WO2011065398A1 - 光学式センサー及びその製造方法 - Google Patents

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WO2011065398A1
WO2011065398A1 PCT/JP2010/070980 JP2010070980W WO2011065398A1 WO 2011065398 A1 WO2011065398 A1 WO 2011065398A1 JP 2010070980 W JP2010070980 W JP 2010070980W WO 2011065398 A1 WO2011065398 A1 WO 2011065398A1
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WO
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optical sensor
base layer
recognition element
concavo
factor
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/070980
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English (en)
French (fr)
Inventor
遠藤達郎
田中覚
奥田徳路
Original Assignee
国立大学法人東京工業大学
Ｓｃｉｖａｘ株式会社
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides
    • G01N21/774—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides the reagent being on a grating or periodic structure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to an optical sensor that is highly sensitive and easy to operate, and a method for manufacturing the same.
  • the electrochemical measurement method is a biomolecule that specifically recognizes the detection target immobilized on the electrode surface as a recognition element, and detects electrochemical signal changes that occur when the detection target binds to the recognition element?
  • signal amplification by a labeling substance such as an enzyme is detected and quantified.
  • the ELISA method is a technique for detecting color development or fluorescence depending on the enzyme reaction by the enzyme labeled in advance after the binding between the biomolecule and the detection target or the concentration of the detection target by the fluorescent molecule.
  • the electrochemical method or ELISA method requires a labeling agent such as an enzyme, a fluorescent substance, or a metal compound for a biomolecule used as an object to be detected or a recognition element.
  • a labeling agent such as an enzyme, a fluorescent substance, or a metal compound for a biomolecule used as an object to be detected or a recognition element.
  • This labeling operation has previously hindered the recognition ability of biomolecules having high recognition ability, and at the same time requires labeling work, resulting in a decrease in sensitivity and complication of operation.
  • an expensive and large-sized measuring device is required when detecting and quantifying a detection object with high sensitivity.
  • the surface plasmon resonance (SPR) method that detects the shift of the resonance angle that enables detection and quantification of unlabeled analytes and the quartz crystal (Quartz crystal microbalance: QMS) that detects frequency changes.
  • SPR surface plasmon resonance
  • QMS Quartz crystal microbalance
  • the SPR method it is necessary to construct a large optical system in order to detect the resonance angle shift, and the series of operations is complicated. Therefore, it is not suitable for on-site monitoring of detected objects.
  • the QCM method allows simple measurement, but is noisy and not suitable for high sensitivity measurement.
  • the cantilever method has problems that it is very difficult to produce a device and that it is not suitable for simple measurement.
  • LSPR localized surface plasmon resonance
  • Patent Document 1 a measurement method using localized surface plasmon resonance (LSPR), which is a nonlinear optical phenomenon expressed in nanometer-order noble metal fine particles such as gold, silver, and platinum
  • Patent Document 2 a measurement method using a sensor having a function as a photonic crystal in which particles are three-dimensionally arranged.
  • an object of the present invention is to provide an optical sensor that is low in manufacturing cost, easy in detection method, highly sensitive and highly reliable, and a manufacturing method thereof.
  • the optical sensor of the present invention is an optical sensor for specifically detecting a predetermined object to be detected, and includes a base layer having a concavo-convex structure in which a predetermined shape is periodically arranged and functions as a photonic crystal, and the target It comprises a recognition element coupled to a detection object, and a mediating means having a recognition element coupling factor coupled to the recognition element and formed on the surface of the concavo-convex structure.
  • the mediating means preferably has a contaminant non-specific adsorption removal factor that prevents binding or adsorption with contaminants other than the detection target, and for example, polyethylene glycol can be used.
  • the mediating means preferably has a base layer binding factor that binds to the base layer.
  • a silanol group can be used as the base layer binding factor.
  • an N-hydroxysuccinimide group can be used.
  • an anti-influenza antibody can be used as the recognition element.
  • an anti-insulin antibody can be used as the recognition element.
  • the optical sensor manufacturing method of the present invention is an optical sensor manufacturing method for detecting a predetermined object, and has a concavo-convex structure in which predetermined shapes are periodically arranged to function as a photonic crystal.
  • the mediating means has a contaminant non-specific adsorption removal factor that prevents binding with contaminants other than the detection target. Further, the mediating means preferably has a base layer binding factor that binds to a material constituting the base layer.
  • the selection of the material constituting the base layer is not affected by the recognition element. Since the material can be selected in consideration of a material that is easy to form a concavo-convex structure in which predetermined shapes are periodically arranged and function as a photonic crystal, a precise concavo-convex structure can be manufactured with good reproducibility. For the same reason, it can be manufactured at a low cost with a high yield and throughput.
  • the mediator is provided with a contaminant non-specific adsorption removal factor that prevents binding or adsorption to contaminants other than the detection target, the influence of the contaminants can be prevented and detection sensitivity can be further improved. Can do.
  • the optical sensor of the present invention is for detecting a predetermined object, and has a concavo-convex structure 11 in which a predetermined shape is periodically arranged two-dimensionally and functions as a photonic crystal. It is mainly composed of a base layer 1, a recognition element 2 that binds to an object to be detected, and a mediating means 3 that has a recognition element binding factor 32 that binds to the recognition element 2 and is formed on the surface of the concavo-convex structure 11. .
  • a to-be-detected object means a chemical substance, a biological substance, etc.
  • Specific examples include antigens, antibodies, receptors, ligands, lectins, sugar chain compounds, RNA, DNA, PNA, and haptens.
  • hormones, immunoglobulins, coagulation factors, enzymes, drugs and the like are included.
  • Substance names include serum albumin, macroglobulin, ferritin, ⁇ -fetoprotein, CEA, prostate specific antigen (PSA), hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), HIV-1P24, and the like.
  • the concavo-convex structure 11 may be anything as long as it functions as a photonic crystal.
  • a structure in which holes and cylinders having a predetermined diameter are two-dimensionally and periodically arranged at predetermined intervals is used. be able to.
  • a hole or column having a diameter of 50 to 500 nm and periodically arranged in a two-dimensional manner at a pitch of 50 to 1000 nm can be used.
  • a three-dimensional periodic array may be used.
  • the material of the base layer 1 may be any material as long as it can form a photonic crystal, but is preferably an imprint technique (thermal imprinting) that can form a large uneven area 11 with good reproducibility.
  • An imprint technique thermal imprinting
  • a material to which print, optical imprint, etc. can be applied is preferable.
  • cyclic olefin-based resins such as cyclic olefin ring-opening polymerization / hydrogenated product (COP) and cyclic olefin copolymer (COC), acrylic resin, polycarbonate, vinyl ether resin, perfluoroalkoxyalkane (PFA) and polytetrafluoroethylene Fluorine resin such as (PTFE), thermoplastic resin such as polystyrene, polyimide resin, and polyester resin can be used.
  • COP cyclic olefin ring-opening polymerization / hydrogenated product
  • COC cyclic olefin copolymer
  • acrylic resin polycarbonate
  • vinyl ether resin vinyl ether resin
  • PFA perfluoroalkoxyalkane
  • PTFE polytetrafluoroethylene Fluorine resin
  • thermoplastic resin such as polystyrene, polyimide resin, and polyester resin
  • a resin produced by a polymerization reaction (thermosetting or photocuring) of group-containing compounds can also be used. It is also possible to use the polymerizable reactive group-containing compounds alone for thermal polymerization, and it is also possible to add and use a thermally reactive initiator to improve thermosetting. is there. Further, the concavo-convex structure 11 may be formed by adding a photoreactive initiator and allowing the polymerization reaction to proceed by light irradiation.
  • Organic peroxides and azo compounds can be preferably used as the heat-reactive radical initiator, and acetophenone derivatives, benzophenone derivatives, benzoin ether derivatives, xanthone derivatives and the like can be preferably used as the photoreactive radical initiator.
  • the reactive monomer may be used without a solvent, or may be used after being dissolved in a solvent and desolvated after coating.
  • any substrate that does not impair the desired sensor sensitivity can be selected, such as a cyclic olefin resin, a transparent plastic substrate such as an acrylic resin or PET, a quartz substrate, a sapphire substrate, A transparent substrate is particularly preferred.
  • the water absorption rate of the resin is preferably 3% or less.
  • the heat generation start temperature (oxidation start temperature) of the heat generation peak accompanying oxidation is the glass of the resin.
  • the transition temperature is preferably + 35 ° C or higher. This is because in the microfabrication by thermal imprinting, particles on the surface of the resin caused by resin deterioration can be prevented, so that transfer defects and mold release defects of the concavo-convex structure 11 can be greatly reduced.
  • the recognition element 2 may be any element as long as it can specifically bind the detection target.
  • the recognition element 2 also includes those fragments or subunits having specific binding ability.
  • the cell itself can be selected as the recognition element 2, and the detected object in this case may specifically recognize a part of the cell (such as a receptor).
  • the mediating means 3 is formed on the surface of the concavo-convex structure 11 and serves to securely bind the recognition element 2 to the concavo-convex structure 11.
  • the material constituting the mediating means 3 includes a recognition element binding factor 32. ing.
  • the recognition element binding factor 32 is not particularly limited as long as it can bind to the recognition element 2, and a molecule having an amino group, a carboxyl group, or a thiol group of the recognition element 2 or an introduced molecule (for example, a protein such as an antibody).
  • N-hydroxysuccinimide group (NHS group), aldehyde group, carboxyl group, maleimide group and the like can be used.
  • an amino group a carboxyl group
  • an N-hydroxysuccinimide group (NHS group) or an aldehyde group can be used
  • a thiol group a maleimide group can be used.
  • the mediating means 3 has a foreign substance non-specific adsorption removal factor 33 that prevents binding with foreign substances other than the object to be detected.
  • the contaminant non-specific adsorption / removal factor 33 may be any as long as it can prevent binding to contaminants other than the object to be detected. For example, it has non-specific adsorption / removal ability.
  • Polyvinyl alcohol (PVA), 2-methacryloyloxyethylphosphorischoline (MPC) polymer, polyethylene glycol (PEG) are applicable.
  • the mediating means 3 can also be formed by coating the base layer 1, but if the mediating means 3 is provided with a base layer binding factor 31 that binds to the material constituting the base layer 1, the mediating means 3 is applied to the base layer 1. It can also be formed directly.
  • the base layer binding factor 31 may be any material as long as it can bind to the material constituting the base layer 1. For example, when the material of the base layer 1 is a cyclic olefin resin, a silanol group can be used. .
  • the optical sensor By forming the optical sensor in this way, when light is irradiated on the concavo-convex structure 11, light having a specific wavelength corresponding to the concavo-convex structure 11 is reflected by the function of the photonic crystal. Further, when a predetermined object to be detected is adsorbed to the concavo-convex structure 11 and the concavo-convex structure 11 has a slight change, the wavelength and intensity of the reflected light change accordingly. This change makes it possible to detect a predetermined object to be detected.
  • the optical sensor manufacturing method of the present invention includes a base layer forming step for forming a base layer 1 having a concavo-convex structure 11 having a predetermined shape periodically arranged and functioning as a photonic crystal, and a recognition element coupling factor 32 for binding to the recognition element 2.
  • any method can be used to form the concavo-convex structure 11 on the material to be the base layer 1 as long as a material that functions as a photonic crystal can be formed. It is preferable to use an imprint technique such as thermal imprint or optical imprint because it can be two-dimensionally and periodically arranged at intervals. Specifically, first, a mold 10 formed of a metal such as nickel, ceramics, a carbon material such as glassy carbon, silicon, or the like is heated to a temperature equal to or higher than the glass transition temperature of the thermoplastic resin 9, and the thermoplastic resin is then heated. It presses against the film or board
  • an imprint technique such as thermal imprint or optical imprint because it can be two-dimensionally and periodically arranged at interval
  • a material having a recognition element binding factor 32 that binds to the recognition element 2 is prepared.
  • the material has a contaminant non-specific adsorption / removal factor 33 for preventing binding with contaminants other than the object to be detected and a base layer binding factor 31 for binding with the material constituting the base layer 1.
  • a method for synthesizing such a material a known method may be appropriately used.
  • a silanol group bonded to the surface of the base layer 1, an NHS group bonded to a biorecognition element, polyethylene glycol having nonspecific adsorption removal ability may be polymerized by radical polymerization.
  • the prepared material is formed on the surface of the concavo-convex structure 11 of the base layer 1.
  • various general methods can be used as long as the function of the concavo-convex structure 11 as a photonic crystal is not impaired.
  • the material when the material is coated on the base layer 1 or the material has the base layer binding factor 31, it can be bonded by chemical bonding.
  • the mediator formation step include, for example, 1.425 g (3 mmol) of polyethylene glycol methacrylate [Poly (ethylene glycol) methyl ether methacrylate: PEGMA], 3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylate [3- (Trimethoxysilyl) propylgmethacrylate: TMSMA] 0.744g (3 mmol), N-Acryloxysuccinimide: NAS 0.507g (3 mmol), 2,2'-azobisisobutyronitrile [2,2'- 16.5 mg (0.1 mmol) of azobisisobutyronitrile: AIBN] is prepared, and these are dissolved in a glass container with tetrahydrofuran (THF), and then allowed to stand at 70 ° C.
  • THF tetrahydrofuran
  • tetrahydrofuran THF
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the base layer may be immersed in this solution for 30 minutes at room temperature and then dried, and the base layer may be fired at 120 ° C. for 5 minutes.
  • any method may be used as long as the recognition element 2 can be coupled to the recognition element coupling factor 32 of the mediating means 3.
  • the surface of the concavo-convex structure 11 on which the mediating means 3 is formed is used.
  • a solution containing the recognition element may be dropped and dried. In this case, it is preferable to remove the excess recognition elements 2 and recognition element coupling factors 32.
  • light is irradiated to an optical sensor in a state where an object to be detected or the like is not adsorbed, and information on optical characteristics of reflected light, in particular, peak wavelength and intensity of reflected light is acquired.
  • Any light source may be used.
  • a tungsten / halogen light source a light emitting diode, an LED, a deuterium lamp, an organic EL, or a laser may be used.
  • a multichannel spectroscope, a CCD image sensor, a CMOS sensor, or the like can be used as the light detection means for detecting the reflected light.
  • Information processing means such as a computer may be used for processing the acquired information.
  • Information processing means such as a computer may be used for processing the acquired information.
  • the optical characteristics of the reflected light when the concentration of the object to be detected contained in the sample is changed in advance are detected by an optical sensor to form a database, and after the sample is brought into contact with the concavo-convex structure 11 By comparing the optical characteristics of the light reflected from the optical sensor, the presence / absence and amount of the object to be detected contained in the solution may be detected. In this case, the operation (1) becomes unnecessary.
  • information on the optical characteristics of transmitted light may be used by irradiating the optical sensor with light.
  • it may be used as follows. (1) First, light is irradiated to an optical sensor in a state where an object to be detected or the like is not adsorbed, and information on optical characteristics of transmitted light, in particular, peak wavelength and intensity of transmitted light is acquired. (2) Next, after a sample that may contain an object to be detected is brought into contact with the concave-convex structure 11 of the optical sensor of the present invention, information on the optical characteristics of the transmitted light is acquired in the same manner. (3) Finally, the optical characteristics of the light transmitted through the optical sensor and the optical characteristics of the light transmitted through the optical sensor after contacting the sample with the concavo-convex structure 11 are included in the solution. The presence or amount of the detected object is detected.
  • the optical characteristics of the transmitted light when the concentration of the object to be detected contained in the sample is changed in advance are detected with an optical sensor to form a database, and the sample is placed on this data and the concavo-convex structure 11.
  • the presence / absence or amount of the object to be detected contained in the solution may be detected. In this case, the operation (1) becomes unnecessary.
  • a cyclic olefin-based resin film having a glass transition temperature (Tg) of 163 ° C. (trade name: ZEONOR FILM ZF- 16: thickness 100 ⁇ m)
  • Tg glass transition temperature
  • ZEONOR FILM ZF- 16 thickness 100 ⁇ m
  • Thermal imprinting was performed by the following method. First, a nickel mold preheated to 205 ° C. is pressed against the resin film at a pressure of 2 MPa for 180 seconds. Next, after cooling the nickel mold and the resin film to 100 ° C., the nickel mold is released from the resin film to form a hole-shaped uneven structure. For thermal imprinting, an SCVAX imprinting device (VX) was used.
  • VX SCVAX imprinting device
  • a base layer into which hydroxyl groups (OH groups) were introduced on the surface by UV / O3 treatment was immersed in a copolymer solution prepared by polymerization to a predetermined concentration.
  • the copolymer was polymerized by radical polymerization of a copolymer containing a silanol group bonded to the surface of the base layer, an NHS group bonded to a biorecognition element, and polyethylene glycol (PEG) having nonspecific adsorption removal ability.
  • PEG polyethylene glycol
  • polyethylene glycol methacrylate [Poly (ethylene glycol) methyl ether methacrylate: PEGMA], 0.744 g of 3- (Trimethoxysilyl) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ propyl methacrylate: TMSMA] (3 mmol), 0.507 g (3 mmol) of N-acryloyloxysuccinimide (NAS), 16.5 mg of 2,2′-azobisisobutyronitrile (AIBN) ( 0.1 mmol) was prepared, dissolved in a glass container with tetrahydrofuran (THF), and then allowed to stand at 70 ° C. for a whole day and night for polymerization.
  • THF tetrahydrofuran
  • tetrahydrofuran THF was vaporized, and the remaining copolymer was adjusted to a concentration of 200 mg / ml using dimethyl sulfoxide (DMSO) and then diluted to 1 mg / ml using ultrapure water.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the base layer cut into 5 ⁇ 5 mm was immersed in this solution for 30 minutes at room temperature.
  • the soaked base layer was dried and subjected to a baking treatment at 120 ° C. for 5 minutes to coat the surface of the concavo-convex structure of the copolymer (mediating means forming step).
  • an anti-influenza antibody (anti-influenza A antibody (H1N1 haemagglutinin), manufacturer: Biogenesis inc.) was used (recognition element binding step).
  • the product was dried with a blower to produce the optical sensor A of the present invention.
  • FIG. 3 shows that the reflection intensity decreases as the concentration increases, and the reflection intensity changes even for a concentration as small as 1 pg / ml.
  • the form of the base layer ⁇ FIG. 4 (a) ⁇ before modifying the copolymer (mediating means) and the surface of the optical sensor A ⁇ FIG. 4 (b) ⁇ after dropping the influenza antigen is observed using an atomic force microscope. did. About 200 nm of particulate matter was observed on the surface of the optical sensor A after the influenza antigen was dropped. This granular material was observed in the same shape and size in other parts. This is considered to be an influenza virus because of its size and shape.
  • the optical sensor of the present invention was able to realize detection and quantification of influenza virus with high sensitivity.
  • Example 2 Using the optical sensor A produced in the same manner as in Example 1, an experiment for detecting influenza virus in saliva was performed by the following method. First, saliva is collected with 6 cotton balls in the mouth on an empty stomach. This was filtered through a syringe filter having a pore size of 0.2 ⁇ m and stored frozen until use.
  • an influenza virus solution diluted to 1 pg / ml, 10 pg / ml, 100 pg / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, and 100 ng / ml with the collected saliva is dropped onto the surface of the optical sensor A, and at room temperature. Left for 30 minutes.
  • FIG. 5 shows the relationship between the concentration of the influenza virus solution and the amount of change in the reflection intensity before and after the antigen-antibody reaction.
  • a cyclic olefin-based resin film (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd., trade name: ZEONOR film ZF-16: thickness 100 ⁇ m) is coated with mediating means having various concentrations having a contaminant nonspecific adsorption removal factor.
  • polymerization of the mediating means was carried out by radical polymerization of a copolymer containing silanol groups bonded to the surface of the base layer, NHS groups bonded to the biorecognition element, and polyethylene glycol (PEG) having nonspecific adsorption removal ability. went.
  • polyethylene glycol methacrylate [Poly (ethylene glycol) methyl ether methacrylate: PEGMA], 0.744 g of 3- (Trimethoxysilyl) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ propyl methacrylate: TMSMA] (3 mmol), 0.507 g (3 mmol) of N-acryloyloxysuccinimide (NAS), 16.5 mg of 2,2′-azobisisobutyronitrile (AIBN) ( 0.1 mmol) was prepared, dissolved in a glass container with tetrahydrofuran (THF), and then allowed to stand at 70 ° C. for a whole day and night for polymerization.
  • THF tetrahydrofuran
  • tetrahydrofuran THF
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the cyclic olefin-based resin film having a hydroxyl group (OH group) introduced on the surface thereof by UV / O3 treatment was immersed in these solutions for 30 minutes at room temperature.
  • the soaked base layer was dried and baked at 120 ° C. for 5 minutes to coat the surface of the concavo-convex structure with the copolymer.
  • bovine serum albumin (BSA) solution (manufacturer: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dropped on these films and on the film not coated with the copolymer, and dried at 37 ° C.
  • Bovine serum albumin (BSA) was immobilized on the NHS group (recognition element binding factor) of the copolymer. After immobilization, excess BSA was removed with 100 mM borate buffer (pH 8.5).
  • HRP horseradish peroxidase
  • TMB 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB), which develops color when horseradish peroxidase (HRP) is present on this film, is added dropwise, 0 min (immediately after the addition), 1 min, 2 min, 5 min, 10 min later Each color was observed. The result is shown in FIG.
  • the film not coated with the copolymer was considerably colored, but the color was weakened as the copolymer concentration was increased, and no color was observed on the film coated with the copolymer having a concentration of 1 mg / ml. It was.
  • horseradish peroxidase (HRP) as a contaminant is inhibited from adsorbing to a film as the amount of polyethylene glycol (PEG) as a contaminant nonspecific adsorption removal factor increases, and the copolymer has a concentration of 1 mg / ml. It can be seen that the film coated with is hardly adsorbed.
  • a cyclic olefin-based resin film (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd., trade name: ZEONOR film ZF-16: thickness 100 ⁇ m) is coated with mediating means having various concentrations having a contaminant nonspecific adsorption removal factor.
  • polymerization of the mediating means was carried out by radical polymerization of a copolymer containing silanol groups bonded to the surface of the base layer, NHS groups bonded to the biorecognition element, and polyethylene glycol (PEG) having nonspecific adsorption removal ability. went.
  • polyethylene glycol methacrylate [Poly (ethylene glycol) methyl ether methacrylate: PEGMA], 0.744 g of 3- (Trimethoxysilyl) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ propyl methacrylate: TMSMA] (3 mmol), 0.507 g (3 mmol) of N-acryloyloxysuccinimide (NAS), 16.5 mg of 2,2′-azobisisobutyronitrile (AIBN) ( 0.1 mmol) was prepared, dissolved in a glass container with tetrahydrofuran (THF), and then allowed to stand at 70 ° C. for a whole day and night for polymerization.
  • THF tetrahydrofuran
  • tetrahydrofuran THF
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the cyclic olefin-based resin film having a hydroxyl group (OH group) introduced on the surface thereof by UV / O3 treatment was immersed in these solutions for 30 minutes at room temperature.
  • the soaked base layer was dried and subjected to a baking treatment at 120 ° C. for 5 minutes to coat the copolymer on the film surface.
  • Saliva or serum was adsorbed as contaminants on the film, and the arithmetic average roughness (Ra value) of each film surface before and after the adsorption was measured by AFM and compared. Saliva and serum were used as impurities.
  • the results of the copolymer concentration and the arithmetic average roughness (Ra value) of each film surface are shown in FIGS.
  • the saliva was prepared by putting a cotton ball into the subject's mouth on an empty stomach, collecting the saliva impregnated in the cotton ball with a syringe, and filtering it with a 0.2 ⁇ m aperture. Further, the saliva was adsorbed onto the film surface by dropping the prepared saliva on each film, and leaving it for 30 minutes to remove excess saliva by a washing operation.
  • the serum was adsorbed by dropping human serum purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. onto each film, leaving it for 30 minutes, and removing excess serum by washing.
  • FIG. 7 shows that when the contaminant is saliva, the arithmetic average roughness before and after adsorption to the film is small when the copolymer concentration is 1 mg / ml to 10 mg / ml.
  • FIG. 8 shows that when the contaminant is serum, the arithmetic average roughness before and after adsorption onto the film is small when the copolymer concentration is 100 ⁇ g / ml to 10 mg / ml. Therefore, it is considered that the copolymer is uniformly and monomolecularly modified on the film surface within the above ranges, and each contaminant is hardly adsorbed on the film surface.
  • the concentration of the copolymer is lower than this range, the copolymer is not uniformly modified on the film surface with a single molecule, and therefore, impurities are adsorbed on the portions where the polymer is not modified (gap), resulting in surface roughness. Seems to have grown. If the copolymer concentration is higher than this range, the copolymer is modified in multiple layers on the film surface, and impurities are easily taken into the copolymer layer. It is done.
  • a cyclic olefin resin film having a glass transition temperature (Tg) of 163 ° C. (trade name: ZEONOR FILM ZF- 16: thickness 100 ⁇ m)
  • Tg glass transition temperature
  • ZEONOR FILM ZF- 16 thickness 100 ⁇ m
  • Thermal imprinting was performed by the following method. First, a nickel mold preheated to 170 ° C. is pressed against the resin film at a pressure of 2 MPa for 300 seconds. Next, after cooling the nickel mold and the resin film to 150 ° C., the nickel mold is released from the resin film to form a pillar-shaped uneven structure. For thermal imprinting, an SCIVAX imprinting device (X-300) was used.
  • a base layer into which hydroxyl groups (OH groups) were introduced on the surface by UV / O3 treatment was immersed in a copolymer solution prepared by polymerization to a predetermined concentration.
  • the copolymer was polymerized by radical polymerization of a copolymer containing a silanol group bonded to the surface of the base layer, an NHS group bonded to a biorecognition element, and polyethylene glycol (PEG) having nonspecific adsorption removal ability.
  • PEG polyethylene glycol
  • tetrahydrofuran THF was vaporized, and the remaining copolymer was adjusted to a concentration of 200 mg / ml using dimethyl sulfoxide (DMSO), and then diluted to 1 mg / ml using ultrapure water.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the base layer cut into 5 ⁇ 5 mm was immersed in this solution for 30 minutes at room temperature.
  • the soaked base layer was dried and subjected to a baking treatment at 120 ° C. for 5 minutes to coat the surface of the concavo-convex structure of the copolymer (mediating means forming step).
  • an anti-insulin antibody manufactured by AbD Serotec, product number: 5329-3806 was used (recognition element binding step).
  • the product was dried with a blower to produce the optical sensor B of the present invention. After drying, the sample was refrigerated at 4 ° C. until used for measurement.
  • FIG. 8 shows that the reflection intensity decreases as the concentration increases, and the reflection intensity changes even for a small concentration of 2 ⁇ U / ml.
  • the normal value of the insulin concentration in the blood is 5 to 15 ⁇ U / ml on an empty stomach, and the optical sensor B of the present invention can realize detection and quantification of insulin with high sensitivity.

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Abstract

　製造コストが低く検出方法が容易で、非常に高感度かつ信頼性の高い光学式センサー及びその製造方法を提供する。所定の被検出物を特異的に検出するための光学式センサーであって、所定の形状が周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造11を有する基層１と、被検出物と結合する認識素子２と、認識素子２と結合する認識素子結合因子32を有し、凹凸構造11の表面に形成される媒介手段３と、を具備することを特徴とする光学式センサー。

Description

光学式センサー及びその製造方法
　本発明は、高感度で操作が容易な光学式センサー及びその製造方法に関する。
　従来酵素や抗体、DNAなどといった生体分子の高い認識能を利用した被検出物の検出および定量には、PCR（Polymerase chain reaction）法や電気泳動法、電気化学的測定手法、ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)法が主に用いられている。
　電気化学的測定手法は、被検出物を特異的に認識する生体分子を認識素子として電極表面に固定化し、認識素子へ被検出物が結合した際に生じる電気化学的なシグナル変化を検出するか、または酵素などの標識物質によるシグナル増幅を検出し、定量を行うものである。
　また、ELISA法は、生体分子と被検出物との結合後にあらかじめ標識した酵素による酵素反応や蛍光分子による被検出物の濃度に依存した発色もしくは蛍光を検出する手法である。
　しかしながら、電気化学的手法あるいはELISA法では、被検出物あるいは認識素子として用いる生体分子へ酵素や蛍光物質、金属化合物などの標識剤を必要とする。この標識作業は、従来高い認識能を有する生体分子の認識能を阻害すると同時に、標識作業を必要とするため、感度の低下および操作の煩雑化を招いている。また、高感度に被検出物を検出・定量する際に高額かつ大型の測定装置を必要とする。
　また、簡便な測定手法として注目されているイムノクロマト法もあるが、この場合でも金コロイドやポリスチレン粒子等の修飾が必要である。
　このような背景から、生体分子へ酵素や蛍光分子などを標識することなく（非標識）、被検出物の検出および定量が行える測定手法が望まれてきた。
　そこで、非標識での被検出物の検出および定量が可能な共鳴角のシフトを検出する表面プラズモン共鳴(Surface plasmon resonance : SPR)法や振動数変化を検出する水晶振動子(Quartz crystal microbalance : QCM)法、また、共振周波数変化を検出するカンチレバーによる非標識に被検出物の検出・定量手法が開発されている。
　しかしながら、SPR法の場合、共鳴角シフトを検出するために大型の光学系を構築する必要があるとともに、一連の操作が煩雑である。そのためオンサイトでの被検出物のモニタリングに適さない。また、QCM法では、簡便に測定は可能ではあるが、ノイズが大きく、高感度測定には適さない。そしてカンチレバー法ではデバイス作製が非常に困難という点とともに、簡易測定には適さないという問題がある。
　また、上記測定法とは別に、金や銀、白金などのナノメートルオーダーでの貴金属微粒子に発現する非線形光学現象である局在表面プラズモン共鳴（LSPR）を利用した測定法（例えば、特許文献１参照）や、粒子を三次元的に配列したフォトニック結晶としての機能を有するセンサーを用いた測定方法もある（例えば、特許文献２参照）。
　しかしながら、これらの方法では、披検出物質を高感度に検出するために、微粒子を均一かつ密に配列させる必要性があるが、密に配列することは非常に難しく再現性も低いため、感度や信頼性の点で未だ問題がある。
　また、従来のセンサーは各センサー同士の再現性が低いため、同一のセンサーを用いて、試料を接触させる前後の光学特性の違いを比較することはできでも、試料に含まれる被検出物の濃度等を変化させた際の光学特性の変化を複数のセンサーを用いて データーベース化し利用するということは困難であるという問題もあった。
　また、センサーの歩留まりやスループットが低く、コストがかかるという問題もあった。
　更に、生体より採取された血液、血清、血漿のほか、唾液、涙液、皮膚滲出液など多種の夾雑物が混在する体液中より被検出物質を特異的に検出・定量するには、非特異的吸着の影響が大きく、微量の被検出物質の検出・定量が困難であった。
特許公開２００６－２５０６６８号公報
特許公開２００７－２７１６０９号公報
　そこで本発明では、製造コストが低く検出方法が容易で、非常に高感度かつ信頼性の高い光学式センサー及びその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明の光学式センサーは、所定の被検出物を特異的に検出するための光学式センサーであって、所定の形状が周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する基層と、前記被検出物と結合する認識素子と、前記認識素子と結合する認識素子結合因子を有し、前記凹凸構造の表面に形成される媒介手段と、を具備することを特徴とする。
　この場合、前記媒介手段は、前記被検出物以外の夾雑物との結合又は吸着を防止する夾雑物非特異的吸着除去因子を有する方が好ましく、例えば、ポリエチレングリコールを用いることができる。また、前記媒介手段は、前記基層と結合する基層結合因子を有する方が好ましく、例えば、前記基層を構成する材料が環状オレフィン系樹脂の場合、前記基層結合因子としてシラノール基を用いることができる。また、前記認識素子結合因子としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基を用いることができる。また、本発明の光学式センサーをインフルエンザウィルスの検出に用いる場合には、前記認識素子として抗インフルエンザ抗体を用いることができる。また、インスリンの検出に用いる場合には、前記認識素子として抗インスリン抗体を用いることができる。
　また、本発明の光学式センサー製造方法としては、所定の被検出物を検出するための光学式センサーの製造方法であって、所定の形状が周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する基層を形成する基層形成工程と、前記認識素子と結合する認識素子結合因子を有する媒介手段を、前記凹凸構造の表面に形成する媒介手段形成工程と、前記媒介手段の認識素子結合因子に前記被検出物と結合する認識素子を結合させる認識素子結合工程と、を具備することを特徴とする。
　この場合、前記媒介手段は、前記被検出物以外の夾雑物との結合を防止する夾雑物非特異的吸着除去因子を有する方が好ましい。また、前記媒介手段は、前記基層を構成する材料と結合する基層結合因子を有する方が好ましい。
　本発明の光学式センサーは、基層と認識素子との間に認識素子と結合する認識素子結合因子を有する媒介手段を設けるので、基層を構成する材料の選択が認識素子に左右されることがなく、所定の形状が周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造を形成し易い材料を考慮して選択することができるので、精密な凹凸構造を再現性良く製造することができる。また、同様の理由から、歩留まりやスループットが高く、低コストで製造することができる。
　また、媒介手段に、被検出物以外の夾雑物との結合又は吸着を防止する夾雑物非特異的吸着除去因子を設ければ、夾雑物による影響を防止して、検出感度をより向上させることができる。
本発明の光学式センサーの構成を示す模式図である。 本発明の光学式センサーの基層の製造方法を説明する図である。 本発明の光学式センサーの光学特性を示す図である。 本発明の光学式センサーの凹凸構造を原子間力顕微鏡で観察した図である。 本発明の光学式センサーにおけるインフルエンザウィルス溶液の濃度と抗原抗体反応前後の反射強度変化量との関係を示す図である。 本発明の光学式センサーに形成された媒介手段の濃度と夾雑物の付着との関係を示す写真である。 本発明の光学式センサーに形成された媒介手段の濃度と唾液の付着との関係を示す図である。 本発明の光学式センサーに形成された媒介手段の濃度と血清の付着との関係を示す図である。 本発明の光学式センサーにおけるインスリンの濃度と抗原抗体反応前後の反射強度との関係を示す図である。
　本発明の光学式センサーは、図１に示すように、所定の被検出物を検出するためのもので、所定の形状が二次元的に周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造11を有する基層１と、被検出物と結合する認識素子２と、認識素子２と結合する認識素子結合因子32を有し、凹凸構造11の表面に形成される媒介手段３と、で主に構成される。
　なお、被検出物とは、化学物質や生体物質等を意味する。具体的には、抗原、抗体、レセプター、リガンド、レクチン、糖鎖化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ハプテン等が挙げられる。被検出物の機能から分類すると、ホルモン、イムノグロブリン、凝固因子、酵素、薬剤等が含まれる。物質名では、血清アルブミン、マクログロブリン、フェリチン、α－フェトプロテイン、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＩＶ－１Ｐ２４などが挙げられる。
　凹凸構造11は、フォトニック結晶として機能するものであればどのようなものでも良いが、例えば、所定の直径を有する孔や円柱を所定の間隔で二次元的に正確に周期配列した構造を用いることができる。また、凹凸構造11の間隔は、反射される光のピーク波長が可視領域となるように形成するのが好ましい。具体的には、50～500ｎｍの直径を有する孔又は柱を50～1000ｎｍのピッチで二次元的に周期配列したものを用いることができる。なお、３次元的に周期配列させたものでも構わない。
　また、基層１の材料としては、フォトニック結晶を形成できるものであればどのようなものでも良いが、好ましくは、大面積で均一な凹凸構造11を再現性良く形成できるインプリント技術（熱インプリント、光インプリント等）を適用可能な材料が良い。例えば、環状オレフィン開環重合／水素添加体（ＣＯＰ）や環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）等の環状オレフィン系樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ビニルエーテル樹脂、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）やポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等のフッ素樹脂、ポリスチレン、ポリイミド系樹脂、ポリエステル系樹脂等の熱可塑性樹脂を用いることができる。
　また、エポキシド含有化合物類、（メタ）アクリル酸エステル化合物類、ビニルエーテル化合物類、ビスアリルナジイミド化合物類のようにビニル基・アリル基等の不飽和炭化水素基含有化合物類、等の重合反応性基含有化合物類の重合反応（熱硬化、または光硬化）によって製造される樹脂を用いることもできる。熱的に重合するために重合反応性基含有化合物類を単独で使用することも可能であるし、熱硬化性を向上させるために熱反応性の開始剤を添加して使用することも可能である。更に光反応性の開始剤を添加して光照射により重合反応を進行させて凹凸構造11を形成してもよい。熱反応性のラジカル開始剤としては有機過酸化物、アゾ化合物が好適に使用でき、光反応性のラジカル開始剤としてはアセトフェノン誘導体、ベンゾフェノン誘導体、ベンゾインエーテル誘導体、キサントン誘導体等が好適に使用できる。また、反応性モノマーは無溶剤で使用しても良いし、溶媒に溶解して塗布後に脱溶媒して使用しても良い。樹脂を塗布するための基板としては、目的のセンサー感度を損なわないものであれば任意に選択でき、環状オレフィン系樹脂、アクリル系樹脂やPETのような透明プラスチック基板、石英基板、サファイア基板等、透明基板が特に好ましい。
　なお、パターンの寸法安定性の観点から、樹脂の吸水率は３％以下である方が好ましい。
　また、熱インプリント用の樹脂としては、空気中、昇温速度5℃/minでの示差走査熱量計測定において、酸化に伴う発熱ピークの発熱開始温度（酸化開始温度）が、当該樹脂のガラス転移温度＋35℃以上である方が好ましい。これは、熱インプリントによる微細加工において、樹脂劣化により発生する樹脂表面のパーティクル状物を防止できるので、凹凸構造11の転写不良や離型不良等を大幅に低減できるからである。
　認識素子２は、被検出物を特異的に結合できるものであればどのようなものでも良い。例えば、抗原に対しては抗体、抗体に対しては抗原、ハプテンに対しては抗ハプテン抗体、抗ハプテン抗体に対してはハプテン、ＤＮＡに対してはハイブリダイズすることができるＤＮＡ又はＰＮＡ、ビオチンに対してはアビジンあるいはストレプトアビジン、アビジンあるいはストレプトアビジンに対してはビオチンあるいはビオチン化タンパク、ホルモン受容体（例えばインスリン受容体）に対してはホルモン（例えばインスリン）、ホルモン（例えばインスリン）に対してはホルモン受容体（例えばインスリン受容体）、レクチンに対しては対応する糖鎖、糖鎖に対しては対応するレクチンなどが挙げられる。また、認識素子２は、特異的結合能を有するそれらのフラグメントあるいはサブユニットなどをも含む。さらに、細胞自体を認識素子２として選択可能であり、この場合の被検出物は、該細胞のある一部（受容体等）を特異的に認識するものでよい。
　媒介手段３は、凹凸構造11の表面に形成され、凹凸構造11に認識素子２を確実に結合させるためのものであり、媒介手段３を構成する材料には、認識素子結合因子32が含まれている。このように媒介手段３を設けることにより、基層１の凹凸構造11を精密に形成できる材料を認識素子２の結合を考慮することなく選択することができ、認識素子２は媒介手段３を介して凹凸構造11上に均一かつ確実に配置することができる。
　認識素子結合因子32は、認識素子２と結合できるものであればどのようなものでも良く、認識素子２のアミノ基やカルボキシル基、チオール基を有する分子あるいは導入した分子（例えば、抗体などのタンパク質）と結合するN-ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）、アルデヒド基、カルボキシル基、マレイミド基等を用いることができる。例えば、アミノ基の場合、カルボキシル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）、アルデヒド基を用いることができ、チオール基の場合、マレイミド基を用いることができる。
　また、媒介手段３は、被検出物以外の夾雑物との結合を防止する夾雑物非特異的吸着除去因子33を有する方が好ましい。夾雑物非特異的吸着除去因子33としては、被検出物以外の夾雑物との結合を防止することができるものであればどのようなものでも良いが、例えば、非特異的吸着除去能を有するポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が該当する。
　また、媒介手段３は、基層１に被覆することによって形成することもできるが、媒介手段３に基層１を構成する材料と結合する基層結合因子31を設ければ、媒介手段３を基層１に直接形成することもできる。基層結合因子31としては、基層１を構成する材料と結合できるものであればどのようなものでも良く、例えば、基層１の材料が環状オレフィン系樹脂の場合には、シラノール基を用いることができる。
　光学式センサーをこのように形成することにより、凹凸構造11に光を照射すると、フォトニック結晶の機能によって凹凸構造11に応じた特定の波長の光が反射される。また、凹凸構造11に所定の被検出物が吸着し、凹凸構造11に微妙な変化があると、それに応じて反射光の波長や強度が変化する。この変化によって、所定の被検出物を検出することが可能となる。
　次に、本発明の光学式センサーの製造方法について説明する。本発明の光学式センサーの製造方法は、所定の形状が周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造11を有する基層１を形成する基層形成工程と、認識素子２と結合する認識素子結合因子32を有する媒介手段３を凹凸構造11の表面に形成する媒介手段形成工程と、媒介手段３の認識素子結合因子32に被検出物と結合する認識素子２を結合させる認識素子結合工程と、で主に構成される。
　基層形成工程において、基層１となる材料に凹凸構造11を形成する方法としては、フォトニック結晶として機能するものを形成できればどのようなものでも良いが、所定の直径を有する孔や円柱を所定の間隔で二次元的に正確に周期配列させることができる点で、熱インプリントや光インプリント等のインプリント技術を用いるのが好ましい。具体的には、まず、ニッケル等の金属やセラミックス、ガラス状カーボン等の炭素素材、シリコンなどから形成された型10を、熱可塑性樹脂９のガラス転移温度以上に加熱し、これを当該熱可塑性樹脂からなるフィルム又は基板に押圧する（図２（ａ））。次に、当該熱可塑性樹脂をガラス転移温度以下に冷却した後、離型する。これにより、型10に形成されたパターン10ａ（凹凸構造11の反転パターン）が転写される（図２（ｂ））。
　媒介手段形成工程では、まず、認識素子２と結合する認識素子結合因子32を有する材料を用意する。この際、当該材料は、被検出物以外の夾雑物との結合を防止する夾雑物非特異的吸着除去因子33や、基層１を構成する材料と結合する基層結合因子31を有する方が好ましい。このような材料の合成方法としては、公知の方法を適宜用いれば良く、例えば、基層１表面に結合するシラノール基、生体認識素子と結合するＮＨＳ基、非特異的吸着除去能を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる下記式（１）で表されるコポリマーをラジカル重合にて重合すれば良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　次に、用意した材料を基層１の凹凸構造11の表面に形成する。形成方法は、凹凸構造11のフォトニック結晶としての機能を損なわない範囲で種々の一般的な方法を用いることができる。例えば、当該材料を基層１上に被覆したり、当該材料が基層結合因子31を有する場合には、化学結合により結合させることができる。
　媒介手段形成工程の具体例としては、例えば、ポリエチレングリコールメタクリレート［Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate：PEGMA］を1.425ｇ（３mmol）、メタクリル酸３－（トリメトキシシリル）プロピル［3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylate：TMSMA］を0.744ｇ（3 mmol）、Ｎ－アクリロイルオキシスクシンイミド［N-Acryloxysuccinimide：NAS］を0.507ｇ（3 mmol）、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル［2,2'-azobisisobutyronitrile：AIBN］を16.5ｍｇ（0.1 mmol）用意し、これらをテトラヒドロフラン(THF)にてガラス容器中に溶解させた後、70℃にて一昼夜静置させることで重合を行う。次に、テトラヒドロフラン（THF）を気化させ、残留したコポリマーを、ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いて200mg/mlの濃度に調製した後、超純水を用いて100μg/ml～10mg/ml、好ましくは１ｍｇ／ｍｌに希釈する。この溶液中に基層を30分間室温にて浸漬した後乾燥し、当該基層を120℃にて５分間焼成すれば良い。
　認識素子結合工程では、媒介手段３の認識素子結合因子32に認識素子２を結合させることができればどのような方法を用いても良いが、例えば、媒介手段３が形成された凹凸構造11表面に認識素子を含む溶液を滴下し乾燥すれば良い。この場合、余剰の認識素子２や認識素子結合因子32は除去する方が好ましい。
　次に、本発明の光学式センサーの使用方法（検出方法）について下記に説明する。
（１）まず、被検出物等が吸着されていない状態の光学式センサーに光を照射し、反射光の光学特性、特に、反射光のピーク波長や強度に関する情報を取得する。光源としてはどのようなものでも良いが、例えば、タングステン・ハロゲン光源や発光ダイオード、ＬＥＤ、重水素ランプ、有機ＥＬ、レーザー等を用いれば良い。また、反射光を検出する光検出手段には、例えば、マルチチャンネル分光器やＣＣＤイメージセンサー、ＣＭＯＳセンサー等を用いることができる。また、取得した情報の処理には、コンピュータ等の情報処理手段を用いれば良い。
（２）次に、被検出物が含まれ得る試料を本発明の光学式センサーの凹凸構造11上に接触させた後、同様に反射光の光学特性に関する情報を取得する。
（３）最後に、光学式センサーから反射される光の光学特性と、凹凸構造11に試料を接触させた後の光学式センサーから反射される光の光学特性とを比較することにより、溶液中に含まれる被検出物の有無や量を検出する。
　なお、予め試料に含まれる被検出物の濃度等を変化させた際の反射光の光学特性を光学式センサーで検出してデーターベース化し、このデータと凹凸構造11に試料を接触させた後の光学式センサーから反射される光の光学特性とを比較することにより、溶液中に含まれる被検出物の有無や量を検出しても良い。この場合、（１）の操作は不要になる。
　また、光学式センサーに光を照射し、透過光の光学特性に関する情報を利用しても良い。この場合、下記のように使用すれば良い。
（１）まず、被検出物等が吸着されていない状態の光学式センサーに光を照射し、透過光の光学特性、特に、透過光のピーク波長や強度に関する情報を取得する。
（２）次に、被検出物が含まれ得る試料を本発明の光学式センサーの凹凸構造11上に接触させた後、同様に透過光の光学特性に関する情報を取得する。
（３）最後に、光学式センサーを透過した光の光学特性と、凹凸構造11に試料を接触させた後の光学式センサーを透過した光の光学特性とを比較することにより、溶液中に含まれる被検出物の有無や量を検出する。
　なお、この場合にも、予め試料に含まれる被検出物の濃度等を変化させた際の透過光の光学特性を光学式センサーで検出して データーベース化し、このデータと凹凸構造11に試料を接触させた後の光学式センサーを透過する光の光学特性とを比較することにより、溶液中に含まれる被検出物の有無や量を検出しても良い。この場合、（１）の操作は不要になる。
　次に本発明の実施例を説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
　まず、実施例に用いた本発明の光学式センサーの製造方法について説明する。
　最初に、熱インプリント技術を用いて、ピラー状パターンが形成されたニッケル金型からガラス転移温度（Ｔｇ）が163℃の環状オレフィン系樹脂フィルム（日本ゼオン社製、商品名：ゼオノアフィルムZF-16：厚み100μｍ）に当該パターンを転写し、直径約250nm、深さ150nmの孔がピッチ500nmで複数配置された凹凸構造を有する基層を作製した（基層形成工程）。
　熱インプリントは次の方法で行った。まず、前記樹脂フィルムに対し、予め205℃に加熱したニッケル金型を圧力２MPaで180秒間押圧する。次に、ニッケル金型と樹脂フィルムを100℃まで冷却した後、この樹脂フィルムからニッケル金型を離型し、孔状の凹凸構造を形成する。なお、熱インプリントには、SCIVAX社のインプリント装置（VX）を使用した。
　次に、重合し所定濃度に調製したコポリマー溶液中に、UV/O3処理によって表面に水酸基(OH基)を導入した基層を浸漬した。
　コポリマーの重合は、基層表面に結合するシラノール基、生体認識素子と結合するＮＨＳ基、非特異的吸着除去能を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるコポリマーをラジカル重合によって行った。詳細には、ポリエチレングリコールメタクリレート［Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate：PEGMA］を1.425ｇ（３mmol）、メタクリル酸３－（トリメトキシシリル）プロピル［3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylate：TMSMA］を0.744ｇ（3 mmol）、Ｎ－アクリロイルオキシスクシンイミド［N-Acryloxysuccinimide：NAS］を0.507ｇ（3 mmol）、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル［2,2'-azobisisobutyronitrile：AIBN］を16.5ｍｇ（0.1 mmol）用意し、これらをテトラヒドロフラン(THF)にてガラス容器中に溶解させた後、70℃にて一昼夜静置させることで重合を行った。
　重合後はテトラヒドロフラン（THF）を気化させ、残留したコポリマーを、ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いて200mg/mlの濃度に調製した後、超純水を用いて１ｍｇ／ｍｌに希釈した。
　この溶液中に５×５ｍｍに裁断した基層を30分間室温にて浸漬した。浸漬した基層は乾燥し、120℃にて５分間焼成処理を施すことで、コポリマーの凹凸構造表面への被覆を行った（媒介手段形成工程）。
　次に、この基層に１μｇ／ｍｌの抗体溶液を滴下し、３５℃にて乾燥させた。抗体（認識素子）としては、抗インフルエンザ抗体（anti-influenza A antibody (H1N1 haemagglutinin)、製造会社： Biogenesis inc.）を用いた（認識素子結合工程）。
　乾燥後、100ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ8.5）中へ室温下にて30分浸漬させ、余剰の認識素子の除去および未反応のＮＨＳ基を加水分解させた。
　加水分解後、ブロアにて乾燥し、本発明の光学式センサーＡを作製した。
　次に、インフルエンザ抗原に対する光学式センサーの光学特性の変化について調べた。本実験では、インフルエンザ抗原の検出・定量実験のため、20ｍＭリン酸緩衝液にて異なる濃度（１pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、１ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、１μg/ml）に希釈したインフルエンザ抗原を光学式センサー上へ滴下した後室温下にて３０分放置し、反応後は100mMホウ酸緩衝液にて洗浄操作を行った。
　この光学式センサーの反応前後の光学特性変化を観察することでインフルエンザの検出・定量実験を行った。その結果を図３に示す。図３より、濃度が大きくなるにつれて反射強度が減少しており、１pg/mlという小さな濃度に対しても反射強度が変化することがわかる。
　また、コポリマー（媒介手段）を修飾する前の基層｛図４（ａ）｝と、インフルエンザ抗原滴下後の光学式センサーＡ表面｛図４（ｂ）｝の形態を原子間力顕微鏡を用いて観察した。インフルエンザ抗原滴下後の光学式センサーＡ表面には、約200 nmの粒状物質が観察された。この粒状物質は他の部位においても同様の形状、サイズにて観察された。これはサイズや形状から、インフルエンザウィルスであると考えられる。
　以上より、本発明の光学式センサーは、インフルエンザウィルスの検出・定量を高感度に実現することができた。
　実施例１と同様の方法で作製した光学式センサーＡを用いて、唾液中のインフルエンザウィルスの検出実験を下記の方法で行った。
　まず、空腹時に綿球を６個、口に含み唾液を採取する。これを細孔径0.2μｍのシリンジフィルターにてろ過し、使用時まで冷凍保存した。
　次に、採取した唾液にて１pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、１ng/ml、10ng/ml、100ng/mlに希釈したインフルエンザウィルス溶液を光学式センサーＡの表面へ滴下し、室温下にて30分静置した。
　反応後100mMホウ酸緩衝液にて洗浄後に乾燥させ、光学特性を評価した。インフルエンザウィルス溶液の濃度と抗原抗体反応前後の反射強度変化量との関係を図５に示す。
　図より、１ng/mlという小さな濃度に対しても反射強度が変化することがわかる。
　夾雑物非特異的吸着除去因子の非特異的吸着除去能を評価するため、下記の実験を行った。
　まず、環状オレフィン系樹脂フィルム（日本ゼオン社製、商品名：ゼオノアフィルムZF-16：厚み100μｍ）に夾雑物非特異的吸着除去因子を有する種々の濃度の媒介手段を被覆する。
　媒介手段の重合は、実施例１と同様、基層表面に結合するシラノール基、生体認識素子と結合するＮＨＳ基、非特異的吸着除去能を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるコポリマーをラジカル重合によって行った。詳細には、ポリエチレングリコールメタクリレート［Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate：PEGMA］を1.425ｇ（３mmol）、メタクリル酸３－（トリメトキシシリル）プロピル［3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylate：TMSMA］を0.744ｇ（3 mmol）、Ｎ－アクリロイルオキシスクシンイミド［N-Acryloxysuccinimide：NAS］を0.507ｇ（3 mmol）、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル［2,2'-azobisisobutyronitrile：AIBN］を16.5ｍｇ（0.1 mmol）用意し、これらをテトラヒドロフラン(THF)にてガラス容器中に溶解させた後、70℃にて一昼夜静置させることで重合を行った。
　重合後はテトラヒドロフラン（THF）を気化させ、残留したコポリマーを、ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いて200mg/mlの濃度に調製した後、超純水を用いて１mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、１μg/ml、に希釈した。
　次に、これらの溶液中に、UV/O3処理によって表面に水酸基(OH基)を導入した上記環状オレフィン系樹脂フィルムを30分間室温にて浸漬した。浸漬した基層は乾燥し、120℃にて５分間焼成処理を施すことで、凹凸構造表面へコポリマーを被覆した。
　次に、これらのフィルム上及びコポリマーを被覆していないフィルム上に１μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（BSA）溶液（製造会社：和光純薬工業株式会社）を滴下し、37℃にて乾燥させて、コポリマーのＮＨＳ基（認識素子結合因子）にウシ血清アルブミン（BSA）を固定化した。固定化後は100mMのホウ酸緩衝液(pH 8.5)にて余剰のBSA除去を行った。
　次に、夾雑物として西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）溶液（製造会社：オリエンタル酵母）を滴下し、30分静置後に洗浄操作にて西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を除去した。
　このフィルムに西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）があると発色する3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）を滴下して、０min（滴下直後）、１min、２min、５min、10min後の発色をそれぞれ観察した。その結果を図６に示す。
　図６より、コポリマーを被覆していないフィルムはかなり発色が観察されたが、コポリマー濃度が大きくなるにつれて発色が弱くなり、濃度が１mg/mlのコポリマーを被覆したフィルム上では、発色は観察されなかった。すなわち、夾雑物としての西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）は、夾雑物非特異的吸着除去因子としてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が多く存在する程、フィルムへの吸着が阻害され、濃度が１mg/mlのコポリマーを被覆したフィルム上では、ほとんど吸着しないことがわかる。
　夾雑物非特異的吸着除去因子の非特異的吸着除去能を評価するため、更に、下記の実験を行った。
　まず、環状オレフィン系樹脂フィルム（日本ゼオン社製、商品名：ゼオノアフィルムZF-16：厚み100μｍ）に夾雑物非特異的吸着除去因子を有する種々の濃度の媒介手段を被覆する。
　媒介手段の重合は、実施例１と同様、基層表面に結合するシラノール基、生体認識素子と結合するＮＨＳ基、非特異的吸着除去能を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるコポリマーをラジカル重合によって行った。詳細には、ポリエチレングリコールメタクリレート［Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate：PEGMA］を1.425ｇ（３mmol）、メタクリル酸３－（トリメトキシシリル）プロピル［3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylate：TMSMA］を0.744ｇ（3 mmol）、Ｎ－アクリロイルオキシスクシンイミド［N-Acryloxysuccinimide：NAS］を0.507ｇ（3 mmol）、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル［2,2'-azobisisobutyronitrile：AIBN］を16.5ｍｇ（0.1 mmol）用意し、これらをテトラヒドロフラン(THF)にてガラス容器中に溶解させた後、70℃にて一昼夜静置させることで重合を行った。
　重合後はテトラヒドロフラン（THF）を気化させ、残留したコポリマーを、ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いて200mg/mlの濃度に調製した後、超純水を用いて100mg/ml、10mg/ml、１mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、１μg/ml、に希釈した。
　次に、これらの溶液中に、UV/O3処理によって表面に水酸基(OH基)を導入した上記環状オレフィン系樹脂フィルムを30分間室温にて浸漬した。浸漬した基層は乾燥し、120℃にて５分間焼成処理を施すことで、フィルム表面へコポリマーを被覆した。
　当該フィルム上に夾雑物として唾液又は血清を吸着させ、その吸着前後における各フィルム表面の算術平均粗さ（Ｒａ値）をＡＦＭにて測定し比較した。夾雑物としては、唾液及び血清を用いた。コポリマーの濃度と各フィルム表面の算術平均粗さ（Ｒａ値）の結果を図７、図８に示す。なお、唾液は、空腹時の被験者口腔内へ綿球を入れ、綿球に含浸させた唾液をシリンジにて採取し、口径0.2μmのフィルターろ過により調製した。また、唾液のフィルム表面への吸着は、調製した当該唾液を各フィルム上に滴下し、30分静置後に洗浄操作により余分な唾液を除去することにより行った。また、血清の吸着は、和光純薬工業株式会社より購入したヒト血清を各フィルム上に滴下し、30分静置後に洗浄操作により余分な血清を除去することにより行った。
　図７より、夾雑物が唾液の場合には、コポリマー濃度が１ｍg/ml～１０ｍg/mlの場合に、フィルムへの吸着前後の算術平均粗さが小さいことがわかる。また、図８より、夾雑物が血清の場合には、コポリマー濃度が１００μg/ml～１０ｍg/mlの場合に、フィルムへの吸着前後の算術平均粗さが小さいことがわかる。したがって、それぞれ上記範囲で、コポリマーがフィルム表面に均一かつ単分子で修飾されており、各夾雑物がフィルム表面に吸着し難い状態になっていると考えられる。一方、この範囲よりコポリマーの濃度が低い場合には、コポリマーがフィルム表面に均一かつ単分子で修飾されないため、ポリマーが修飾されていない個所（隙間）に夾雑物が吸着してしまい、表面粗さが大きくなったものと考えられる。また、この範囲よりコポリマーの濃度が高い場合には、フィルム表面にコポリマーが多層に修飾されることとなり、当該コポリマー層に夾雑物が取り込まれやすくなったため、表面粗さが大きくなったものと考えられる。
　次に本発明の別の実施例を説明する。まず、実施例に用いた本発明の光学式センサーの製造方法について説明する。
　最初に、熱インプリント技術を用いて、ホール状パターンが形成されたニッケル金型からガラス転移温度（Ｔｇ）が163℃の環状オレフィン系樹脂フィルム（日本ゼオン社製、商品名：ゼオノアフィルムZF-16：厚み100μｍ）に当該パターンを転写し、直径約2３0nm、高さ200nmのピラーがピッチ460nmで複数規則配置された凹凸構造を有する基層を作製した（基層形成工程）。
　熱インプリントは次の方法で行った。まず、前記樹脂フィルムに対し、予め170℃に加熱したニッケル金型を圧力２MPaで300秒間押圧する。次に、ニッケル金型と樹脂フィルムを150℃まで冷却した後、この樹脂フィルムからニッケル金型を離型し、ピラー状の凹凸構造を形成する。なお、熱インプリントには、SCIVAX社のインプリント装置（X-300）を使用した。
　次に、重合し所定濃度に調製したコポリマー溶液中に、UV/O3処理によって表面に水酸基(OH基)を導入した基層を浸漬した。
　コポリマーの重合は、基層表面に結合するシラノール基、生体認識素子と結合するＮＨＳ基、非特異的吸着除去能を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるコポリマーをラジカル重合によって行った。詳細には、ポリエチレングリコールメタクリレート［Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate：PEGMA］を1.425ｇ（３mmol）、メタクリル酸３－（トリメトキシシリル）プロピル［3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylate：TMSMA］を0.744ｇ（3 mmol）、Ｎ－アクリロイルオキシスクシンイミド［N-Acryloxysuccinimide：NAS］を0.507ｇ（3 mmol）、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル［2,2'-azobisisobutyronitrile：AIBN］を16.5ｍｇ（0.1 mmol）用意し、これらをテトラヒドロフラン(THF)にてガラス容器中に溶解させた後、70℃にて一昼夜静置させることで重合を行った。
　重合後はテトラヒドロフラン（THF）を気化させ、残留したコポリマーを、ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いて200mg/mlの濃度に調製した後、超純水を用いて１ｍｇ／ｍｌに希釈した。
　この溶液中に５×５ｍｍに裁断した基層を30分間室温にて浸漬した。浸漬した基層は乾燥し、120℃にて５分間焼成処理を施すことで、コポリマーの凹凸構造表面への被覆を行った（媒介手段形成工程）。
　次に、この基層に１μｇ／ｍｌの抗体溶液を滴下し、室温にて乾燥させた。抗体（認識素子）としては、抗インスリン抗体（製造会社：AbD Serotec社、製品番号：5329-3806）を用いた（認識素子結合工程）。
　乾燥後、100ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ8.5）中へ室温下にて30分浸漬させ、余剰の認識素子の除去および未反応のＮＨＳ基を加水分解させた。
　加水分解後、ブロアにて乾燥し、本発明の光学式センサーＢを作製した。なお、乾燥後は測定に使用するまで４℃で冷蔵保存した。
　次に、インスリン抗原に対する光学式センサーＢの光学特性の変化について調べた。本実験では、インスリン抗原の検出・定量実験のため、20ｍＭリン酸緩衝液（pH7.4）にて異なる濃度（500nM、１μU/ml、2μU/ml、5μU/ml、10μU/ml、20μU/ml、50μU/ml、100μU/ml、200μU/ml）に希釈したインスリン抗原（製造会社：LINCO RESEARCH INC、製品番号：8014）を光学式センサーＢ上へ滴下した後室温下にて３０分静置し、反応後は100mMホウ酸緩衝液(pH8.5)にて洗浄操作を行った。
　この光学式センサーＢの反応前後の光学特性変化を観察することでインスリンの検出・定量実験を行った。その結果を図８に示す。図８より、濃度が大きくなるにつれて反射強度が減少しており、２μU/mlという小さな濃度に対しても反射強度が変化することがわかる。血中のインスリン濃度の正常値は空腹時に5～15μU/mlであり、本発明の光学式センサーＢは、インスリンの検出・定量を高感度に実現することができる。
１　　基層
２　　認識素子
３　　媒介手段
９　　熱可塑性樹脂
１０　型
１０ａ　パターン
１１　凹凸構造
３１　基層結合因子
３２　認識素子結合因子
３３　夾雑物非特異的吸着除去因子

Claims (10)

  1. 　所定の被検出物を特異的に検出するための光学式センサーであって、
    　所定の形状が周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する基層と、
    　前記被検出物と結合する認識素子と、
    　前記認識素子と結合する認識素子結合因子を有し、前記凹凸構造の表面に形成される媒介手段と、
    を具備することを特徴とする光学式センサー。
  2. 　前記媒介手段は、前記被検出物以外の夾雑物との結合又は吸着を防止する夾雑物非特異的吸着除去因子を有することを特徴とする請求項１記載の光学式センサー。
  3. 　前記媒介手段は、前記基層と結合する基層結合因子を有することを特徴とする請求項１又は２記載の光学式センサー。
  4. 　前記夾雑物非特異的吸着除去因子はポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項２記載の光学式センサー。
  5. 　前記基層を構成する材料は環状オレフィン系樹脂であり、前記基層結合因子がシラノール基であることを特徴とする請求項３記載の光学式センサー。
  6. 　前記認識素子結合因子はＮ－ヒドロキシスクシンイミド基であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の光学式センサー。
  7. 　前記認識素子は抗インフルエンザ抗体又は抗インスリン抗体であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の光学式センサー。
  8. 　所定の被検出物を検出するための光学式センサーの製造方法であって、
    　所定の形状が周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する基層を形成する基層形成工程と、
    　前記認識素子と結合する認識素子結合因子を有する媒介手段を、前記凹凸構造の表面に形成する媒介手段形成工程と、
    　前記媒介手段の認識素子結合因子に前記被検出物と結合する認識素子を結合させる認識素子結合工程と、
    を具備することを特徴とする光学式センサーの製造方法。
  9. 　前記媒介手段は、前記被検出物以外の夾雑物との結合を防止する夾雑物非特異的吸着除去因子を有することを特徴とする請求項８記載の光学式センサーの製造方法。
  10. 　前記媒介手段は、前記基層を構成する材料と結合する基層結合因子を有することを特徴とする請求項８又は９記載の光学式センサーの製造方法。
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