JPS58116683A - 固定化菌体又は固定化酵素及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化菌体又は固定化酵素及びその製造法に関
する。更に詳しくは、本発明は。

「１　菌体又は酵素及び高分子素材を含有する含水ビー
ズの表面が多孔質ポリペプチド膜で被覆されている固定
化菌体又は固定化酵素。

２　菌体又は酵素及び高分子素材を含有する含水ビーズ
の表面が、多官能インシアナート及び／又は多官能エポ
キシ化合物で架橋処理された多孔質ポリペプチド膜で被
覆されている固定化菌体又は固定化酵素。

３　有機溶剤中に分散された、菌体又は酵素及び高分子
素材を含有する含水ビーズの表面に、化学構造式（Ｉ） （式中、Ｒはアミノ酸側鎖を示す。）を有するアミノ酸
酸無水物を反応させて多孔質ポリペプチド膜を形成させ
ることを特徴とする固定化菌体又は固定化酵素の製造法
。

４、有機溶剤中に分散された、菌体又は酵素及び高分子
素材を含有する含水ビーズの表面に、化学構造式（Ｉ） Ｃ式中、几はアミノ酸側鎖を示す。）を有するアミノ酸
酸無水物を反応させて多孔質ポリペプチド膜を形成させ
、このポリペプチド膜を多官能インシアナート及び／又
は多官能エポキシ化合物で架橋処理することを特徴とす
る固定化菌体又は固定化酵素の製造法。」に関するもの
である。

本発明でいう含水ビーズは、含水ゲル状ビーズでもよく
、又、水溶液ビーズでもよい。

従来より酵素反応を利用して有用な化合物を製造したり
、有害物質を分解したりすることが行われて来た。酵素
反応を行うに当っては一般的に微生物菌体や酵素を水溶
液中で基質と直接作用させることによって目的とする反
応を行わせている。この場合には反応終了後反応液より
目的とする生成物を取り出すに当って、生成物力ゝ、 と菌体もしくは酵素の分離が非常に困難であ〉〆もしく
は全く出来ないため、一旦蘭体や酵素を失活又は変性さ
せた後、目的生成物を分離し取り出すという方法が採用
されており、これによる菌体、酵素のロス、分離作業の
困難さが伴い不経済な方法で欠点が多い。

上記の如き欠点を改善する方法としては、酵素活性を有
する微生物菌体や酵素等を水に不溶性の支持体に保持さ
せて固定化し、酵素反応をバッチ方式でくり返し行わせ
たり又完全に連続化しようとする試みがなされてきた。

この固定化の方法については種々の方法が提案され又一
部実施されているが一酵素活性を有する微生物菌体、酵
素等の固定化法を大別すると、（１）共有結合法、（２
）吸着法、（３）包括法、（４）直接架橋法、（５）マ
イクロカプセル化法、など多くの方法がある。

固定化法については上記の如く種々の方法があるが、（
１）の共有結合法及び（４）の直接架橋法は多官能性試
薬と酵素蛋白のもつ官能基の間に反応性で選択性がなく
、菌体や酵素にとって反応条件が一般的には激しいため
、失活を伴う割合が大きく、全稈条件をうまく設定しな
いと活性の高い固定化菌体又は固定化酵素が得られない
という欠点がある。

又、（２）の吸着法については１本来の結合力が一５＝ 弱いことやｐｌ−１一温度、使用する緩衝液の種類やそ
のイオン濃度といった種々の影響を受けやすく、従って
固定化するに当って、又実用する使用条件に当って、き
わめて多くの制限を受けやすいという欠点がある。

（３）のポリマーゲルの格子の中に包括させる代表的な
方法としては、アクリルアミドモノマー及びＮ、Ｎ’−
メチレンビスアクリルアミドモノマーと重合開始剤を含
む水溶液中に微生物菌体や酵素を混合するか溶解させ、
これを重合、ゲル化させ生成したゲル格子中に酵素又は
微生物菌体を包括させる方法がある。

又、他のゲル格子中に包括させる別の方法としては１合
成高分子やカラギーナン、アルギン酸す）　ＩＪウム塩
の如き天然高分子と微生物菌体。

酵素を混合した後に二次的にゲル化させ包括する方法も
ある。しかし−この（３）の方法には、後に述べるよう
な欠点がある。

（５）のマイクロカプセル化法は一般的には微粒子径の
ものであるため、実用条件下では濾過分−６＝ 離郷場合によっては使用しずらいこともあり一又酵素活
性に対してよりダメージを与えやすい乳化剤（界面活性
剤）を多量に使用したり、その調製や後処理で煩雑さが
多いという欠点をもっている。

以上の如〈従来からの固定化法及び固定化菌体又は固定
化酵素には種々の欠点があり、従ってより有意な工業的
に実施出来る固定化法及び固定化菌体又は固定化酵素が
求められて来た。

前記（３）の包括法について更に詳しく述べると。

剤併用下で静置重合させて包括更にはＵＶ、電子線、放
射線等を用いて重合させる方法が多く提案され実施され
て来た。又、水溶性の天然高分子や合成高分子を用いて
微生物菌体、酵素類を含水ゲルに包括させ更に二次的に
架橋させる方法等も提案、実施されて来た。

上記方法の中で前者の了クリルアミド、Ｎ　−ジメチル
アクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート
の如き水溶性モノマー中に菌体や酵素類を添加して重合
包括させる場合、得られる固定化物の酢素活性安定性は
必ずしも十分でない。

後者の水溶性ポリマーを用いて菌体並びに酵素類を包括
固定化する場合の代表的な素材としては、カラギーナン
、アルギン酸ソーダ、キナサン、ゼラチン、ポバール等
がある。これら水溶性高分子素材を用いて菌体、酵素類
を固定化する場合の処理方法としては、イオン架橋法。

反応性試薬による架橋法が一般的に行われている。

ところが、水溶性ポリマーを使用する場合の最大の欠点
は、ポリマー濃度を上げると増粘し加工性が悪くなるこ
とで・ある。例えば、イオン架７嬌法を実施するポリマ
ー素材についてみると、通常そのポリマー濃度は数％で
あり又高くても１０％位に駆足される。−万菌体、酵素
類の包括安定性は系内のポリマー濃度に大きく依存し。

ポリマー濃度に反比例する。従って、このような低ポリ
マー濃度の包括固定化物の酵素活性の保持性を向上させ
るため、水中で二次架橋処理する場合、その処理工程に
於て菌体、酵素類のもれに伴う酵素活性の低下には無視
出来ないものがある。

このような欠点をなくすため、検討を進めて来た結果、
高分子分散剤を含む有機溶剤中に重合法によって得られ
た固定化物（含水ゲル状ビーズ）又は水溶性高分子を含
む粘稠な原料水溶液を分散粒子化させ、この粒子表面で
７ミノ酸酸無水物の界面重合反応を行えば、（又は、そ
の後必要により更に架橋剤で架橋処理すると、）粒子表
面にポリペプチドの多孔質コーテイング膜が形成され１
重合法で得た固定化物からは直ちに実用可能な酵素活性
の保持性が１段と良い固定化物が得られ、又水溶性ポリ
マー、菌体。

もしくは酵素を含有する粘稠な原料水溶液からはこれら
を密閉した容易に濾過可能な固定化物（マクロカプセル
）が得られることを見いだし本発明を完成させるに至っ
た。

９一 本発明の固定化菌体又は固定化酵素は例えば次のように
して製造することが出来る。

菌体又は酵素及び高分子素材を含有する含水ゲル状ビー
ズ（包括固定化ビーズ）、又は菌体又は酵素及び水溶性
高分子素材を含有する粘稠な水溶液を、前記高分子素材
及び水に不溶性の有機溶剤に高分子分散剤を用いて分散
（油中水滴型）させ、有機溶剤に可溶のアミノ酸酸無水
物を滴下して粒子表面で界面重合させ１粒子表面に多孔
質ポリペプチド膜を形成させ包括ビーズを得ろ。又、必
要により、更に、上記操作で得られた包括ビーズ表面の
コーテイング膜を補強するため、上記有機溶剤中に多官
能インシアナート及び／又は多官能エポキシ化合物を添
加し、ポリペプチド膜を更に架橋処理する。

本発明に於て固定化函体又は固定化酵素を製造するに当
って、（１）アミノ酸酸無水物及び更に必要に応じ（２
）架橋性試薬（架橋剤）を固定化ゲルビーズ又は粘稠原
料水溶液を分散させた高分子分散剤を含む有機溶剤中に
添加し分散粒子表−１〇− 面を多孔質ポリペプチドでコーティングした固定化ゲル
ビーズ又はポリマー（高分子素材）、菌体又は酵素を含
有する含水状マクロカプセルを調製するが、（］）アミ
ノ酸酸無水物としては、アラニン、ロイシン、イソロイ
シン、バリン、フェニルアラニン、γ−メチルグルタミ
ン酸クリシン、フェニルグリシン、ｐ−ハイドロキシフ
ェニルグリシン、ジアミノピメリン酸等通常得られるア
ミノ酸の酸無水物が使用出来る。又。

これらアミノ酸についてはＬ体＋　ＤＬ体、Ｄ体のいず
れでも使用可能である。

本発明で用いるアミノ酸酸無水物は前述の化学構造式（
Ｉ）を有するものであるが−１”ｔ（アミノ酸側鎖）と
しては５例えば、メチル、ブチル。

イソブチル、イングロビル等のアルキル基、アリル基、
ベンジル基、ヒドロキシル基置換アリル基、ヒドロキシ
ル基置換ベンジル基等が挙げられる。

又−アミノ酸酸無水物でポリペプチド膜を形成させた後
に（２）架橋性試薬で架橋処理しポリペプチド膜を補強
することも出来るが−この内。

多官能インシアナート化合物としては１例えば。

ヘキサメチレンジアミンジインシアナート、トルイレン
ジインシアナート、キシリレンジイソシアナート、ジフ
ェニルメタン−４，４′−ジイソシアナート−ポリメチ
レンポリフェニルイソシアナート等があり、多官能エポ
キシ化合物としては２例えばペンタエリスリトールポリ
グリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエ
ーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、グリセ
ロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパ
ンポリグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジ
グリシジルエーテル、ビスフェノールＡ−ジグリシジル
エーテル、ジグリシジルヘキサヒドロテレフタレート−
ジグリシジルシクロペンタン１．３−ジカルボキシレー
ト、ジグリシジルオルトフタレート等が使用出来る。

これらアミノ酸酸無水物及び多官能インシアナート、多
官能エポキシ化合物等の架橋性試薬は夫々１種又は２種
以上を選択して使用することが出来る。

また、界面重合反応を実施するに当っては、最初にアミ
ノ酸酸無水物でコーティング層を形成させ１次に（２）
の架橋性試薬は、（１）のアミノ酸酸無水物に対し１〜
５０重量％用いるのが好捷しく、特に、５〜２０重量％
の範囲で用いるのが好ましい。

本発明を実施するに当って、含水ビーズ（含水ゲル状ビ
ーズ又は水溶液ビーズ）に対するアミノ酸酸無水物の使
用割合は５重量％〜５０重量％が好１しく、特に１０〜
３０重量％の範囲が好ましい。

又１本発明に用いる有機溶剤は一般的に疎水性溶剤とし
て知られているものならばどの溶剤でも使用可能である
が、アミノ酸酸無水物を使用する関係で、より疎水性の
強い有機溶剤が好ましい。

例えば、芳香族炭化水素系溶剤としては、ベンゼン、ト
ルエン、キシレン等カー　ＪＪｌｉ族炭化１３− 水素系溶剤としては０５〜ＣＩＯの炭化水素例えばロー
ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−へブタン。

ｎ−オクタン−ノナン、デカン等が使用出来る。

ハロゲン系溶剤としてはトリ又はテトラクロロエチレン
、トリ又はテトラクロロエタン、及びモノ又はジクロロ
ベンゼン等が使用可能である。

又シクロヘキサン、酢酸エチル等の溶剤も使用可能であ
る。本発明を実施するに当って、有機溶剤は単独で用い
ても良いが、二種以上の溶剤を混合して用いることも出
来る。この逆相分散系での界面重合を実施するに当って
は有機溶剤の使用量は特に限定されないが有機溶剤と分
散体との割合は分散体が５〜５０容量％の分散比を占め
る範囲が好１しく、特に２０容量％〜４０容量％の範囲
で実施するのが好ましい。

本発明を実施する際１分散剤としては親水性基を有する
不飽和モノマーと親油性不飽和モノマーの共重合物であ
る高分子分散剤を用いるの好ましく、含水分散体を合一
させることなく分散状態を維持させる点で、又、高分子
分散剤で１４− あるため分散粒子表面だけで作用し、乳化剤に比べて菌
体、酵素類に対し悪影響がないという点で極めてすぐれ
た分散剤である。

親水性基を有する不飽和モノマーとしては。

カルボキシル基（−ＣＯＯＩ（）、アミノ基−ヒドロキ
シル基等を有するラジカル重合性不飽和モノマーを挙げ
ることが出来る。

更にくわしく例を挙げると。

アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、
フマール酸等のカルボキシル基を有スる不飽和モノマー
、又ジアルキルアミン基もしくは、アミン類の塩基性基
を有するものとしては、ジメチルアミノエチルメタクリ
レート、ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ−ビニ
ルカルバゾール、ビニルピリジン等の不飽和モノマーが
ある。又、ヒドロキシル基を有するものとしては２−ヒ
ドロキシエチルアクリレート。

２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセリンモノ
アクリレートーグリセリンモノメタクリレートートリメ
テロールプロパンモノアクリレート、トリメチロールプ
ロパンモノメタクリｖ−３ジエチレングリコールモノア
クリレート、ジエチレングリコールモノメタクリレート
、スチレンスルホン酸等種々のものがある。

又、高分子分散剤の主成分である親油性不飽和モノマー
としては、界面重合を実施するに当って使用する有機溶
剤によっても異なるが有機溶剤に応じて不飽和モノマー
の選択を適当に行えば良い。

例えば、アクリル酸、メタクリル酸のメチル。

エチル、ブチル、プロピル、イソブチル、２−エチルヘ
キシル、シクロヘキシル等の各種エステル類を挙げるこ
とが出来、又スチレンー酢酸ビニル等も使用出来る。こ
れら種々の不飽和モノマーの２種以上の成分から得られ
る共重合物からなる高分子分散剤の分散粒子に対する使
用量は通常０．００１重量％から５重量％用いるのが好
捷しく、特に０．０１重量％〜０．５重量％用いるのが
好ましい。分散粒子に対する高分子分散剤の安定イヒ効
果は乳化剤に比較して犬である。

本発明において、アミノ酸酸無水物の界面重合反応を行
う場合、反応温度は、４０Ｃ以下が好ましい。

本発明におい、多官能インシアナート及び／又は多官能
エポキシ化合物で架橋処理する場合処理温度は、４０Ｃ
以下が好ましい。

本発明において、高分子素材としては種々のものが使用
出来る。例えば、水溶性不飽和単量体と水溶性多官能不
飽和単量体の共重合体等が挙げられる。水溶性不飽和単
量体としては、アクリル了ミド、メタクリルアミド、ジ
メチルアミンエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエ
チルメタクリレート−２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト、トリメチル了ミノエチルメタクリレートクロライド
、ジメチルアミノエテルメタＮ−メチルアクリルアミド
、Ｎ−メチルメタクリル了ミド等が使用出来る。水溶性
多官能不飽和単量体としては、Ｎ、Ｎ’−メチレンビス
アクリ１フー ルアミド＋　Ｎ、Ｎ−メチレンビスメタクリルアミド、
トリ了すル了ミン、モノメチルトリ了り−ルアンモニウ
ムクロライド５グリセリンジアクリレート、ペンタエリ
スリトールジアクリレート及びメタクリレート等が使用
出来る。又、他の高分子素材例えばカラギーナン、アル
ギン酸ソーダ、キナサン、ゼラチン、ポバール等の水溶
性高分子素材等も使用出来る。

高分子素材の使用量は特に限定されないが、含水ビーズ
中の高分子素材の量が２〜６０％となるようにするのが
好ましい。

本発明は広範囲の微生物菌体或は酵素の固定化に適用可
能である。例えば、微生物菌体としては、フザリウム・
了ングイオイデス、ジベレラ・フジクロイ、ストレプト
ミセス―ラベンズエー、ノカルディア・了ステロイデス
、バチルス−ズブチリス、シュードモナス・エルギノー
ザ、カンディダ・フミコーラ、トリゴノプシス・パリア
ビリス、アルカリゲネス番ファエカリス、エシェリヒア
・コリ、等を挙げることが出１８− 来る。

又、酵素の例としては、ウリアーゼ−リパーゼ、β−ラ
クテート・デヒドロゲナーゼ、ペニシリンアシラーゼ、
ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、トリプシン、キ
モトリプシン、コレステロールオキシダーゼ−クレアチ
ニンアミドヒドロラーゼ、グルタミールオキザレート。

トランスアミナーゼ、β−グルクロニダーゼ等が挙げら
れる。

以下に参考例、実施例を挙げて本発明の詳細な説明する
。

〔参考例−１，〕 メタクリル酸メチルエステル８ｆ−２−エチルへキシル
アクリレート２？並びにアクリル酸０．３ｇ−をガラス
製試験管に計量し、史に重合開始剤としてベンゾイルパ
ーオキサイド１０■を添加して溶解させる。

この共重合性不飽和モノマー組成物を仕込んだ試験管に
ダブルキャップをして水冷下注対針を用いてＮ２置換後
６０Ｃのウォーターバス中に６時間浸漬して重合を完結
させる。重合終了後、ガラス試験管より中の共重合物を
取り出しトルエンに溶解させ、更にこのトルエン溶液な
ｎ−ヘキサン中に徐々に投入して析出沈澱してきたポリ
マーを回収し分散剤として使用する。

−〔参考例−２〕 メタクリル酸メチル８１２−エチルへキシルメタクリレ
ート２１．並びに４−ビニルピリジ１０．５ｇ−をガラ
ス製試験管に計量し、更に重合開始剤としてベンゾイル
パーオキサイド１０■を添加して溶解させた他は〔参考
例−１〕と同様の操作を行い共重合ポリマーを回収し分
散剤として使用した。

〔参考例−３〕 ２−エチルへキシルメタクリレート４．Ｐ−インブチル
メタクリレート６１並びに２−ヒドロキシエチルアクリ
レ−）１ｇ−をガラス製試験管に取り更に重合開始剤と
してアゾイソブチロニトリル１２■を添加して溶解させ
た他は〔参考例−１〕と同様の操作を行い共重合ポリマ
ーを回収し分散剤として使用した。

〔参考例−４，〕 ２本の邪魔棒及び１本の攪拌棒を設置した５００ｍＡ−
５０のガラス製丸底セパラフラスコに０．６？のポリビ
ニルアルコール（ゴーセノールＫＨ−１７１日本合成化
学社製）を含む水３００　ｍｌを仕込み、ウォーターバ
スで５０Ｃに加熱し２００　ｒｐｍの回転速度で攪拌を
行う。この攪拌している水中に２−エチルへキシルアク
リレート４、０　ｙ−、メタクリル酸イソブチル６０９
−とアクリル酸１．Ｏｆ及び重合開始剤パーカドノクス
−１６（化薬ヌーリー社製）ｌｏｏＩｌｌｇからなる共
重合性不飽和モノマー組成物を添加する。この加えられ
た共重合性不飽和モノマー組成物はセパラフラスコ内で
液滴化し小さな粒子状となって懸濁する。

仕込み終了後Ｎ２ガスを導入管で導入しＮ２バージを行
いＮ２置換すると重合が開始され、この重合を５０Ｃで
４時間続行する。４時間経過後更に６０Ｃに昇温し２時
間重合を続行させ完了させた。

重合終了後冷却し濾過すると粒子状の高分子分散２１− 剤が得られる。これは水洗乾燥した後逆相用分散剤とし
て使用した。

本分散剤ポリマーの固有粘度は〔η〕−２．７ｇ−（ト
ルエン＋　３０ｔＺ’）でアリ）ルエン、ベンゼン、キ
シレンにはＯＣでも良好な溶解性を示す。しがしヘプタ
ンに対する溶解温度は３５ｔｒである。

〔参考例−５、〕 カンディダ・フミコーラ微工研寄託受理番号４４８５号
をグリセリン２％、大豆粉１％、第１リン酸カリ０４％
７硫酸マグネシウム０．１％、塩化カルシウム０．０５
％、ホウ酸ナトリウム０．０１％。

ＤＬ−メチオニン０．２５％を含む培地（ｐＴ−Ｔ二６
．０）１０．８に接種し２７１．７２時間振盪培養した
。

培養液から遠心分離により菌体を採取し、８１の湿菌体
を得た。

〔実施例−１〕 邪魔棒（１本）、攪拌棒（１本）、並びにコンデンサー
、ロートを設置した３００ｍ１のガラス製セパラ丸底フ
ラスコに〔参考例−１〕で得られた高分子分散剤０．０
５ｉを含む混合溶剤（ローへプ２２− タンＩ　ＯＯｍｌ＋酢酸エチル５０ｍ１を仕込み室温（
２５Ｃ）で２００　ｒｐｍの回転速度で攪拌を行う。

この混合溶剤中にアクリルアミド７５１．メチレンビス
アクリルアミド０．７５７．カンディダ拳フミコーラの
湿菌体２．０７．純水３９．７５ｇ−の構成成分からな
る重合済の包括固定化菌体ビーズ５０１をロートより投
入した。次にＤＬ−フェニルグリシンのＮ−力ルボキシ
酸無水物（ＤＬ−フェニルグリシンＮＣＡ）！Ｍｌ−を
含む２０　ｍｌ酢酸エチル溶液を添加した。室温水冷下
で反応を続行すると１分散含水粒子表面にポリペプチド
膜が形成されビーズ表面が白濁してくる。約１時間反応
させてポリペプチドによるコーディングを終了させた。

次にトルイレンジイソシアナート０．５１を含む２０ｍ
１３酢酸エチル溶液を添加し更に１時間反応を続行させ
た。

反応終了後攪拌を停止するとコーティングされ白濁した
固定化ビーズは沈降し、有機溶剤層は透明であった。こ
のことはビーズ表面でのみ重合が進行し良好なコーティ
ングが行われていることを示している。

上記反応で得られた固定化ビーズの酵素活性についてみ
ると、初期仕込みの固定化ビーズのＤ　＝アミノ酸酸化
酵素活性は生菌体の酵素活性に比較して６９％であり、
酵素活性半減期は１７時間であったのに対し−ポリペプ
チド膜をコーティングして製造したものは酵素活性保持
率６４％、酵素活性半減期８９時間でほぼ半減期にして
５倍のものが得られた。

〔実施例−２，〕 邪魔棒（１本）、攪拌棒（１本）、並びにコンデンサー
、ロートを設置した５００ｍｇのガラス製セパラ丸底フ
ラスコに、〔参考例−２〕で得られた高分子分散剤０．
５ｇ−を含むｎ−ヘプタン２００ｍＬ酢酸エチル１００
ｍ１からなる混合溶型を仕込み、室温（２５Ｃ）、２０
０　ｒｐｍの回転速度で攪拌を行う。この混合溶剤中に
、分散重合包括法で得られたーアクリルアミド３０？、
メチレンビスアクリルアミド３０１．アルカリゲネスフ
ァ力リスＩＦＯ］２６６９の湿閘体４３１（菌体濃度７
０％）及び水７４％の構成成分からなる重合済みの固定
化ゲルビーズ１５０１を投入し分散させる。

次にＤ−パラハイドロキシフェニルグリシンのＮ−力ル
ボキシ酸無水Ｔｈ（Ｄ−パラハイドロキシフェニルグリ
シンＮＣＡ　）　９　ｙ−ヲ２０　ｍｌ酢ｅエチルに溶
解した溶液をロートより添加し、界面重合反応を開始さ
せた。室温で１時間反応させた後、ジフェニルメタン−
４，４′−ジイソシアナート（日本ポリウレタン社製）
０．９９−を含む酢酸エチル溶液１５ｍ１を添加し更に
１時間反応を続行した。反応終了後攪拌を停止し、固定
化ビーズと有機溶剤を分離させると有機溶剤層は〔実施
例−１〕と同様透明で、固定化ビーズの表面だけで界面
重合が発生していた。

上記反応で得られた固定化ビーズの酵素活性についてみ
ると、初期仕込み固定化ビーズの酵素活性保持率は８６
％であり、又酵素活性半減期は３２時間であったのに対
し、ポリペプチドコーティングした固定化ビーズの酵素
活性保持率は７９％、酵素活性半減期は約２４０時間で
あった。コーティング法更には架橋法を取り入れること
によ２５− り酵素活性半減期は大巾に肴失した。尚、ジフェニルメ
タン−４，４′−ジイソシアナートによる架橋処理をし
なかったものの酵素活性半減期は８３時間であった。

尚上記酵素活性保持率及び半減期は、バラノ・イドロキ
シフェニルグリシンメチルエステルと６−アミンペニシ
ラン酸（モル比２．１）とからヘフチド形成反応を行わ
せた場合のデーターであり。

パラハイドロキシＤ−フェニルグリシンメチルエステル
２００ｍＭ、６−アミノペニシラン酸１００ｍＭの濃度
条件下、３０Ｃ、バッチ反応を実施した場合である。

〔実施例−３〕 邪魔棒、攪拌棒、並びにコンデンサー、ロートを設置し
た５　００　ｍｌのガラス製セパラ丸底フラスコに〔参
考例−３〕で得られた高分子分散剤０．５Ｊを含む、ｎ
−ヘプタン２００ｍ１．トルエン１００ｍ１からなる混
合溶剤を仕込み３５ｒのウォーターバス中にて加温しな
から４００　ｒｐｍの攪拌を行う。

この混合溶剤中に、ポリビニルアルコール１５１２６− （日本合成化学社製−Ｑｌ（−１７）、アルヵリゲネス
ファエ力すスＩＦ’０１２６６９菌体２１１（菌体濃度
７０％）、純水１２０Ｊからなる粘稠な原料液をロート
より添加、１時間攪拌を行った。

粘稠な菌体を含む原料水溶液は混合溶剤中で小粒子状に
分散する。攪拌回転数を２５０　ｒｐｍに落し、水冷下
、２２．５％のフェニルアラニンＮ−カルボキシ酸無水
物（フェニルアラニンＮｃＡ）を溶解させた酢酸エチル
溶液６０ｍ１を徐々に添加し。

分散粒子表面上で界面重合を行わせると粒子表面が白濁
しポリペプチドコーティング層の形成が認められた。次
にジフェニルメタン−４，４′−ジイソシアナート（日
本ポリウレタン社製）３．３７５１を含む酢酸エチル溶
液２０　ｍｌを添加し、更に水冷下で１時間反応を続行
した。反応終了後、ヌノチェを使用してロカすると、粒
子状（２００〜１０００ミクロン）のマクロカプセル状
包括ビーズが得られた。この段階での、バラハイドロキ
シＤ−フェニルグリシンメチルエステルと６−アミンペ
ニシラン酸からペプチドを形成させる反応に対する酵素
活性保持率は８９％であった。次に上記反応で得られた
包括ビーズ５０ｉを、０．５％濃度のグルタルアルデヒ
ド水溶液２５０　ｍｌ中に水冷下（４〜５　Ｕ　）でゆ
っくり攪拌しながら浸漬し３０分反応させた。更に０．
５％濃度のへキサメチレンシアミーン水溶液並びに０５
％濃度のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル
（ブナコール８２０長瀬産業）に夫々３０分浸漬し内部
硬化させ包括固定化ビーズを得た。このものの上記ペプ
チド形成反応に対する酵素活性保持率は４７％であった
。

〔実施例−４〕 邪魔棒、攪拌棒、並びにコンデンサー、ロートを設置し
た５　００　ｍｌのガラス製セパラ丸底フラスコに〔参
考例−４〕で得られた高分子分散剤ｏ５ｆを含むトルエ
ン、パークレン混合溶剤（Ｐ−１，０５−２５０）３０
０ｍｌを仕込み３１Ｃのウォーターバス上で加温しなか
ら３００　ｒｐｍの攪拌を行う。この混合溶剤中に、ゼ
ラチン３ｏ１にノビ製）プロテウス・ブルガリスの湿菌
体２２．５Ｐ及び生理食塩水９７．５　Ｐからなる粘稠
な原料水浴液をロートより添加し、１時間攪拌を行った
。菌体を含むゼラチン水溶液は混合溶剤中で小粒子状（
３００〜１２００μｍ）に分散する。攪拌回転数を２０
　Ｏｒｐｍに減速し、氷冷下２２．５７のＤＬフェニル
グリシンＮ−カルボキシ酸無水物（ＤＬ　　フェニルグ
リシンＮＣＡ）を溶解させた酢酸エチル溶液６０　ｍｌ
を徐々に添加し分散粒子表面上で界面重合を行わせた。

１時間界面重合を行わせた後５．０１のソルビトールポ
リグリシジルエーテル（ブナコール６１１長潮産業社製
）を含む酢酸エチル溶液１５ｍ１を添加し更に１時間反
応を続行した。反応終了後ヌノチェでロカし包括ビーズ
を得た。このもののＤ−アミノ酸酸化酵素活性は８２％
であった。更に上記口力で得られた包括ビーズ３０ｆＦ
を０５％ゲルタールアルデヒド水溶液に水冷下１時間浸
漬しゆっくり攪拌しながら反応させ内部硬化を行わせた
。このようにして得られた包括固定化ビーズのＤ−アミ
ノ酸酸化酵素活性は生菌体の酵素活性に対し３９％の酵
素活性保持率を示した。

２９− 〔実施例−５，〕 〔実施例−１〕と同様の装置にキシレン＋　ｎ　−ヘプ
タンの混合溶剤（ρ＝１．０５　）３００ｍｌを仕込み
３０Ｃで３０　Ｏｒｐｍの攪拌を行う。この混合溶剤中
にアルギン酸ソーダ３ｇ−、アルカリゲネスファエ力す
スＩＦＯ１２６６９菌体より抽出回収したペニシリンア
シラーゼ酵素０．１９−及び生理食塩水７２ｆ／−かも
なる粘稠な原料水溶液をロートより添加１時間攪拌を行
った。上記操作で原料水溶液は液滴状で分散する。これ
に対しバラハイドロキシＤＬフェニルグリシンＮ−カル
ボキシ酸無水物１５％を含む酢酸エチル溶液６０ｍ１を
滴下ロートより徐々に仕込み界面重合をＩＢ８？ｊ間実
施する。次にジフェニルメタン−４，４′−ジイソシア
ナート２．２５７を含む酢酸エチル溶液１０ｍ１を徐々
に滴下し１時間実施する。

反応終了後２００　ｍｌの混合溶剤を抜き取り１％塩化
カルシウム水溶液２５０ｍ１を添加し水冷下でゆっくり
攪拌しながら内部硬化させた。塩化カルシウムによるイ
オン架橋ゲル化は］５分実施し１次３０− に水冷下の状態で５％グルタルアルデヒド水溶液１０ｍ
１を１５分かけ徐々に滴下し滴下終了後更に１５分反応
を続行した。上記操作で得られた固定化ビーズのペプチ
ド結合形成反応に対する酵素活性の保持率は５３％であ
った。

以上の如く、前述のアミノ酸酸無水物と、必要により多
官能イソシアナート、多官能エポキシ化合物等を用いた
コーティング法を用いることにより不安定な固定化ビー
ズを安定なものにしたり、又本来水溶液状の天然高分子
１合成高分子から容易に酵素活性保持率の高い固定化ビ
ーズが得られる。

特許出願人　日本化薬株式会社 ３１− ４５７−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、菌体又は酵素及び高分子素材を含有する含水ビーズ
   の表面が多孔質ポリペプチド膜で被覆されている固定化
   菌体又は固定化酵素。 ２、菌体又は酵素及び高分子素材を含有する含水ビーズ
   の表面が、多官能イソシアナート及び／又は多官能エポ
   キシ化合物で架橋処理された多孔質ポリペプチド膜で被
   覆されている固定化菌体又は固定化酵素。 ３、有機溶剤中に分散された。菌体又は酵素及び高分子
   素材を含有する含水ビーズの表面に、化学構造式（Ｉ） （式中、Ｒはアミノ酸側鎖を示す。）を有するアミノ酸
   酸無水物を反応させて多孔質ポリペプチド膜を形成させ
   ることを特徴とする固定化菌体又は固定化酵素の製造法
   。 ４、有機溶剤中に分散された、菌体又は酵素及び高分子
   素材を含有する含水ビーズの表面に、化学構造式（１１ （式中、Ｒはアミノ酸側鎖を示す。）を有するアミノ酸
   酸無水物を反応させて多孔質ポリペプチド膜を形成させ
   、このポリペプチド膜を多官能イソシアナート及び／又
   は多官能エポキシ化合物で架橋処理することを特徴と−
   する固定化菌体又は固定化酵素の製造法。