CH615440A5

CH615440A5 -

Info

Publication number: CH615440A5
Application number: CH156474A
Authority: CH
Inventors: Jiri Hradil; Jiri Coupek; Miroslava Krivakova; Jiri Stamberg; Artur Stoy; Jaroslava Turkova
Original assignee: Ceskoslovenska Akademie Ved
Priority date: 1973-02-05
Filing date: 1974-02-05
Publication date: 1980-01-31
Also published as: SE409328B; NL7401523A; JPS49109580A; GB1412563A; BE810622A; DE2405498C2; FR2216298A1; FR2216298B1; ATA67774A; DE2405498A1; CA1025172A; AU6517174A; AT326596B; CS167593B1; JPS58872B2; US3964973A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung unlöslicher, durch kovalente Bindungen an polymere Trägerstoffe gebundener, biologisch aktiver Verbindungen. Die Erfindung betrifft ebenso die derart erhaltenen biologisch aktiven Verbindungen sowie eine Anwendung des Verfahrens in der Enzyme oder Coenzyme durch kovalente Bindungen an einen polymeren Träger gebunden werden.

Zur Insolubilisation von biologisch aktiven Verbindungen wie Enzymen, Coenzymen, Inhibitoren der Enzyme, Hormonen, Antigenen, Gegenmitteln, immunoaktiven Verbindungen u. dgl. wurde poröses Glas, Zellulose und ihre Derivate, Stärke, Derivate von Polystyrolen, Copolymerisate von Maleinanhydrid mit Ethylen, Polyacrylamid und Polysaccharide verwendet. Nachteile der meisten dieser Stoffe sind geringe mechanische Festigkeit, niedrige Beständigkeit gegen Hydrolyse oder Hydrophobie der Oberfläche der Trägersubstanz.

Geringe mechanische Festigkeit macht Arbeit unter Druck unmöglich, was aber Voraussetzung für höhere Durchflussgeschwindigkeiten bei Gelsäulen ist. Polysaccharide und biologische Substanzen, die in ein weitmaschig vernetztes dreidimensionales Polymernetz eingeschlossen werden, haben geringe mechanische Festigkeit, was häufig wegen der Diffusionsprozesse die biologische Aktivität der eingeschlossenen Substanzen sehr stark beeinflusst. Geringe hydrolytische Beständigkeit (z. B. von Polysacchariden) pflegt im Falle der Insolubilisation von Enzymen hinderlich zu sein. Es sind auch Fälle bekannt, bei denen die Reaktion von Substrat mit einer biologisch aktiven, auf einen Träger gebundenen Substanz durch ungenügende Hydrophilität der Trägeroberfläche (z. B. Polystyrol) oder unspezifische Sorptionen seiner Oberfläche kompliziert wird.

Die Vorteile von immobilisierten biologisch aktiven Substanzen kann man am Beispiel unlöslicher Enzyme beweisen. Die Jahres-Weltproduktion an Enzymen, die für die Katalyse von chemischen Reaktionen in Pharmazie- und Lebensmittelindustrie verwendet werden, beträgt Tausende von Tonnen. Ihre vermehrte Anwendung im industriellen Masstab wird durch Herstellungsschwierigkeiten, relativ hohen Preis, niedrige Stabilität und nicht zuletzt auch durch die unwirtschaftliche Anwendungsweise verhindert. Die bisher bekannten Verfahren ermöglichen nämlich keinesfalls die Wiedergewinnung der verwendeten Enzyme.

Bindung von löslichen Enzymen an polymere Träger ermöglicht aber Regenerierung der Enzyme und die wiederholte Anwendung sowohl bei Chargen- als auch bei Durchflussanordnung des Verfahrens.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung unlöslicher, durch kovalente Bindungen an polymere Trägerstoffe gebundener, biologisch aktiver Verbindungen ist im vorstehenden Patentanspruch 1 definiert.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann man unlösliche biologisch aktive Systeme herstellen, die z. B. Enzyme, Coenzyme, Inhibitoren von Enzymen, Gegenmittel, Antigene, Hormone, immunoaktive Verbindungen, Antibiotika usw. an oberflächlich hydrophylisierte im wesentlichen hydrophobe und nicht quellende makroporöse Polymerisate und Copolymerisate gebunden enthalten. Als solche polymere Träger können beispielsweise Homo- und Copolymerisate von Alkylendiacrylaten, Alkylendimethacrylaten, Polyglykoldiacrylaten, Polyglykoldimethacrylaten, Alkylendiacrylamiden, Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Polyglykolacrylaten, Polyglykolmethacrylaten, Acrylnitril, Methacrylnitril, ferner Copolymerisate von diesen Substanzen mit Vinylverbindungen, wie Vinylanilin, Vinylpyridin und Vinylkarbazol, verwendet werden. Die Hydrolyse kann in alkalischem oder saurem Milieu durchgeführt werden; in alkalischem vorzugsweise mit 2 m bis 10 m Natronlauge bei einer Temperatur von 60 bis 135°C innerhalb von 30 bis 120 Minuten.

In der niedermolekularen organischen Chemie stellen Anhydride von Carbonsäuren bedeutende Acylierungsmittel, welche z. B. zu Umsetzungen mit Hydroxyl- oder Thiolgrup-pen verwendet werden, dar. Anhydrierung kann durch Erhitzen von hydrophilisiertem Homo- oder Copolymerisat auf eine Temperatur von 200 bis 250°C innerhalb von 30 bis 300 Minuten bei einem Druck von 0,2 bis 0,01 Torr erreichen.

Makromolekulare Analoge dieser Reaktionen wurden viel weniger studiert (Goddrich Co. Erf.: R.M. Summers: US Pat. 2 967 175 [1958]; Monsanto Chemical Co.; Brit. Pat. 815 821 [1958]; Monsanto Chemical Co. Erf.: R.M. Herick, J.A. Herbig: Ger Pat. 1 109 373 [1956]. In den bisherigen Arbeiten wurden ausschliesslich polymere Anhydride, welche aus entsprechenden Monomeren, besonders der Malein-, Acryl- bzw. Methacrylsäure hergestellt werden, verwendet. Nach der Erfindung kann man polymere Anhydride in hoher Konzentration in hydrophilisierter oberflächlicher Schicht von üblichen Polymerisaten, besonders von Polymerisaten auf Basis von Estern oder Nitrilen der Polyacryl- und Polymethacrylsäure herstellen, wobei die guten mechanischen Eigenschaften des Ausgangspolymerisats erhalten bleiben. Gute mechanische

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Eigenschaften von hydrophoben makroporösen Ausgangspolymerisaten mit hydrophilisierter Oberfläche und mit reaktiven Gruppen ermöglichen nur nur erfolgreiche Anknüpfung von biologisch aktiven Substanzen, sondern auch deren leichte und effektive Applikation. Zum Verfahren nach der Erfindung sind am besten stark vernetzte Polymerisate geeignet. Manche völlig unquellende Polymerisate, wie Polyacrylnitril oder Poly-methylmethacrylat, kann man aber auch im unvernetzten oder wenig vernetzen Zustand verwenden. Vernetzung kann man nicht nur durch Zugabe von Vernetzungsmitteln, sondern auch durch Kettenübertragung, besonders bei Acrylnitril, erreichen.

Nach der Erfindung kann man Polymerisate mit verschiedenstem Gehalt von Anhydridgruppen auf einfache Weise herstellen. Polymere Ester oder Nitrile können z. B. durch Umsetzen mit 2 bis 9 m Natronlauge bei einer Temperatur von 90 bis 130°C innerhalb von 0,5 bis 2 Stunden in erwünschten Grad hydrolysiert werden, wobei die Reaktion bekannterweise in Mikroblöcken, vorzugsweise in Abschnitten mit ataktischer Struktur, fortschreitet. Dadurch werden in der oberflächlich hydrophiüsierten Schicht Stellen gebildet, welche ausgeprägte Dispositionen zum Schliessen von sechsgliedrigen bevorzugten Anhydridringen aufweisen. Das kann man durch Copolymeri-sation von monomerer Säure nicht erreichen, da das Vorkommen von Carboxylgruppen in Ketten rein zufällig wäre, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Bildung von cyclischen Anhydriden erniedrigt wäre. Nach einer Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens folgt nach partieller alkalischer Hydrolyse saure Behandlung zur Umwandlung von Carboxylgruppen in H+-Form und schliesslich Bildung von Anhydriden durch thermische Dehydratation bei einer Temperatur von 200 bis 250°C und unter niedrigerem Druck als 0,1 Torr, gegebenenfalls durch Umsetzen mit bekannten Anhy-drierungsmitteln, wie z. B. Acetanhydrid bei Temperaturen von 20 bis 140°C oder mit Thionylchlorid bei Temperaturen von —10 bis +20°C. Die zwei letzten Reaktionen kann man mit Vorteil durch Pyridin oder andere azidobasische Katalysatoren katalysieren. Entstandene reaktive Anhydridgruppen sind durch IR-Spektren (Banden bei 1785 und 1050 cm-1) nachweisbar.

Im folgenden werden anand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

2,5 Teile von wenig hydrophilem, makroporösem Gel mit einer spezifischen Oberfläche von 209 m2/g, welches aus einem Copolymerisat aus 90 Gew. % Ethylendimethacrylat und 10 Gew.% 2-Hydroethylmethacrylat besteht, werden mit 10 Teilen 9 m Natronlauge durch einstündiges Erhitzen auf 125°C hydrophilisiert. Das hydrophilisierte Gel wird abfiltriert, durch 200 Teile 2 m HCl in die H+ Form überführt, mit Wasser gründlich gewaschen und im Vakuumtrockner getrocknet. Reaktive Anhydridgruppen werden durch vierstündiges Erhitzen von oberflächlich hydrophilisiertem Copolymerisat auf 230°C bei einem Druck von 0,1 Torr gebildet. Dehydratisier-tes Gel wird in 75 Teilen 2 m Phosphatpuffer mit pH 6,5 aufgequollen, die Mischung wird abgekühlt und unter Rühren zu einer Lösung aus 1 Teil Chymotrypsin und 25 Teilen 2 m Phosphatpuffer zugefügt. Danach wird das mit dem Enzym chemisch gebundene Gel abgesaugt, mit Puffer und Wasser gewaschen und durch Waschen mit 400 Teilen 0,1 m Lösung Natriumcarbonat und 1 m Lösung Natronlauge (pH 8,5), weiter mit 300 Teilen 0,1 m Natriumacetat (pH 4,1) und 300 Teilen 0,01 m Natriumacetat (pH 4,1) aktiviert. Die Konzentration des so insolubilisierten Enzyms war 3 mg pro 1 ml Gel. Das gebundene Enzym weist esterasische und proteolytische Aktivität auf.

Beispiel 2

2.4 Teile hydrophobes, makroporöses Polyethylendiacrylat mit einer Korngrösse von 0,1 bis 0,2 mm werden in 10 Teilen 9 m NaOH aufgequollen und durch halbstündiges Erhitzen auf 130°C hydrolysiert. Nach Überführen in die H* Form wird es durch Erhitzen auf 225°C unter Druck (0,1 Torr) innerhalb von 4 Stunden anhydrisiert. Die Menge von Chymotrypsin, das gemäss Beispiel 1 an Gel gebunden ist, beträgt 1,5 mg/ml Gel.

Beispiel 3

2.5 Gewichtsteile wenig hydrophiles makroporöses Copolymerisat von Ethylendimethacrylat mit 50 Gew.% 2-Hydroxy-ethylmethacrylat mit einer spezifischen Oberfläche von

97,2 m2/g werden durch zweistündiges Erhitzen mit 9 n NaOH auf 125°C hydrolysiert. Nach Uberführung in die H ' Form wird die oberflächliche Anhydridschicht durch vierstündiges Erhitzen des Gels auf 200°C bei einem Druck von 0,05 Torr hergestellt. An das aktivierte Gel wird Chymotrypsin in einer Konzentration von 7,6 mg aktivem Enzym pro 1 ml Gel auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise gebunden.

Beispiel 4

2,5 Gewichtsteile des Gels des Copolymerisats von Diethy-lenglykolmethacrylats mit 50 Gew.% Diethylenglykoldimeth-acrylat werden durch 10 Teile 9 m NaOH bei 80°C innerhalb von 2 Stunden hydrolysiert. Nach der Reaktion wird das Gel abfiltriert und durch 200 Teile 2m HCl in die H+ Form übergeführt, mit Wasser gewaschen und bei 78°C und 0,05 Torr getrocknet. Das oberflächlich hydrolysierte Gel wird in 200 Teilen Diethylether mit 2,5 Teilen Pyridin suspendiert. Nach Zugabe von 2,5 Teilen Acetanhydrid in 10 Teilen Diethylen-ether wird es 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, auf Glas-fritte abgesaugt, mit 100 Teilen Eiswasser und 10 Teilen Ethanol gewaschen, abgesaugt und im Vakuum getrocknet oder unverzüglich zu weiteren im Beispiel 1 beschriebenen Umsetzungen verwendet.

Beispiel 5

2,5 Gewichtsteile makroporöses Copolymerisat aus Ethylen-diacrylat und 50 Gew.% 2-HydroxyethyImethacrylat werden wie im Beispiel 1 beschrieben hydrolysiert, mit dem Unterschied, dass das oberflächlich hydrolysierte Gel nach dem Waschen und Trocknen ohne weitere chemische Umsetzungen unter Rückflusskühlung mit 5 Teilen Acetanhydrid auf eine Temperatur von 118 bis 140°C erhitzt wird. Nach der Umsetzung wird die Suspension auf 0°C abgekühlt und filtriert; das Gel wird mit 200 Teilen Eiswasser, dann mit Ethanol gewaschen und schliesslich im Vakuum getrocknet. Das so aktivierte Gel wird in 75 Teilen Phosphatpuffer (pH 7, 5) aufgequollen; die Mischung wird abgekühlt und unter Rühren zu einer Lösung aus 1 Teil Trypsin und 25 Teilen Puffer gefügt. Nach 24 Stunden langem Rühren bei 4°C wird die Mischung wie im Beispiel 1 lyophilsiert.

Beispiel 6

2,5 Gewichtsteile wenig hydrophiles makroporöses Gel, das als Copolymerisat aus 75 Gew.% Ethylendimethacrylat und 25 Gew.% 2-Hydroxyethylmethacrylat besteht und eine spezifische Oberfläche von 159,7 m2/g aufweist, werden in 10 Teilen 9 m NaOH aufgequollen und bei einer Temperatur von 100°C innerhalb von 2 Stunden oberflächlich hydrolysiert. Dann wird das Gel gründlich mit Wasser gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das erhaltene Gel wird in 20 Teilen Diethylether suspendiert; die Mischung wird auf — 20°C abgekühlt, und zu der so hergestellten Suspension wird eine Lösung aus 0,5 Teilen Thionylchlorid und 5 Teilen Diethylether unter Rühren zugetropft. Nach Zugabe der Thionylchloridlösung scheidet sich ein Niederschlag des Natriumchlorids aus. Bei s

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— 103 C wird es noch eine Stunde weiter gerührt, danach auf Glasfritte abgesaugt, mit 100 Teilen Eiswasser und 10 Teilen Ethanol gewaschen, abgesaugt und im Vakuum getrocknet oder ohne weitere Umsetzungen zu Umwandlungen, die im Beispiel 1 beschrieben sind, verwendet.

Beispiel 7

2,4 Gewichtsteile hydrophobes makroporöses Poly(methyl-methacrylat-co-ethylendimethacrylat) mit einer Körnigkeit von 100 bis 200 Jim wird oberflächlich hydrophilisiert, aktiviert und zur Insolubilisierung von Chymotrypsin nach Beispiel 1 verwendet. Konzentration des gebundenen Enzyms beträgt 1,4 mg/ml Gel.

Beispiel 8

Makroporöses hydrophobes Copolymerisat, welches aus 50 Gew.% Acrylnitril und 50 Gew.% Ethylendimethacrylat zusammengesetzt ist, wird nach Hydrophilisation und Aktiva-tuon, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, zur Insolubiiisation von Enzymen verwendet.

Beispiel 9

Eine Mischung von 53 Gewichtsteilen Acrylnitril und 47 Gewichtsteilen 65%iger Salpetersäure wird durch 0,1 g Ammoniumperoxidisulfat, 0,3 g Dimethylaminoethylacetat und 0,005 g Silbernitrat, wobei Peroxidisulfat und Silbernitrat a-s 10%ige wässrige Lösungen verwendet werden, initiiert. Die Polymerisation dauert bei 15°C unter Sauerstoffausschuss in einem gläsernen Zylinder insgesamt 5 Tage. Die Lösung wird in weisse Substanz verwandelt, die sich einfach aus dem Zylinder herausnehmen lässt, da der Umfang durch Polymerisation kleiner wird. Der Zylinder aus porösem Polyacrylnitril wird dann zuerst einen Tag mit Leitungswasser, dann einen Tag in einige Male erneuerter 1 %iger wässriger Lösung von Natriumhydrogencarbonat und zwar so durchgewaschen, dass die Waschflüssigkeit durch Zylinder, der mit dem auf Zylinder angezogenen Mantel aus Polyethylen dicht eingeschlossen ist, durchgesaugt wird. Danach wird die Alkalihydrolyse so durchgeführt, dass 90"C warme 6 m Natronlauge und schliesslich destilliertes Wasser durch die poröse Säule gesaugt wird, bis das austretende Wasser neutral reagiert. Die Säule wird dann mittels Durchsaugen von Warmluft getrocknet, abgekühlt, mit kaltem Diethylether ( — 10°C) gewaschen. Dann wird unter äusserer Kühlung auf - IOC gekühlte 10%ige etherische Thionylchloridlösung durch die Säule gesaugt, wodurch aktive Anhydridgruppen gebildet werden. Danach s wird der Ether abgesaugt und destilliertes Wasser bis zur neutralen Reaktion durch die Säule gesaugt. Die Säule lässt sich in diesem Zustand zur Aufnahme von biologisch aktiven Stoffen auf die in vorstehenden Beispielen beschriebene Weise verwenden.

Beispiel 10

Eine Mischung aus 30 Teilen Acrylnitril, 20 Teilen Methyl-methacrylat, 10 Teilen Divinylbenzol und 40 Teilen Toluol ls wird durch 0,2 Teile Azoisobuttersäuredinitril initiiert und in Suspension in gesättigter Natriumchloridlösung bei 75°C copo-lymerisiert. Nach 8 Stunden wird die Suspension abgetrennt, mit Ether gewaschen, getrocknet und eine Kolonne gefüllt, durch die 5 m Natronlauge bei 100°C im Kreislauf innerhalb 20 von einer Stunde geführt wird. Anschliessend wird das Polymerisat in der Kolonne mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen, mit durchgesaugtem Warmluftstrom getrocknet, mit kaltem Ether mit Thionylchloridlösung gewaschen und weiter gemäss Beispiel 9 verarbeitet.

25 Die Dicke der hydrolysierten Schicht auf der Oberfläche des hydrophoben Polymerisats hängt sowohl von Konzentration des Hydrolysierungsmittels als auch von der Temperatur und der Reaktionsdauer ab. Diese Bedingungen kann man deshalb beliebig nach bekannten Regeln ändern, z. B. so, dass man bei so niedrigerer Reagenzkonzentration höhere Temperatur verwendet oder bei höherer Temperatur kürzere Reaktionszeit wählt. Die Erfindung wird also keineswegs auf die in den Beispielen angeführten Bedingungen begrenzt. Man kann selbstverständlich neben alkalischer Hydrolyse auch saure Hydrolyse unter 35 Verwenden von starker Mineralsäure, wie z. B. Schwefelsäure oder Salzsäure, anwenden. Die Uberführung des Polymerisats in die H+ Form entfällt dann. Bei Hydrolyse der Nitrilgruppen muss man aber in solchem Fall mehr verdünnte Säure und höhere Temperatur verwenden, da sonst vorwiegend Amid-gruppen entstehen. Aus diesem Grund eignet sich saure Hydrolyse mehr für polymere Ester von ungesättigten Säuren als für Nitrile.

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615 440 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung unlöslicher, durch kovalente Bindungen an polymere Trägerstoffe gebundener, biologisch aktiver Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man an der Oberfläche eines polymeren, im wesentlichen hydrophoben Trägermaterials mit makroporöser Struktur, das Gruppen enthält, die durch Hydrolyse in Carboxylgruppen überführbar sind, mindestens einen Teil dieser Gruppen hydrolysiert, erhaltene benachbarte Carboxylgruppen anhydridisiert und den so erhaltenen Trägerstoff mit einer biologisch aktiven Verbindung, die imstande ist, mit Anhydridgruppen unter Ausbildung kovalenter Bindungen zu reagieren, umsetzt.

2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung der Säureanhydridgruppen durch Erhitzen unter vermindertem Druck oder durch wasserabspaltende Mittel erfolgt.

3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als polymeren Träger ein Homo- oder Copolymerisat von Alkylendiacrylaten, Alkylendimethacryla-ten, Polyglykoldiacrylaten, Polyglykoldimethacrylaten, Alky-lendiacrylamiden, Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmeth-acrylaten, Polyglykolacrylaten, Polyglycolmethacrylaten, Acryl-nitril, Methacrylnitril, ferner Copolymerisate von diesen Substanzen mit Vinylverbindungen, wie Vinylanilin, Vinylpyridin und Vinylkarbazol, verwendet.

4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrolytische Behandlung der Oberfläche durch Erhitzen des polymeren Trägers in alkalischem Milieu erfolgt.

5. Verfahren gemäss Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse an der Oberfläche bei einer Konzentration von 2 m bis 10 m Natronlauge erfolgt.

6. Verfahren gemäss Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse an der Oberfläche bei einer Temperatur von 60 bis 135°C innerhalb von 30 bis 120 Minuten erfolgt.

7. Nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 hergestellte, unlösliche, durch kovalente Bindungen an polymere Trägerstoffe gebundene, biologisch aktive Verbindungen.

8. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1 zur Herstellung von unlöslichen, biologisch aktiven Systemen, in denen Enzyme oder Coenzyme durch kovalente Bindungen an einen polymeren Träger gebunden sind.