JP5136147B2 - 生理活性物質の検出方法および測定キット - Google Patents
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(1)アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)を共重合した高分子物質を表面に有する不溶性担体上に、生理活性物質に特異的に結合する抗体をリン酸塩溶液の濃度が0.1M以上である高濃度リン酸塩緩衝液に溶解し接触させて前記不溶性担体上に前記抗体を結合させる工程、ついで検体を接触させ、検体中の抗体結合性生理活性物質を前記不溶性担体上の前記抗体に特異的に結合させる工程、前記不溶性担体に結合した前記抗体結合性生理活性物質を検出する工程、を有し、
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)が下記の一般式[1]で表され、前記架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)が下記の一般式[2]で表されるアルコキシシリルを有するモノマーであること
を特徴とする生理活性物質の検出方法、
基の連鎖であってもよい。)
(2)前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)がメトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートである(1)記載の生理活性物質の検出方法。
(3)前記メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が3〜100である(2)記載の生理活性物質の検出方法、
(4)前記不溶性担体に結合した生理活性物質に特異的に結合する抗体が抗サイトカイン抗体であることを特徴とする(1)〜(3)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(5)前記抗サイトカイン抗体がインターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インターロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10、インターロイキン−11、インターロイキン−12、インターロイキン−13、インターロイキン−15、インターロイキン−16、インターロイキン−17、インターロイキン−18、インターロイキン−21、インターロイキン−23、インターロイキン−25、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒状コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒状マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF−α、TNF−β)、MIP−1α(macrophage inflammatory protein)、MIP−1βの群より選択された少なくとも1種に対する抗体である(4)記載の生理活性物質の検出方法、
(6)前記不溶性担体に結合した抗体結合性生理活性物質の検出を、前記生理活性物質に特異的に結合する物質を用いて行う(1)〜(5)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(7)前記不溶性担体に結合した抗体結合性生理活性物質の検出が、標識物質により標識された前記生理活性物質に対する二次抗体を用いる(6)記載の生理活性物質の検出方法、
(8)前記抗体結合性生理活性物質の検出を、前記生理活性物質に対する二次抗体と、二次抗体に対する三次抗体であって標識物質により標識された三次抗体を用いて行う(6)記載の生理活性物質の検出方法、
(9)前記標識物質が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、発光物質、酵素、補酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群から選択される物質である(7)又は(8)記載の生理活性物質の検出方法、
(10)検体中に二種以上の抗体結合性生理活性物質が含まれ、前記抗体結合性生理活性物質を検出する工程において、各抗体結合性生理活性物質に対する二種以上の二次抗体によって検出する(1)〜(9)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(11)二種以上の二次抗体の検出が、該抗体に結合した異なる種類の標識物質をそれぞれ測定することによって行う(10)記載の生理活性物質の検出方法、
(12)二種以上の二次抗体の検出が、二種以上の各二次抗体に対する三次抗体であって
別異の標識物質により標識された三次抗体によって行う(10)記載の生理活性物質の検出方法、
(13)前記標識物質が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、発光物質、酵素、補酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群から選択される物質である(11)又は(12)記載の生理活性物質の検出方法、
(14)前記不溶性担体の形状が96ウェル又は384ウェルのマイクロタイタープレートである(1)〜(13)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(15)前記不溶性担体の材質がプラスチックである(1)〜(14)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(16)前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも1種である(15)記載の生理活性物質の検出方法、(17)(10)記載の生理活性物質の検出方法に用いる生理活性物質の測定キットであって、少なくとも下記の(ア)〜(ウ)の構成要素を含む抗体結合性生理活性物質の測定キット、
(ア)抗体を結合した不溶性担体
(イ)抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体
(ウ)標識物質により標識した、上記(イ)の二次抗体に対する三次抗体
(18)前記不溶性担体の形状が96ウェルないし384ウェルのマイクロタイタープレートである(17)記載の測定キット、
(19)前記抗体結合性生理活性物質がサイトカインである(17)又は(18)記載の測定キット、
(20)前記標識物質が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、発光物質、酵素、補酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群から選択される物質である(17)〜(19)いずれか記載の測定キット、
(21)(12)記載の生理活性物質の検出方法に用いる生理活性物質の測定キットであって、少なくとも下記の(ア)〜(オ)の構成要素を含む抗体結合性生理活性物質の測定キット、
(ア)抗体を結合した不溶性担体
(イ)標識物質により標識した、第一の抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体(二次抗体1)
(ウ)標識物質により標識した、第二の抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体(二次抗体2);
(エ)第一の標識物質により標識した二次抗体1に対する三次抗体(三次抗体1)
(オ)第二の標識物質により標識した二次抗体2に対する三次抗体(三次抗体2)
(22)前記不溶性担体の形状が96ウェル又は384ウェルのマイクロタイタープレートである(21)記載の測定キット、
(23)二次抗体1及び二次抗体2が異なる生物種由来である(21)又は(22)記載の測定キット、
(24)第一及び第二の抗体結合性生理活性物質が、サイトカインの中からそれぞれ選択される異なる物質である(21)〜(23)いずれか記載の測定キット、
(25)第一及び第二の標識物質が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、発光物質、酵素、補酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群からそれぞれ選択される異なる物質である、(21)〜(24)いずれか記載の測定キット、
(26)第一及び第二の標識物質のいずれか一方が、ラジオアイソトープ又は蛍光物質であることを特徴とする(21)〜(24)いずれか記載の測定キット、
である。
本発明方法1の生理活性物質の検出方法は、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)を共重合した高分子物質を表面に有する不溶性担体上に、生理活性物質に特異的に結合する抗体を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解し接触させることで該抗体を不溶性担体に固定化させ、ついで抗原となる生理活性物質を反応させて、不溶性担体に結合した当該抗体結合性生理活性物質を検出することを特徴とする。
本発明方法2の生理活性物質の検出方法は、検体中に含まれる二種以上の抗体結合性生理活性物質を測定する方法であって、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)を共重合した高分子物質を表面に有する不溶性担体上に、生理活性物質に特異的に結合する抗体を高濃度リン酸塩緩衝液に溶解し接触させ、ついで不溶性担体に検体を接触させ、抗体を介して不溶性担体に結合した二種以上の抗体結合性生理活性物質を、抗体結合性生理活性物質に対する二種以上の二次抗体により測定する方法であり、かつ二種以上の抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体、あるいはこれらの抗体に対する三次抗体がそれぞれ異なる標識物質により標識されていることが好ましい。
本発明キット1は、少なくとも下記の(ア)〜(ウ)の構成要素を含む抗体結合性生理活性物質の測定キットである。
(ア)抗体を結合した不溶性担体
(イ)抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体
(ウ)標識物質により標識した、上記(イ)の二次抗体に対する三次抗体
本発明キット2は、少なくとも下記の(ア)〜(オ)の構成要素を含む抗体結合性生理活性物質の測定キットである。
(ア)抗体を結合した固相担体
(イ)標識物質により標識した、第一の抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体(二次抗体1)
(ウ)標識物質により標識した、第二の抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体(二次抗体2)
(エ)第一の標識物質により標識した二次抗体1に対する三次抗体(三次抗体1)
(オ)第二の標識物質により標識した二次抗体2に対する三次抗体(三次抗体2)
(実施例)
飽和環状ポリオレフィン樹脂(5−メチル−2ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、MFR(Melt flow rate):21g/10分、水素添加率:実質的に100%、熱変形温度123℃)を96ウェルプレート形状(1ウェルの寸法:底面直径6.4mm×高さ11mm)に加工して固相担体を作成した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって担体表面に酸化処理を施した。この固相担体をポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート)−p−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート−3−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン(PEGMA−MEONP−MPDES、各基はモル%で92:3:5)共重合体である高分子化合物の0.3重量%エタノール溶液に浸漬、65℃、72時間加熱乾燥することにより、担体表面にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーからなる高分子化合物を含む層を導入した担体を得た。
実施例のプラズマ処理の後の担体を高分子化合物を塗布せずに用いた。
次に、実施例および比較例で得られた担体に、1.2Mのリン酸二水素カリウム(和光純薬製)水溶液中に一次抗体であるマウス由来抗ヒトインターロイキン−4抗体を1μg/mLの濃度になるように調製した溶液を100μL/ウェルの割合で分注し、室温で2時間静置した。その後、各々の担体について、0.05wt%の界面活性剤Triton X−100(MPBIO社製)を添加したPBSを用いて、室温にて5分間洗浄を行った。
実施例についてはブロッキング処理を行わなかった。比較例については、上記洗浄後の担体に、1wt%のBSA(ウシ血清アルブミン;シグマアルドリッチ製)を溶解したPBSを100μL/ウェルの割合で分注し、室温で2時間静置した。その後、0.05wt%の界面活性剤Triton X−100を添加したPBSを用いて、室温にて5分間洗浄を行った。
次に、上記洗浄後の担体に、表1に示した各濃度(溶媒:1wt%のBSAを溶解したPBS)で抗原であるマウスIgG2aを添加した溶液を100μL/ウェルの割合で分注し、室温で2時間静置することで抗原抗体反応を実施した。反応後、各々の担体について、0.05wt%の界面活性剤Triton X−100を添加したPBSを用いて、室温にて5分間洗浄を行った。
次に、上記担体表面に、0.5μg/mLの濃度(溶媒:1wt%のBSAを溶解したPBS)に調製した二次抗体であるマウス由来ビオチン標識抗ヒトインターロイキン−4抗体溶液を100μL/ウェルの割合で分注し、室温で1時間静置することで抗原抗体反応を実施した。反応後、各々の担体について、0.05wt%の界面活性剤Triton X−100を添加したPBSを用いて、室温にて5分間洗浄を行った。
次に、上記担体表面に、0.1μg/mLの濃度(溶媒:1wt%のBSAを溶解したPBS)に調製したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)溶液を100μL/ウェルの割合で分注し、室温で30分静置することでビオチン−アビジン反応を実施した。反応後、各々の担体について、0.05wt%の界面活性剤Triton X−100を添加したPBSを用いて、室温にて5分間洗浄を行った。
最後に、TMBペルオキシダーゼ発色キット(BIO−RAD社製)を用いて発色反応を行った。操作は製品の添付のプロトコールに従った。
Claims (26)
- アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)、及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)を共重合した高分子物質を表面に有する不溶性担体上に、生理活性物質に特異的に結合する抗体をリン酸塩溶液の濃度が0.1M以上である高濃度リン酸塩緩衝液に溶解し接触させて前記不溶性担体上に前記抗体を結合させる工程、ついで検体を接触させ、検体中の抗体結合性生理活性物質を前記不溶性担体上の前記抗体に特異的に結合させる工程、前記不溶性担体に結合した前記抗体結合性生理活性物質を検出する工程、を有し、
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)が下記の一般式[1]で表され、前記架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)が下記の一般式[2]で表されるアルコキシシリルを有するモノマーであること
を特徴とする生理活性物質の検出方法。
- 前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)がメトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートである請求項1記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が3〜100である請求項2記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記不溶性担体に結合した生理活性物質に特異的に結合する抗体が抗サイトカイン抗体であることを特徴とする請求項1〜3いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記抗サイトカイン抗体がインターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インターロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10、インターロイキン−11、インターロイキン−12、インターロイキン−13、インターロイキン−15、インターロイキン−16、インターロイキン−17、インターロイキン−18、インターロイキン−21、インターロイキン−23、インターロイキン−25、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒状コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒状マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF−α、TNF−β)、MIP−1α(macrophage inflammatory protein)、MIP−1βの群より選択された少なくとも1種に対する抗体である請求項4記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記不溶性担体に結合した抗体結合性生理活性物質の検出を、前記生理活性物質に特異的に結合する物質を用いて行う請求項1〜5いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記不溶性担体に結合した抗体結合性生理活性物質の検出が、標識物質により標識された前記生理活性物質に対する二次抗体を用いる請求項6記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記抗体結合性生理活性物質の検出を、前記生理活性物質に対する二次抗体と、二次抗体に対する三次抗体であって標識物質により標識された三次抗体を用いて行う請求項6記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記標識物質が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、発光物質、酵素、補酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群から選択される物質である請求項7又は8記載の生理活性物質の検出方法。
- 検体中に二種以上の抗体結合性生理活性物質が含まれ、前記抗体結合性生理活性物質を検出する工程において、各抗体結合性生理活性物質に対する二種以上の二次抗体によって検出する請求項1〜9いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 二種以上の二次抗体の検出が、該抗体に結合した異なる種類の標識物質をそれぞれ測定することによって行う請求項10記載の生理活性物質の検出方法。
- 二種以上の二次抗体の検出が、二種以上の各二次抗体に対する三次抗体であって別異の標識物質により標識された三次抗体によって行う請求項10記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記標識物質が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、発光物質、酵素、補酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群から選択される物質である請求項11又は12記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記不溶性担体の形状が96ウェル又は384ウェルのマイクロタイタープレートである請求項1〜13いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記不溶性担体の材質がプラスチックである請求項1〜14いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも1種である請求項15記載の生理活性物質の検出方法。
- 請求項10記載の生理活性物質の検出方法に用いる生理活性物質の測定キットであって、少なくとも下記の(ア)〜(ウ)の構成要素を含む抗体結合性生理活性物質の測定キット。
(ア)抗体を結合した不溶性担体
(イ)抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体
(ウ)標識物質により標識した、上記(イ)の二次抗体に対する三次抗体 - 前記不溶性担体の形状が96ウェルないし384ウェルのマイクロタイタープレートである請求項17記載の測定キット。
- 前記抗体結合性生理活性物質がサイトカインである請求項17又は18記載の測定キット。
- 前記標識物質が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、発光物質、酵素、補酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群から選択される物質である請求項17〜19いずれか記載の測定キット。
- 請求項12記載の生理活性物質の検出方法に用いる生理活性物質の測定キットであって、少なくとも下記の(ア)〜(オ)の構成要素を含む抗体結合性生理活性物質の測定キット。
(ア)抗体を結合した不溶性担体
(イ)標識物質により標識した、第一の抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体(二次抗体1)
(ウ)標識物質により標識した、第二の抗体結合性生理活性物質に対する二次抗体(二次抗体2);
(エ)第一の標識物質により標識した二次抗体1に対する三次抗体(三次抗体1)
(オ)第二の標識物質により標識した二次抗体2に対する三次抗体(三次抗体2) - 前記不溶性担体の形状が96ウェル又は384ウェルのマイクロタイタープレートである請求項21記載の測定キット。
- 二次抗体1及び二次抗体2が異なる生物種由来である請求項21又は22記載の測定キット。
- 第一及び第二の抗体結合性生理活性物質が、サイトカインの中からそれぞれ選択される異なる物質である請求項21〜23いずれか記載の測定キット。
- 第一及び第二の標識物質が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、発光物質、酵素、補酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群からそれぞれ選択される異なる物質である、請求項21〜24いずれか記載の測定キット。
- 第一及び第二の標識物質のいずれか一方が、ラジオアイソトープ又は蛍光物質であることを特徴とする請求項21〜24いずれか記載の測定キット。
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