同
様に製造した担体物質の0.1gに加え、この混合物を密閉
容器中に16℃で３日間貯蔵した。ビーズを次に１モルの
塩化ナトリウム溶液で洗浄し、0.02％のアジ化ナトリウ
ムを含むpH7.0の50mMのリン酸シリウム緩衝液中に４℃
で貯蔵した。結合収率は48％、効率η＝0.48であつた。
活性度はヒプロイル−Ｌ−アルギニンを基体として使用
して測定して1g湿重量当り230単位、1g乾燥物当り710単
位に相応であつた。

〔比較例〕（欧州特許出願公開第0,146,329号の実施例
の繰り返し） 脱イオン水490ml、塩化ナトリウム16.2g、ポリアクリ
ル酸ナトリウムの12.5％強度溶液10.5g、および脱イオ
ン水50mlに溶解した薬用ゼラチン0.9gからなる水性相を
反応容器中で10分間攪拌した。トリメチロールプロピル
トリメタクリレート111.4g、グリシジルメタクリレート
28g、トルエン314g、およびアゾイソブチロニトリル1.3
5gからなる有機相を反応容器に添加し、この混合物を20
0rpmで15分間攪拌した。温度を次に65℃に高め、この水
準に20時間維持した。混合物を次に放冷した。結果とし
て生じた白いビーズを各回1,000mlの脱イオン水で３
回、500mlのトルエンで１回洗い、次にビーズを真空中
で乾燥した。ビーズ状重合体の収率は理論の93.5％であ
つた。ふるい分析で下記の粒度分布が明らかになつた。

＞300μm:5.8％;200〜300μm:40.9％;100〜200μm:43.5
％;50〜100μm:7.8％；＞50μm:2.0％。

ビーズ状重合体は生物学的に活性な物質としてのペニ
シリンアシラーゼと反応させて生物学的な活性度を測定
した。これはペニシリンアシラーゼ溶液の1,200μｌ（3
0mg/ml、230U/ml）（これは1.5モルのリン酸カリウム緩
衝液でpH7.6）をビーズ状重合体の0.2gに添加すること
を必要とした。23℃で72時間固定化した後、ビーズは１
モルの塩化ナトリウム溶液と緩衝溶液で完全に洗浄し
た。吸引フイルターからの湿物質の収率はペニシリン酸
カリウムを基体として使用して37℃、pH7.8で自動滴定
器によつて測定して501mgで148単位/gであつた。これは
乾燥重量を基準として370単位/gであつた。最初の活性
度と洗浄水中の活性度の均衡後に残存している固定化収
率は27％であつた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｚ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ａ）グリシジルアクリレート、グリシジル
   メタクリレート、アリルグリシジルエーテルおよび／ま
   たはビニルグリシジルエーテルに由来する単位の１〜70
   重量％、およびＢ）N,N′−ジビニル−エチレン尿素お
   よび／またはN,N′−ジビニルプロピレン尿素に由来す
   る単位の99〜30重量％から実質的に構成された重合体か
   らなり、そして本質的に球形で、10〜600μｍの平均粒
   度および５〜1,000nmの平均孔径をもつ架橋重合体粒子
   からなる生物学的に活性な物質の固定化用担体。
2. 【請求項２】Ａ）グリシジルアクリレート、グリシジル
   メタクリレート、アリルグリシジルエーテルおよび／ま
   たはビニルグリシジルエーテルに由来する単位の１〜70
   重量％、Ｂ）N,N′−ジビニル−エチレン尿素および／
   またはN,N′−ジビニルプロピレン尿素に由来する単位
   の99〜30重量％、およびＣ）酢酸ビニル、メタクリル酸
   メチル、アクリル酸ブチルおよび／またはスチレンに由
   来する単位の0.1〜20重量％から実質的に構成された重
   合体からなり、そして本質的に球形で、10〜600μｍの
   平均粒度および５〜1,000nmの平均孔径をもつ架橋重合
   体粒子からなる生物学的に活性な物質の固定化用担体。