DE2366179C2 - Aktiviertes Vinylmonomeres - Google Patents

Aktiviertes Vinylmonomeres

Info

Publication number
DE2366179C2
DE2366179C2 DE2366179A DE2366179A DE2366179C2 DE 2366179 C2 DE2366179 C2 DE 2366179C2 DE 2366179 A DE2366179 A DE 2366179A DE 2366179 A DE2366179 A DE 2366179A DE 2366179 C2 DE2366179 C2 DE 2366179C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
enzymes
insoluble
binding
immobilized
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2366179A
Other languages
English (en)
Inventor
James J. Stonington Conn. Hamsher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Original Assignee
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Inc filed Critical Pfizer Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE2366179C2 publication Critical patent/DE2366179C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2/00—Processes of polymerisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/096—Polyesters; Polyamides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/828—Aerobacter
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y10S435/839—Bacillus subtilis

Description

det werden können, geeignet ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein aktiviertes Vinyimonomeres, erhalten durch Umsetzung eines hydroxylgruppenhaltigen Vinylmonomeren der Formel
Ii
CH2=C-C-X-(Y-O)n-H
iO
Ri
worin X —O— oder —NR3 bedeutet, wobei R3 Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; Y den Äthylen- oder Propylenrest darstellt; η die Zahl 1 oder 2 bedeutet; und Ri Wasserstoff, die Methylgruppe oder Chlor bedeutet, in wäßrigem Medium mit Bromcyan zwischen 10 und 30° C und bei einem pH-Wert von 11 nanfjStandardmethoden gelöst
Das erfindungsgemäöe aktivierte Vinyimonomere kann sodann durch Umsetzung mit einem Enzym unter Bildung eines Enzym-tragenden Monomeren und Polymerisation oder Copolymerisation des das Enzym tragenden Monomeren in Gegenwart eines Vernetzungsmittels und eines Initiators in ein immobilisiertes Enzym umgewandelt werden.
Die Bindung der Enzyme an das erfindungsgemäße aktivierte Vinyimonomere erfolgt vermutlich hauptsächlich über Aminogruppen der Enzyme. Enzyme enthalten jedoch im allgemeinen zahlreiche reaktionsfähige Gruppen, die miteinander bei dl?- Reaktion und Bindung an das Monomere konkurrieren. Unter diesen konkurrierenden reaktionsfähigen Truppen sind z. B. die Sulfhydryl-, Hydroxyl-, Carboxyl- und Imidazoiylreste.
Je nach Stellung der reaktiven Gruppe im Enzym kann die Kupplung mit dem Monomeren ein bestimmtes Ausmaß an Enzymdesaktivierung verursachen. In manchen Fällen ist selbstverständlich auch die aktive Stelle des Enzyms sterisch unerreichbar, so daß durch die Kupplung mit dem Monomeren kein Aktivitätsverlust eintritt. Führt die Kupplung des Enzyms mit dem Monomeren zu übermäßiger Inaktivierung, so kann gegebenenfalls das aktive Zentrum des Enzyms in geeiggeri ATCC 9250. Esehei ichia coli ATCC 9637 und Aspergillus Flavus Link ATCC 13608 die bevorzugten Mikroorganismen zur Herstellung von Penicillin-Acylase sind.
Das Monomere/Enzym-Produkt kann mit einem unter Addition polymerisierbaren Monomeren in Gegenwart eines Vernetzungsmittels und eines Initiators polymerisiert werden. Geeignete additionspolymerisierbare Monomere (Comonomere) sind z. B.
Acryl-, Λ-Chloracryl-, Methacrylsäure und deren Glycidyl-, niedere Alkylester, N,N-(disubstituierten)-AminoaIkyIester,-amide, nieder-alkylsubstituierten Amide, methylol-substituierten Amide. N-monosubstituierten Aminoalkylamide und Ν,Ν-disubstituierten Aminoalkylamide, Styrol, Butadien und Isopren.
Die Polymerisation oder Copolymerisation des Monomeren/Enzym-Produkts wird in Gegenwart eines Vernetzungsmittels durchgeführt, welches dem fertigen Polymeren die Struktur eines dreidimensionalen Netzwerks und Unlöslichkeit verleiht.
Zahlreiche Vernetzungsmittel können verwendet werden, beispielsweise Acrylmonomere oder Olefinverbindungen. Als Beispiele seien
13-ButylendiacryIat, Äthylenglykoldimeth-acrylat,
1,3-Butylen-dimethacrylat,
1,6-Hexameihylendi-acrylat,
Diäthylenglykol-dimethacrylat, Ν,Ν'-MethyIen-bis-acrylamid, Neopentylglykol-dimethacrylat.
1,1,1-Tnrnethyioiäihan-ii'iiJieihacryiat und
Diviniylbenzol
genannt. Bevorzugt wird als Vernetzungsmittel N.N'-Methylen-bisacrylamid, da dieses Reagens dem Endprodukt die gewünschte hydrophile Natur verleiht.
Polymerisations- und Copolymerisationsreaktionen werden durch freiradikalische Initiatoren eingeleitet. Die Wahl des Initiators wird weitgehend durch die Temperaturempfindlichkeit des Enzyms, die milde Bedin-
ncter Weise geschützt werden, z. B. mit einem spezifi- 45 gungen erfordert, bestimmt. Geeignete freiradikalische sehen Reagens oder konkurrierenden Inhibitor, wo- 1«;.:". . :-j --i_l_ j:_ l_: _· —
durch das Enzym und seine aktive Konfiguration stabilisiert werden, und/oder man kann die Kupplung mit dem Monomeren mit reaktiven Gruppen des Enzyms vornehmen, die vom aktiven Zentrum entfernt liegen.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen aktivierten Vinylmonomeren können zahlreiche Enzyme immobilisiert werden. In der Übersicht von Melrose Rev. Pure and Appl.Chem. 21,83-115 (1971) sind zahlreiche derartige Enzyme genannt, von denen die meisten leicht zugänglich und brauchbar sind.
Urease-, Amyloglukosidase-, Glukoseoxidase-, Fumarase-. Bacillus subtilis-Protease und Subtilopeptidase A (Handelsbezeichnung »Maxatase«)-Präparate sind im Initiatorsysteme sind solche, die bei einer Temperatur unterhalb etwa 4O0C freie Radikale in zur Polymerisation oder Copolymerisation geeigneter Menge bilden. Redox-Initiatorsysteme werden bevorzugt. Typische
Systeme sind Peroxyverbindungen, wie Ammonium-, Natrium- oder Kaliumpersulfat, Benzoylperoxyd und Peroxycarbonat, in Verbindung mit Reduktionsmitteln, wie Natriumthiosulfat, Natriumetabisulfat, Ferroammoniumsulfat-hexahydrat, Dimethylaminopropionitril oder
Riboflavin. Zur Herstellung des bevorzugten Initiatorsystems wird im allgemeinen Dimethyl-aminopropionitril zu Ammoniumpersulfat zugegeoen.
Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zwischenproduktes immobilisierten Enzyme enthalten größere Men-
Handel erhältlich. Das zuletzt genannte Enzym wird aus 60 gen an aktivem Enzym als Produkte, bei denen gemäß Bacillus subtilis ATCC 21839 gewonnen, der mit dem Stand der Technik das Enzym kovalent an ein fertiges
Polymeres gebunden wurde.
Das immobilisierte Enzympräparat kann als Aufschlämmung oder in einer Säule verwendet werden. Nach Beendigung der Enzym/Substrat-Reaktion wird das immobilisierte Enzym aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt, mit Wasser gewaschen und zur wiederholten Verwendung /ur Seite gestellt.
Mikroorganismus Bacillus subtilis Stamm R4 identisch ist. L-Aspartase kann aus Enterobacter aerogenes ATCC 9760 erhalten, werden. Penicillin-Acylasen können von zahlreichen Mikroorganismen produziert werden, siehe US-PSen 32 60 653, 32 12 995 und 32 39 427. l/izymprii parate aus diesen Mikroorganismen sind für die vorliegenden Zwecke geeignet, wobei Proteus rett-
Beispiel 1
Durch Bromcyan aktiviertes Hydroxyäthylmethacrylat
und dessen Verwendung zur Bindung von Penicillin-Acylase (ohne Comonomeres)
Zu einer Lösung von 20 g 2-Hydroxyäthyl-methacrylat in 80 ml Wasser wird eine Lösung von 10 g Bromcyan in 80 ml Wasser zugegeben. Der pH-Wert wird mit 30%iger (Gewicht/Volumen) Natriumhydroxidlösung auf 11,0 eingestellt und bei einer Temperatur zwischen 20 und 30° C auf diesem pH-Wert gehalten.
Die so erhaltene Lösung des aktivierten Hydroxyäthylmethacrylats wird direkt zur Bindung von Penicillin-Acylase verwendet. Dazu wird der pH-Wert mit Salzsäure auf 6,5 gebracht, sodann werden 20 g (8 Einheiu;n/mg) Penicillin-Acylase aus Proteus rettgeri ATCC 9250 in 200 ml Wasser unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur IV2 Stunden gerührt, dann werden 10 g N,N'-Methylenb;scrylamid zugesetzt, und das Gemisch wird noch efva 30 Minuten gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch in ein Eisbad überführt und unter Stickstoff auf 4° C gekühlt. Unter Rühren wird ein Katalysatorsystem aus 3 ml Dimethylaminopropionitril und 375 mg Ammoniumpersulfat zugesetzt.
Das Eisbad wird entfernt und man läßt das Reaktionsgemisch sich unter Stickstoff langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Die Polymeristion erfolgt allmählich im Verlauf von 30 bis 60 Minuten, bis zur Bildung eines dicken Gels. Der resultierende Feststoff wird aufgebrochen, 500 ml Wasser werden zugegeben und das Gemisch wird gerührt, um das dicke Gel in einen körnigen Feststoff zu überführen. Der Feststoff wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft oder im Vakuum getrocknet, dabei erhält man 37 g immobilisiertes Enzymmaterial, welche gemäß Aktivitätstest etwa 50% der gesamten anfänglichen freien Enzymaktivität enthält.
Mit der immobilisierten Penicillin-Acylase können mehr als 30 Reaktionsansätze durchgeführt werden, bei denen Benzylpenicillin zu 6-Aminopenicillansäure hydrolysiert wird, wobei diese Ansätze sich über einen Zeitraum von 12 Wochen erstrecken, ohne daß ein merklicher Aktivitätsverlust eic tritt. Die Umwandlung des Benzylpenicillins in 6-Aminopenicillansäure iiegt unter optimalen Bedingungen bei Verwendung des so erhaltenen immobilisierten Penicillin-Acrylasesystems oberhalb 95%.
Beispiel 2
Durch Bromcyan aktiviertes Hydroxyäthylmethacrylat
und dessen Verwendung
zur Bindung von Penicillin-Acylase
(Methylmethacrylat als Comonomeres) chia coli ATCC 9637 (US-PS 32 60 653) in 200 ml Wasser zugibt. Das Gemisch wird IV2 Stunden bei 20 bis 30°C gerührt, dann werden 4,0 g N,N'-Methylen-bisacrylamid und 1,0 g Methylmethacrylat unter Rühren zugegeben. Dann wird unter Stickstoff auf 4°C abgekühlt, worauf man ein Katalysatorsystem aus 1,5 ml Dimethylaminopropionitril und 250 mg Amrnoniumpersulfat unter Rühren zugibt. Das Eisbad wird entfernt und das Gemisch wird bis zur beendeten Polymerisation gerührt (etwa 1,5 Stunden), wobei die Temperatur unterhalb etwa 200C gehalten wird. Unter Rühren werden zum Poiymeren 400 ml Wasser zugegeben, um letzteres in kleine körnige Partikel zu überführen. Das Gemisch wird filtriert, das resultierende immobilisierte Enzym-Polymere wird als feuchter Kuchen gelagert. Es enthält 45% der anfänglichen Gesamtaktivität des freien Enzyms. Das Polymere kann mehrere Monate zur Deacylierung von Penicillin G unter Bildung der 6-Aminopenicillansäure ohne spürbaren Aktivitätsverlust verwendet werden.
Beispiel 3
Durch Bromcyan aktiviertes Hydroxyäthylmethacrylat und dessen Verwendung zur Bindung von Penicillin-Acylase (Acrylamid als Comonomeres)
Zu einer Lösung von 15,0 g Hydroxyäthylmethacrylat in 70 ml Wasser wird eine Lösung von 7,5 g Bromcyan in 70 ml Wasser zugegeben. Der pH-Wert wird mit 5n-Natriumhydroxid auf 11,0 eingestellt und auf diesem Wert konstant gehalten. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wird zwischen 20 und 300C gehalten.
Nachdem sich das Reaktionsgemisch beim pH-Wert 11,0 stabilisiert hat, wird die so erhaltene Lösung des aktivierten Hydroxyäthyimethacryiats direkt zur Bindung von Penicillin-Acylase verwendet. Dazu wird sie mit Salzsäure auf den pH-Wert 6,5 gebracht, dann werden 15 g Penicillin-Acylase aus Aspergillus flavus Link ATCC 13608 in 150 ml Wasser zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 45 Minuten gcrühri, dann werden 15 g Acrylamid und 1,5 g N,N'-Methylen-bis-acrylamid zugesetzt, und es wird noch 30 Minuten gerührt. Danach wird das Gemisch in ein Eisbad gestellt und unter Stickstoff auf 4°C abgekühlt. Ein Katalysatorsystem aus 3 ml Dimethylaminopropioniiril und 350 mg Ammoniumpersulfat wird unter Rühren zugegeben. Man entfernt das Gemisch aus dem Eisbad und läßt es sich auf Raumtemperatur erwärmen, wobei während dieser Zeit Polymerisation eintritt und ein dikker gelartiger Fesistoff resultiert. Der Feststoff wird aufgebrochen, kräftig mit 1 I Wasser gerührt, filtriert mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet, wobei man 40 g immobilisiertes Enzymmaterial erhält, dessen Aktivität der Aktivität des Produktes von Beispiel 1 vergleichbar ist.
Zu einer Lösung von 4,0 g Bromcyan in 65 ml Wasser
von 10°C werden 10,0 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat in Wiederholt man die Verfahrender Beispiele 1 bis 3,so
40 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wird mit 5n-Natri- so erhält man bei Ersatz des Hydroxyäthylmethaerylats umhydroxidlösung auf 11,0 eingestellt und konstant bei durch die folgenden Monomeren vergleichbare Ergebdiesem Wert gehalten, wobei die Temperatur zwischen nisse. Die Monomeren entsprechen der Formel
10 und 30°C gehalten wird.
Die so erhaltene Lösung des aktivierten Hydroxyäthyimethacryiats wird direkt zur Bindung von Penicil- b5 lin-Acylase verwenJst. Dazu wird der pH-Wert mit 6n-Salzsäure auf 6,5 eingestellt, worauf man 10,0 g (5,6 Einheiten pro mg Aktivität) Penicillin-Acylase aus Escheri-
CH2=C-C-X-(Y-O)n-H
Ri
7 X 23 66 179 8 -(Y-O)n- IO
ο C2Il4O I j
K, NH C2H4O
H O (C2H4O)2
CHj O CjH0O
Cl NH C2H4O
CH1 NC6Hn C2H4O
CH)
CH3
40
45
60

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Aktiviertes Vinylmonomeres, erhalten durch Umsetzung eines hydroylgruppenhaltigen Vinylmonomeren der Formel
    CH2=C-C-X-(Y-O)n-H
    R1
    worin X —O— oder — NR3 bedeutet, wobei R3 Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; Y den Äthylen- oder Propylenrest darstellt; π die Zahl 1 oder 2 bedeutet; und Ri Wasserstoff, die Methylgruppe oder Chlor bedeutet, in wäßrigem Medium mit Bromcyan zwischen 10 und 30° C und bei einem pH-Wert von 11 nach Standardmethoden.
    Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch beschriebene aktivierte Vinylmonomere, das als Zwischenprodukt zur Herstellung eines immobilisierten Enzym geeignet ist.
    Die neueren Entwicklungen auf dem stark durchforschten Gebiet der Enzyme richten sich auf die Bereitstellung stabiler, unlöslicher Enzymformen, die die Aktivität des natürlichen Enzyms besitzen. In zahlreichen Übersichtsartikeln wurden die Herstellung und Verwendung unlöslich gemachter Enzyme behandelt: Orth u. a., Angew. Chemie 11,249-346 (1972); Mosbach, Acta Chem. Scand. 24. 2084-2092 (1970): Mosbach, Sc. Amer. 224,26-33 (1971); Kay, Pro'c. Bio'chem. 3,36-39 (1968); Goldstein u.a. Z. Anal. Chem. 243, 375-396 (1968); Goldstein, »Methods in Enzymology«, Academic Press, N. Y. (1971) ; Bd. 19, S. 935 ff.; Silman u.a, Ann. Rev. Biochem. 35,873-908 (1966); Katchalski u. a., Advan. Enzymol. 34, 445 (1971). Eine weitgehend vollständige Zusammenfassung des Standes der Technik findet sich in der US-PS 36 50 900 und bei Melrose, Rev. Pure and Appl.Chem.,21.83-119(1971).
    Die verschiedenen, bisher verwendeten Verfahren zum Unlöslichmachen von Enzymen durch Bindung an oder auf einer Matrix fallen in vier Hauptgruppen:
    (a) Kovalente chemische Bindung über funktionell Gruppen des Enzyms, die für die Enzymaktivität nicht essentiell sind;
    (b) Einschluß des Enzyms in einem hydrophilen Gelgitter, welches das Enzym festhält, jedoch Substrat und Produkt passieren läßt;
    (c) lonenbindung (physikalische Adsorption) an hydrophilen Ionenaustauschern, Kohle oder Glaskugeln und
    (d) Vernetzung unter Bildung großer Aggregate durch Umsetzung mit bifunktionellen Verbindungen.
    Unlösliche bzw. immobilisierte Enzyme und deren Herstellung wurden in folgenden Patentschriften beschrieben:
    US- PSen 35 36 587,35 74 062.36 07 653. 36 16 229, 36 19 371.36 45 852,36 50 900,36 50 901:
    GBPSen 12 24 947 und 12 74 869;
    DE-PSenl9 35 7ll und 20 12 089.
    Die lonenbindung ist nicht zuverlässig, wenn man ein
    vollständig unlösliches Präparat anstrebt, da aus einer Veränderung der lonenstärke, des pH-Werts oder der Temperatur oder dem Zusatz von Substrat partielle
    5 oder totale Desorption des Enzyms resultieren kann.
    Die Unlöslichmachung von Enzymen durch Einschluß ist nicht vollständig befriedigend, da aus so zubereitenden Gelen kleine Enzymmengen ausgelaugt werden.
    Die kovalente Bindung von Enzymen an unlösliche Träger bietet ein Verfahren zur Herstellung wasser-unlöslicher Derivate, bei der Verwendung oder bei Veränderung der Zusammensetzung des Mediums nicht solubilisiert werden, vorausgesetzt, daß die entstandenen kovalenten Bindungen unter den Bedingungen der biochemischen Verwendung nicht gespalten werden.
    Im allgemeinen muß die Bindung eines biologischen aktiven Proteins in einen unlöslichen Träger durch kovalente Bindung über funktionell Gruppen des Enzyms erfolgen, die für dessen biologische Wirkung nicht cssentieü sind. Die Bindungsrcaktion so" selbstverständlich unter solchen Bedingungen stattfinden, die keine Denaturierung zur Folge haben.
    Verschiedene physikalische Eigenschaften des Trägers wie Löslichkeit, mechanische Stabilität, Quelleigenschäften und Porosität sowie elektrische Ladung und hydrophile bzw. hydrophobe Natur spielen eine wesentliche Rolle bei Bestimmung der maximalen Enzymmenge, die kovalent gebunden werden kann, ferner hinsichtlich der Stabilität und biologischen Wirkung des unlöslichen Produkts. Für die Herstellung biologisch wirksamer, gebundener Enzyme, die leicht und vollständig durch Filtration oder Zentrifugieren aus Reaktionsgemischen abgetrennt werden können, sind Mindestlöslichkeit, hohe mechanische Beständigkeit und entspre-
    is chende Teilchengröße von ausschlaggebender Bedeutung. Die gleichen Anforderungen werden bei der Herstellung stabiler, biologisch wirksamer Säulen mit definierten Durchflußgeschwindigkeiten gestellt.
    Bekannte immobilisierte Enzyme sind z. B. hydrolytisehe Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Pankreatin, Papain und Pilz- und Bakterienproteasen, Aminosäure-Acylase, Ribonuklease, Phosphatase, Pektinase, Invertase und Amylase. Besonderes Interesse findet die Immobilisierung der Penicillin-Acylase und Glukose-Oxydase, d. h. die für die Hydrolyse eines Penicillins unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure und einer Carbonsäure und für die Umwandlung von Glukose in Glukono-o-lacton verantwortliche-: Enzyme. Die 6-Aminopenicillansäure wird zur Synthese »neuer Penicil'ine« gebraucht. Die chemische Bindung von Penicillin-Acylase an Cellulosederivate und die Kinetik dieser immobilisierten Präparate sind in Biotechnology Bioengineering 11, 337—348 (1969) beschrieben. Weitere immobilisierte Penicillin-Acylase-Präparate sind in den GB-PSen 11 83 257, 11 83 258, 11 83 260 und 11 93 918 beschrieben. Das kinetische Verhalten und die kovalente Bindung von Glukose-Oxydase an poröses Glas wird in Biochemical Journal 124. 801 (1971) beschrieben. Die chemische Bindung von Glukose-Oxydase an unlösliche
    M) kieselsäurehaltige Teilchen ist aus der US-PS 35 19 538 bekannt.
    Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein aktiviertes Vinylmonomeres bereitzustellen, das als Zwischenprodukt zur Herstellung neuer, stabiler, iminobilisierter Enzympräparate mit hohem Enzymgehalt und hoher Enzymaktivität, in welchen das En/.ym kovalent an ein Polymeres gebunden ist und die wiederholt und ohne spürbaren Verlust an Enzymaktivitiit vcrwen-
DE2366179A 1972-07-12 1973-07-10 Aktiviertes Vinylmonomeres Expired DE2366179C2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27115972A 1972-07-12 1972-07-12
US312694A US3925157A (en) 1972-07-12 1972-12-06 Immobilized enzymes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2366179C2 true DE2366179C2 (de) 1986-03-13

Family

ID=26954726

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2334900A Expired DE2334900C3 (de) 1972-07-12 1973-07-10 Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms
DE2366180A Expired DE2366180C2 (de) 1972-07-12 1973-07-10 Enzymanlagerungsprodukt
DE2366179A Expired DE2366179C2 (de) 1972-07-12 1973-07-10 Aktiviertes Vinylmonomeres

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2334900A Expired DE2334900C3 (de) 1972-07-12 1973-07-10 Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms
DE2366180A Expired DE2366180C2 (de) 1972-07-12 1973-07-10 Enzymanlagerungsprodukt

Country Status (15)

Country Link
US (2) US3925157A (de)
JP (1) JPS5713274B2 (de)
AR (1) AR198676A1 (de)
AU (1) AU475699B2 (de)
BE (1) BE802178A (de)
CA (1) CA1025382A (de)
CH (1) CH576995A5 (de)
DE (3) DE2334900C3 (de)
ES (1) ES416781A1 (de)
FI (1) FI52733C (de)
FR (1) FR2212340B1 (de)
GB (1) GB1442613A (de)
IE (1) IE37902B1 (de)
NL (1) NL167996C (de)
SE (1) SE441100B (de)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4352883A (en) * 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
IT1141249B (it) * 1980-02-28 1986-10-01 Italfarmaco Spa Procedimento per la preparazione di copolimeri di polisaccaridi supprotanti attivita' enzimatica,e copolimeri cosi' ottenuti
JPS6137983U (ja) * 1984-08-11 1986-03-10 昭 中沢 絵葉書入れ
GB8423228D0 (en) * 1984-09-14 1984-10-17 Unilever Plc Specific binding materials
DK336987D0 (da) * 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
US5034428A (en) * 1986-06-19 1991-07-23 Board Of Regents Of The University Of Washington Immobilized biomolecules and method of making same
US4829098A (en) * 1986-06-19 1989-05-09 Washington Research Foundation Immobilized biomolecules and method of making same
ES2036149A6 (es) * 1989-12-12 1993-05-01 Consejo Superior Investigacion Procedimiento de sintesis de antibioticos semiestaticos en sistemas termodinamicamente controlados agua-cosolventes organicos miscibles apolares con el empleo de penicilina g acilasa.
US6927051B1 (en) 2002-04-04 2005-08-09 The University Of Akron Polymer-protein surfactants
JP3740529B2 (ja) * 2002-05-23 2006-02-01 独立行政法人産業技術総合研究所 配向制御したタンパク質の固定化方法およびそれを利用したタンパク質の整列固定化方法
WO2003106655A2 (en) * 2002-06-18 2003-12-24 The University Of Akron Fibrous protein-immobilization systems
US7160669B2 (en) * 2002-10-16 2007-01-09 Sumitomo Chemical Company, Limited Chemical amplification type resist composition
NO344627B1 (en) * 2018-04-30 2020-02-10 Sintef Tto As Hybrid polymer membrane

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3314905A (en) * 1962-03-16 1967-04-18 Swift & Co Acyclic organic acid-halogenated epoxy compound ester modified protein
NL299972A (de) * 1962-11-10
SE337223B (de) * 1967-05-23 1971-08-02 Pharmacia Ab
US3650900A (en) * 1968-09-27 1972-03-21 Yeda Res & Dev Insoluble polymer-enzyme products
US3576760A (en) * 1969-06-13 1971-04-27 Nat Patent Dev Corp Water soluble entrapping
AT317424B (de) * 1971-06-09 1974-08-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteinen
BE795316A (fr) * 1972-02-11 1973-05-29 Nat Patent Dev Corp Systeme catalytique presentant une activite enzymatique durable et de stabilite augmentee

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS-ERMITTELT *

Also Published As

Publication number Publication date
JPS5713274B2 (de) 1982-03-16
ES416781A1 (es) 1976-06-16
US3925157A (en) 1975-12-09
NL167996C (nl) 1982-02-16
NL7309488A (de) 1974-01-15
FR2212340A1 (de) 1974-07-26
US4061867A (en) 1977-12-06
FR2212340B1 (de) 1977-05-13
JPS4955892A (de) 1974-05-30
AU5778573A (en) 1975-01-09
CH576995A5 (de) 1976-06-30
DE2366180C2 (de) 1981-02-26
GB1442613A (en) 1976-07-14
BE802178A (fr) 1974-01-11
IE37902B1 (en) 1977-11-09
SE441100B (sv) 1985-09-09
DE2334900B2 (de) 1978-11-23
AU475699B2 (en) 1976-09-02
IE37902L (en) 1974-01-12
NL167996B (nl) 1981-09-16
DE2334900A1 (de) 1974-01-31
FI52733C (fi) 1977-11-10
AR198676A1 (es) 1974-07-15
DE2366180B1 (de) 1980-06-26
CA1025382A (en) 1978-01-31
DE2334900C3 (de) 1979-08-02
FI52733B (de) 1977-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0075815B1 (de) Wasserunlösliches Proteinmaterial, dessen Herstellung und Verwendung
DE2366179C2 (de) Aktiviertes Vinylmonomeres
DE2426988C2 (de) Verfahren zur Trägerbindung biologisch aktiver Proteine
DE1908290C3 (de) Acrylamid-mischpolymerisat
DE3520001C2 (de) Verfahren zur Herstellung immobilisierter Mikroorganismen oder Enzyme
DE2513929C2 (de) Verfahren zur Immobilisierung intakter mikrobiologischer Zellen
CH619003A5 (de)
DE2705377C2 (de)
DE2215687C3 (de) Neue wasserunlösliche Proteinpräparate
DE2721829A1 (de) Verfahren zur herstellung eines hydrophilen komplexen gels zur immobilisierung mikrobieller zellen
EP0110281B1 (de) Vinylencarbonat-Polymerisate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Anwendung
DE3132493C2 (de)
EP1053258B1 (de) Vorrichtung zur herstellung von trägerpolymermaterialien in form von porösen polymerperlen
CH615440A5 (de)
DE2215539C2 (de) Neue wasserunlösliche Enzym-, insbesondere Penicillinacylase-oder Enzyminhibitor-Präparate
EP0049385B1 (de) Perlpolymerisat und dessen Verwendung zur Immobilisierung von Enzymen
DE2413694B2 (de) Wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterlal
DE2407340A1 (de) Substanz und verfahren zu ihrer herstellung
DE2805607C3 (de) Herstellung von Bio-Katalysatoren durch Polymereinschluß von Mikroorganismen
WO2006084490A1 (de) Makroporöses kunststoffperlenmaterial
AT331972B (de) Durchfuhrung von durch wasserunlosliche proteinpraparate katalysierbarenreaktionen
Ghali et al. Studies on the Combined Action of Amylases and Glucose Isomerase on Starch and Its Hydrolysates Part II. Immobilization of Glucoamylase
DE2215512C3 (de) Vernetzte Copolymerisate
AT335604B (de) Durchfuhrung von durch wasserlosliche proteinpraparate katalysierbaren reaktionen
DE2805366A1 (de) Verfahren zur herstellung wasserunloeslicher, an einen poroesen traeger kovalent gebundener proteine

Legal Events

Date Code Title Description
OI Miscellaneous see part 1
OI Miscellaneous see part 1
OD Request for examination
AC Divided out of

Ref country code: DE

Ref document number: 2334900

Format of ref document f/p: P

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition