DE2366180C2 - Enzymanlagerungsprodukt - Google Patents

Enzymanlagerungsprodukt

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Description

Il
CH2=C-C-R2 R.
!0
15
worin Ri Wasserstoff, die Methylgruppe oder Chlor und R2 eine Hydroxylgruppe, Halogen, eine Azido-, Acryloyloxy-. niedere Alkoxy-carbonyloxy-. Benzolsulfonyloxy- oder N-[(p^Diazoniumchlorid)phenyfjaminogruppe bedeutet, wobei das Monomer, in dem Rz eine Hydroxylgruppe ist, vor der Reaktion mit dem Enzym durch Reaktion mit einem carboxylgruppenaktivierendeii Reagens aktiviert wird, oder mit einem Produkt, das durch Reaktion eines hydroxylgruppenhaltigen Vinylmonomers der Forme!
CH2=C- C— X—(Y- O>„— H
30
35
worin Ri die vorstehende Bedeutung hat, X —O— oder -NR3 bedeutet, wobei R3 Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, Y den Äthylen- oder Propylenrest darstellt und π die Zahl 1 oder 2 bedeutet, mit einem Halogencyan erhalten wurde.
45
Die Erfindung betrifft ein Enzymanlagerungsprodukt wie es im Patentanspruch gekennzeichnet ist, das als Zwischenprodukt zur Herstellung immobilisierter Enzyme geeignet ist
Die neueren Entwicklungen auf dem stark durch forschten Gebiet der Enzyme richten sich auf die Bereitstellung stabiler, unlöslicher Enzymformen, die die Aktivität des natürlichen Enzyms besitzen. In zahlreichen Obersichtsartikeln wurden die Herstellung und Verwendung unlöslich gemachter Enzyme behandelt: Orth et al, Angew. Chemie 11. 249-346 (1972); Mosbach, Acta Chem. Scand 24, 2084-2092 (1970); Mosbach, Sc Amer. 224. 26-33 (1971): Kay, Proc. Biochem. 3, 36-39 (1968); Goldstein et al. Z. Anal. Chem. 243, 375-396 (1968); Goldstein, »Methods in Enzymology«, Academic Press, N. Y. (1971); Bd. 19, S. ff.; Silman et al.; Ann. Rev. Biochem. 35, 873-908 (1966); Katchalski et al, Advan. Enzymol. 34,445 (1971). Eine weitgehend vollständige Zusammenfassung des Standes der Technik findet sich in der US-PS 36 50 900 und bei Melrose, Rev. Pure and Appl. Chem. 21,83-119 (1971).
Die verschiedenen, bisher verwendeten Verfahren zum Unlöslichmachen von Enzymen durch Bindung an oder auf einer Matrix fallen in vier Hauptgruppen:
(a) Kovalente chemische Bindung über funktionelle Gruppen des Enzyms, die für die Enzymaktivität nicht essentiell sind;
(b) Einschluß des Enzyms in einem hydrophilen Gelgitter, welches das Enzym festhält jedoch Substrat und Produkt passieren läßt;
(c) Ionenbindung (physikalische Adsorption) an hydrophilen Ionenaustauschern, Kohle oder Glaskugeln und
(d) Vernetzung unter Bildung großer Aggregate durch
Umsetzung mit bifunktionellen Verbindungen.
Unlösliche bzw. immobilisierte Enzyme und deren Herstellung wurden in den US-PS 35 3b 587,35 74 062, 36 07 653, 36 16 229, 36 19 371. 36 45 852, 36 50 900, 36 50 901; den GB-PS 12 24 947 und 12 74 869; den DE-PS 19 35 711 und 2012 089 sowie der DE-OS 19 55 638 beschrieben.
Die Ionenbindung ist nicht zuverlässig, wenn man ein vollständig unlösliches Präparat anstrebt da aus einer Veränderung der Ionenstärke, das pH-Werts oder der Temperatur oder beim Zusatz von Substrat partielle oder totale Desorption des Enzyms resultieren kana
Die Unlöslichmachung von Enzymen durch Einschluß, wie sie z. B. in der DE-OS 19 55 638 beschrieben wurde, ist nicht vollständig befriedigend, da aus so zubereiteten Gelen kleine Enzymmengen ausgelaugt werden.
Die kovalente Bindung von Enzymen an unlösliche Träger bietet ein Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Derivate, die bei Verwendung oder bei Veränderung der Zusammensetzung des Mediums nicht solubilisiert werden, vorausgesetzt daß die entstandenen kovalenten Bindungen unter den Bedingungen der biochemischen Verwendung nicht gespalten werden.
Im allgemeinen muß die Bindung eines biologisch aktiven Proteins an einen unlöslichen Träger durch kovalente Bindung Ober funktionelle Gruppen des Enzyms erfolgen, die for dessen biologische Wirkung nicht essentiell sind. Die Bindungsreaktion soll selbstverständlich unter solchen Bedingungen statffinden, die keine Denaturierung zur Folge haben.
Verschiedene physikalische Eigenschaften des Trägers wie Löslichkeit mechanische Stabilität Quelleigenschaften und Porosität sowie elektrische Ladung und hydrophile bzw. hydrophobe Katur spielen eine wesentliche Rolle bei Bestimmung der maximalen Enzymmenge, die kovalent gebunden werden kann, ferner hinsichtlich der Stabilität und biologischen Wirkung des unlöslichen Produkts. Für die Herstellung biologisch wirksamer, gebundener Enzyme, die leicht und vollständig durch Filtration oder Zentrifugieren aus Reaktionsgemischen abgetrennt werden können, sind minimale Löslichkeit hohe mechanische Beständigkeit und entsprechende Teilchengröße von ausschlaggebender Bedeutung.
Bekannte immobilisierte Enzyme sind ζ. Θ. hydrolytische Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Pancreatin, Papain und Pilz- und Bakterienproteasen, Aminosäure-Acylase, Ribonuclease, Phosphatase, Pectinase, Invertase und Amylase. Besonderes Interesse findet die Immobilisierung der Penicillin-Acylase und Glucose-Oxydase, d. h. die für die Hydrolyse eines Penicillins unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure
und einer Carbonsaure und für die Umwandlung von Glucose in Glucono-d-lacton verantwortlichen Enzyme. Die 6-Aminopenicillansäure wird zur Synthese »neuer Penicilline« gebraucht Die chemische Bindung von Penicülin-Acylase an Cellulosederivate und die Kinetik s dieser immobilisierten Präparate sind in Biotechnology und Bioengineering 11, 337—348 (1969) beschrieben. Weitere immobilisierte Penicillin-Acylase-Präparate sind in den GB-PS Il 83 257, 11 83 258, 11 83 260 und 11 93 918 offenbart. Das kinetische Verhalten und die kovalente Bindung von Glucose-Oxydase an poröses Glas wird in Biochemical Journal 124. 801 (1971) beschrieben. Die chemische Bindung von Glucose-Oxydase an unlösliche kieselsäurehaltige Teilchen ist aus der US-PS 35 19 538 bekannt '
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Enzymanlagerungsprodukte bereitzustellen, die als Zwischenpro- *' dukte zur Herstellung stabiler, immobilisierter Enzympräparate mit hohem Enzymgehalt und hoher Enzymaktivität geeignet jnd, die wiederholt und ohne spürbaren Verlust an Enzymaktivität verwendet werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Enzymanlagerungsprodukt gelöst das durch Umsetzung eines der Enzyme Penicillin-Acylase, Glucose-Oxydase, Urease, Amyloglucosidase, Fumarase, Subtilo- peptidase A aus Bacillus subtilis ATCC 21 839 und L-Aspartase aus Enterobacter aerogenes ATCC 9760 mit einem polymerisierbaren, äthylenisch ungesättigten Monomer der Formel
CH2=C-C-R2
(D
30
35
worin R) Wasserstoff, die Methylgruppe oder Chlor und R2 eine Hydroxylgruppe, Halogen, eine Azido-, Acryloyloxy-, niedere Alkoxy-carbonyloxy-, Benzolsulfonyloxy- oder N-[(p-Diazoniumchlorid)phenyl]aminogruppe bedeutet, wobei das Monomer, in dem R2 eine Hydroxylgruppe ist, vor der Reaktion mit dem Enzym durch Reaktion mit einem carboxylgruppenaktivierenden Reagens aktiviert wird, oder mit einem Produkt das durch Reaktion eines hydroxylgruppen haltigen Vinylmonomers der Formel
C)
CH2=C C X -(Y O).-H
(U)
50
worin Ri die vorstehende Bedeutung hat; X —O— oder —NR3 bedeutet wobei R3 Wasserstoff oder ein Alkylrest mit I bis 6 Kohlenstoffatomen ist; Y den Äthylen- oder Propylenrest darstellt; und π die Zahl 1 oder 2 bedeutet, mit einem Halogencyan erhalten wurde, erhältlich ist
Das erfindungsgemäße Enzymanlagerungsprodukt kann durch Polymerisation oder Copolymerisation des das Enzym tragenden Monomeren in Gegenwart eines Vernetzungsmittels und eines Initiators in ein immobilisiertes Enzym, d. h. ein unlösliches Enzympräparat, in welchem das Enzym kovalent an ein Polymer gebunden b5 ist, umgewandelt werden.
Mit Ausnahme der Monomeren, bei denen R2 eine Hydroxylgruppe bedeutet, enthalten sämtliche Monomeren der Formel I eine zur Vereinigung mit einem Enzym befähigte reaktive Gruppe.
Wenn R2 eine HydroKylgruppe ist sind die monomeren Säuren reaktionsfähig, nachdem die Carboxylgruppe durch Reaktion mit einem geeigneten carboxylgnippen-aktivierenden Reagens aktiviert worden ist beispielsweise mit einem Carbodiimid wie Dicyclohexylcarbodiimid oder ÄthyunoφhouncaΓbodiiπϋd, N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (Woodward's Reagenz K); Keteniminen wie z. B. Pentamethylenketen, Cyclohexylimin, Acetyläthern wie z. B. Äthoxyacetylen, Hexahalogencyclotriphosphattriazinen, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxysuccinimid und anderen Reagentien, die zur Bildung einer Peptidbindung verwendet werden.
Die Monomeren der Formel II werden durch die Umsetzung mit dem Halogencyan nach Standardmethoden in reaktive Monomere überführt
Das erfindungsgemäße Enzymanlagerungsprodukt kann mit einem unter Addition polymerisierbaren Monomeren in Gegenwart eines Vernetzungsmitteis und eines initiators polymerisiert werden. Geeignete additionspolyrnerisierbare Comonomere sind z. B. Acryl-, «-Chloracryl- und Methacrylsäure und deren Glycidyl- und niederen Alkylester, am Stickstoffatom der Aminogruppe disubstituierte Amine alkylester und -amide, niederalkylsuostituierte Amide, methylol substituierte Amide und am Stickstoffatom der Aminogruppe monosubstituierte und disubstituierte Aminoalkylamide sowie Styrol, Butadien und Isopren.
Die Polymerisation oder Copolymerisation des erfindungsgemäßen Enzymanlagerungspraduktes wird in Gegenwart eines Vernetzungsmitteis durchgeführt, welches dem fertigen Polymerisat die Struktur eines dreidimensionalen Netzwerks und Unlöslichkeit verleiht Als Vernetzungsmittel können beispielsweise Acrylmonomere oder Olefinverbindungen verwendet werden. Bevorzugt wird als Vernetzungsmittel N,N'-Methylen-bis-acrylamid verwendet ·'*? dieses Reagens dem Endprodukt die gewünschte hydrophile Natur verleiht Die Polymerisations- und Copolymerisationsreaktionen werden durch freiradikalische Initiatoren eingeleitet Geeignete freiradikalische Initiatorsysteme sind solche, die bei einer Temperatur unterhalb etwa 40°C freie Radikale bilden. Redox-Initiatorsysteme werden bevorzugt. Ein besonders bevorzugtes Initiatorsystem besteht aus Dimethylaminopropionitril und Ammoniumpersulfat
Die aus den erfinaungsgemäßen Enzymanlagerungsprodukten erhaltenen immobilisierten Enzyme enthalten größere Mengen an aktivem Enzym als bekannte Produkte, bei denen das Enzym kovalent an ein fertiges Polymer gebunden wurde. Bei den aus den erfindungsgemäßen Enzymanlagerungsprodukten erhaltenen Produkten handelt es sich weder um bloßen Einschluß des Enzyms in den Träger durch Vernetzung zwischen Trägermolekülen, noch um einfache Enzymadsorption. Die Elektrophorese nach der Kupplungsreaktion zwischen Enzym und Monomer unter Bildung des erfindungsgemäßen Enzymanlagerungsproduktes zeigt, daß praktisch sämtliches Enzym kovalent an das reaktionsfähige Monomer gebunden ist. Folglich ist auch praktisch alles Enzym an das fertige Polymer gebunden. Hierauf beruhen die extrem hohe Enzymbeladung und Enzymaktivität, die gleichbleibend sind, und nach fortgesetzter Verwendung des Produktes wird kein Auslaufen oder Ausbluten von Enzym aus dem Polymer beobachtet.
Die Bindung des Enzyms an des Monomer unter Bildung des erfindungsgemäßen Enzymanlagerungsproduktes erfolgt vermutlich hauptsächlich über Aminogruppen der Enzyme. Enzyme enthalten jedoch im allgemeinen mehrere reaktionsfähige Gruppen, die zur Reaktion und Bindung mit dem Monomeren miteinander konkurrieren. Unter diesen konkurrierenden reaktionsfähigen Gruppen sind z. B. die Sulfhydryi-, Hydroxyl-, Carboxyl- und Imidazolylreste.
Je nach Stellung der reaktiven Gruppen im Enzym kann die Kupplung mit dem Monomeren ein bestimmtes Ausmaß an Enzymdesaktivierung verursachen. In manchen Fällen ist auch die aktive Stelle des Enzyms sterisch unerreichbar, so daß durch die Kupplung mit dem Monomeren kein Aktivitütsverlust eintritt. Führt die Kupplung des Enzyms mit dem Monomeren zu übermäßiger Inaktivierung, so kann gegebenenfalls das aktive Zentrum des Enzyms in geeigneter Weise geschützt werden, z. B. mit einem spezifischen Reagens oder konkurrierenden Inhibitor, wodurch das Etv.ym und seine aktive Konfiguration stabilisiert werden, und/oder man kann die Kupplung mit dem Monomeren mit reaktiven Gruppen des Enzyms vornehmen, die vom aktiven Zentrum entfernt liegen.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Enzymanlagerungsprodukte können als Enzyme Urease, Amyloflucosidase, Glucose-Oxidase, Fumarase, Subtilopeptidase A (Handelsbezeichnung »Maxatase«) ans Bacillus subtilis ATCC 21839 (identisch mit dem Mikroorganismus Bacillus subtilis Stamm R»), L-Aspartase aus Enterobacter aerogenes ATCC 9760 und Penicillin-Acylasen verwendet werden. Die letzteren können mit zahlreichen Mikroorganismen produziert werden, wie dies in den US-PS 32 60 653, 3212 995 und 32 39 427 beschrieben ist Enzympräparate aus diesen Mikroorganismen sind für die vorliegenden Zwecke geeignet, wobei Proteus rettgeri ATCC 9250. Eschericia coli ATCC 9673 und Aspergillus Flavus Link ATCC 13608 die bevorzugten Mikroorganismen zur Herstellung von Penicillin-Acylase sind.
Das aus dem erfindungsgemäQen Enzymanlagerungsprodukt erhaltene immobilisierte Enzym kann als Aufschlämmung oder in einer Säule verwendet werden. Nach Beendigung der Reaktion zwischen Enzym und Substrat wird das immobilisiert- F.n/ym aus dem Rcakiionsgcmisch abgetrennt, mit Wasser gcwaschci, nnil zur wiederholten Verwendung /ur Seite gestellt.
Zur Herstellung von PcnieillinAcvlasc werden l'rciii-us rcltgcri ATCi 9250 /eilen nach der Vorschrift .lcr I1SPS J? 59 427 gc/uchlcl Die Bakicricn/ellcn werden jus der Kulturbruhc .ibfiltticrt oder jb/cntrifii K'icri und in W.isscr in degen wan wind bis J"/> > Toluol in einer Menge Min etwa "> dew "Ί. suspendiert Die wäßrige Aufschlämmung wird etwa 5 Stunden bei 37 ( gehalten wobei der pH Wert durch vorsichtige /ug'bc von Natnumhvdroxidlosiing bei clw,i KO konstant gehalten wird Das Gemisch wird filtriert oder zentrifugiert, und die klare waürigc lösung wird gefriergeirocknci oder sprühgetrocknet Die Aktivität wird nach Biotechnology und Engineering ! I, JJ7 - J4« (1969) bestimmt.
Mit der immobilisierten Penicillin-Acylase von Beispiel I können mehr als 30 Reaktionsansätze durchgeführt werden, bei denen Benzylpenicillin zu 6-Aminopenicilianiäure hydrolysiert wird, wobei diese Ansätze sich über einen Zeitraum von 12 Wochen erstrecken, ohne daß ein merklicher Aktivitätsverlust eintritt. Die Umwandlung des Benzylpenicillins in 6-Aminopenicillansäure liegt untsr optimalen Bedingungen bei Verwendung des erfindungsgemäßen immobilisierten Penicillin-Acylasesystems oberhalb 95%.
Das immobilisierte Enzym/Polymerprodukt von Beispiel 2 kann mehrere Monate zur Deacylierung von Penicillin G unter Bildung der 6-Aminopenicillansäure ohne spürbaren Aktivitätsverlust verwendet werden. Das immobilisierte Enzympolymer von Beispiel 4
to kann wiederholt in diskontinuierlichem Verfahren oder in einem Säulenbetrieb zur Deacylierung von Benzylpenicillin und Benzylcephalosporin unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure und 7-Aminocephalosporansäure verwendet werden, wobei kein spürbarer
Aktivitätsverlust beobachtet wird.
Eine über ein erfindungsgemäßes £nzymanlagerungsprodukt immobilisierte Urease kann wiederholt zur Hydrolyse von Harnstoff unter Bildung von Kohlendioxid und Ammoniak verwendet wc- :en. Das immobili- sierte Enzym kann in kontinuierlich arbeitender Säuie oder in diskontinuierlichem Verfahren während mehrerer Monate ohne spürbaren Aktivitätsverlust gebraucht werden.
Einr über ein erfindungsgemäßes Enzymanlagerungs-
produkt immobilisierte Fumarase kann zur Umwandlung von Fumarat in L-Malat bei pH 7 und 25°C verwendet werden, wobei man Ausbeuten von mehr als 80% erzielt Die immobilisierte Fuiiarase ist lang haltbar und kann stetig zur Umwandlung von
Fumarsäure in L-Äpfelsäure in einem Säulenverfahren oder diskontinuierlichen Verfahren eingesetzt werden.
Eine über ein erfindungsgemäßes Enzymanlagerungsprodukt immobilisierte L-Aspartase kann zur Umwandlung von Diammoniumfumarat in L-Aspartat verwendet werden, wobei man bei pH 7 und 25° C Ausbeuten von 90% erzielt Das immobilisierte L-Aspartase-Polymer kann stetig wiederholt ohne spürbaren Ak'ivitätrverlust zur Umwandlung von Fumarat in L-Aspartat eingesetzt werdea
p-ine über ein erfindungsgemäßes Enzymanlagerungsprodukt immobilisierte Amyloglucosidase kann zur Umwandlung von Stärkehydrolysaten in Glucose in 95%iger Ausbeute eingesetzt werden. Die inimobilisierte Amyloglucosidase kann während mehreren Monaten
:, ohne spürbaren Aktivitätsverlust kontinuierlich zur Umwandlung von Stärkehydrolysaten in Glucose gebraucht werden.
Eine über ein erfindungsgemäßes Enzymanlagerungsprodukt immobilisierte Subtilopeptidase A kann konti-... nuierlich während T Wochen zur Hydrolyse von Casein unter Bildung von Peptiden und Aminosäuren verwendet werden, wobei man keinen spurbaren Aktiviiaisver lusi 'vcobachtcl.
I Im die Überlegenheit der mit Hilfe der crfindungsge-.. mäßen ι n/ymanLgerungsproduktc erhalten.·.π immobi lisicrtcn l.n/ymc gegenüber den Produkten der Dt-OS 19 55 6i8 /u erläutern, wird darauf hingewiesen, daß die Produkte der Beispiele der DE-OS 19 55 638 nur noch IO bis 15% der ursprünglichen Enzymaktivitat ajfwic
mi sen, wahrend die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Enzymanlagertingsprodukte erhaltenen immobilisierten Enzyme bis /u 40 bis 50% der ursprünglichen Enzymaktivität aufweisen (vgl. z. B. die nachstehenden Beispiele 1,2,5und 14).
h-, In einem weiteren Vergleichsversuch wurde gezeigt, daß ein durch Polymerisation von Acrylamid in Gegenwart von Glucose-Oxidase erhaltenes immobilisiertes Enzym eine spezifische Wirksamkeit von 90
Einheiten pro g des Polymerisates aufwies, während ein immobilisiertes Enzym, das durch Mischpolymerisation von Acrylamid mit einem erfindungsgemäßen Enzymanlagerungsprodukt aus Glucose-Oxidase und Acrylsäurechlorid erhalten wurde, eine spezifische Wirksamkeit von 300 Einheiten pro gr des Polymerisates aufwies. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Bindung von Penicillin-Acylase an durch
Bromcyan aktiviertes Hydroxyäthylmethacrylat
(kein Comonomer)
A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Zu einer Lösung von 20 g 2-Hydroxyäthyl-methacrylat in 80 ml Wasser wurde eine Lösung von 10 g Bromcyan in 80 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wurde mit 30%iger (Gewicht/Volumen) Natriumhydroxidlösung auf 11,0 eingestellt, und dann wurde bei einer Temperatur zwischen 20 und 30°C auf diesen pH-Wert stabilisiert. Dann wurde der pH-Wert mit Salzsäure auf 6,5 gebracht, sodann wurden unter Rühren 20 g (8 Einheiten/mg) Penicillin-Acylase aus Proteus rettgeri ATCC 9250 in 200 ml Wasser zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur IV2 Stunden gerührt. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A erhaltene Gemisch wurde mit 10 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid versetzt und etwa 30 Minuten gerührt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch in ein Eisbad überführt und unter Stickstoff auf 40C gekühlt Unter Rühren wurde ein Katalysatorsystem aus 3 ml Dimethylaminopropionitril und 375 mg Amrnoniumpersulfat zugesetzt. Das Eisbad wurde entfernt, und man ließ sich das Reaktionsgemisch unter Stickstoff langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Die Polymerisation erfolgte allmählich im Verlauf von 30 bis 60 Minuten, bis zur Bildung eines dicken Gels. Der
500 ml Wasser versetzt, und das Gemisch wurde' gerührt, um das dicke Gel in einen körnigen Feststoff zu überführen. Der Feststoff wurde abfiltriert mit Wasser gewaschen und an der Luft oder im Vakuum getrocknet. Dabei erhielt man 37 g immobilisiertes Enzym, das nach dem Aktivitätstest etwa 50% der gesamten anfänglichen freien Enzymaktivität enthielt
B- i s pi el 2
Bindung von Peniciilin-Acylase an durch
Bromcyan aktiviertes Hydroxyäthyl-methacrylat
(Methylmethacrylat als Comonomer)
A. Hersteilung des Enzymanlagerungsproduktes
Zu einer Lösung von 4,0 g Bromcyan in 65 ml Wasser von 100C wurden 10,0 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat in 40 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wurde mit 5n Natriumhydroxidlösung auf 11,0 eingestellt und konstant bei diesem Wert gehalten, wobei die Temperatur zwischen 10 und 300C gehalten wurde. Dann wurde der pH mit 6 η-Salzsäure auf 6,5 eingestellt worauf man 10,0 g (5,6 Einheiten pro mg Aktivität) Penicillin-Acylase aus Escherichia cdi ATCC 9637 (ÜS-PS 32 öö 653) in 200 ml Wasser zugab.
Das Gemisch wurde VI2 Stunden bei 20 bis 300C gerührt. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsproduki wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A erhaltene Gemisch wurde unter Rühren mit 4,0 g N1N -Methylen-bis-acrylamid und 1,0 g Methylmethacrylat versetzt. Dann wurde unter Stickstoff auf 4°C abgekühlt, worauf man unter Rühren ein Katalysatorsystem aus 1,5 ml Dimethylaminopropionitril und 250 mg Ammoniumpersulfat zugab. Das Eisbad wurde entfernt, und das Gemisch wurde bis zur beendeten Polymerisation (etwa 1,5 Stunden) gerührt, wobei die Temperatur unterhalb etwa 20°C gehalten wurde. Unter Rühren wurde das Polymer mit 400 ml Wasser versetzt, um letzteres in kleine körnige Partikel aufzubrechen. Das Gemisch wurde filtriert und das resultierende immobilisierte Enzym-Polymer wurde als feuchter Kuchen gelagert. Es enthielt 45% der anfänglichen Gesamtaktivität des freien Enzyms.
Beispiel 3
Bindung von Penicillin-Acylase an durch
Bromcyan aktiviertes Hydroxyäthyl-methacrylat
(Acrylamid als Comonomer)
A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Zu einer Losung von 15,0 g Hydroxyäthylmethacrylat in 70 ml Wasser wurde eine Losung von 7,5 g Bromcyan
in in 70 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wurde mit 5 η-Natriumhydroxid auf 11,0 eingestellt und bis zur Konstanz bei diesem Wert gehalten. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wurde zwischen 20 und 300C gehalten. Nachdem sich das Reaktionsgemisch beim
r. pH-Wert 11,0 stabilisiert hatte, wurde es mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht, und dann wurden 15 g Penicillinacylase aus Aspergillus flavus Link ATCC 13 608 in 150 ml Wasser zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 45 Minuten gerührt Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A erhaltene Gemisch wurde mit 15 g Acrylamid und 1,5 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid versetzt und noch 30 Minuten gerührt. Danach wurde das Gemisch in ein Eisbad gestellt und unter Stickstoff auf 4°C abgekühlt Ein Katalysatorsystem aus 3 ml Dimethylaminopropionitril und 350 mg Ammoniumpersulfat wurde unter Rühren zugegeben. Man entfernte das Gemsich aus dem Eisbad und ließ es sich aui Raumtemperatur erwärmen, wobei während dieser Zeit Polymerisation eintrat und ein dicker gelartiger Feststoff resultierte. Der Feststoff wurde aufgebrochen, kräftig mit 21 Wasser gerührt, filtriert, mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet, wobei man 40 g immobilisiertes Enzymmaterial erhielt, dessen Aktivität der Aktivität des Produktes von Beispiel 1 vergleichbar war.
Beispiel 4
Bindung von Penicillin-Acylase an durch
Trichlortriazin aktiviertes Hydroxyäthylmethacrylat
6:1 A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Ein Gemisch aus 25 g (0,2 MoI) Hydroxyäthylmethacrylat in 150 ml Wasser wurde auf einen pH-Wert von
9 und 10°C eingestellt. Das wäßrige Gemisch wurde mit einer Lösung von 45 g (0,25 Mol) Trichlortriazin in 100 ml Aceton versetzt und etwa 5 Minuten lang unter Einstellung des pH-Wertes auf 9 mittels 1 n-Natriumhydroxidlösung bei 10 bis 15°C gerührt. Der pH-Wert wurde dann mit Salzsäure auf 6,5 eingestellt, und das V;eton wurde im Vakuum entfernt. Das resultierende wäßrige Gemisch wurde mit einer Lösung von 25 g (7,0 Einheiten/mg Aktivität) Penicillin-Acylase aus Proteus rettgeri ATCC 9250 versetzt und 6 Stunden bei 20°C gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 1 n-Natriumhydroxidlösung bei 6,5 bis 7,0'gehalten wurde. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A. erhaltene Gemisch wurde mit 10 g Äthylenglycnl-dimethacrylat und 2.5 α Methylmethacrylat versetzt, unter Stickstoff auf 4° C abgekühlt und unter Rühren mit einem Katalysatorsystem auf 375 mg Ammoniumpersulfat und 3 ml Dimethylaminopropionitril versetzt. Das Eisbad wurde entfernt, und die Polymerisation war nach etwa 2 Stunden beendet, wonach ein weißer Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde mit 500 ml Wasser verrührt, filtriert und bis zum Gebrauch als feuchter Kuchen gelagert. Das immobilisierte Enzympolymer enthielt 35% der anfänglichen Gesamtaktivität des freien Enzyms.
B e i s ρ i e 1 5
Bindung von Penicillin-Acylase an durch Bromacetylbromid aktiviertes Hydroxyäthylmethacrylat
A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Zu einer Lösung von 39,04 g (030 MoI) Hydroxyäthylmethacrylat und 40 g (0,5 Mol) Pyridin in 300 ml Benzol von 60C wurde unter Rühren eine Lösung von 60,6 g (030 Mol Bromacetylbromid zugetropft Nach beendeter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 6 bis 80C gerührt und filtriert Das Filtrat wurde mit verdünnter Salzsäure extrahiert, unü uic uigauiäCnc Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und dann zur Trockene eingedampft, wobei man 56 g Bromacetoxyäthylmethacrylat in Form eines hellgelben Öls erhielt
Ein Gemisch aus 17,5 g Bromacetoxyäthyl-methacrylat in 50 ml Wasser wurde mit einer Lösung von 12,5 g (73 Einheiten pro Milligramm Aktivität) Penicillin-Acylase aus Aspergillus flavus Link ATCC 13608 in 150 ml Wasser versetzt Das resultierende Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 7,75 eingestellt, und mit 1 n-Natriumhydroxidlösung bis zur Beendigung der Reaktion (etwa 5 Stunden) bei diesem pH-Wert gehalten. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A erhaltene Gemisch wurde mit 6,25 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 1,25 g Methylmethacrylat versetzt und unter Stickstoff auf 4" C gekühlt En Katalysatorsystem aus 0,5 g Kaliumpersulfat und 2J5 ml Dimethylaminopropionitril wurde unter Rühren zugesetzt und das Kühlbad wurde entfernt worauf eine allmähliche Polymerisation resultierte. Sobald die es Polymerisation beendet war (etwa 2 Stunden), wurden unter Rühren 200 ml Wasser zugesetzt um das Polymer zu einem körnigen Feststoff aufzubrechen. Das Gemisch wurde filtriert, und der Feststoff wurde an der Luft getrocknet, wobei man 22 g immobilisiertes Enzympolymer erhielt, das 40% der Anfangsaktivität des freien Enzyms besaß.
Beispiel 6
Durch Diimid katalysierte Bindung von Glucose-Oxydase an Hydroxyäthylmethacrylat
A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Zu einer Suspension von 1 g Glucose-Oxydase (Aktivität = 4080 IUB-Einheiten pro Gramm) und 20 mg Hydroxyäthylmethacrylat in 5 ml Acetonitril wurden 40 mg l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 17'/2 Stunden gerührt, auf 4°C abgekühlt und unter Stickstoff gebracht. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A erhaltene Gemisch wurde mit 400 mg Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 2,5 g Methylmethacrylat behandelt. Dann wurde 1 g N,N-Diäthyl-aminoäthyl-methacrylat zugetropft, wobei der pH-Wert bei 5,8 gehalten wurde. Das Gemisch wurde 10 Minuten gerührt und mit 140 mg Ammoniumpersulfat und 0,5 ml Dimethylaminopropionitril behandelt. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur wurde noch 3 Stunden gerührt dann mit einer gleichen Volumenmenge Wasser verdünnt und filtriert. Das Polymer wurde gewaschen und an der Luft getrocknet, dabei erhielt man 5,27 g Feststoffe, die 24% der ursprünglichen Enzymaktivität enthielten.
Beispiel 7
Die Arbeitsweise der Beispiele 1 bis 6 wurde unter Ersatz des Hydroxyäthylmethacrylats durch die folgenden Monomeren wiederholt, wobei vergleichbare Ergebnisse erhalten wurden. Die folgenden Monomeren wurden eingesetzt.
45 Rl O
|| 		X — H -(Y-O)n
H CH2=C-C-X-(Y-O), O C2H4O
55 CH3 I
R1 		NH C2H4O
50 Cl N-CH3 (C2H4O)3
Cl O (C2H4O)2
Cl O (C2H4O)3
CH3 O C3H6O
60 H O (C3H6O)3
CH3 NH C2H4O
CH, NC6H13 C2H4O
Im wesentlichen analoge Ergebnisse wurden erhalten, als als Katalysator Kaliumpersulfat und Natriumthiosulfat Natriummetabisulfit oder Benzoylperoxid und Ferroammoniumsulfathexahydrat anstelle des Ge-
mischs aus Ammoniumpersulfat und Dimethylamino- spension mit eiridr gleichen Volumenmenge Wasser
propionitril verwendet wurden.
Beispiel 8
Dun. !i Diimid katalysierte Bindung
von Glueose-Oxydase an Acrylsäure
A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Eine Lösung von 5 g Acrylsäure in 50 ml Wasser wurde auf 500C abgekühlt, auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und mit 50 mg l-Cyclohexyl-3-(2-tnorpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toiuolsulfonat behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei einem pH-Wert von 10 10 Minuten lang gerührt und dann mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt. Eine Lösung von 1,5 g Glueose-Oxydase (Aktivität = 1340 IUB-Einheiten pro Gramm) in 100 ml Wasser wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 15° C 19 Stunden gerührt. Sodann wurde unter Stickstoff auf 4°C abgekühlt. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A. erhaltene Gemisch wurde mit 500 mg Acrylamid und 2,5 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid versetzt und 15 Minuten bei 40C gerührt, dann wurden 1 ml Dimethylaminopropionitril und 280 mg Ammoniumperiulfat zugesetzt. Nach 15minütigem Rühren bei 4° C wurde das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das resultierende Gel wurde mit Wasser verdünnt, und der pH-Wert wurde mit 2 η-Salzsäure auf 4 eingestellt. Nach 35minütigem Rühren wurde das Gemisch homogenisiert und zentrifugiert, und überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert. Der Feststoff wurde erneut wie vorstehend beschrieben gewaschen, und das abgesetzte Polymer wurde gefriergetrocknet Dabei erhielt man 5,5 g immobilisiertes Enzym mit 28% der ursprünglichen Aktivität des freien Enzyms.
Bindung von Glueose-Oxydase an
Methacrylsäure-anhydrid
A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Eine Suspension von 1 g Methacrylsäure-triäthylaminsalz (in situ zubereitet) in 5 ml Acetonitril wurde bei 5°C mit 1 g Methacryloylchlorid versetzt Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur bis zur beendeten Anhydridbildung gerührt, und dann wurden 3 g Glueose-Oxydase (Aktivität = 4080 IUB-Einheiten pro Gramm) auf einmal zugesetzt Nach 2- bis 5stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch unter Stickstoff gebracht und auf 4° C abgekühlt Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A. erhaltene Gemisch wurde mit 16 ml Wasser verdünnt, dann mit 1,25'g Ν,Ν'-Methylen-bisacrylamid und 1 g «-Chloracrylsaurepropvlester versetzt und noch 10 Minuten gerührt Unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 6,5 wurden 100 mg Benzoylperoxid und 100 mg Natriumthiosulfa! zugegeben, und dann ließ man das Reaktionsgemisch sich auf 25° C erwärmen. Nach 2 Stunden wurde die Polymersu-
behandelt, filtriert und gewaschen. Das immobilisierte Enzymsystem ließ sich trocken oder in Form eines feuchten Kuchens lagern.
Beispiel 10
Bindung von Glueose-Oxydase an Methacryloylchlorid A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Eine Suspension von 3 g Glueose-Oxydase (Aktivität 3500 IUB-Einheiten/Gramm), 200 mg Methacryloylchlorid und 200 mg Triäthylamin in 5 ml Acetonitril wurde 2'/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde unter Stickstoff gesetzt und auf 40C abgekühlt. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A. erhaltene Gemisch wurde mit 8 ml Wasser 1 25 g N,N'-Methylen-bis-Acrylamid und 1 g Methylmetnacrylat versetzt, und der pH-Wert wurde mit verdünnter Natriumhydroxydlösung auf 6,5 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten gerührt und dann mit 100 mg Ammoniumpersulfat und 0,5 ml Dimethylaminopropionitril behandelt, wobei man den ρΉ-Wert bei 6,5 hielt Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das teilweise verfestigte Reaktionsgemisch mit einer gleichen Volumenmenge Wasser verdünnt, filtriert und sorgfältig mit Wasser gewaschen, wobei man 39,2 g eines feuchten, immobilisierten Enzymkuchens erhielt, der 50% der Ausgangsaktivität des freien Enzyms aufwies. Das immobilisierte Enzym ließ sich während mehrerer Monate wiederholt zur Oxydation von Glucose in wäßriger Lösung unter Bildung von Glucono-ö-lacton verwenden, ohne daß spürbarer Aktivitätsverlust eintrat.
Beispiel 11
Bindung von Glueose-Oxydase an Methacr^Ioylazid A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Zu einer Suspension von 1,24 g Natriumazid in 5 ml Acetonitril wurden 2 g Methacryloylchlorid zugegeben. Das Gemisch wurde einen Tag bei Raumtemperatur gerührt, dann auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, auf 5° C abgekühlt und mit 3 g Glueose-Oxydase (Aktivität 4080 IUB-Einheiten/Gramm) behandelt. Man rührte 2 bis 5 Stunden bei 50C, um die Enzymverbindung zu maximieren. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A. erhaltene Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff mit 16 ml Wasser, 1,25 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 1 g Methylmethacrylat versetzt Nach lOminütigem Rühren erfolgte ein Zusatz von 100 mg Ammoniumpersulfat und 0,5 ml Dimethylaminopropionitril, wobei der pH-Wert bei 6,5 gehalten wurde. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur noch 2 Stunden gerührt, dann mit einer gleichen Volumenmenge Wasser behandelt und Filtriert worauf der Filterkuchen ausgiebig mit Wasser gewaschen wurde. Das immobilisierte Enzym ließ sich trocken oder in Form eines feuchten Kuchens lagern.
Beispiel 12
Bindung von Glucose-Oxydase an das au? Methacrylsäure und Chlorameisensäureäliiylcster
erhaltene gemischte Anhydrid --,
A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Eine Suspension aus 2 g Methacrylsäure-triäthylaminsalz (in situ zubereitet) in 5 ml Acetonitril wurde mit 1 Äquivalent Chlorameisensäureäthylester behan- in delt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf man 3 g Glucose-Oxydase (Aktivität 4080 lUB-Einheiten/Gramm) zusetzte und noch 5 Stunden rührte. Dann wurde das Gemisch auf 40C abgekühlt. Das auf diese Weise erhaltene Eniiymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das xa-.'&t A. erhaltene Reaktionsgemisch wurde mit 8 ml Wasser, 1,25 g Ν,Ν'-Methylen-bis-Acrylamid und 1 g Ν,Ν'-Dimethyl-acrylamid versetzt. Das Gemisch wurde unter Stickstoff gebracht, auf pH 6,5 eingestellt und 10 Minuten gerührt. Dann wurden 100 mg Peroxydicarbonat und eine Lösung von 0,5 ml Dimethylaminopropionitril in 2 ml Wasser (pH-Wert 6) zugesetzt, und man ließ das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 2 Stunden wurde das Gemisch mit Wasser behandelt und filtriert, und der Filterkuchen wurde sorgfältig ausgewaschen und im Kühlschrank feucht oder trocken gelagert.
Beispiel 13
Bindung von Glucose-Oxydase an das gemischte Anhydrid aus Benzolsulfonsäure und Methacrylsäure
A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Eine Suspension von 2,9 g Benzolsulfonsäure-triäthylaminsalz (in situ zubereitet) in 5 ml Acetonitril von 00C wurde tropfenweise mit 2 g Methacryloylchlorid verpropionitril zugesetzt, und der pH-Wert wurde bei 6,5 gehalten. Man ließ das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührte dann 2 Stunden. Danach wurde eine gleiche Volumenmeng·; Wasser zu dem Gemisch gegeben, und das Polymer wurde abfiltriert, gewaschen und bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank als feuchter Kuchen oder trockenes amorphes Pulver gelagert.
Beispiel 14
Bindung von Penicillin-Acylase an das Diazoniumsalz vonN-(p-Aminophenyl)-methacrylamid
A. Herstellung des Enzymanlagerungsproduktes
Zu 10 g des Diazoniumsalzes von N-(p-Aminophenyl)-methacrylamid (hergestellt durch Behandlung des entsprechenden Amins mit Natriumnitrit) in 50 ml Wasser vom pH-Wert 6,5 wurden bei 10°C 10g Penicillip-Acylase aus Proteus rettgeri 9250 (6 Einhei; ten/mg Aktivität) in 200 ml Wasser zugesetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei 100C gerührt. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A. erhaltene Gemisch wurde mit 5 g Neopentylglycol-dimethacrylat und 1 g Methoxyäthylmethacrylat versetzt. Dann wurde das Gemisch unter Stickstoff auf 5°C abgekühlt und unter Rühren mit einem Katalysatorsystem aus 200 mg Ammoniumpersulfat und 2 ml Dimethylaminopropionitril versetzt. Das Eisbad wurde entfernt, und man ließ das Gemisch während des langsamen Temperaturanstiegs auf 25°C polymerisieren. Nach beendeter Polymerisation (etwa 2 Stunden) wurden 400 ml Wasser zugegeben, und das Gemisch wurde kräftig gerührt, um das feste Polymer in kleine Körnchen aufzubrechen. Das Gemisch wurde filtriert, und der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man 18 g immobilisiertes Enzympolymer erhielt, welches 42% der
Raumtemperatur gerührt und dann mit 3 g Glucose-Oxydase (Aktivität 4080 IUB-Einheiten/Gratnm) versetzt. Die Suspension wurde 5 Stunden gerührt, abgekühlt und mit 16 ml Wasser verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff gesetzt. Das auf diese Weise erhaltene Enzymanlagerungsprodukt wurde ohne Isolierung weiterverarbeitet.
B. Weiterverarbeitung zum Endprodukt
Das unter A. erhaltene Gemisch wurde mit 1,25 g N.N'-Methylen-bis-acrylamid und 1 g Methylmethacrylat behandelt und 10 Minuten gerührt. Dann wurden 100 mg Ammoniumpersulfat und 0.5 ml DimethylaminorMilaiigaiiiiuvuai uca licicii L.ii£.yill3 autwica. uaa immobilisierte Enzympolymer ließ sich »iederholt während mehrerer Monate ohne spürbaren Aktivitätsverlust zur Deacylierung von Penicillin G unter Bildung der 6-Aminopenicillansäure verwenden.
Beispiel 15
Die Arbeitsweisen der vorstehenden Beispiele wurden wiederholt, jedoch unter Ersatz von Penicillin-Acylase bzw. Glucose-Oxydase durch Urease, Amyloglucosidase, Fumarase, Subtilopeptidase A aus Bacillus subtilis ATCC 21 839 und L-Aspartase aus Enterobacter aerogenes ATCC 9760.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Enzymanlagerungsprodukt, erhältlich durch Umsetzung eines der Enzyme Penicillin-Acylase, Glucose-Oxidase, Urease, Amyloglucosidase, Fumarase, SubtUopeptidase A aus Bacillus subtilis ATCC 21 839 und L-Aspartase aus Enterobacter aerogenes ATCC 9760 mit einem polymerisierbar«!, äthylenisch ungesättigten Monomer der Formel
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