DE2552510A1

DE2552510A1 - Biologisch aktive verbindungen und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2552510A1
Application number: DE19752552510
Authority: DE
Inventors: Heinrich Dr Huemer; Rudolf Schmidtberger; Tibor Dipl Chem Dr Toth
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1975-11-22
Filing date: 1975-11-22
Publication date: 1977-06-30
Also published as: LU76243A1; IT1121742B; BE848601A; SE7612998L; FR2332287B1; FI763314A; ATA863176A; AT358275B; IL50940A0; DE2552510C3; DE2552510B2; IL50940A; CA1069070A; FR2332287A1; DK522976A; JPS6048524B2; GB1571182A; SE430066B; ZA766942B; ES453362A1

Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg / Lahn

Aktenzeichen: Ma 233 - HOE 75/B 014 -

Datum: 21. November 1975

Biologisch aktive Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung

f;

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen von biologisch aktiven Substanzen und wasserlöslichen hochmolekularen Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung vorzugsweise bei der Affinitätschroirat.ographie.

In den letzten Jahren hat sich eine neue Technik innerhalb der biochemischen Arbeitsmethoden mehr und mehr durchgesetzt, deren primäres Merkmal darin besteht, die Affinität von trägergebundenen, biologisch aktiven Substanzen zu selektiv durchzviführenden Reaktionen einzusetzen.

Ober eine spezifische Komplexbildung der trägergebundenen Substanz mit einer zweiten, die in einem Gemisch vorliegt, kann die betreffende Substanz aus dem Gemisch entfernt und gewünschtenfalls anschließend durch Desorption isoliert werden.

Trägergebundene Enzyme bieten den Vorteil, StoffUmwandlungen in präparativen, kontinuierlichen Prozessen durchzuführen und die Reaktionsprodukte enzymfrei zu erhalten.

In der biochemischen, enzymatischen Analytik stehen trägergebun-

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dene wasserunlösliche Enzyme als mehrfach verwendbare Reagenzien zur Verfügung.

Aufgrund der Eigenschaft der Enzyme, Affinitäten nicht nur gegenüber den Substraten, sondern auch gegenüber den spezifischen Inhibitoren aufzuweisen, hat sich die Gewinnung von Enzyminhibitoren mit Hilfe der Affinitäschromatographie an trägergebundenen Enzymen besonders günstig erwiesen. Andererseits erlaubt die Bindung von Inhibitoren an wasserunslösliche Matrizen die präparative Gewinnung der entsprechenden Enzyme.

Als sogenannte Immunadsorbentien werden Antigene oder Antikörper an wasserunlösliche Matrizen gebunden und erlauben danach die Isolierung der korrespondierenden Antikörper bzw. Antigene.

Als biologisch aktive Substanzen werden entsprechend den vorhergehenden Ausführungen in vivo und in vitro wirksame natürliche und künstlich hergestellte Stoffe verstanden, die im weitesten Sinne als Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, Vitamine und Hormone bezeichnet werden können. Für diese biologisch aktiven Substanzen hat sich, da sie die Wirkprinzipien der wasserunslöslichen Systeme darstellen, die Bezeichnung Effektoren eingeführt.

Die meisten der bisher beschriebenen trägergebundenen Effektoren sind wSentlich stabiler als die entsprechenden biologisch aktiven Substanzen in Lösung.

Als Trägermaterialien, sogenannte Matrizen, sind vorteilhaft solche Stoffe einzusetzen, die neben der Unlöslichkeit in wässrigen Systemen eine möglichst niedrige umspezifische Adsorption aufweisen. Dazu müssen hydrophobe, hydrophile und ionische Wechselwirkungen zwischen Matrize und dem Reaktionspartner des Effektors · weitgehend unterbunden werden. Mit Substanzen, deren Bindung an den Effektor unerwünscht ist, z.B. solchen, die keine spezifischen Reaktionspartner des Effektors sind, sollte eine Bindung ausgeschlossen sein. ''■·■■

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Die bislang verwendeten Matrizen als Träger für biologisch aktive Substanzen können unterteilt werden in diejenigen, die die Effektoren durch physikalische Adsorption binden, dazu gehören beispielsweise Polystyrol, Aktivkohle und Glasperlen und diejenigen, die mit den Effektoren über eine kovalente Bindung miteinander verknüpft sind. Die Letztgenannten schliessen Vinylpolymeie als Homo- und Cop^ymerisate, z.B. Polyacrylsäure, Polyacrylsäureamide und Amino-, Carboxy- oder Sulfonyl-substituiertes Polystyrol, ferner die Zellulose und ihre Abkömmlinge und schliesslich natürliche und synthetische Polypeptide und Proteine ein. Wegen der ausgeglichenen Wechselwirkung zwischen Matrize und Effektor hat die Verwendung von Kohlenhydraten, insbesondere der Zellulose, des Dex~ trans, der Stärke, des. Agars bzw. deren Abkömmlingen, als Matrize in wäßrigen Systemen die höchste Verbreitung gefunden, wenn auch die in diesen Naturstoffen häufig enthaltenen Carboxylgruppen wegen ihren unspezifischen Affinitäten als störend empfunden werden. Daneben weisen diese Stoffe eine relativ geringe thermische und chemische Stabilität auf.

Viele dieser Nachteile konnten durch Verwendung von Polyvinylenglykol, einem synthetischen Polymeren, als Matrize weitgehend beseitigt werden. Polyvinylglykol, auch Polyhydroximethylen genannt, wird durch saure oder basische Hydrolyse aus Polyvinylencarbonat hergestellt. Jedes Kohlenstoffatom trägt eine Hydroxylgruppe und ein Wasserstoffatom. Die durchgehende -C-C-Bindung verleiht dem Träger eine besonders hohe Stabilität.

Es wurde nun gefunden, daß man statt Polyvinyüsnglykol vorteilhaft Vinylenglykol-Copolymere als Trägermatrix verwenden kann. Durch Einpolymerisieren von geeigneten Comonomeren in Polyvinylencarbonat können die physikalischen und chemischen Eigenschaften des daraus hergestellten Polyvinylglykols weitgehend variiert werden.

So kann z.B. die "Hydrophilie" bzw. "Quellung" des Polyvinylenglykols durch Einpolymerisieren von hydrophoben Monomeren, wie Äthylen, Vinylchlorid oder Styrol in das Polyvinylencarbonat ver-

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ändert werden. Durch die Copolymerisation von Vinylacetat wird im verseiften Endprodukt eine Vinylenglykolgruppe durch eine Vinylalkoholgruppe ersetzt, was eine erhöhte Quellbarkeit in wäßrigem Medium zur Folge hat.

Es ist möglich, mit Hilfe von■Comonoraeren,wie z.B. Diäthylenglykoldivinyläther und Divinylbenzol eine Vernetzung und damit eine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften des Trägers zu erhalten.' Durch Einpolymerisieren von elektrophilen Funktionen, z.B. 'Oxirangruppen (Epoxigruppen) aus Vinylglycidyläther-Comonomeren, ist eine direkte Umsetzung der Matrix mit nucleophilen Funktionen (-NH-, -OH usw) möglich. Carboxylgruppen können durch Acrylsäure-· ester-Comonomere eingeführt werden. Nach erfolgter Copolymerisation werden die Estergruppen zu Carboxylgruppen verseift. Die Einführung von -NH₀- oder -COOH-Gruppen erlaubt die Aktivierung mit Hilfe von Carbodiimiden, Isoxasoliumsalzen, Glutaraldehyd usw. Copolymerisate-Vinylenglykol/Vinylalkohol haben eine höhere spezifische Oberfläche und damit eine höhere Bindungskapazität für z.B. Proteine an der Oberfläche des Polymerpulvers im Vergleich zu Vinylenglykol-Homopolymerisat.

Gegenstand der Erfindung sind demnach biologisch aktive Verbindungen aus einem vorzugsweise wasserunlöslichen Copolymer!sat des Polyvinylenglykols und einer daran unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität gebundenen biologisch aktiven Substanz. In diesen Verbindungen ist die Trägermatiix ein Polyvinylenglykol-Copolymerisat enthaltend bis zu 45 %, vorzugsweise 5-20%, eines Comonomeren. Die biologisch aktiven Substanzen sind Stoffe wie Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, andere Plasmaproteine, Blutgruppensubstanzen, Phytämagglutinine, Antibiotika, Vitamine oder Hormone, Peptide oder Aminosäuren oder synthetisch hergestellte Effektoren.

Der polymere Träger und die biologsich aktive Substanz sind entweder direkt oder über eine Seitenkette (Spacer) kovalent miteinander verknüpft.

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Die biologsich aktiven Verbindungen über eine Seitenkette (Spacer) zu binden ist von Vorteil, wenn die Molekulargewichte ihrer affinen Partner sehr unterschiedlich sind, oder wenn bei der Verwendung in einem biospezifischen Prozess sehr hochmolekulare oder aus mehreren Untereinheiten aufgebaute Proteine teilnehmen. Spacer sind an der polymeren Matrix verankerte Seitenketten "bestimmter Länge, die durch Einpolymerisieren durch An- oder Einbau (Bindung von bi- oder polyfunktionellen Verbindungen - z.B. einem Tripeptid - an die Matrix) oder durch Einbau von funktionellen Gruppen und schrittweise Verlängerung an diesen erhalten werden können.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur kovalenten Verbindung der biologisch aktiven Substanzen mit dem Träger.

Hierzu steht eine Reihe von allgemein bekannten Reaktionen zur Verfügung.

Sie betreffen zunächst die Verfahren zur Herstellung des PoIyvinylenglykol-Copolymeien. Sie sind dadurch gekennzeichnet, daß Vinylencarbonat mit Comonomeren der allgemeinen Formeln:

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H₂CHC^

COOR

· \TV CH=CiI

0-CH=CH₂

-- CH

.R

/i

R ^/l

in denen R.. Wasserstoff/ Methyl, Äthyl, R₃ Methyl, Äthyl, Propyl und η eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten, polymerisiert wird.

Die Polymerisation des Polyvinylencarbonats erfolgt mit bis zu 45 % Comonomeren, vorzugsweise mit 5-20 %.

"Die Herstellung der biologisch aktiven Verbindung ist beispielsweise dadurch möglich, daß eine elektrophile Gruppe entweder in die biologisch aktive Substanz oder in das Polyvinylenglykolcopolymer eingeführt wird und über diese die biologisch aktive Substanz mit den Polyvinylenglykolcopolymeren umgesetzt wird.

Die Einführung der elektrophilen Gruppen in die Trägermatrix erfolgt entweder durch Copolymerisieren von Vinylencarbonat mit elektrophile Gruppen enthaltenden Comonomeren oder durch Um-

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Setzung der Trägermatrix mit aktivierenden, elektrophile Gruppen tragenden niedermolekularen Verbindungen.

Allgemein ist die chemische Kupplung eines Reaktionspartners an die Trägermatrix einfach, wenn auf der einen Seite nucleophile und auf der anderen elektrophile Funktionen vorhanden sind. Als reaktive nucleophile Funktionen kommen vor allem Amino-, Sulfhydryl- und Hydroxylgruppen in Betracht, die gewöhnlich entweder in der Matrix oder im Reaktionspartner bereits enthalten sind. Elektrophile Funktionen müssen erst eingeführt werden. Dazu können Carboxylgruppen in Säurehalogenide, Säureazide, Säureanhydride, Imidazolide übergeführt oder direkt mit Carbodiimiden aktiviert werden. Als reaktive elektrophile Gruppen werden auch Isocyanat-, Isothiocyanat-, Diazonium-Gruppen oder cyclische Imidocarbonatester benutzt. Besonders günstig ist die Einführung reaktiver Gruppen mit Hilfe der Copolymerisation.

Durch Einpolymerisieren von Monomeren mit Epoxy-Gruppen, z.B. mit Epoxyalkylvinyläthern in das Polyvinylencarbonat und durch die sehr großen Unterschiede in der Verseifungsgeschwindigkeit zwischen cyclischen Carbonat- und Epoxy-Gruppen, erhält man leicht eine Polyvinylenglykol-Matrix mit reaktiven Epoxy-Gruppen, die mit nucleophilen Funktionen umgesetzt werden können. So ist die direkte Bindung einer biologisch aktiven Substanz und/oder die Einführung (Verlängerung) einer Seitenkette. (Spacer) möglich.

Ein weiterer Vorteil ist demnach bei der Verwendung von Copolymeren auch die Möglichkeit der direkten Einführung (Einpolymerisieren) von elektrophilen Funktionen, die eine Umsetzung nach bekannten Methoden erlauben.

Durch Copolymerisieren von Vinylencarbonat mit Äthyl-Acrylat und nachfolgender Verseifung der Polymeren erhält man eine Matrix mit -OH- und -COOH-Funktionen. Die Carboxylgruppen können mit Hilfe von Carbodiimiden aktiviert werden und sodann eine Amidbindung

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mit Aminogruppen des Effektors eingehen. Carboxylgruppen lassen ferner die Ausbildung von Amidbindungen mit Hilfe der von Woodward eingeführten Isoxazoliumsalze zu.

Eine weitere Methode zur Kupplung von biologisch aktiven Verbindungen an·Carboxylgruppen-haltigen Polymeren wird mit Hilfe von N-äthoxycarbonyl-2-äthoxy 1,2-dihydrochinolin (EEDQ) ausgeführt.

Die Carboxylgruppen können nach bekannten Methode verestert, danach der Ester in das Hydrazid überführt und schließlich das in der Folge resultierende Azid mit der Aminogruppe des Effektorproteins mit der Polyv.inylglykol-Matrix verknüpft werden.

Besitzt das in die Matrix einpolymerisierte Comonomere durch nachfolgende umsetzungen frei verfügbare Aminogruppen, so ist mit Arylaminogruppen enthaltenden Vinylsulfonderivaten oder Schwefelsäureestern von ß-Hydroxyäthylsulfönen die Einführung von Arylaminogruppen möglich, wobei die Ary!aminogruppen sodann nach bekannten Methoden diazotiert und anschließend mit entsprechend reaktiven Gruppen eines Effektors verbunden werden können, z.B.

OJI OH

il	II	II	H	H	H
1	I			i
•c- J	*-C-* 1	p. f	—C (	-?	*C--** (

π ο η

CH₀ ■■--

I ²

HO-CH ' · '^_

.CIT₂-^ ilH- (CH₂) 6"^la:~^cn2"^CH2~^SO2~C~yf ~^mi2

Auf diese Weise kann auch eine "Verlängerung" eines Spacers vorgenommen werden.

Ein anderer Weg zur Bindung von Proteinen über die Aminogruppen erfolgt mit Hilfe von Glutardialdehyd.

Einfach ist die Verknüpfung des Effektors an die Matrix nach einer Aktivierung, der Hydroxyl- oder Aminogruppen des Polyvinylen-

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glykol-Copolymeren mittels Cyanhalogeniden, vorteilhaft mit Bromcyan und einer nachfolgenden Umsetzung der Aminogruppen enthaltenden biologisch aktiven Effektoren über diese aktivierten Gruppen.

Eine weitere Möglichkeit zur Verknüpfung des Effektors mit einer Polyvinylenglykol- oder Polyvinylenglykol-Copolymerisat-Matrix besteht in der Acylierung der Hydroxylgruppen mit Bromacetylbromid,'gefolgt von der Alkylierung der Aminogruppen des Effektors.

Ähnliche Reaktionsverläufe sind beispielsweise durch Umsetzung der Hydroxylgruppen des Trägers mit reaktiven Triazinen zu erreichen, · wobei ein Teil der reaktiven Gruppen des Triazins mit der Polyvinyl englykol-Verbindung, ein anderer mit Aminogruppen des Effektors in Reaktion tritt.

Diazotierbare aromatische Amine, die über eine weitere reaktive Gruppe mit den Hydroxylgruppen des Trägers einerseits in Verbindung treten können, erlauben auf der anderen Seite die Kupplung mit dazu befähigten, aktivierten Aminosäuren, beispielsweise den Tyrosin- oder Histidinresten des Proteineffektors.

Arykminogruppen enthaltende Vinylsulfonderivate und Schwefelsäurehalbester von ß-Hydroxyäthylsulfonen können mit den Hydroxylgruppen des Trägers zur Reaktion gebracht werden. Sie ermöglichen die Bindung des Effektors nach der vorbeschriebenen Diazotierungsreaktion.

Besonders stabile Ätherverbindungen entstehen bei der Umsetzung > der Hydroxylgruppen des Polyvinylenglykol-Copolymerisats mit nicht ionenbildenden Epoxiden, die mindestens 2 reaktive Gruppen enthalten, wie die Epihalohydrine oder die Polyepoxide, beispielsweise Epichlorhydrin oder Bisepoxide.

Eine weitere Art der Modifizierung ist die Einpolymerisation von Comonomeren in die Polyvinylencarbonat-Kette (wie z.B. von Viny-

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pyrrolidon) mit anschließender' partieller Umsetzung der Zyklocarbonatringe des Polyvinylencarbonats mit einem Amin, z.B. mit Hexamethylendiamin, zu einem über eine Urethanbindung mit einem Spacer oder Effektor substituierten Polyvinylencarbonat-Cöpolymerisat. Die restlichen Zyklocarbonatgruppen werden dann zu Hydroxylgruppen' verseift:

CH-CH-

ι. :

^ ο'

CH- CI

ο ..ο-

Γ T

-CH-CII₀- CU*— CU—CII—CH-

² ' I

2 2

0 - O

OhI O

^ό η-1 ' f¹ -' R

Polyvinylencarbonat

versei::i

	- '.CiI-CIi₀-¹CH	1	— CH	■—CIi- CH —
- ·*	-I ■·.:-. ¹.	OH	,1	I I
	N		ion	Oil O
¹¹O		-	ι	I.
■ ^	V. /		i -	,ΞΓ c-o
		:■ (
			• ι ·
			R

Neben den hier beispielhaft angeführten Verfahren zur Herstellung der kovalenten Verbindung zwischen der Trägermatrix und dem Proteineffektor oder anderen Effektoren, existieren noch weitere Methoden, die zur Reaktion der Hydroxylgruppen oder bestimmter Gruppen des Copolymeren mit einem Effektor führen und dadurch die kovalente Verbindung zwischen beiden herstellen; so die bekannte Umsetzung mit komplexbildenden Metallverbindungen, z.B. Titanverbindungen. Alle diese Methoden sind dem Fachmann bekannt. Bei der Bindung niedermolekularer biologisch aktiver Verbindungen ist es oft von Vorteil, nicht den Träger, sondern den Effektor zu aktivieren.

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Im Prinzip können alle Verfahren verwendet werden/ die in der makromolekularen Chemie bei der Modifizierung von synthetischen oder natürlichen makromolekularen Verbindungen bekannt sind.

Die Polyvinylenglykol-Polymerisate zeichnen sich neben der chemischen und thermischen Stabilität durch vorteilhafte verarbeitungstechnische Eigenschaften aus und führen damit zu einer Überlegenheit gegenüber den bisher als optimal gefundenen Trägermatrizen auf der Basis von natürlichen Kohlenhydraten. Sie sind z.B. in Form von Fasern, Fäden, Folien oder sjferischen Partikeln herstellbar, so daß je nach dem Anwendungszweck des daran zu bindenden Effektors die geeignetste Form gewählt werden kann. Vorzugsweise werden diese Copolymerisate in Form von feinteiligen Pulvern mit hoher spezifischer Oberfläche angewendet.

Durch die produktionstechnisch lenkbare Größe der für die Bindung der Effektoren= bzw. der Spacer zugänglichen Oberfläche zeigt sich ein weiterer Vorzug der Polyvinylenglykol-Copolymerisate gegenüber den bekannten Trägermaterialien.

Die erfindungsgemäßen biologisch aktiven Verbindungen eignen sich "für die meisten Anwendungsverfahren, die bisher für andere an hydrophile, wasserunlösliche Träger gebundene Effektoren bekannt geworden sind. Es können demnach Enzyme wasserunlöslich gemacht werden. Die unlöslichen Enzyme werden zunehmend zur Bestimmung von Substraten in Analysenautomaten und als sogenannte Enzymelektroden verwendet. Wegen der erhöhten Stabilität eignet sich eine Reihe trägergebundener Enzyme für die Durchführung technisch enzymatischer umsetzungen.

Trägergebundene, biologisch aktive Substanzen haben wegen ihrer Eigenschaft als spezifische Adsorbentien eine breite Anwendung in der Affinitätschromatographie gefunden. Mit Hilfe von trägergebundenen natürlichen oder synthetischen Enzyminhibitoren gelingt die Hochreinigung von Enzymen, während die Enzyme als Effektoren insbesondere zur Gewinnung natürlicher Enzyminhibitoren aus Rohextrak-

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ten hervorragend geeignet gefunden wurden. Trägergebundene wasserunlösliche Antigene werden zur Isolierung der zugehörigen Antikörper verwendet, die auf diese Weise frei von anderen Serumbestandteilen und frei von anderen Antigenen erhalten werden. Af finitätschromatographisch können auch nicht präzipitjrerbaren Antikörper sowie solche, die wegen ihrer geringen Konzentration im Serum nicht fällbar sind, isoliert und auch quantitativ bestimmt werden.

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Beispiele

Herstellung von Vinylencarbonat-Copolymeren

Das bei der Herstellung der Copolymeren (CP) eingesetzte Vinylencarbonat wurde vor dem Einsatz eine Stunde über Natriumborhydrid (100 Gewichtsteile Vinylencarbonat auf 2 Gewichtsteile NaBH.) bei einem Druck von 33 mm am Rückfluß gekocht, dann bei 75°/33 mm über eine 50 cm lange, mit Raschig-Glasringen gefüllte Silbermantel-Kolonne destilliert und möglichst umgehend für die Copolymerisation· eingesetzt. Ebenso wurden die eingesetzten Comonomeren zuvor noch durch Destillation gereinigt.

1.) Copolymer!sat-Vinylenglykol/Vinylalkohol aus verseiftem Copolymer isat-Vinylencarbonat/ Vinylacetat

a) In 9 Gewichtsteilen Vinylencarbonat und 1 Gewichtsteil Vinylacetat werden 0,05 Gewichtsteile Azobisisobutyronitril unter Stickstoff gelöst. Das Monomerengemisch wird unter Stickstoff.in eine flachgedrückte (4 mm dicke, 60 mm breite, 150 mm lange) Aluminiumtube mit Schraubverschluß eingefüllt (Gesamtfüllvolumen etwa 35 ml), unter N„ verschlossen und 48 h in ein 50° warmes Wasserbad eingehängt. Es werden harte, spröde Kunststoffplatten erhalten, die in einer Schlagmühle vor zeiJcleinert werden. Anschließend wird das Granulat bei 1-2 mm Druck 5 h lang auf 120° erwärmt, um das nicht polymerisierte Rest-Monomere abzutrennen. Das entmonomerisierte Granulat wird in einer Mühle weiter auf eine Korngröße <T 0,1 mm gemahlen, in 500 Gewichtsteilen 0,5 N Natronlauge eingetragen, bei 20° mit einem schnelllaufenden Rührer eine Stunde lang gemischt, wobei die Carbonat- und Acetyl-Gruppen verseift werden. Das wasserunlösliche CP-Vinylenglykol/Vinylakohol wird abgesaugt, gut mit

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Wasser von anorganische Salzen freigewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 4,7 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol mit einer spezifischen Oberfläche gemessen nach BET von 34m²g"¹.

b) Wie unter 1 .)a) beschrieben, nur daß auf 7 Gewichtsteile Vinylencarbonat 3 Gewichtsteile Vinylacetat eingesetzt werden.

Ausbeute: 4,1 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol mit einer spezifischen Oberfläche des gefriergetrockneten Polymerpulvers von 62,5m²g

.'■ c); Vergleichsversuch wie unter 1 .) a) beschrieben, nur daß ■10 Gewichtsteile Vinylencarbonat und kein Comonomer eingesetzt werden.

Ausbeute: 4,7 Gewichtsteile Homopolymerisat-Vinylenglykol mit einer spezifischen Oberfläche des gefriergetrockneten Polymerpulvers von 20,5 m²g ... .

2.) Copolymerisat-Vinylenglykol/Vinylglycidylather

Ein Gemisch von 7 Gewichtsteilen Vinylencarbonat, 3 Gewichtsteilen Vinylglycidyläther und 0,1 Gewichtsteil Azobisisobutyronitril wird wie unter 1.)a) beschrieben in flachen AIu-' miniumtuben unter N₂ 3 Tage auf 50° erwärmt. Die erhaltenen Kunststoffplatten werden wie unter 1.)a) beschrieben zerkleinert, entmonomerisiert, auf eine Korngröße <^ 0,1 mm gemahlen, in 500 Gewichtsteilen eiskalter, 0,5 η NaOH mit einem schnell-, laufenden Rührer 30 Minuten suspendiert, anschließend das verseifte Polymere sofort abzentrifugiert, in Eiswasser aufgeschlämmt, unter Eiskühlung mit 2n H₃SO₄ auf pH 7 neutralisiert, abgesaugt, mit Eiswasser ausgewaschen und gefriergetrocknet. Ausbeute: 3,9 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol(Vinylglycidyläther enthaltend 1,3 Milliäquivalenten Oxirangruppen/g (bestimmt nach: "Praktikum der makromolekularen organischen Chemie", S. 221, von Braun, D., Cherdron, H., Kern, W., Müthig Verlag, Heidelberg 1966). ■

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3.) Aminosubstituierte Copolymerisat-Trägermaterial

3,9 Gewichtsteile CP-Vinylglykol/Vinyglycidylather (aus Beispiel 2.)) werden mit einem Ültra-Turrax-Rührer in 100 Gewichtsteilen H₂O suspendiert und mit 10 ml 30 %igem Ammoniak versetzt. Mit einem kleinen Magnetrührer wird anschließend noch 10h bei 50° gerührt, schließlich abgesaugt und gut mit Wasser ausgewaschen und gefriergetrocknet. Ausbeute:3,5 Gewichtsteile Copolymerisat-Trägermaterial enthaltend 0,9 m äquivalente Aminogruppen pro Gramm, in Form von 3-Ämino-2-hydroxy-propyl-Gruppen (aus der Umsetzung von Ammoniak mit Glycidylgruppen entstanden).

4.) CP-Vinylenglykol / Arylsäure

9 Gewichtsteile Vinylencarbonat, 1 Gewichtsteil Acrylsäureäthylester und 0,05 Gewichtsteile Azobisisobutyronitril werden unter N₂ wie bei Beispiel 1.)a) polymerisiert, zerkleinert, entmonomerisiert und auf eine Korngröße <^0,1 mm gemahlen, verseift, abgesaugt, ausgewaschen und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,0 Gewichtsteile hydrophiles Polymerpulver, enthaltend 4,1 Milliäquivalente Carboxylgruppen pro Gramm Träger mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 27,2 m²g

5.) IW -Aminohexy!-Gruppen-substituiertes Poly-Vinylglykol

5 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Acrylsäure aus Beispiel 4.) werden mit dem ültra-Turrax in 100 ml H₂O suspendiert, auf 5° gekühlt, mit 2,5 g N-Cyclohexyl-N¹- (N-roethylmorpholino)-äthyl)-carbodiimido-p-toluol-sulfonat versetzt, 30 Minuten bei pH 5 und 5° gerührt, abfiltriert und schnell mit Eiswasser gewaschen. Der aktivierte Träger wird anschließend sofort in eine mit 2 η HCl auf pH 7,5 gestellte und auf 5° gekühlte Lösung von 5 g Hexamethylendiamin in 100 ml Wasser suspendiert und noch weitere 24 Stunden unter diesen Bedingungen mit einem Magnetrührer gerührt, abgesaugt, gut mit Wasser

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ausgewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 4,5 Gewichtsteile k/'-Aminohexyl-Gruppen-substituiertes Poly-Vinylenglykol mit 0,7/Milliäquivalenten Aminogruppen pro Gramm Träger.

6.) Umsetzung von CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol aus Beispiel 1.)a) mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 34 m²g

a) mit Epichlorhydri>n

50 g eines CP-Vinylenglykol/Vinylakohol, hergestellt nach Beispiel 1.)a) werden in 1 Liter 2 η NaOH suspendiert, mit . 250 ml Epichlorhydrin versetzt und 2 Stunden bei 55-60° gerührt. Der pH-Wert der Suspension sinkt nach kurzer Zeit auf 10-11. Durch Zugabe von NaOH wird noch 1 Stunde dieser pH-Wert gehalten. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird der Feststoff abgesaugt, mit Wasser, Aceton und zum Schluß wieder mit Wasser gewaschen.

b) mit Hexamethylendiamin

50 g Hexamethylendiamin werden in 1,5 1 Wasser gelöst und mit HCl bis pH 10 versetzt. Zu der Lösung wird das nach 6.)a) aktivierte CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol gegeben und bei 50-55° 6 Stunden gerührt. Danach wird das Produkt abgesaugt und mit Wasser frei von Hexamethylendiamin gewaschen.

c) mit i-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester -

Das unter Beispiel 6.)b) erhaltene Produkt wird mit 50 g i-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester bei 55° und pH 10 eine Stunde lang gerührt. Anschließend wird der Feststoff abfilüri ert, mit Wasser, Aceton und wieder mit Wasser gewaschen. -

c) Diazotierung

10 g des unter Beispiel 6.)c) erhaltenen Produktes werden auf einer Nutsche mit -200 ml η HCl gewaschen und danach - in 300 ml 0,5 η HCl suspendiert. Die Suspension wird unter

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Rühren mit 0,1 η NaNO^Lösung bei 0-4° versetzt, bis bei der Diazotierung mit KJ-Stärkepapier ein geringer Nitrit-Überschuß festzustellen ist. Nach 10 Min. wird über eine Nutsche abfiltriert und der Rückstand mit Eiswasser und anschließend mit 0,15 M Natriumphosphat-Puffer pH 7,5 von 0-4° gewaschen.

e) Kovalente Bindung mit Protein

0,8 g Albumin werden in 350 ml Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst, auf 4° abgekühlt und das unter 6.)d) hergestellte Produkt zugegeben. Die Suspension wird 20 Stunden bei 4° gerührt, danach abfiltriert und der Feststoff mit 1 M NaCl und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (wäßrige 0,9 %ige NaCl-Lösung mit einem Gehalt an 1/15 Mol Na₂HPO₄-KH₃PO₄-PUffer von pH 7,2) gewaschen. Filtrat und Waschlauge werden nach der Methode der radialen Immundiffusion auf Albumin untersucht. Es werden 60 mg Albumin an 1 g des so hergestellten Trägers gebunden.

7.) Umsetzung von CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol aus Beispiel 1.)b) mit einer spezifischen Oberfläche nach BET, von 62,5 m²g

Nach analogen Umsetzungen wie unter 6.)a) bis e) beschrieben können 1 g aktivierten Träger 80 mg Albumin quantitativ gebunden werden.

8.) Umsetzung von Homopolymerisat-Vinylenglykol aus Beispiel 1.)c) mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 20,5ro²g

Nach analogen Umsetzungen wie unter 6.)a) bis e) beschrieben können an 1 g aktivierten Träger 45 mg Albumin quantitativ gebunden werden.

9.) (-c-Aminohexylgruppen-substituiertes Vinylenglykol(Vinylpyrrolidon-Copolymerisat

In 9 Gew.Tl. Vinylencarbonat und 1 Gew.Tl. Vinylpyrrolidon werden Ό,05 Gew.Tl. Azobisisobutyrolnitril unter Stickstoff gelöst und analog Beispiel 1.)a) polymerisiert -und aufgear-

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Nach dem Entmonomerisieren wird das Granulat zu einer 12 Gew. %-igen Dimethylformariid-Lösung gelöst, und mit einem Druck von 15 Atü wird diese Lösung in ein Methanol-Fallbad hinein-· gedüst. Man erhält einen feinfaserigen Niederschlag Vinylencarbonat/Vinylpyrrolidon-Copolymerisat, der abgesaugt, mit Methanol nachgewaschen und in 200 Gew.Tl. Methanol resuspendiert wird. Es werden 6 Gew.Tl. Hexamethylendiamin, gelöst iu 50 Gew.Tl. Methanol, zugegeben, die Suspension 2 Teige bei Raumtemperatur gerührt, abgesaugt und mit Methanol ausgewaschen. Der gewaschene Filterrückstand wird jetzt in einer Lösung von 10 Gew.Tl. Natriumraethylat in 300 Gew.Tl. 96 %igem Methanol 4 Tage bei Raumtemperatur suspendiert, mit Methanol und dann sehr intensiv mit Wasser ausgewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 5,0 Gew.Tl. eines über Urethan-Bindurigen mit hexyl-Gruppen substituierten VinyIglykol/Vinylpyrrolidon-Copolymerisats enthaltend 1,6 m Äquivalent NH^-Grippen/g Träger.

10.) Bindung von IgG an CiT-Aminohexyl-Gruppen-substituiertes Copolymerisat aus Beispiel 9.) mit Hilfe von Bernsteinsäureanhydrid und wasserlöslichen Carbodiixaid

5 Gew.Tl. von nach Beispiel 9.) hergestelltem tcT-Aminohexylsubstituierten Träger werden bei 10° und pH 6 mit 2,5 Gew.Tl. Bernsteinsäureanhydrid, die in 200 Gew.Tl. Wasser suspendiert sind, 4 Stunden succincyliert. Der pH-Wert wird mit 2 η NaOH einreguliert. Nach der Waschung des Feststoffes mit Wasser wird das Produkt mit 1,25 Gew.Tl. N-Cyclohexyl-N¹-(N-methymorpholino)-äthyl)-carbodiimid-p-toluol-sulfonat bei pH 5 und 5° 30 Min. gerührt, abfiltriert und schnell mit Eiswasser gewaschen.

0,5 Gew.Tl. IgG werden in 150 Gew.Tl. Phosphat-Puffer pH 7,5 gelöst und mit dem aktivierten Träger 24 Stunden bei 4° gerührt. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.
An 1 g· des Trägers werden 75 mg IgG kovalent gebunden.

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"·"·-) Copolymerisat-Vinylenglykol/Diäthylenglykoldivinyläther

In 9 Gew. Tl. Vinylencarbonat und 1 Gew>il. Diäthylenglykol-divinyläther werden 0,1 Gew.Tl. Azobisisobutyrolnitril unter Stickstoff gelöst und wie unter 1.)a) beschrieben in flachen Aluminiumtuben unter N~ 3 Tage auf 50° erwärmt und polymerisiert. Nach Aufarbeitung und Verseifung wie unter 1,)a) boschrieben werden 3,5 Gew.Tl. CP-Vinylenglykol/Diäthylenglyko.· divinyläther erhalten.

12.) Copolymerisat-Vinylenglykol/ N-Acryloylaminoacetaldehyddiiue-

■ thy !acetal ·

a) In 9 Gew.Tl. Vinylencarbonat und 1 Gew.Tl. N-Acyloylaminoacetaldehyddimethylacetal werden 0,05 Gew.Tl. Azolisisobutyronitril unter Stickstoff gelöst. Das Monomerengemisch wird wie unter 1.}a) beschrieben polymerisiert, aufgearbeitet und verseift zu 4,1 Gew.Tl. N-Acryloylaminoacetaldehyddimethylacetal/Vinylenglykol-Copolymer.

10 Gew.Tl. N-Acryloylaminoacetaldehyddimethylacetal/Vinylenglykol-Copolymere wurden in 100 Gew.Tl.· 1 N HCl 4-5 Stunden gerührt. Der aktivierte Träger wurde mit Wasser und Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen.

b) 0,5 g Albumin wurden in 200 ml PBS gelöst und mit dem unter a) hergestellten Produkt 14 Stunden bei 4° gerührt. Nach Filtration wurde das trägergebundene Protein mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.

1 g des so hergestllten Trägers bindet 40 mg Albumin.

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INSPECTED

Claims

Patentansprüche;

1. Verbindung aus einem Copolymeren des Vinylenglykols und einer daran chemisch gebundenen biologisch aktiven Substanz.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch-gekennzeichnet, daß das Copolymere mindestes 55 % Monomereneinheiten des Vinylenglycols enthält und höchstens 45 % Monomereneinheiten mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formeln:

-He-/' ^H2° S₀-

₉C=C V/ V CH=CH₉

\ΓΛ V^ 0-CK=CH₂

/h

\ ι

OC ^ _C

R /

₉C=C_v 2 \_CHC

^Q-CH-CH₂ I I

in denen R^ Wasserstoff, Methyl, Äthyl, R₃ Methyl, Äthyl, Pro- pyl und η eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten.

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OWQlNAL INSffCTEP

3. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz ein Enzym, Aktivator, Inhibitor, Antigen oder Antikörper, ein Plasmaprotein, eine Blutgruppensubstanz, ein Phythämagglutinin, ein Antibiotikum, Vitamin oder Hormon, ein Peptid oder eine Aminosäure, ein natürlicher oder snythetisch hergestellter Effektor.ist.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 , dcidurch gekennzeichnet, daß man

(A) ein Copolymeres des Vinylcarbonats mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzt und danach die noch vorhandenen Cyclocarbonatgruppen in Hydroxygruppen überführt oder

(B) die Cyclocarbonatgruppen eines Copolymeren des Vinylen-■ · carbonats in Hydroxygruppen überführt und

(a) im Copolymerisat vorhandene oder in dieses eingeführte elektrophile Gruppen mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzt oder

(b) diese Hydroxygruppen

(1) entweder zuerst mit einer elektrophile Gruppen enthaltenden Verbindung und sodann mit einer biologisch aktiven Substanz

(2) oder unmittelbar mit einer elektrophilen Gruppen tragenden biologisch aktiven Substanz umsetzt.

5. Mittel enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1.

6. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Affinitätschromatographie, zur Durchführung von Immunreaktionen oder zur Durchführung von Enzymreaktionen.

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